CN102031258A - 纯化质粒dna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供连续的碱裂解细菌悬浮液以收集pDNA的方法。它还给定了可选的附加纯化步骤,包括裂解物过滤,阴离子交换色谱,三螺旋亲和色谱和疏水相互作用色谱。这些可选的纯化步骤可以和所述连续裂解结合以提供基本上不含gDNA,RNA,蛋白质,内毒素和其他污染物的高度纯化的pDNA产物。
Description
本申请为分案申请,原申请的申请日为2005年4月19日,申请号为200580011784.7(PCT/EP2005/005213),发明名称为“纯化质粒DNA的方法”。
技术领域
本发明涉及核酸纯化的方法。本发明特别涉及制备高度纯化的质粒DNA(pDNA)的方法,特别涉及生产和分离药物级质粒DNA。
背景技术
分子生物学的发展清楚地说明,基于质粒的疗法,尤其在疫苗和人类基因治疗领域中,可能支持有效的疾病治疗途径。但是,对于该技术存在一个显著的障碍,那就是制备数量上和质量上都足以用于临床的质粒DNA。通过质粒DNA来将正常基因安全而有效地导入人类细胞是一种有前景的方法。质粒DNA是一种闭合环状形式的细菌DNA,其中可插入感兴趣的DNA序列。可以导入哺乳动物细胞的感兴趣的DNA序列的例子包括外源的功能基因,或突变基因,反义序列,干扰RNA(RNAi)或双链干扰RNA(dsRNAi),核酶(ribozymes),例如在病毒感染,癌症或血管发生相关疾病的治疗中。一旦导入到人类细胞中,pDNA就开始复制并产生被插入的DNA序列的拷贝。因此,科学家们把质粒DNA看作一种有前景的载体,用于将感兴趣的DNA序列传送到人类细胞中以治疗多种疾病状态。
为了在治疗中实施基于质粒的技术,需要极大量的质粒DNA用于研究和开发。由于用于基因治疗和其他临床应用的质粒DNA通常是用细菌例如大肠杆菌(Escherichia coli)生产的,需要有效地将质粒DNA与细菌细胞的基因组DNA(gDNA)及细菌细胞的内毒素和蛋白质分离的方法。由此,对于简单、稳健、可放大、可用来从细菌细胞中分离大量的质粒DNA的纯化方法,存在着不断增长的需求。
在任何质粒纯化方法中都有一个重要的步骤,其包括裂解细菌细胞以释放细胞内容物,从该内容物中可分离pDNA。事实上,首先需要实现细胞重悬、细胞裂解,及宿主污染物的中和和沉淀这三个步骤。细胞重悬一般使用手动或磁力搅拌器,和匀浆器或转叶(impeller)混合器将细胞重悬于重悬缓冲液中。细胞裂解可通过手工旋转或磁力搅拌来将重悬的细胞与裂解溶液(由稀碱和去污剂组成),然后将该混合物在室温(20-25摄氏度(degrees Celsius))或冰上保持一段时间,例如5分钟,来完成裂解。如上面指出的,手工旋转和磁力搅拌是不可放大的。第三个步骤是宿主污染物的中和和沉淀。第二个步骤生成的裂解物通常通过温和的旋转或磁力搅拌与冷的中和溶液混合以酸化该裂解物,然后置于冰中10-30分钟以便于高分子量的染色体DNA、宿主蛋白质和其他宿主分子变性和沉淀。手工旋转和磁力搅拌都是不可放大的。
通常,通过短时间溶菌酶处理,或通过碱或醋酸钾(KOAc)处理来消化细胞壁。一般还加入RNA酶来降解细菌悬液中的RNA。这些化学性步骤对小规模地裂解细胞可能是足够的。但是,粘度的增加使得大规模的加工非常困难。
一种快速而简单的质粒制备的替代方法包括用溶菌酶处理细菌,然后在合适的缓冲液中约100℃左右煮沸20到40秒,生成不溶的基因组DNA、蛋白质和碎片的凝结块(clot),留下质粒和作为主要污染物的RNA在溶液中。接着,加入NaOH和十二烷基硫酸钠(SDS)来溶解细胞膜。NaOH部分地变性DNA并部分地降解RNA;SDS起溶解膜和变性蛋白的作用。接着,加入5N醋酸钾(pH 4.8)来沉淀SDS-蛋白质复合物和细胞碎片。此时,pH对于中和上述操作中使用的NaOH和复性质粒都是重要的。此后,离心除去沉淀,得到上清中的目标质粒。但是,该技术不适合放大到高容量的细菌发酵,其原本就是用于小于5升的发酵的。同时,这一系列的操作要求缓慢和稳定地混合以避免细菌染色体DNA被切割成小片段并聚集,使它们污染质粒,并且难以在大规模加工中实现。
一种常用的裂解细胞的替代方法称为碱裂解(alkaline lysis),其包括(consist of)将细菌细胞悬液(溶液1)和碱裂解溶液(溶液2)混合。溶液2包括去污剂,例如十二烷基硫酸钠(SDS),用于裂解细菌细胞并释放细胞内物质;和碱,例如氢氧化钠,用于使细胞的蛋白和核酸(特别是gDNA和RNA)变性。由于细胞裂解和DNA变性,溶液的粘度急剧升高。变性后,加入酸性溶液,例如醋酸钾(溶液3)以中和氢氧化物,导致核酸的变性。gDNA的长片段随机地重新结合形成网状结构,其以絮凝物的形式沉淀,并捕获蛋白,脂类及其他核酸。十二烷基硫酸的钾盐也沉淀,并带走与其结合的蛋白。pDNA(质粒DNA)互相缠绕的两条链正常地重新组合,恢复为初始的质粒,并保留在溶液中。
该裂解技术是以分批的模式进行的,即,通过顺序地将不同的溶液加入容器或槽中来混合这些溶液。由于碱裂解物是极难于操作的粘弹性流体,这种方法在混合不同溶液过程中存在困难。由于剪应力造成gDNA片段化,片段化的gDNA极难与pDNA分离,因此需要避免对该流体施加剪应力的方法。另外,大pDNA(即大于约10个千碱基对)也对混合过程中的剪切损伤敏感。当含有细胞悬液的溶液与裂解溶液混合后,粘弹性的碱裂解物与中和溶液混合。同样,由于该溶液的粘弹性性质,该混合过程也是有问题的。
另外,放大该分批裂解方法的另一个困难包括在试图限制剪应力以避免gDNA片段化的同时混合不同流体的效率。如前面所述的,片段化的基因组DNA的色谱行为与pDNA非常相似,因此几乎不可能使用标准的纯化程序来去除gDNA。由此,使用分批方法裂解细菌细胞明显地存在几方面的局限性,例如放大,片段化的gDNA污染导致回收的pDNA的质量不佳,以及所得的pDNA的量相对较低等等。
相对于分批方法,还提出了几种使用一系列静态混合器连续地混合多种细胞裂解溶液的方法。根据这些方法,细胞悬液和细胞裂解溶液被同时加入静态混合器。然后,将从所述第一个静态混合器中出来的裂解细胞的溶液与沉淀溶液同时加入第二个静态混合器。从第二个静态混合器中出来的溶液含有沉淀的裂解物和质粒。其他裂解细胞的连续模式包括使用流过式(flow-through)热交换器,其中悬浮的细胞被加热到70-100℃。在热交换器中裂解细胞后,对出口流进行连续流式或分批式离心,此过程中细胞碎片和基因组DNA被沉淀,留下质粒DNA在上清中。
因此,从大容量的微生物发酵中大规模地分离和纯化质粒DNA需要开发改进的质粒制备方法。
尽管目前有多种方法用于裂解细菌细胞,但这些方法都没有涉及流体的粘弹性质和混合步骤中牵涉的剪切力所引起的问题。因此,本发明涉及大规模连续碱裂解细菌细胞悬液的新方法,并提供限制剪切力的重要优点。
在任何涉及在治疗中将核酸引入人或动物的应用中,还有重要的一步,就是对大量高度纯化的、药物级的核酸的需求。这样的纯化核酸必需满足安全性、效力(potency)和效能(efficacy)的药品质量标准。另外,还希望有能放大的方法,可以用来生产若干克量的DNA。因此,希望有这样的制备高纯度核酸的方法,其不需要毒性化学品,诱变剂,有机溶剂或者其他可能损害产品核酸的安全性和效力,或使放大变得困难或无法实行的试剂。还希望能制备没有内毒素污染的核酸,内毒素施用于患者后可引发毒性反应。当质粒DNA是从革兰氏阴性细菌来源纯化时,去除内毒素是特别重要的:革兰氏阴性细菌具有高水平的内毒素,作为其细胞外膜的必需组分。
从细菌发酵分离和纯化质粒DNA的经典方法适用于小型或实验室规模的质粒制备。含质粒的细菌宿主细胞破碎之后,用醋酸盐中和使得宿主细胞基因组DNA和蛋白质沉淀,并一般通过例如离心而去除。质粒含于液相中,通过醇沉淀后,在溴化乙锭存在下使用CsCl进行等密度离心以分离各种形式,即超螺旋的,缺口环状(nicked circle),和线性化的质粒DNA。需要用丁醇进一步抽提以去除残余的溴化乙锭,然后用醇沉淀DNA。接着进行其它去除宿主细胞蛋白质的纯化步骤。
这些现有的分离质粒DNA的方法有几点局限性。例如,涉及使用大量可燃性有机溶剂(例如乙醇或异丙醇)和有毒化学品,例如溴化乙锭、苯酚和氯仿的方法,对于大规模分离和纯化质粒DNA是不理想的。氯化铯离心的替代方法可用于质粒DNA纯化,例如大小排阻(size exclusion)色谱,羟基磷灰石色谱和多种基于反相或阴离子交换的色谱方法。这些替代方法可能足够用来在实验室规模产生少量的研究材料,但一般不易于放大,且不能产生质粒DNA的量。
另外,使用化学分离方法,分离和纯化过程复杂,必须使用大量的有机溶剂,因此产生了废物处理等许多问题。
除了化学分离纯化方法以外,还有用电泳分离质粒的方法。电泳方法包括纸电泳和凝胶电泳,目前凝胶电泳是常用的。但是,电泳方法具有分离时间长,收集困难,载样量小等许多问题。
目前可用的分离两种形式的质粒DNA的方法利用离子交换色谱(Duarte et al.,Joumal of Chromatography A,606(1998),31-45)或大小排阻色谱(Prazeres,D.M.,Biotechnology Techniques Vol.1,No.6,June1997,p 417-420),结合使用添加剂例如聚乙二醇(PEG)、去污剂和其他组分例如六胺钴(hexamine cobalt),精胺和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。但是,现在已知的方法不能充分地且节约成本地分离超螺旋和缺口(或松环(relaxed))DNA。而且很多已知方法都有一个缺点:其使用PEG或其他添加剂,这在质粒DNA生产中是不希望的,因为它们需要额外的分离、处置和质量控制方法,这可能是困难的,且耗费更多的时间和成本。这些已知的分离超螺旋和松环形式的质粒DNA的方法的替代形式使用非常昂贵的树脂,而且加工中还使用溶剂,例如乙腈,乙醇,和其他组分,例如三乙胺和四丁基磷酸铵。其他分离超螺旋和松环DNA的方法依靠大小排阻色谱,其涉及基于两种形式的质粒DNA在大小上的细微差异来分离二者。这些色谱柱倾向于较长,从而导致显著的放大问题,使其难以实用于大规模生产。而且,大小排阻方法需要浓的样品溶液,由于DNA的高度粘性,这对质粒DNA溶液是难以实现的。
从细菌制备物生产的、经常含有松环和超螺旋质粒DNA的质粒DNA制备物,经常需要去除内毒素,如FDA所要求的,因为已知许多细菌宿主产生的内毒素会在接受该质粒DNA的宿主中引起炎症反应,例如发热或败血病。这些内毒素一般是脂多糖或其片段,存在于宿主细胞和宿主细胞膜或大分子的制备物中。因此,在用于治疗或预防的质粒DNA的纯化中内毒素的去除是关键和必要的步骤。从质粒DNA溶液中去除内毒素主要利用内毒素带负电的结构。但是,质粒DNA也是带负电的,所以通常纯化是这样实现的:使用同时结合这两种分子的阴离子交换树脂,并在一定的条件下,优选地洗脱质粒DNA而结合内毒素。这样的分离只能实现部分的去除,因为有相当量的内毒素和质粒DNA一起被洗脱,而且/或者,质粒DNA的回收率很低。
因此,为了从大容量微生物发酵大规模分离和纯化质粒DNA,需要开发更好的质粒制备方法。同时,也需要一种更简单、更省时地分离和纯化大量质粒DNA的方法。对于基于质粒的研究和治疗方法而言,还希望核酸的分离和纯化能保持核酸相同的结构,并以可重复的方式进行,而且,为了避免杂质对哺乳动物身体的不良影响,要求核酸已经被分离纯化达到高纯度。
但是,使用常规方法存在这样的问题:不能获得足够高的纯度和足够大的量的核酸,尤其是质粒。因此,本发明旨在提供一种使用至少两个色谱步骤的分离方法,其使得在更短的时间内分离大量的质粒DNA成为可能,且达到未预料到的高纯度等级。
发明概述
本发明基于产生和分离高度纯化的质粒DNA的方法的发现。根据本发明的发明产生和分离的质粒DNA含有非常低水平的污染性染色体DNA,RNA,蛋白质和内毒素。根据本发明生产的质粒DNA具有足以用于基于质粒的治疗的纯度。
因此,本发明包括产生和分离高度纯化的质粒DNA的方法,包括细胞裂解步骤,该步骤中存在(a)湍流装置(a means for turbulent flow),用于快速地混合细胞悬液和溶解该细胞的溶液;和(b)层流装置(ameans for laminar),其使得(a)中产生的混合物可以在不受到显著扰动的条件下温育,其中(a)中形成的混合物从所述湍流装置流入所述层流装置。
在本发明的一个进一步的实施方式中,所述机构还包括加入第二溶液的装置,所述第二溶液中和裂解溶液;其中(b)中温育的混合物从所述层流装置流入该加入第二溶液的装置。
在另一个实施方式中,该机构可用于从细胞中分离质粒DNA的方法,该方法包括(a)在所述湍流装置中将细胞与碱性裂解溶液混合;和(b)加入酸性溶液来中和所述碱性裂解溶液。
本发明还涉及连续细胞碱裂解装置,包括:第一混合器或注射器,其可以与细胞悬液相反的方向注射碱性流体,小直径的第一管,以在所述混合物中产生湍流;大直径的第二管,以在所述混合物中产生层流;和第二混合器或注射器,用于将在一端注射中和溶液和收集裂解物。
本发明进一步包括生产和分离高度纯化的质粒DNA的方法,所述质粒DNA基本上(essentially)不含污染物,因此是药物级的DNA。
本发明的另一个目的是涉及分离和纯化核酸和质粒DNA的方法。更详细地说,本发明涉及分离核酸和质粒DNA的方法,所述核酸和质粒DNA为药品级,可用于研究和基于质粒的治疗方法。根据本发明的方法分离的质粒DNA制备物可经历纯化步骤,其至少包含三螺旋色谱(triple helix chromatography)还可进一步包含阴离子交换色谱和疏水相互作用色谱。
因此这些方法包括本文所描述的连续碱裂解步骤及后续阴离子交换色谱和/或三螺旋亲和色谱和/或进一步疏水相互作用色谱的组合。
因此这些方法还包括此处描述的连续碱裂解步骤,其与随后的步骤组合,阴离子交换色谱,三螺旋色谱,和与疏水性相互作用色谱的组合。裂解物的过滤或其它絮凝物去除先于第一色谱步骤。
本发明的一个目的是使从宿主细胞/质粒DNA组合中制备质粒DNA的产量最大化。
本发明的另一个目的是提供基本上不含细菌宿主RNA的质粒DNA制备物。
本发明的另一个目的是提供基本上不含细菌宿主蛋白质的质粒DNA制备物。
进一步地,本发明的另一个目的是提供基本上不含细菌宿主染色体DNA的质粒DNA制备物。
本发明的另一个目的是提供基本上不含细菌宿主内毒素的质粒DNA制备物。
本发明的另一个目的是提供制备药物级质粒DNA的方法,所述质粒DNA是高度纯化的,用于研究和基于质粒的治疗方法,并且其适于放大到大规模生产。
因此本发明包括基本不含污染物、高纯度且完整的药物级质粒DNA,该DNA包括载体骨架,治疗基因和相关的调控序列。
本发明还涉及质粒DNA液体制剂,该制剂是稳定的,在室温下长期保持不降解,因此适用于保存用于研究和相关人类治疗方法的质粒DNA。
本发明的其他目的和优点,一部分在下面的描述部分中提出,一部分可以根据该描述而显然自明,或在本发明的实施中得知。本发明的目标和优点可以借助所附权利要求中特别指出的要素和组合来实现和达到。
要理解的是前面的一般性描述和下面的详细描述都仅仅是例示性和解释性的,而并非限制本发明,如所声称的那样。
被引入并作为本说明书的一部分的附图说明了数个本发明的实施方式,并且与描述部分一起起到解释本发明的原则的作用。
附图说明
图1是可用于本发明的连续式细胞裂解的装置的示意图。
图2是上述连续细胞裂解装置的混合器M1的示意图。
图3是比较三种纯化方法以gDNA、RNA、蛋白质、内毒素污染物为指标的纯化产率的表,三种方法分别为:单步的阴离子交换色谱(AEC);阴离子交换色谱步骤和三螺旋亲和色谱步骤(THAC)组合的两步法;和包括阴离子交换色谱步骤、三螺旋亲和色谱步骤和疏水相互作用色谱的组合的三步法;ND表示未检测到:低灵敏度的分析方法。
图4是多种分离纯化质粒DNA方法,例如单独使用或组合使用的阴离子交换色谱(AEC)、羟基磷灰石色谱(HAC),疏水相互作用色谱(HIC),反相色谱(RPC),大小排阻色谱(SEC)和三螺旋亲和色谱(THAC),与本发明的方法的比较。这里提供了以纯化的质粒DNA的质量为指标的结果。ND表示未检测到(低灵敏度的分析方法)。
图5A和5B是显示质粒DNA在+25℃和+5℃贮存到90天的脱嘌呤和缺口率(形成开环形式的质粒)的图。
定义
“酸性”表示与酸相关或含有酸,具有小于7的pH。
“碱性”表示与碱(alkali或base)相关或含有碱,具有大于7的pH。
“连续”表示不被间断,没有间断。
“基因组DNA”表示来自或存在于染色体的DNA。
“层流”表示溶液水流中的一种流动形式,其中各个颗粒在与每个颗粒平行的方向上流动。
“裂解物”表示由细胞裂解过程产生的物质。术语“裂解”指通过使用含有裂解剂的溶液进行化学处理,使处于缓冲溶液中的细胞(即细胞悬液)的细胞壁和/或细胞膜破裂的作用。裂解剂包括,例如,碱、去污剂、有机溶剂和酶。在一个优选的实施方式中,进行细胞裂解以从宿主细胞中释放完整的质粒。
“中和”指使(溶液)称为中性或使(酸或碱(base/alkali))受到中和作用。我们用这个术语指中和溶液的某个物质将该溶液的pH变为pH5-7,优选为7左右,更优选比先前更靠近7。
“牛顿流体”(newtonian fluid)指这样的流体,其中剪应力与速度梯度成比例并垂直于剪切面。比例常数被称为粘度。牛顿流体的例子包括液体和气体。
“非牛顿流体”(Non-newtonian fluid)指这样的流体,其中剪应力不仅仅与速度梯度成比例并垂直于剪切面。非牛顿流体可能不具有确定的粘度。非牛顿流体包括塑性固体(plastic solids),幂律流体(power-law fluids),粘弹性流体(viscoelastic fluids)(兼具粘性和弹性),和时变粘度流体(time-dependent viscosity fuids)。
“质粒DNA”指一类由非染色体的环状DNA组成的小的细胞内含物,其可能具有让非内源的DNA片段插入自身的能力。如本文中所使用的,质粒DNA也可以是质粒DNA的任何形式,例如被切割、加工或其他被操作过的形式的非染色体DNA,包括,例如,下列的任一个或任意组合:缺口环状(nicked circle)质粒DNA,线性化的或线性的(linearized orlinear)质粒DNA,和单链质粒DNA。构建质粒的程序包括如Maniatis et al.,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,2d,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)中所描述的那些。本领域中熟知的一种小量制备质粒DNA的操作规程(Bimboim and Doly,Nucleic Acids Research 7:1513(1979))可以用来初步分离质粒DNA,以供后面通过本发明的某些方面来加工,并且可以和本发明的方法所生产的高度纯化样品作比较。优选地,该质粒DNA的形式是,或至少在用本发明的纯化方法制备后是,基本上闭合环状形式的质粒DNA,或大约80%,85%,90%,95%,或高于大约99%为闭合环状形式的质粒DNA。或者,超螺旋共价闭合形式的pDNA(ccc)在某些治疗方法中可能是优选的,在该方法中其可能比开环,线性或其他多种形式更为有效。因此,所述药物级质粒DNA可以从一种或多种形式的质粒分离或纯化,并且可包含一种或多种希望的形式。
对本发明而言,术语“流动”(flowing)指使液体以一定的流速(例如升每分钟)通过混合器,通常通过泵的作用。需要指出,通过混合器的流速被认为影响裂解、沉淀和混合的效率。
术语“缺口的”(nicked)和“松环的”(relaxed)指非超螺旋的DNA。“超螺旋的”(supercoiled)DNA是本领域熟知的用于描述特定的分离的质粒DNA形式的术语。质粒DNA的其他形式在本领域中也是已知。
“污染性杂质”(contaminating impunty)指希望将DNA与其分开或从其分离的任何物质。污染性杂质包括但不限于,宿主细胞蛋白质;内毒素;宿主细胞DNA,例如染色体DNA或基因组DNA;和/或宿主细胞RNA。如人们所理解的,什么是污染性杂质,或者可以认为是污染性杂质,可能取决于实施本发明的方法的具体条件。“污染性杂质”可能是或不是来自宿主细胞的,即,其可以是也可以不是宿主细胞杂质。
“分离”或“纯化”第一组分(例如DNA)指将该第一组分从最初与其一起的其他组分中富集出来。本文提供了所希望的和/或所能达到的纯化程度。
术语“基本上不含有”(essentially free)和“高度纯化的”(highlypurified)定义为大约95%,和优选地大于98.88%纯或不含污染物,或含有少于5%,和优选地少于1-2%的污染物。
“药物级DNA”(pharmaceutical grade DNA)在本文中定义为这样的DNA制备物,其含有不多于约5%,和优选地不多于大约1-2%的细胞组分,例如细胞膜。
本发明进一步包括生产和分离高度纯化的质粒DNA的方法,该质粒DNA基本上不含污染物,因此是药物级的DNA。通过本发明的方法生产和分离的质粒DNA含有极低水平,即百万分率(ppm,parts permillion)的污染性染色体DNA、RNA、蛋白质和内毒素,且主要地含有闭合环状形式的质粒DNA。根据本发明生产的质粒DNA具有足够的纯度用于研究和基于质粒的治疗方法及可选地用于人类临床试验材料和人类基因治疗试验和临床试验。
本发明的“药物级质粒DNA组合物”是指用本发明的方法生产的药物级质粒DNA组合物,和/或这样的组合物,其至少具有一种被如下定义为“药物级质粒DNA”的纯度水平。优选地,本发明的“药物级质粒DNA组合物”具有这样的纯度水平,其按照至少两种如下文提出的标准被定义为“药物级质粒DNA”,例如,少于约0.00008%的染色体或基因组DNA和少于约0.00005%的蛋白质污染物,或例如少于约0.00008%的染色体或基因组DNA和少于约0.1EU/mg的内毒素。其他纯度水平的组合也包括在该定义之下。当然,所述药物级质粒DNA组合物还可以包括或包含添加的组分,其可用于任何特定用途,包括用于组合治疗,组合物和疗法。染色体或基因组DNA,RNA,内毒素或蛋白质指来自基于细胞的质粒生产的污染物或来自纯化过程中的其他污染物。
如指出的,“药物级质粒DNA”定义为这样的DNA制备物,其包含百万分之一份或1ppm(<0.0001%,即,<0.0001mg每100mg质粒DNA)水平的,或更少的基因组DNA,RNA和/或蛋白质污染物。
同时,或更准确地,“药物级质粒DNA”在本文中可以指这样的DNA制备物,其含有少于约0.01%,或少于0.001%,且优选地少于0.0001%,或优选地少于0.00008%(<0.00008%,即<0.00008mg每100mg质粒DNA)的染色体DNA或基因组DNA。
“药物级质粒DNA”还可以指这样的DNA制备物,其含有少于约0.01%,或少于0.001%,并优选地少于0.0001%,或优选地少于0.00002%(<0.00002%,即<0.00002mg每100mg质粒DNA)的RNA污染物。
“药物级质粒DNA”还可以指这样的DNA制备物,其含有少于约0.0001%,和最优选地少于0.00005%(<0.00005%,即<0.00005mg每100mg质粒DNA)的蛋白质污染物。
“药物级质粒DNA”还可以指这样的DNA制备物,其含有少于0.1EU/mg的内毒素。
“药物级质粒DNA”在本文中指这样的DNA制备物,其优选地主要为环状形式,更准确地说,是指含有多于80%,85%,90%,95%,或多于99%的闭合环状形式质粒DNA的DNA。
“T形管”(T-tube)是指T形的管道构造,其中,该构造中形成的一条单独管道构成T形,或者多于一个的管道共同形成此种构造。T形管具有三个臂,以及三个臂结合的中心区域。T形管可以用来混合成分,因为两种流体可以分别流入T的一个臂,在中心区域汇合,并从第三臂流出。当该流体合并时就发生混合。
“湍流”是指流体颗粒在主流方向的横向上所作的不规则的随机运动,其中给定点上的速度的大小和方向无规律地变化。
“粘弹性”指兼具粘性和弹性的流体。
发明详述
本发明是基于高产率地生产药物级质粒DNA的可放大方法的发现。具体地,本发明是基于使用连续碱裂解宿主细胞产生和分离高度纯化的质粒DNA的方法的发现。
作为第一步,用质粒DNA接种,即转化指数生长期中的宿主细胞,并将其在含有抗生素例如四环素的LB培养基平板上划线。然后将平板上的单菌落分别接种到单独的无菌塑料锥形瓶(Erlenmeyer)中添加了合适的抗生素四环素的20ml LB培养基中,振荡培养器中37℃下培养12-16小时。将这些培养物中的一个接种到加有200ml灭菌的LB培养基的2L锥形瓶中。将其在37℃、200rpm的振荡培养器中培养,并用来接种两个5L的锥形瓶,将其在37℃、200rpm的振荡培养器中培养,并在5小时后,OD600nm=2单位的指数中期,用其来接种发酵容器。
宿主细胞培养和接种是本领域熟知的。一般来说,宿主细胞被培养,直至其达到高的生物量且细胞处于指数生长中,以获得大量的质粒DNA。可以使用两种不同的方法,即分批(batch)和补料分批(fed-batch)发酵。
分批发酵使得生长速率可以通过调节生长温度和所用碳源而得以控制。如本文中所用的,术语“分批发酵”是指这样的细胞培养过程,其中在接种时,所有细胞生长和细胞中所含质粒的生产所需的营养物在发酵容器中都是大大过量的(例如10倍于现有技术的浓度的营养物),因此在灭菌后加料(post-sterilization additions)之后再不需要对该无菌容器加料,也不需要复杂的补料模式和策略。
根据本发明,另外一种有用的发酵是补料分批发酵,其中通过在细胞生长过程中对培养物添加营养物而控制细胞生长速度。如本文中使用的,“补料分批发酵”是指这样的细胞培养过程,其中通过在发酵过程中在仔细监控下向培养物添加代谢物,来控制生长速率。根据本发明,补料分批发酵可以使细胞培养物达到比分批发酵更高的生物量。
下面描述发酵过程的示例和示例性的补料速率,其用于50L的制备。但是,其他容量,例如10L,50L,或高于500L,都可以使用下面描述的示例性补料速率来进行,取决于设备的规模。
高度营养强化的分批培养基和补料分批培养基发酵适合于产生高细胞密度的培养物,以使特定的质粒产率最大化,并使得还在指数生长期中便回收高的生物量称为可能。
补料分批发酵使用葡萄糖或甘油作为碳源。发酵以分批模式进行,至少初始的碳底物(葡萄糖)被耗尽。这个点表现为溶氧(DO)急剧上升,并可通过上述情况发生后立即取样作葡萄糖分析来确认。然后,事先准备好的补料培养基泵开始工作。泵的速率由Curless等(Bioeng.38:1082-1090,1991)的模型来确定,上述文献的全文被引入本文供参考。该模型被设计来帮助控制补料分批发酵的补料阶段。在开始的分批过程中,非抑制性浓度的底物被以其最大比生长速率生长的细胞所消耗,使得接种后生物量水平快速地提高。由于有毒的代谢物的积累(Fieschio et al.,Fermentation Technology Using RecombinantMicroorganisms.″In Biotechnology,eds.H.J.Rhem and G.Reed.Weinheim:VCH Verlagsgesellschaft mbH 7b:117-140,1989)该培养物不能无限地以该速率生长。为了实现持续的对数生长,该模型根据操作者的设定,计算生长限制性碳底物的基于时间的补料速率,在不需要反馈控制的条件下,达到生长的补料分批阶段。该速率选择为这样的水平,其不引起抑制性代谢物的积累,又足以提供高的生物量。
一般而言,在应用分批发酵高水平(例如,比现有技术高4倍的浓度)的前体存在于富集的分批培养基中。尤其是分批培养基中的酵母提取物的量从5g/l(as in LB培养基)富集到20g/l,这样就提供了极大量的生长因子和核酸前体。培养基还添加了硫酸铵(5g/l)作为有机氮源。补料分批发酵设计为在补料过程中添加前体(硫酸铵形式的有机氮源),以避免对质粒的质量产生有害影响。
根据本发明的方法的一个重要方面是细胞裂解。因此,本发明包括生产和分离高度纯化的质粒DNA的方法,其包括细胞裂解步骤,其中存在(a)湍流装置,用于快速混合细胞悬液(图1中的溶液1)和裂解细胞的溶液(图1中的溶液2);和(b)层流装置,使得(a)中形成的混合物可以在没有显著扰动的状态下温育,其中(a)中形成的混合物从湍流装置中流入层流装置中。
根据本发明的一个实施方式,该机构还可包括加入第二溶液(图1中的溶液3)的装置,所述第二溶液中和上述裂解溶液;其中(b)中温育的混合物从所述层流装置流入该加入第二溶液的装置。
在另一个实施方式中,该机构可用于从细胞中分离质粒DNA的方法,该方法包括(a)在所述湍流装置中将细胞与碱性裂解溶液混合;和(b)加入酸性溶液来中和所述碱性裂解溶液。
尽管目前有多种方法用于裂解细菌细胞,但这些方法都没有涉及流体的粘弹性质和混合步骤中牵涉的剪切力所引起的问题。本发明的一个目的是,使用T形管,在粘弹性流体出现之前,均匀地且非常快速地混合细胞悬液(溶液1)和碱溶液(溶液2)。因此,根据本发明的连续裂解提供了限制剪切力的重要优点。T形管一般具有小直径的管道,通常直径小于1cm,优选2到8mm左右,更优选6mm左右,以增加被混合溶液的接触时间,但该方法并没有利用流过该管而导致的混合。下面的表1显示了湍流装置和层流装置的B1a,B1b,B2参数的变化,以及它们的如图1所示的相应流速S1、S2和S3。
表1
本发明的另一个目的是具有非T形管的混合器或喷射器,其使细胞能够被悬浮到裂解溶液中。由此,与流体在槽中被例如浆搅拌时相比,对通过管的流体的机械应力大大减小。初始的混合效率造成后面几秒钟中效率更高,因为该流体还没有粘弹性,而且小直径管所实现的混合是非常高效的。相反,当T形管被用来混合时,初始的混合只是中度的,而流体很快变成粘弹性,使得在管中流动时产生显著的问题。不完全的混合造成只有一部分细胞被裂解,因为在中和之前只能释放一部分的质粒。
根据本发明,我们在裂解过程中确定了两个阶段,命名为阶段I和阶段II。这两个阶段对应于I)细胞的裂解和II)核酸的变性,引起流变学行为的重大变化,从而形成粘弹性流体。调节管的直径使得满足这两个阶段的要求成为可能。在小直径管(B1a)中,混合被增加。这是用于阶段I的构造。在大直径的管(B1b)中,混合(从而剪切力)被减少。这是用于阶段II的构造。
于是,我们使用一种称为M1的混合器,其如图2所绘。任何T形的设备都可以用来根据本发明提供细胞悬液。使用该混合器,溶液1被通过一个或多个小直径的孔逆流向地注射到碱裂解溶液中以获得高效的分散。这些孔的直径为0.5mm到2mm左右,在所绘的构造中优选为大约1mm。
该混合物从M1混合器出来后以短暂的时间(大约2.5秒)通过小直径的管。可以容易地计算直径和流动时间的组合以维持湍流。表1提供了这些参数的变化的例子。所有提到管直径的地方都是提供的管内径,而不是包括管壁本身厚度的外径。在管中短暂的停留时间使溶液1和2能极快地混匀。如果假设溶液1和2在阶段I中仍是牛顿流体,则在混匀的过程中流动模式是湍流。在从该管出来时,溶液1和2被混匀,并且悬液中开始细胞裂解。
然后,混匀的混合物通过具有大得多的直径的第二管(B1b),在该管中发生细胞裂解和粘弹性流体的形成。在这个阶段中,混合可能被最小化,且该溶液可能被“停止”(rest)以最大限度地限制湍流,从而最小限度地减小任何可能将gDNA片段化的剪切力。在本发明的一个实施方式中,大约1到3分钟,2分钟左右,优选1分20秒的接触时间就足以完成细胞裂解和使核酸变性。在变性阶段中,流体的流动模式是层流,推动SDS和氢氧化钠缓慢地向细胞组分扩散。
然后,由此得到的裂解物和中和溶液3通过称为M2的Y形混合器被混合。在本发明的一个实施方式中,所述Y形混合器的内径是4到15min左右,或6到10mm左右。小直径的管(例如,大约6mm的管)位于Y形混合器的出口处使所述裂解物和溶液3得以快速(<1秒)和高效地混合。然后,中和的溶液被收集到收集槽(harvesting tank)中。在中和过程中,pH的快速降低诱使絮凝物形成(即形成团或块)。另一方面,部分变性的质粒极快地复性并留在溶液中。絮凝物在收集槽中逐渐沉淀,同时带走大部分污染物。
图1中的示意图显示了所述连续裂解(CL)系统的一个实施方式。连续裂解可以独立地使用或与其他的过程一起使用。
本发明的方法可以用于裂解任何种类的细胞(即原核和真核细胞),以实现裂解相关的任何目的,例如从目标细胞中释放要加以纯化的所需质粒。在一个优选的实施方式中,本发明的方法用于裂解含有质粒的宿主细胞以释放质粒。
根据本发明的连续碱裂解步骤的过程可以对从发酵中收集的细胞进行,所述发酵已被培养成尚未达到静止期,因而还在指数生长中的细胞的生物质(2-10g干重/升)。所述连续碱裂解步骤的过程还可以对从这样的发酵中收集的细胞进行,所述发酵已被培养成已不再处于指数生长中,而是达到静止期的细胞的高生物质,其细胞浓度为大约10-200g干重每升,优选12-60g干重每升。
本发明的另一个重要的方面是高度纯化的质粒DNA组合物和药物级质粒DNA组合物,其通过组合的色谱步骤制备,所述组合的色谱步骤可以和也可以不和前述的细胞裂解方面结合。因此,本发明进一步涵盖,或者说还包括,生产和分离高度纯化的质粒DNA的方法,所述质粒DNA是基本上不含污染物,因此是药物级的DNA。通过本发明的方法生产和分离的质粒DNA含有极低水平,即百万分率(ppm)的污染性染色体DNA、RNA、蛋白质和内毒素,并且主要地含有闭合环状形式的质粒DNA。根据本发明生产的质粒DNA具有足够的纯度以用于研究和基于质粒的治疗方法。如上面指出的,本发明的药物级质粒DNA组合物可以,在一个方面,由相对于一种或多种典型的污染物,例如宿主细胞污染物的纯度水平来限定。因此,本发明的药物级质粒DNA组合物可以是这样的组合物,其包含百万分之一份或1ppm(<0.0001%,即,<0.0001mg每100mg质粒DNA)水平的,或更少的基因组DNA,RNA和/或蛋白质污染物。或更准确地,药物级质粒DNA可包含这样的质粒DNA制备物,其含有少于约0.01%,或少于0.001%,且优选地少于0.0001%,或优选地少于0.00008%(<0.00008%,即<0.00008mg每100mg质粒DNA)的染色体DNA或基因组DNA。药物级质粒DNA还可以包含这样的质粒DNA制备物,其含有少于约0.01%,或少于0.001%,并优选地少于0.0001%,或优选地少于0.00002%(<0.00002%,即<0.00002mg每100mg质粒DNA)的宿主细胞RNA污染物。“药物级质粒DNA”还可以包含这样的质粒DNA制备物,其含有少于约0.0001%,和最优选地少于0.00005%(<0.00005%,即<0.00005mg每100mg质粒DNA)的蛋白质污染物。药物级质粒DNA还可以包括这样的质粒DNA制备物,其含有少于0.1EU/mg的内毒素。特别地,上述纯度水平的至少2种,或至少3种,或至少4种的任意组合也包括在本发明中。因此,具有少于约0.01%的宿主细胞基因组DNA和少于约0.001%的宿主细胞RNA的可检测水平的组合物可以包括在本发明中。最优选地,所述药物级质粒DNA组合物可以具有少于约0.00008%的宿主细胞基因组DNA和少于约0.00002%的宿主细胞RNA及少于约0.00005%的宿主细胞蛋白质。事实上,上面指出的纯度水平的任意组合都可以用于本发明下的任意具体的药物级质粒DNA组合物。所述组合物还可以包含其他药学上可接受的组分、缓冲液、稳定剂、或用于提高基因转移,尤其是质粒DNA转移进入细胞或生物体的化合物。
在另一个方面中,本发明的方法包括三螺旋亲和色谱的使用,在所述三螺旋亲和色谱之前或之后使用另外至少一种色谱技术,可选地或通常地,三螺旋亲和色谱作为最后的纯化步骤,或者至少在质粒纯化方案的末尾或靠近末尾处使用。三螺旋亲和色谱优选地和离子交换色谱、疏水相互作用色谱和凝胶渗透或称大小排阻色谱中的一种或多种组合使用。其他技术包括羟基磷灰石(I型和II型)色谱、反相色谱和亲和色谱。任何可获得的涉及核酸分离的亲和色谱操作规范都可以适用。阴离子交换色谱或所用的任意一种或多种其他的色谱步骤或技术可以使用固定相,顶替色谱方法,模拟移动床(simulated movingbed)技术,和/或连续床(continuous bed)柱或系统。另外,所述步骤或技术中的任意一个或多个可以使用高效(high performance)色谱技术或系统。
因此,本发明的方法包括纯化步骤,所述纯化步骤包含三螺旋亲和色谱和进一步的离子交换色谱步骤,进一步还可以包含疏水相互作用色谱或凝胶渗透色谱。所述离子交换色谱步骤可以是流化床离子交换色谱和轴向和/或径向高分辨阴离子交换色谱。
本发明的方法因此包含本文描述的碱裂解步骤以及后续依次的离子交换色谱、三螺旋亲和色谱和疏水相互作用色谱步骤。第一个色谱步骤前可以有过滤裂解物或者其他去除絮凝物的步骤。本文中描述的本发明的质粒纯化方法是可以放大的,因此适合于放大和大规模生产。
在本发明的一些实施方式中,连续裂解可以和另外的纯化步骤结合起来以产生含有pDNA的高纯度产品。例如,其可以和絮凝物去除(例如裂解物过滤,沉降,或离心)、离子交换色谱(例如阳离子或阴离子交换),三螺旋(triplex)亲和色谱,和疏水相互作用色谱中的至少一种组合。在一个实施方式中,连续裂解后面依次是阴离子交换色谱,三螺旋亲和色谱和疏水相互作用色谱。在另一个实施方式中,连续裂解后面依次是裂解物过滤,阴离子交换色谱,三螺旋亲和色谱和疏水相互作用色谱。使用这些步骤可以实现真正的可放大质粒制备过程,该过程可以制备具有前所未有的纯度的大量pDNA。宿主DNA、RNA和蛋白质在ppm以下的范围。
本发明的方法还可以进一步使用大小排阻色谱(SEC)、反相色谱、羟基磷灰石色谱和/或其他可获得的色谱技术、方法或系统,与本文描述的根据本申请的步骤组合。
可以进行絮凝物去除来提高所得pDNA产品的纯度。该步骤可以用来去除大部分沉淀的物质(絮凝物)。进行絮凝物去除的机制之一是通过裂解物过滤步骤,例如通过1到5mm,优选3.5mm的栅网过滤器(grid filter),然后进行深层过滤(depth filtration)作为精滤步骤。其他进行絮凝物去除的方法是通过离心或沉降(settling)。
可以使用离子交换色谱来提高所得pDNA产品的纯度。取决于污染物的性质和溶液的pH,可以选择阴离子交换色谱。
可以使用阴离子交换色谱来提高所得pDNA产品的纯度。阴离子交换色谱通过将带负电的(或酸性的)分子结合到带正电的支持物上而起作用。由此,使用离子交换色谱可以使分子基于它们的电荷被分离。通过这种技术,可以容易地分开不同家族的分子(酸性的,碱性的和中性的)。可以使用分步洗脱,其中许多污染物在较早洗脱的级分中洗脱,而pDNA在较晚的级分中洗脱。阴离子交换能非常高效地将蛋白质和内毒素从pDNA制备物中去除。
对于离子交换色谱而言,填料和制备填料的方法,以及制备、聚合和官能化(functionalizing)阴离子交换色谱的过程,以及通过其洗脱和分离质粒DNA的过程在本领域都是公知的。
用于合成阴离子交换色谱填料所用基材的化合物可以是任何化合物,前提是该基材合成后可以通过后反应(post reaction)引入多种显示疏水性的官能团或多种离子交换基团。单官能(monofunctional)的单体的例子包括苯乙烯、邻(o-)卤甲基苯乙烯,间(m-)卤甲基苯乙烯,对(p-)卤甲基苯乙烯,o-卤烷苯乙烯,m-卤烷苯乙烯,p-卤烷苯乙烯,α-甲基苯乙烯,α-甲基-邻卤甲基苯乙烯,α-甲基-间卤甲基苯乙烯,α-甲基-对卤甲基苯乙烯,α-甲基-邻卤烷基苯乙烯,α-甲基-间卤烷基苯乙烯,α-甲基-对卤烷基苯乙烯,邻羟甲基苯乙烯,间羟甲基苯乙烯,对羟甲基苯乙烯,邻羟烷基苯乙烯,间羟烷基苯乙烯,对羟烷基苯乙烯,α-甲基-邻羟甲基苯乙烯,α-甲基-间羟甲基苯乙烯,α-甲基-对羟甲基苯乙烯,α-甲基-邻羟烷基苯乙烯,α-甲基-间羟烷基苯乙烯,α-甲基-对羟烷基苯乙烯,甲基丙烯酸缩水甘油酯,丙烯酸缩水甘油酯,丙烯酸羟乙基酯,羟甲基丙烯酸酯,和乙酸乙烯。最优选的化合物是芳环上取代的卤烷基基团,卤素例如Cl,Br,I和F以及碳原子数2-15的直链和/或分枝的饱和烃。多官能的单体的例子包括二乙烯基苯,三乙烯基苯,二乙烯基甲苯,三乙烯基甲苯,二乙烯基萘,三乙烯基萘,二甲基丙烯酸乙二醇酯,二丙烯酸乙二醇酯,二甲基丙烯酸二乙二醇酯,二丙烯酸二乙二醇酯,亚甲基双甲基丙烯酰胺,和亚甲基双丙烯酰胺。
通过后反应可以引入多种离子交换基团。所述基材的制备包括:第一步,称取合适比例的单官能单体和多官能单体,并加入精确称取的、用于调节形成的颗粒的孔的稀释剂或溶剂,和类似地精确称取的聚合引发剂,然后充分搅拌。然后将该混合物进行水包油(oil-in-water)型悬浮聚合,其中将该混合物加入到溶解有实现精确称取的悬液稳定剂的水溶液中,用搅拌器混合形成具有目标大小的油滴,通过逐渐对混合溶液加温来进行聚合。单官能单体对多官能单体的比一般为1mol左右的单官能单体和0.01-0.2mol左右的多官能单体,以得到软颗粒的基材。聚合引发剂也不是具体限制的,常用的偶氮二型(azobis type)和/或过氧化物型都可以使用。
也可以用悬液稳定剂,例如离子型表面活性剂,非离子型表面活性剂,具有两亲性质的聚合物,及其混合物,来防止油滴自身的聚集。
要用作纯化质粒DNA的离子交换色谱的填料,优选地具有相对较大的孔径,特别是在1500-4000埃的范围内。对基材进行表面改性以引入离子交换基团在本技术领域内是众所周知的。
离子交换色谱可以使用两种洗脱液。可以使用含有低浓度的盐的第一洗脱液和含有高浓度的盐的第二洗脱液。洗脱方法是基于逐步地从第一洗脱液转换到第二洗脱液,而梯度洗脱方法是基于将组成从第一洗脱液连续地改变为第二洗脱液。可以使用离子交换色谱洗脱液中一般使用的缓冲液和盐。对于含低浓度盐的第一洗脱液,特别优选具有10到50mM的缓冲液浓度,pH值为6到9的水溶液。对于含高浓度盐的第一洗脱液,特别优选洗脱液C中加入0.1到2M钠盐的水溶液。钠盐可以使用氯化钠和硫酸钠。
另外,可以使用二价金属离子螯合剂,例如乙二胺四乙酸,来抑制大肠杆菌裂解物中DNA降解酶造成的质粒降解。二价金属螯合剂的浓度优选为0.1到100mM。
有很多种商品化的阴离子交换基质可适用于本发明,包括但不限于那些可从POROS Anion Exchange Resins、Qiagen、Toso Haas、Sterogene、Spherodex、Nucleopac和Pharmacia获得的。例如,柱(PorosII PI/M,4.5mm x 100)首先用pH7.5的20mM Bis/TRIS Propane及0.7M NaCl平衡。加载样品并用相同的初始溶液冲洗。然后使用25个柱体积从0.5M到0.85M NaCl的洗脱梯度并收集级分。优选的阴离子交换色谱包括Fractogel TMAE HiCap。
根据所述分离和纯化质粒DNA的方法的一个优选的实施方式,本发明涉及分离和纯化核酸和/或质粒DNA的方法,其联合使用离子交换色谱和三螺旋色谱以高效地获得大量高纯度的核酸。
三螺旋亲和色谱在专利US 6,319,672,6,287,762以及本申请人的公开号WO02/77274的专利申请,以及其他地方得到描述。
三螺旋亲和色谱是基于寡核苷酸和双链DNA中目标序列的特异性杂交。这些寡核苷酸可以含有下面的碱基:
-胸腺嘧啶(T),其可与双链DNA的A.T对(A.T doublets)形成三联体(triplets)(Rajagopal et al.,Biochem 28(1989)7859);
-腺嘌呤(A),其可与双链DNA的A.T对形成三联体;
-鸟嘌呤(G),其可与双链DNA的G.C对形成三联体;
-质子化胞嘧啶(C+),其可与双链DNA的G.C对形成三联体(Rajagopal et al.,loc.cit.);
-尿嘧啶(U),其可与A.U或A.T碱基对形成三联体。
优选地,所使用的寡核苷酸包含富含胞嘧啶的同型嘧啶序列,且所述DNA中的特定序列是同型嘌呤-同型嘧啶序列。胞嘧啶的存在使得可以具有这样的三螺旋:其在胞嘧啶质子化的酸性pH下稳定,而在胞嘧啶中性化的碱性pH下去稳定。
寡核苷酸和DNA中的特定序列优选地互补以形成三螺旋。使用完全互补的寡核苷酸和DNA中的特定序列可以获得最好的产率和最好的选择性。例如,寡核苷酸聚(CTT)和特异序列聚(GAA)。优选的寡核苷酸具有序列5′-GAGGCTTCTTCTTCTT CTTCTTCTT-3′(GAGG(CTT)7(SEQ ID NO:1),其中碱基GAGG并不形成三螺旋,而是使该寡核苷酸与交联臂(CTT)7序列间隔开;这些寡核苷酸可以和含有互补单位的特定序列(GAA)形成三螺旋。所讨论的序列可以,特别地,是含有7,14或17个GAA单位的区域,如实施例中所描述的。
另一个特别感兴趣的序列是序列5′-AAGGGAGGGAGGAGAGGAA-3′(SEQ ID NO:2)。该序列与寡核苷酸5′-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3′(SEQ ID NO:3)或5′-TTGGTGTGGTGGGTGGGTT-3′(SEQ ID NO:4)形成三螺旋。此时,该寡核苷酸反向平行地结合与该多聚嘌呤链。这些三螺旋只有在Mg2+的存在下才是稳定的(Vasquez et al.,Biochemistty,1995,34,7243-7251;Beal and Dervan,Science,1991,251,1360-1363)。
如上所述,所述特定序列可以是所述双链DNA中天然存在的序列,也可以是人为导入到后者的合成序列。特别有利的是使用可以与所述双链DNA中天然存在的序列,例如质粒复制起来或标记基因,形成三螺旋的寡核苷酸。关于这一点,通过序列分析已经得知,这些DNA的一些区域,特别是在复制起点区域中,可以具有同型嘌呤-同型嘧啶区域。通过合成可以和这些天然同型嘌呤-同型嘧啶区域形成三螺旋的寡核苷酸,可以将本发明的方法应用于未修饰的质粒,特别是商品化质粒例如pUC,pBR322,pSV之类的质粒,这是有利的。在双链DNA中天然存在的同型嘌呤-同型嘧啶序列中,有这样的序列,其包含大肠杆菌质粒ColE1的复制起点中5′-CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3′(SEQ ID NO:5)序列的全部或部分。对于该序列,形成三螺旋的寡核苷酸具有下列序列:5′-GAAGGGCTTCCCTCTTTCC-3′(SEQ ID NO:6),并交替地结合双螺旋的两条链,如Beal和Dervan(J.Am.Chem.Soc.1992,114,4976-4982)Jayasena和Johnston所述。还有质粒pBR322β-内酰胺酶基因的5′-GAAAAAGGAAGAG-3′(SEQ ID NO:7)序列(Duval-Valentin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1992,89,504-508)。
已经在ColE1质粒和pCOR质粒的复制起点中鉴定了可以和特定的寡核苷酸形成三螺旋的合适的目标序列。pCOR质粒是具有条件性复制起点的质粒,其在US 2004/142452和US 2003/161844以及其他地方得以描述。ColE1源的质粒含有12体同型嘌呤序列(5′-AGAAAAAAAGGA-3′)(SEQ ID NO:8),其定位于参与质粒复制的RNA-II转录本的上游(Lacatena et al.,1981,Nature,294,623)。该序列与12体互补寡核苷酸5′-TCTTTTTTTCCT-3′(SEQ ID NO:9)形成稳定的三螺旋结构。pCOR骨架含有一段14个非重复碱基的同型嘌呤序列(5′-AAGAAAAAAAAGAA-3′)(SEQ ID NO:10),其位于pCOR γ复制起点富含A+T的片段中(Levchenko et al.,1996,Nucleic Acids Res.,24,1936)。该序列与14体互补寡核苷酸序列5′-TTCTTTTTTTTCTT-3′(SEQ ID NO:11)形成稳定的三体结构。相应的寡核苷酸5′-TCTTTTTTTCCT-3′(SEQ ID NO:8)和5′-TTCTTTTTTTTCTT-3′(SEQ ID NO:11)高效地并特异地靶向其位于ColEl ori or pCOR(oriγ)中的各自的互补序列。事实上,单个不规则的三联体(T*GC或C*AT)就可能造成整个三螺旋结构(triplex structure)失去稳定。
使用可与复制起点或标记基因中的序列形成三螺旋的寡核苷酸是特别有利的,因为由此就有可能使用相同的寡核苷酸来纯化任何还有所述复制起点或标记基因的DNA。因此,就不需要修饰该质粒或双链DNA来掺入人工的特定序列了。
尽管优选完全互补的序列,应当理解,所述寡核苷酸和所述DNA中的序列之间的一些错配是可以容忍的,只要这些错配不损失太大的亲和性。例如大肠杆菌β-内酰胺酶序列5′-AAAAAAGGGAATAAGGG-3′(SEQ ID NO:12)。该序列中,打断多聚嘌呤序列的胸腺嘧啶可以被第三条链中的鸟嘌呤所识别而形成G*TA三联体,当该三联体被两个T*AT三联体侧翼包夹是,它是稳定的(Kiessling et al.,Biochemistry,1992,31,2829-2834)。
根据一个具体的实施方式,本发明的寡核苷酸包括序列(CCT)n,序列(CT)n或序列(CTT)n,其中n是1到15之间的整数,包括1和15。使用(CT)n或(CTT)n型序列是特别有利的。本申请人证明,事实上,纯化产率受寡核苷酸中C的量的影响。特别地,如实施例7所示,当该寡核苷酸含有较少量的胞嘧啶时,纯化产率增加。应当理解的是本发明的寡核苷酸也可以结合(CCT)、(CT)或(CTT)单位。
所用的寡核苷酸可以是天然的(包含未修饰的天然碱基)或化学修饰的。特别地,该寡核苷酸可以有利地具有特定的化学修饰,以增加其针对核酸酶的抗性或保护作用,或针对所述特定序列的亲和性。寡核苷酸还被理解为指任何连接起来的连续的核苷,其骨架受到修饰以增加其对核酸酶的抗性。可能的修饰包括,例如,可以和DNA形成三螺旋的寡核苷酸硫代磷酸酯(Xodo et al.,Nucleic Acids Res.,1994,22,3322-3330),以及具有甲缩醛(formacetal)或膦酸甲基酯骨架的寡核苷酸(Matteucci et al.,J.Am.Chem.Soc.,1991,113,7767-7768)。还可以使用用核苷酸的α异头物合成的寡核苷酸,其也与DNA形成三螺旋(Le Doan et al.,Nucleic Acids Res.,1987,15,7749-7760)。另一种骨架修饰是氨基磷酸酯键。例如,Gryaznov和Chen描述的核苷酸间N3′-p5′氨基磷酸酯键,其产生可以和DNA形成特别稳定的三螺旋的寡核苷酸(J.Am.Chem.Soc.,1994,116,3143-3144)。其他骨架修饰中,还包括核糖核苷酸、2′-O-甲基核糖、磷酸二酯等(Sun and Hèlène,Curr.Opinion Struct.Biol.,116,3143-3144)。最后,还可以如PNA(肽核酸,peptide nucleic acid)中那样,用聚酰胺骨架取代基于磷的骨架,其也可以形成三螺旋(Nielsen et al.,Science,1991,.254.,1497-1500;Kim etal.,J.Am.Chem.Soc.,1993,115,6477-6481)或者如DNG中那样用基于胍的骨架(脱氧核糖核酸胍(deoxyribonucleic guanidine),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1995,92,6097-6101)来取代,或者用多阳离子的DNA类似物来取代,其也形成三螺旋。
第三条链的胸腺嘧啶也可以用5-溴尿嘧啶来代替,其增加该寡核苷酸对DNA的亲和性(Povsic and Dervan,J.Am.Chem.Soc.,1989,111,3059-3061)。第三条链还可以包含非天然的碱基,其中有7-脱氮-2’-脱氧黄嘌呤核苷(7-deaza-2′-deoxyxanthosine)(Milligan et al.,NucleicAcids Res.,1993,21,327-333),1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-甲基-5-氨基-1H-吡唑[4,3-d]-嘧啶-7-酮(1-(2-deoxy-β-D-ribofuranosyl)-3-methyl-5-amino-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-7-one)(Koh and Dervan,J.Am.Chem.Soc.,1992,114,1470-1478),8-氧代腺嘌呤(8-oxoadenine),2-氨基嘌呤,2’-O-甲基-假同胞苷(2′-O-methyl-pseudoisocytidine),或其他本领域技术人员知晓的修饰(参见Sun和Hélène,Curr.Opinion Struct.Biol.,1993,3,345-356的综述)。
另外一种寡核苷酸修饰的目的是,更特别地,提高寡核苷酸和特定序列的相互作用和/或亲和性。特别地,根据本发明的最有利的修饰是基于寡核苷酸的胞嘧啶的甲基化。这样甲基化的寡核苷酸显示出引人注意的性质:其在更接近中性的pH范围(≥5)与所述特定序列形成稳定的三螺旋。这样就可以比现有技术的寡核苷酸在更高的pH值下工作,也就是说,在质粒DNA降解的风险小得多的pH值下工作。
本发明的方法中使用的寡核苷酸的长度为5-30。优选地使用长度超过10个碱基的寡核苷酸。本领域的技术人员可以改变该长度以适应所需的相互作用的选择性和稳定性。
根据本发明的寡核苷酸可以用任何已知的技术来合成。特别地,它们可以使用核酸合成仪来合成。显然,可以使用任何本领域技术人员已知的方法。
为使其可以共价交联到支持物上,寡核苷酸一般要官能化。因此,它可以在5’或3’位被硫醇、胺或羧基末端基团修饰。特别地,通过添加硫醇、胺或羧基基团,从而可以,例如,将该寡核苷酸交联到带有二硫化物、马来酰亚胺、胺、羧基、酯、环氧化物、溴化氰或醛官能的支持物上。这些交联是通过在该寡核苷酸和该支持物之间建立二硫键、硫醚键、酯键、酰胺键或胺键而形成的。可以使用本领域技术人员已知的任何其他方法,例如双功能交联剂。
另外,为了促进与交联的寡核苷酸的杂交,该寡核苷酸可能有利地含有“手臂”(arm)或“间隔物”(spacer)。使用手臂,可以与支持物相隔选择的距离来结合所述寡核苷酸,从而改善其与DNA相互作用的条件。该手臂较优地由包含1到18个,优选6或12个(CH2)基团的线性碳链,和使得该手臂能够结合到柱的胺组成。该手臂连接到该寡核苷酸或“间隔物”的磷酸上,所述“间隔物”包含不干扰杂交的碱基。例如,该“间隔物”可以包含嘌呤碱基。例如,该“间隔物”可包含序列GAGG。所述手臂较优地包含线性碳链,其包括6或12个碳原子。
三螺旋亲和色谱去除RNA和基因组DNA是非常高效的。它们可以是官能化的色谱支持物,散装的(bulk)或预装填在柱中,官能化的塑料表面或官能化的乳胶珠,磁性的或其他的。优选色谱支持物。例如,可以使用的色谱支持物有琼脂糖,丙烯酰胺或葡聚糖以及其衍生物(例如Sephadex、Sepharose、Superose等),聚合物例如聚(乙烯基苯/二乙烯基苯),或接枝的或非接枝的二氧化硅。色谱柱可以在扩散(diffusion)或灌注(perfusion)模式下工作。
为了获得更好的纯化产率,特别有利的是,在质粒上使用含有数个与所述寡核苷酸杂交的位置的序列。事实上,多个杂交位置的存在促进所述序列和所述寡核苷酸之间的相互作用,从而提高纯化产率。因此,对于具有n个重复的(CCT),(CT)或(CTT)基序(motifs)的寡核苷酸,优选使用含有至少n个互补基序的DNA序列,并优选含有n+1个互补基序。由此,带有n+1个互补基序的序列可提供2个与所述寡核苷酸杂交的位置。有利的是,所述DNA序列含有多达11个杂交位置,也就是说含有n+10个互补基序。
根据本发明的方法可以用来纯化任何种类的双链DNA。后者的例子有环状DNA,例如质粒,其一般带有一个或多个具有治疗上的重要性的基因。该质粒还可以含有复制起点,标记基因,诸如此类。本发明的方法还可以直接应用于细胞裂解物。在这个实施方式中,通过转化然后细胞培养而扩增的质粒在细胞裂解后被直接纯化。本发明的方法还可以应用于澄清的(clear)裂解物,也就是中和并离心细胞裂解物后所得的上清。很明显,它还可以应用于用已知方法预纯化的溶液。该方法还可以从含有不同序列的DNA的混合物中将带有重要序列的线性或环状DNA纯化出来。根据本发明的方法还可以用来纯化双链DNA。
所述细胞裂解物可以是原核或真核细胞的裂解物。
原核细胞的例子有大肠杆菌,枯草芽孢杆菌(B.subtilis),鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)或链霉菌(Strepomyces)等细菌。真核细胞的例子有动物细胞,酵母,真菌,诸如此类,更具体地有克鲁维酵母属(Kluyveromyces)或糖酵母属(Saccharomyces)的酵母或COS,CHO,C127,NIH3T3及诸如此类的细胞。
至少包含三螺旋亲和色谱步骤的本发明的方法可以用来提高所得pDNA产品的纯度。三螺旋亲和色谱中,寡核苷酸结合于支持物,例如色谱树脂或其他基质。然后将纯化中的样品与结合的所述寡核苷酸混合,例如通过将该样品施加到含有结合于色谱树脂的所述寡核苷酸的色谱柱。样品中所希望的质粒将结合到该寡核苷酸,形成三联体。该寡核苷酸和该质粒之间的键可以是Hoogsteen键。这一步可以在pH≤5,高盐浓度下接触20分钟或更长的时间。可以使用清洗步骤。最后,在中性缓冲液中发生胞嘧啶去质子化,从而将质粒从结合寡核苷酸的树脂上洗脱下来。
根据最优选的实施方式,所述分离和纯化核酸和/或质粒DNA的方法包含离子交换色谱,三螺旋亲和色谱,和疏水相互作用色谱的组合。
疏水相互作用色谱使用基质上的疏水部分来吸引要纯化样品中的分子的疏水区域。要指出的是,这些HIC支持物依靠“聚集”(clustering)效应来工作,当这些分子结合时,没有共价键或离子键的形成或共享。疏水相互作用色谱是有利的,因为其非常高效地去除开环形式的质粒和其他污染物,例如gDNA、RNA和内毒素。
疏水相互作用色谱基材的合成,以及制备、聚合和官能化疏水相互作用色谱,和通过其洗脱和分离质粒DNA的方法在本领域是公知的,其在美国专利号:6,441,160中及他处被描述,美国专利号:6,441,160被并入本文作为参考。
用于合成疏水相互作用色谱填料所用基材的化合物可以是任何化合物,前提是该基材合成后可以通过后反应引入多种显示疏水性的官能团或多种离子交换基团。单官能(monofunctional)的单体的例子包括苯乙烯、邻卤甲基苯乙烯,间卤甲基苯乙烯,对卤甲基苯乙烯,o-卤烷苯乙烯,m-卤烷苯乙烯,p-卤烷苯乙烯,α-甲基苯乙烯,α-甲基-邻卤甲基苯乙烯,α-甲基-间卤甲基苯乙烯,α-甲基-对卤甲基苯乙烯,α-甲基-邻卤烷基苯乙烯,α-甲基-间卤烷基苯乙烯,α-甲基-对卤烷基苯乙烯,邻羟甲基苯乙烯,间羟甲基苯乙烯,对羟甲基苯乙烯,邻羟烷基苯乙烯,间羟烷基苯乙烯,对羟烷基苯乙烯,α-甲基-邻羟甲基苯乙烯,α-甲基-间羟甲基苯乙烯,α-甲基-对羟甲基苯乙烯,α-甲基-邻羟烷基苯乙烯,α-甲基-间羟烷基苯乙烯,α-甲基-对羟烷基苯乙烯,甲基丙烯酸缩水甘油酯,丙烯酸缩水甘油酯,丙烯酸羟乙基酯,羟甲基丙烯酸酯,和乙酸乙烯。最优选的化合物是芳环上取代的卤烷基基团,卤素例如Cl,Br,I和F以及碳原子数2-15的直链和/或分枝的饱和烃。
多官能的单体的例子包括二乙烯基苯,三乙烯基苯,二乙烯基甲苯,三乙烯基甲苯,二乙烯基萘,三乙烯基萘,二甲基丙烯酸乙二醇酯,二丙烯酸乙二醇酯,二甲基丙烯酸二乙二醇酯,二丙烯酸二乙醇酯(diethylene glycol diacrylate),亚甲基双甲基丙烯酰胺,和亚甲基双丙烯酰胺(methyl enebisacry lamide)。
通过后反应可以引入多种疏水功能基团或多种离子交换基团。为了最大程度地减小基材本身表现的疏水性导致的对要分离的目标产物的影响,或者由于盐浓度和pH值变化导致的基材本身的膨胀或萎缩,优选地用相对亲水的单体,例如甲基丙烯酸缩水甘油酯,丙烯酸(acrylate)缩水甘油酯,丙烯酸羟乙基酯,羟甲基丙烯酸酯和乙酸乙烯来制备基材。所述基材的制备包括:第一步,称取合适比例的单官能单体和多官能单体,并加入精确称取的、用于调节形成的颗粒的孔的稀释剂或溶剂,和类似地精确称取的聚合引发剂,然后充分搅拌。然后将该混合物进行水包油型悬浮聚合,其中将该混合物加入到溶解有实现精确称取的悬液稳定剂的水溶液中,用搅拌器混合形成具有目标大小的油滴,通过逐渐对混合溶液加温来进行聚合。
单官能单体对多官能单体的比一般为1mol左右的单官能单体和0.01-0.2mol左右的多官能单体,以得到软颗粒的基材。多官能单体的比例可以增加到0.2到0.5mol左右以获得硬颗粒的基材。还可以只使用多官能单体来获得更硬的颗粒。
聚合引发剂也不是具体限制的,常用的偶氮二型和/或过氧化物型都可以使用。
也可以用悬液稳定剂,例如离子型表面活性剂,非离子型表面活性剂,具有两亲性质的聚合物,及其混合物,来防止油滴自身的聚集。
形成的颗粒的直径一般在2到500μm左右。优选的颗粒直径为2-30μm,更优选2到10μm左右。要大规模纯化高纯度的核酸时,其为10到100μm左右,当从粗储液中纯化目标产物是,其可以为100到500μm,更优选200到400μm左右。可以通过在聚合过程中调节搅拌器的转速来调节颗粒直径。当需要小直径的颗粒时,可以增加转数,而当需要大颗粒时,可以降低转数。这里,因为将要使用的稀释剂是用来调节所形成的颗粒的孔的,所以稀释剂的选择是特别重要的。一个基本的思想是,对于要用于组合的溶剂,通过把单体的不良溶剂和单体的良溶剂不同地组合来进行调节。孔径的大小可以基于设计来要分离的核酸的分子大小而合适地选择,但优选地,对于疏水相互作用色谱填料在500到4000埃的范围内,对于离子交换色谱填料在1500到4000埃的范围内。
疏水相互作用色谱中,对于分离具有不同疏水性的核酸,优选地通过分别使用不同疏水性的填料,基材的表面改性是重要的。
疏水基团可以从长链或分枝从选择,包括碳原子数2到20的饱和烃基或不饱和烃基。烃基中还可以含有芳香环。
所述疏水基团还可以从具有下式的化合物中选择:
其中n=0到20左右,亚甲基基团可以是直链也可以是分枝的,m=0到大约3,烃基基团可以是直链也可以是分枝的,A是C=O基团或醚基,但亚甲基基团可以直接结合到基材而没有A。
烃基还可以进一步包括碳原子数2到20的烷撑二醇醚基,其包括0到10个重复单位,其中,与和基材反应的官能团相对的一端可以保留有原本的OH基团,或者可以被1到4个碳原子的烷基加帽(capped)。
上述的疏水性基团可以单独使用或混合使用来对表面改性(modify)。
对于低疏水性的,例如质粒,优选6到20个碳原子的烷基链。具有2到15个碳原子的长烷基链用于分离高度疏水性的化合物,例如来自大肠杆菌的RNA和人及动物细胞中的RNA。4到18个碳原子的烷基用于分离相对低度疏水性的化合物,例如来自大肠杆菌的DNA和人及动物细胞中的DNA。
分离上述化合物时,可以不受上述例子的限制合适地选择化合物来对表面改性。事实上,填料的疏水性依赖于介质中的盐浓度或洗脱液中用于吸附的盐浓度而改变。另外,填料的疏水性随引入基材中的基团的量而不同。
疏水相互作用色谱的基材孔径特别优选500到4000埃,但其可根据要分离的核酸的分子尺寸而从该范围内合适地选择。一般而言,由于核酸在填料上的停留和吸附容量(sample leading)随孔径而变化,优选对于分子尺寸大的核酸使用大孔径的基材,而对分子尺寸小的核酸使用小孔径的基材。
例如,使用含卤素化合物和/或碳酰卤,和催化剂如FeCl3,SnCl2或AlCl3等,苯乙烯基材可以和包含长链烷基的疏水基团反应,而且,利用Friedel-Craft反应,可以直接作为脱卤的化合物和/或酰化的化合物加到基材中的芳环上。当基材是含有卤素基团的颗粒时,例如,使用要添加的官能团中含有OH的化合物,并利用Williamson反应,使用碱如NaOH或KOH作催化剂,可以通过醚键来引入该官能团。当要添加的官能团是含有氨基的化合物,例如己胺时,可以利用脱卤酸反应(dehalogenic acid reaction)使用碱催化剂例如NaOH或KOH来添加。反过来,当基材含有OH基团时,如果事先向要添加的官能团中引入环氧基,卤素或碳酰卤基团,就可以通过醚键或酯键来引入该官能团。当基材含有环氧基团时,如果与要引入的官能团中含有OH基团或氨基的化合物反应,就可以听过醚键或胺键来引入该官能团。另外,如果要添加的官能团含有卤素基团时,可以使用酸催化剂通过醚键添加该官能团。因为要添加到基材的官能团的比例受要分离的目的产物的疏水性的影响,其不能被限定,但一般而言,每1g干基材具有0.05到4.0mmol左右的官能团的填料是合适的。
对于表面改性,通过基材或颗粒形成后的后反应添加官能团的方法如上所述。表面改性根据相同的方法进行,其中用单体聚合后形成基材,所述官能团在聚合之前添加。
基材还可以是多孔硅胶。一种生产硅胶的方法包括硅烷耦合,使用烷基三甲氧基硅烷直接耦合到根据″Latest High-Speed LiquidChromatography″,page 289 ff.(written by Toshio Nambara and NobuoIkegawa,published by Tokyo Hirokawa Bookstore in 1988)中描述的方法制备的颗粒上。在使用含有环氧基的硅烷耦合剂耦合硅烷之前或之后,可以根据前述的方法添加官能团。引入的官能团的比例为每1g干基材大约0.05到4.0mmol官能团是合适的。
疏水相互作用色谱或纯化步骤中使用洗脱液。一般而言,使用两种洗脱液。一种洗脱液含有高浓度的盐,另一种洗脱液还有低浓度的盐。洗脱方法包括逐步地从具有高盐浓度的洗脱液转换到具有低盐浓度的洗脱液,还可以使用梯度洗脱方法,将组成从一种洗脱液连续地改变为另一种洗脱液。可以使用通常用于疏水相互作用色谱的缓冲液和盐。对于所述含有高浓度盐的洗脱液,特别优选具有1.0到4.5M的盐浓度和pH值6到8的水溶液。对于所述含有低浓度盐的洗脱液,特别优选具有0.01到0.5M的盐浓度和pH值6到8的水溶液是优选的盐。一般而言,可以使用硫酸铵和硫酸钠作为盐。
疏水相互作用色谱质粒DNA纯化步骤可以通过将引入了弱疏水性官能团的填料和引入了序列中具有强疏水性的官能团组合来进行。
事实上,培养基中培养的大肠杆菌含有大量具有不同疏水性的各种组分,例如多糖,大肠杆菌基因组DNA,RNA,质粒和蛋白质。还已知甚至核酸自身中也有疏水性的差异。作为杂质的蛋白质与质粒相比具有更高的疏水性。
许多疏水相互作用色谱树脂可以从商业途径获得,例如丙基Fractogel,Toyopearl,异丙基Source或者其他具有疏水性基团的树脂。最优选的树脂是Toyopearl大批(bulk)聚合介质。Toyopearl是具有高度机械和化学稳定性的甲基丙烯酸树脂。可以获得的树脂有非官能化的“HW”系列的树脂,其可以通过表面化学衍生化用于离子交换色谱或疏水相互作用。可以使用4中以不同表面化学和疏水性水平为特征的Toyopearl HIC树脂。Toyopearl HIC树脂的疏水性按下面的序列升高:醚(Ether),苯基(Phenyl),丁基(Butyl),和己基(Hexyl)。优选的Toyopearl HIC树脂,即具有1000埃孔径的Toyoperal HW-65的结构如下所示:
上面描述的Toyopearl树脂可以有多种粒度等级。Toyopearl 650C的粒度为大约50到150μm,优选大约100μm,而Toyopearl 650M具有大约40到90μm的粒度,优选为大约65μm,Toyopearl 650S具有大约20到50μm的粒度,优选为大约35μm。众所周知粒度影响分辨率,即,从C到M到S粒度等级分辨率依次增加。根据本发明的质粒DNA分离和纯化方法中的HIC色谱所用的最优选的Toyopearl树脂是Toyopearl butyl-650S,其由Tosoh Bioscience出品。
根据优选的实施方式,还进行渗滤(diafiltration)步骤。标准的,商业上可获得的渗滤材料可根据本领域所知的标准技术应用于该方法。优选的渗滤方法是根据质粒的大小使用具有30,000到50,000范围的分子量截留的超滤膜进行渗滤。渗滤步骤可以交换缓冲液并进行浓缩。洗出物通过切向流过滤(tangential flow filtration)(膜的截留为30kDa)浓缩3到4倍到大约2.5到3.0mg/mL的目标浓度,并用10倍体积的盐水对浓缩液在等体积下通过渗滤进行缓冲液交换,并用盐水调节到目标质粒浓度。由浓缩液样品260nm的吸收来计算质粒DNA的浓度。质粒DNA溶液用0.2μm囊式过滤器(capsule filter)过滤并分为数等份保存在2-8℃的冷室中的容器中直到进一步的处理。这产生质粒DNA浓度为超螺旋质粒大约为70%,75%,80%,85%,90%,95%,及优选99%的纯化浓缩液。该方法的总质粒回收率为至少35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%,和80%,平均回收率为60%。
根据该实施方式,所述渗滤步骤根据下面的条件进行:缓冲液用于步骤a)和步骤b):
第一渗滤(步骤a)对12.5到13.0体积的50mM Tris/HCl,150mMNaCl,pH 7.4(名为缓冲液I)和
将上面的步骤a)所得的渗余物3.0到3.5体积的盐水赋形剂(salineexcipient)(150mM NaCl)进行第二渗滤。根据本发明的这一优选的渗滤步骤高效地广泛地去除硫酸铵和EDTA。另外,该渗滤步骤以后,获得了合适的生理NaCl浓度(大约150mM)和低于1mM的Tris终浓度(200uM-1mM)。
通过该渗滤步骤而得到的质粒DNA制剂包含NaCl作为盐水赋形剂以及合适的Tris缓冲液浓度以保持或控制pH值在7-7.5。根据本申请的质粒DNA制剂是特别有用的,因为令人惊讶的是,质粒DNA可以以稳定的不可降解的状态在这些条件下,在5℃到高达25℃,即室温下储藏更长的时间。
如所述的,根据本发明的分离具有高纯度质粒DNA的方法,可以通过比常规方法简单的操作而大量获得高纯度的质粒DNA。
该质粒纯化方法可以在上述连续裂解方法之后,或者本领域熟知的任何其他裂解方法之后使用。例如,可以使用含质粒微生物细胞的流过式热裂解。该方法在国际公开WO 96/02658和他处描述。具体的热交换器是由10英尺×0.25英寸外径的不锈钢管形成的盘管(coil)构成的。该盘管完全浸没在高温恒温水浴中。该盘管的滞留体积为大约50mL。分别使用热电偶和温度计来测量入口和出口温度及水浴温度。用带硅胶管路的Masterflex蠕动泵将产物流泵入该加热盘管。从盘管出来的细胞裂解物用Beckman J-21分批式离心机离心使之澄清。离心后,可以使用根据本发明的纯化方法来纯化该质粒DNA。
其他的细胞裂解方法可以使用串联的静态混合器。事实上,如WO97/23601(已并入本文供参考)所描述的:用于通过第一静态混合器来裂解细胞,并通过第二静态混合器来沉淀细胞裂解物的第一静态混合器,可以在使用根据本发明的纯化质粒DNA的方法之前,作为替代的细胞裂解方法。使用该静态混合器,可以在线(in-line)地对大体积的细胞进行温和、连续的裂解,其他的静态混合器在线排列以完成其他功能,例如稀释和沉淀。可用于本发明的合适的静态混合器包括在本领域中被称为静态(static)或静止(motionless)混合器的,具有可进行本发明的方法的足够长度的任何流过式设备。例如,对于裂解细胞,静态混合器可能需要这样的长度,其能够给裂解溶液和细胞提供足够的接触时间,使得目标细胞在通过该混合器的过程中发生裂解。在一个优选的实施方式中,合适的静态混合器包含内部的螺旋结构,其使得两种液体在反向旋流中互相接触,从而使得这些液体在湍流中得到混合。
根据本发明的分离和纯化质粒DNA的方法可以用于分离和纯化任何种类、任何大小的载体。可使用根据本发明的方法分离的质粒DNA的大小范围是大约5kb到大约50kb,优选15kb到50kb,这样的DNA包括大约3kb的载体骨架、治疗基因和相关调控序列。因此,可用于本发明的载体骨架可能可以携带大约10-50kb或更大的插入序列。所述插入序列可以包括来自任何生物的基因,但优选来源于哺乳动物,而且,除了编码治疗蛋白的基因外,还可以包括调控序列例如启动子、聚腺苷酸化序列、增强子和基因座控制区等等。所述编码治疗蛋白的基因可以是基因组来源的并因此含有外显子和内含子,如其基因组的组织所反映的;或者,其可以来自互补DNA。这样的载体可以包括,例如:可以高拷贝数复制的载体骨架,具有用于插入治疗基因的多接头(polylinker),编码选择标记的基因,例如,SupPhe tRNA,四环素卡那霉素抗性基因,并且具有小而稳定的形体(physically)。该质粒的载体骨架较优地允许插入哺乳动物、其他真核、原核或病毒DNA的片段,且所得质粒可以被纯化并用于体内或体外的基于质粒的治疗方法。具有相对高的拷贝数,即20-40个拷贝/细胞到1000-2000个拷贝/细胞的范围的载体,可以用根据本发明的方法分离和纯化。例如,根据本发明的方法,包含pUC复制起点的载体是优选的。pUC复制起点使质粒DNA能够更高效地复制并且使质粒拷贝数/细胞相比例如pBR322起点增加10倍。优选地,具有如US 2003/1618445所描述的条件性复制起点或称pCOR的质粒DNA可以用根据本发明的方法分离。所得的高拷贝数大大提高了质粒DNA相对染色体DNA、RNA、细胞蛋白和辅因子(co-factors)的比例,改善质粒产率,并使下游纯化更容易。因此,任何载体(质粒DNA)都可根据本发明使用。代表性的载体包括但不限于NV1FGF质粒。NV1FGF是编码酸性成纤维细胞生长因子或成纤维细胞生长因子1型(FGF-1)的质粒,可用于治疗终末期周围动脉闭塞疾病(PAOD)或周围动脉疾病(PAD)患者。Camerota等(J Vasc.Surg.,2002,35,5:930-936)描述,对51名无法重建的、具有休息时痛或组织坏死的末期PAD患者,将逐渐升高的单剂量或重复剂量的NV1FGF肌肉内注射到缺血的大腿和腓肠。然后评估多种参数例如经皮氧压力,踝和趾背指数(ankle and toe brachial indexes),疼痛评估(pains assessment)和溃疡愈合。在施用NV1FGF后,观察到显著的臂指数升高、疼痛减轻、溃疡尺寸消散和灌注的改善。
根据本发明,有用的宿主细胞可以是任何细菌菌株,即,革兰氏阳性和革兰氏阴性菌株,例如大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌或可维持如上所述的质粒的高拷贝,例如20-200个拷贝的芽孢杆菌。根据本发明可以使用大厂杆菌宿主菌株,包括HB101,DH1,和DH5αF,XAC-1和XAC-1pir 116,TEX2和TEX2pir42(WO04/033664)。含有F质粒或F质粒衍生物(例如JM109)的菌株一般是不优选的,因为F质粒会和治疗质粒产物共纯化(co-purify)。
根据另一个方面,本发明还涉及包含高度纯化的质粒DNA的组合物,所述高度纯化的质粒DNA基本上不含或含有ppm以下范围的污染物,因此是药物级的DNA。因此,根据本发明的药物级的DNA组合物包含ppm以下(<0.0001%,即<0.0001mg每100mg质粒DNA)的gDNA、RNA及蛋白质污染物。
因此,所述药物级质粒DNA组合物含有少于约0.01%,或少于0.001%,并优选地少于0.0001%,或优选的少于0.00008%(<0.0008%,即<0.0008mg每100mg质粒DNA)的染色体DNA或基因组DNA。
因此,所述药物级质粒DNA组合物含有少于约0.01%,或少于0.001%,并优选地少于0.0001%,或优选的少于0.00002%(<0.0002%,即<0.0002mg每100mg质粒DNA)的RNA污染物。
因此,所述药物级质粒DNA组合物含有少于约0.0001%,最优选少于0.00005%的蛋白质污染物。
因此,所述药物级质粒DNA组合物含有少于约0.1EU/mg的内毒素。
因此,所述药物级质粒DNA组合物主要地含有环状形式的,更准确地说含有多于80%,85%,90%,95%,或99%的闭合环状形式的质粒DNA。
本发明还涉及质粒DNA液体制剂,其是稳定的并在室温下长期保持不降解,因此可用于保存用于研究和相关人体疗法的质粒DNA。
因此本发明涉及稳定的质粒DNA制剂,其包含质粒DNA,非常稀的缓冲溶液,和盐水赋形剂,其中所述缓冲溶液的浓度可以维持所述制剂或组合物的pH在7-7.5。
可以将所述组合物的pH维持在7-7.5的缓冲溶液,或者由包括Tris[三(羟甲基)-氨基甲烷]的酸/碱系统,或者由赖氨酸和选自强酸(例如盐酸)或弱酸(例如马来酸,苹果酸或乙酸)的酸,或者由包括Hepes[2-(4-(2-羟乙基哌嗪)-1-基)乙磺酸]和强碱(例如氢氧化钠)的酸/碱系统组成。该缓冲溶液还可包括Tris/HCl,赖氨酸/HCl,Tris/马来酸,Tris/苹果酸,Tris/乙酸,或Hepes/氢氧化钠。
优选地,所述pH维持在7-7.5,更具体地在7.2左右。
可用于本发明的制剂的盐水赋形剂优选地是100-200mM浓度的NaCl,优选浓度为150mM左右。其他盐水赋形剂可以包含选自乙酸根、磷酸根、碳酸根、SO4 2-、Cl-、Br-、NO3 -、Mg2+、Li+、Na+、K+和NH4 +的阴离子和阳离子。
缓冲溶液的摩尔浓度被这样地确定,以在一定的限度和体积内起缓冲作用,使pH值稳定在7-7.5。因此根据本发明的质粒-DNA保存组合物包含质粒DNA,盐水赋形剂和缓冲溶液,其中该缓冲溶液的浓度可高达1mM,优选为250μm-1mM,或优选400μM-1mM,以将所述制剂或组合物的pH维持在7-7.5。在根据本发明的缓冲液体系中,400μM浓度的Tris缓冲液具有特别满意的效果,因此其被优选用于本发明的质粒制剂。
如下面的实施例所示,根据本发明的质粒DNA制剂在4℃和室温(RT)例如20或25℃下显示出极佳的稳定性。特别地,质粒DNA制剂适用于在4℃下和25℃下,例如RT下,保持1个月,2个月,3个月,到6个月及长达12个月的长期间。
因此本发明涉及组合物,其包含质粒DNA、缓冲溶液和盐水赋形剂,其中所述缓冲溶液以足够使质粒DNA在4℃到25℃下保持为稳定形式的浓度存在。
本发明还涉及组合物,其包含质粒DNA、缓冲溶液和盐水赋形剂,其中所述缓冲溶液以这样的浓度存在,其足够使质粒DNA在4℃到25℃下保持为稳定形式达1个月,2个月,3个月,到6个月及长达12个月的长期间。
事实上,长时间保持在5℃或室温的质粒DNA显示非常低的脱嘌呤和开环(open-circularization)率,低于20%,15%,10%,5%,或≤1%每月。
根据本发明的组合物还可进一步包含佐剂,例如选自聚乙二醇,pluronic,或聚山梨酸酯糖(polysorbate sugar)或醇的聚合物。
根据另一个方面,本发明涉及在温度达到约20℃时在组合物中保存质粒DNA的方法,包括a)制备质粒DNA的纯化样品,和b)将该质粒DNA的纯化样品与盐水赋形剂和缓冲溶液组合,其中该缓冲溶液使由此形成的组合物的pH保持在7-7.5。
本发明还涉及在组合物中保存质粒DNA的方法,包括a)制备质粒的纯化样品;b)将该质粒的纯化样品与盐水赋形剂和缓冲溶液组合,其中该缓冲溶液的浓度为少于1mM,或250μm-1mM,或优选400μM;和c)在大约4℃到大约20℃的温度下保存在质粒DNA组合物。
实施例
通用克隆和分子生物学技术
传统的分子生物学方法,例如限制酶消化,凝胶电泳,转化大肠杆菌,沉淀核酸及诸如此类,都描述在文献中(Maniatis et al.,T.,E.F.Fritsch,and J.Sambrook,1989.Molecular cloning:a laboratory manual,second edition.Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring HarborLaboratory Press,New York;F.M.,R.Brent,R.E.Kinston,D.D.Moore,J.A.Smith,J.G.Seidman and K.Struhl.1987.Currentprotocols in molecular biology 1987-1988.John Willey and Sons,NewYork.)。根据以公开的操作规范(Ausubel et al.,1987),使用链终止法测定核酸序列。
限制酶由New England Biolabs,Beverly,MA(Biolabs)提供。
为进行连接,将DNA片段在包含50mM Tris-HCl pH 7.4,10mMMgCl2,10mM DTT,2mM ATP的缓冲液中,在T4噬菌体DNA连接酶(Biolabs)的存在下温育。
使用亚磷酰胺化学法(phosphoramidite chemistry)合成寡核苷酸,其中用氰乙基在β位保护亚磷酰胺(Sinha,ND.,J.Biemat,J.McManusand H.1984.Polymer support oligonucleotide synthesis,XVIII:Use ofβ-cyanoethyl-N,N-dialkylamino-/N-morpholino phosphoramidite ofdeoxynucleosides for the synthesis of DNA fragments simplifyingdeprotection and isolation of the final product.Nucl.Acids Res.,12,4539-4557:Giles,J.W.1985.Advances in automated DNA synthesis.Am.Biotechnol.,Nov./Dec.),使用Biosearch 8600自动DNA合成仪按照制造商的推荐进行。
使用被连接的DNA或要检测其转化效率的DNA来转化下列感受态菌株:
大肠杆菌DH5α[F/endA1,hsdR17,supE44,thi-1,recA1,gyrA96,relA1,Δ(lacZYA-arqF)U 169,deoR,Φ80dlac(lacZΔM15)](对任何ColE1质粒);或
大肠杆菌XAC-pir(对任何pCor衍生质粒).
根据Klein等,1980的操作规范进行质粒DNA的小规模制备。
使用LB培养基来培养大肠杆菌菌株(Maniatis等,1982)。菌株在37℃培育。细菌在添加合适的抗生素的LB培养基平板上铺板。
实施例1
根据连续裂解系统的盘管中的雷诺数(Reynolds)的计算来调节针对所用流速的直径。因为下面的分析假定流体的行为是牛顿型的(Newtonian),下面报道的数字只在Bla中是完全有效的,在B2中是一定程度上有效的。
根据雷诺数的值,本领域的技术人员可以确定所遇到的行为的类型。这里,我们只涉及在管中流动的流体(水力工程)。
1)非牛顿流体
工业中最常遇到的两种非牛顿流体是Bingham流体和Ostwald deWaele流体。
这里,雷诺数(Re)如下计算:
ReN是广义的(generalized)雷诺数
ReN=(1/(2n-3))x(n/3n+1)n x((ρx Dnx w2-n)/m) (1)
D:横截面内径(m)
ρ:流体的体积质量(volumetric mass)(kg/m3)
w:流体的空间传播速度(spatial velocity)(m/s)
n:流动特性指数(dimensionless)
m:流体稠度系数(consistency coefficient)(dyn.sn/cm2))
n和m是经验地确定的(考察流变行为)
2)牛顿流体
对于第一节,方程(1)中我们有:
Re=f(内径,μ,ρ,和u),因为n和m是μ的函数。
Re=(u x D x ρ)/μ (2)
ρ:流体的体积质量(kg/m3)
μ:流体的粘度(Pa.s,1mPa.s=1cP)
D:横截面内径(m)
u:流体的平均空间传播速度(m/s)
n=1时,方程(1)简化为方程(2)。
若Q=流速(m3/h),S=横截面表面积(m2),且μ以cp为单位给出,则有:
Re=(4x(Q/3600)x ρ)/((μ/1000)x∏x D)(3)
圆管路中,对低于2500的雷诺数,流动为层流;对2000-500,000的雷诺数,流动为水力光滑(hydraulically smooth)的湍流。该界限在2000到2500之间被有意地模糊,在这里,两种行为类型都被用来预测将要发生的情况,而选择是事后作出的。
3)计算
由于n和m一般是未知的,用下面的近似来估计该趋势:
牛顿流体(在所有横截面上)
ρ=1000kg/m3(对于所有流体)
μ=5cP(B1a中)和40cP(B1b)(我们的数据)
2.5cP(B2中)(我们的数据)
测试了两种标准的管道配置,分别称为配置1和配置2(无B1b管),用方程(3)对其进行了下面的计算:
表2
在这两种配置中,流动在所有阶段都是层流,各溶液没有充分地混合到一起。
对其他的管道配置(无B1b管),我们有:
表3
对具有B1a和B1b管的多种管道配置,用方程(3)进行了类似的计算:
表4
显然,通过调节管道直径和流速,可以获得预定的雷诺数。
本领域的技术人员可以想到用于B2或B1的两段(B1a和B1b)的多种直径和长度组合。例如,B1的第一段可以从6mm减为3mm以缩小长度而增加扰动。另外,n和m可以通过研究流体的流变行为而确定,并可用于确定管道的恰当特性。
除了扰动效率,还可以考虑扰动的持续,在本发明的一些实施方式中这是通过调节盘管的长度而获得的。
对于非牛顿流体,管道的直径或流动速度在方程(1)中似乎不起主要影响(数据未显示)。换言之,如果使用方程(1)在B1b和B2中计算,看起来改变直径并不比改变流速更有效。当希望高流速时,直径可以随流速变化。
可以用这个原则作为基础,在B1b和B2中尽量限制扰动,以避免gDNA的片段化。
裂解过程中,只要gDNA不变性,扰动可以相当剧烈。在B1起始处减小直径,可以增加扰动(增加Re),以充分混合溶液2和细胞。另一方面,当细胞裂解后,可以减小扰动和对壁的摩擦力,以避免核酸片段化。增加直径,则可以减小扰动(减少Re)和摩擦(降低速度)。
M1:混合流体
B1a:在裂解开始时对混合进行微调:传递现象(宏观混合)
B1b:使变性发生,加上扩散现象(微观混合)
这里假定广义雷诺数对于非牛顿流体具有如同经典雷诺数对于牛顿流体相同的意义。特别地,假定圆横截面管道中层流区的界限是ReN<2300。
在B2中进行中和。高流速引起过于剧烈的扰动和管壁的摩擦力(机械应力)从而倾向于增加基因组DNA的片段化。使用大直径的管可以减少扰动(Re)和摩擦力(速度)。我们在这里安置小直径的管(6mm)以避免扰动不足。我们的观察显示,最好只有B2使用小直径管以“剧烈地和迅速地”扰动中和的裂解物。
实施例2
我们可以把CL系统拆分为5个步骤。在一个具体的实施方式中,配置如下:
1)混合:细胞(在溶液1中)+溶液2(M1+3m的6mm管)。SDS裂解细胞开始,只要DNA不变性,没有片段化的危险。
2)裂解结束,gDNA变性(13m的16mm管)。
3)混合:裂解物+溶液3(M2+3m的6mm管)。
4)4℃下收集中和的裂解物。
5)4℃下过夜沉降絮凝物和gDNA的大片段。
可以使用下面的条件进行连续裂解:
-溶液1:EDTA 10mM,葡萄糖(Glc)9g/l和Tris HCl 25mM,pH7.2。
-溶液2:SDS 1%和NaOH 0.2N。
-溶液3:乙酸2M和乙酸钾3M。
-流速60l/h:溶液1和溶液2。
-流速90l/h:溶液3。
-细胞用溶液1调节到38.5g/l。
溶液1中的细胞流过3个管嘴,并被这些管嘴分散到从反方向到来的溶液2中。
-混合器M1具有可以使所述两种流体的混合最优化的几何形状(见图2,混合器的示意图)。
-混合器M1之后的第一段管道是B1a,之后的一段是B1b。
B1a:长3m,直径6mm,停留时间2.5sec
B1b:长13m,直径16mm,停留时间77sec
本发明的方法提供了效率上的优势,概括为:分散,短暂剧烈混合,和通过扩散温和地混合。
使用本发明的方法,裂解的细胞数增加,从而回收的pDNA的量也增加。
扩散的想法是特别重要的,因为由于这些流体的性质,尤其是粘弹性,使得它们难于混合。
本发明的方法可以限制剪切应力从而限制gDNA的片段化,从而使它们在后续的色谱纯化中易于去除。
于是问题就在于与溶液3的混合,该溶液可能被冷却到4℃。在一个实施方式中,本发明的方法利用:
-混合器M2,呈Y形,内径约10mm
-混合器M2后的B2段管道。
B2:2m的6mm管道;停留时间:1sec。
下面的表5给出了比较性试验的结果,显示我们的连续裂解方法相比分批裂解的优势。
表5
实施例3
所用的柱是用NHS(N-羟基琥珀酰亚胺,Pharmacia)活化的1mlHiTrap柱,连接到蠕动泵(输出<1ml/min)。所用的特定寡核苷酸在5’末端具有NH2基团,其序列如下:5′-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3′(SEQ ID NO:1)。
该实施例中所用的缓冲液如下:
偶联缓冲液:0.2M NaHCO3,0.5M NaCl,pH 8.3。
缓冲液A:0.5M乙醇胺,0.5M NaCl,pH 8.3。
缓冲液B:0.1M乙酸盐,0.5M NaCl,pH 4。
柱用6ml的1mM HCl洗涤,然后将稀释于偶联缓冲液中的寡核苷酸(1ml中50nmol)施加到柱上,室温下放置30分钟。接连用6ml的缓冲液A和6ml的缓冲液B洗涤3次。这样该寡核苷酸通过CONH键共价结合到柱上。该柱保存在4℃下,PBS,0.1%NaN3中,并可以使用最少4次。
合成了下面两种寡核苷酸:寡核苷酸4817:
5′-GATCCGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAA GAAGAAGG-3′(SEQ ID NO:13)和寡核苷酸4818:5′-AATTCCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCG-3′(SEQ ID NO:14)
这些寡核苷酸当被杂交并克隆到质粒中时,将同型嘌呤-同型嘧啶序列(GAA)17(SEQ ID NO:15)引入到相应的质粒中,如上所述。
这两个杂交的寡核苷酸的相应序列被克隆到带有氨苄青霉素抗性基因的质粒pBKS+(Stratagene Cloning System,La Jolla CA)的多克隆位点。为此,以下列方式使此寡核苷酸杂交:1μg的这两种寡核苷酸一起置于40ml的最终缓冲液中,最终缓冲液包含50mM Tris-HCl pH 7.4和10mM MgCl2。将混合物加热到95℃然后置于室温使温度缓慢下降。在30μl终体积中将10ng的杂交寡核苷酸与200ng用BamHI和EcoRI消化的质粒pBKS+(Stratagene Cloning System,La Jolla CA)连接。连接以后,用1份转化DH5a。转化混合物在添加氨苄青霉素(50mg/l)和X-gal(20mg/l)的LB培养基上铺板。重组克隆必须在该培养基上不显示(absence)蓝色,这与允许大肠杆菌β-半乳糖苷酶ω片段α-互补的亲本质粒(pBKS+)相反。从6个克隆中小量制备质粒DNA后,它们都显示pBKS+的EcoRI和BamHI位点之间的PstI位点消失,且含有所述多克隆位点的448-bp PvuII条带的分子量增加了。选择了一个克隆并将相应质粒命名为pXL2563。使用用于质粒pBKS+(StratageneCloning System,La Jolla CA)的引物-20(5′-TGACCGGCAGCAAAATG-3′(SEQ ID NO:16))(Viera J.and J.Messing.1982.The pUC plasmids,an M13mp7-derived system forinsertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers.Gene,19,259-268)进行测序来验证克隆的序列。质粒pXL2563使用Wizard Megaprep试剂盒(Promega Corp.Madison,WI)根据提供商的推荐来纯化。该质粒DNA制备用于下述的实施例中。
在如1.1中所描述的与寡核苷酸耦合的HiTrap柱上,从还含有质粒pBKS+的溶液中纯化质粒pXL2563。
此纯化中所用的缓冲液如下:
缓冲液F:2M NaCl,0.2M乙酸盐,pH 4.5to 5.
缓冲液E:1M Tris-HCl,pH 9,0.5mM EDTA.
柱子用6ml缓冲液F冲洗,然后将质粒(20μg的pXL2563和20μg的pBKS+,于400μl缓冲液F中)施加到柱上,并在室温下温育2小时。用10ml缓冲液F冲洗柱子,然后用缓冲液E洗脱。用1%琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色后检测质粒。溶液中各质粒的比例通过测量其转化大肠杆菌的活性来估计。
从含有30%的pXL2563和70%的pBKS+的混合物开始,在柱子的出口回收了含100%pXL2563的溶液。通过260和280nm的OD值的比例估计的纯度从1.9升到了2.5,说明通过该方法去除了污染性的蛋白质。
实施例4
如实施例3所述将寡核苷酸(5′-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3′(SEQ ID NO:1))偶联到柱子上。为了偶联,用氨基修饰该寡核苷酸的5’端,所述氨基通过含6个碳原子的手臂连接到间隔物的磷酸上(修饰的寡核苷酸Eurogentec SA,Belgium)。用Wizard Megaprep试剂盒(Promega Corp.,Madison,WI)根据提供商的推荐纯化质粒pXL2563。本实施例中所用的缓冲液如下:
缓冲液F:0-2M NaCl,0.2M乙酸盐,pH 4.5-5。
缓冲液E:1M Tris-HCl pH 9,0.5mM EDTA。
柱子用6ml的缓冲液F冲洗,然后将稀释于400μl缓冲液F中的100μg质粒pXL2563施加到柱子上,室温下温育2小时。用10ml缓冲液F冲洗柱子并用缓冲液E洗脱。通过测量260nm的光密度对质粒定量。
在本实施例中,结合在对NaCl的摩尔浓度为0-2M的缓冲液(缓冲液F)中进行。NaCl的摩尔浓度下降则纯化产率降低。结合缓冲液的pH可以在4.5-5变化,其中在4.5的纯化产率较好。还可以使用一种碱性pH的洗脱溶液:由此用含有50mM硼酸盐,pH9,0.5mM EDTA的缓冲液进行。
将寡核苷酸(5′-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3′(SEQ IDNO:1)偶联到柱上根据实施例3中所述进行。用Wizard Megaprep试剂盒(Promega Corp.,Madison,WI)根据提供商的推荐纯化质粒pXL2563。本实施例中所用的缓冲液如下:
缓冲液F:0.1M NaCl,0.2M乙酸盐,pH 5。
缓冲液E:1M Tris-HCl pH 9,0.5mM EDTA。
柱子用6ml的缓冲液F冲洗,然后将稀释于400μl缓冲液F中的100μg质粒pXL2563施加到柱子上,室温下温育1小时。用10ml缓冲液F冲洗柱子并用缓冲液E洗脱。测量通过寡核苷酸柱之前和之后质粒样品中基因组或染色体大肠杆菌DNA的含量。该基因组DNA利用PCR进行定量,使用大肠杆菌galK基因中的引物。根据下面的操作规范:这些引物的序列由Debouck等所描述(Nucleic Acids Res.1985,13,1841-1853):5′-CCG AAT TCT GGG GAC CAA AGC AGT TTC-3′(SEQ ID NO:17)
和5′-CCA AGC TTC ACT GTT CAC GAC GGG TGT-3′(SEQ IDNO:18)。
反应介质包含,在25μlPCR缓冲液(Promega France,Charbonnières)中:1.5mM MgCl2;0.2mM dXTP(Pharmacia,Orsay);0.5μM引物;20U/ml Taq聚合酶(Promega)。反应根据下面的顺序进行:
-95℃,5min
-30个如下的循环:
95℃,10sec
60℃,30sec
78℃,1min
-78℃,10min
长124个碱基对的扩增的DNA片段用SybrGreen I(MolecularProbes,Eugene,USA)存在下3%琼脂糖凝胶电泳分离,然后参照大肠杆菌B菌株的Ultrapur基因组DNA系列(Sigma,refD4889)来定量。
实施例5
该实施例描述从细菌培养物的澄清的裂解物中以所谓“小量制备”规模纯化质粒DNA。对1.5ml含有质粒pXL2563的DH5α菌株的过夜培养物离心,沉淀重悬在100μl的含50mM葡萄糖,25mM Tris-HCl,pH 8,10mM EDTA的溶液中。加入200μl的0.2M NaOH,1%SDS,将管颠倒混合,加入150μl的3M乙酸钾,pH 5,将管颠倒混合。离心后,回收上清并加载到如实施例1所述得到的寡核苷酸柱上。从1.5ml培养物中回收了约1μg的质粒。所得的质粒用琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色分析,显示“超螺旋的”环状DNA的单个条带形式。通过该方法纯化的质粒中检测不到高分子量(染色体)DNA或RNA的痕迹。
实施例6
本实施例描述在与实施例5相同的条件下进行的质粒DNA纯化实验,其从20ml的含质粒pXL2563的DH5α菌株细菌培养物开始。将细胞沉淀收集到1.5ml的50mM葡萄糖,25mM Tris-HCl,pH 8,10mMEDTA溶液中。用2ml的0.2M NaOH,1%SDS裂解,并用1.5ml的3M乙酸钾,pH 5中和。然后用3ml的2-丙醇沉淀DNA,将沉淀收集到0.5ml的0.2M乙酸钠,pH 5,0.1M NaCl溶液中并加载到如上面的实施例所述得到的寡核苷酸柱上。结合,冲洗柱子和洗脱如上述实施例进行,但冲洗缓冲液不同,其NaCl的摩尔浓度为0.1M。所得的质粒用琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色分析,显示“超螺旋的”环状DNA的单个条带形式。该纯化的质粒中检测不到高分子量(染色体)DNA或RNA的痕迹。用限制酶消化该质粒产生预计的3kb分子量的单个条带。该质粒包含:含有巨细胞病毒启动子的盒,编码荧光素酶的基因,以及源自质粒pXL2563的同型嘌呤-同型嘧啶序列(GAA)17(SEQ ID NO:15)。在7升发酵罐中培养含有该质粒的DH1菌株(Maniatis等,1989)。从200克细胞制备澄清的裂解物:将细胞沉淀收集于2升的5mM Tris,pH 6.8,50mM葡萄糖,10mM EDTA溶液,并加入2升的0.2M NaOH,1%SDS。加入1升的3M乙酸钾中和该裂解物。渗滤后,将4ml的该裂解物施加到5ml HiTrap-NHS柱上,该柱子根据实施例3的描述偶联了5′-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3′(SEQ ID NO:1)序列的寡核苷酸。冲洗和洗脱按照上面的实施例所述进行。
实施例7
本实施例描述带有甲基化胞嘧啶的寡核苷酸的应用。所用的寡核苷酸的序列如下:
5′-GAGGMeCTTMeCTTMeCTTMeCTTMeCCTMeCTTMeCTT-3′(SEQ IDNO:19)
该寡核苷酸在5’末端具有NH2基团。MeC=5-甲基胞嘧啶。该寡核苷酸使得质粒pXL2563可以在实施例1的条件下纯化,使用pH 5的结合缓冲液(这样质粒降解的风险就减小了)。
实施例8
在上面的实施例中,所述寡核苷酸的5’端被修饰,其中胺基通过含6个碳原子的手臂:NH2-(CH2)6连接到磷酸上。在本实施例中,胺基通过含12个碳原子的手臂:NH2-(CH2)12连接到5’末端的磷酸上。寡核苷酸的偶联和过柱都如实施例3所述进行,其中缓冲液F:2MNaCl,0.2M乙酸盐,pH 4.5。这种寡核苷酸可以具有更好的纯化产率:得到了53%的纯化产率,而在相同条件下含有6个碳原子的寡核苷酸的产率为大约45%。
实施例9
根据实施例3描述的克隆策略,构建了另外两个带有同型嘌呤-同型嘧啶序列的质粒:含有序列(GGA)16,(SEQ ID NO:20)的质粒pXL2725,和含有序列(GA)25(SEQ ID NO:21)的质粒pXL2726。
质粒pXL2725和pXL2726与质粒pXL2563类似,它们是根据实施例3中描述的克隆策略,使用下面的寡核苷酸对构建的:
5986:5′-GATCC(GA)25GGG-3′(SEQ ID NO:22)
5987:5′-AATTCCC(TC)25G-3′(SEQ ID NO:23)
5981:5′-GATCC(GGA)17GG-3′(SEQ ID NO:24)
5982:5′-AATT(CCT)17CCG-3′(SEQ ID NO:25)
使用寡核苷酸对5986和5987来构建质粒pXL2726:将该寡核苷酸克隆到pBKS+(Stratagene Cloning System,La Jolla CA)的BamHI andEcoRI位点,而使用寡核苷酸对5981和5982来构建质粒pXL2725。使用与质粒pXL2563的构建相同的实验条件,改变的只有寡核苷酸对。类似地,通过对质粒测序来验证克隆的序列。由此发现pXL2725相对于预测的序列相比具有一个修饰:GGAGA(GGA)15(SEQ ID NO:26)取代了17个重复的GGA序列。
实施例10
根据实施例1.1描述的技术将与这些同型嘌呤序列形成三螺旋的寡核苷酸偶联到HiTrap柱上。使用序列5′-AATGCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCT-3′(SEQ ID NO:27)的寡核苷酸纯化质粒pXL2725,并用序列5′-AGTGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT-3′(SEQ ID NO:28)的寡核苷酸纯化质粒pXL2726。
可以使用由此得到的两个柱子按照实施例2所描述的技术来纯化相应的质粒,使用下面的缓冲液:
缓冲液F:2M NaCl,0.2M乙酸盐,pH 4.5。
缓冲液E:1M Tris-HCl,pH 9,0.5mM EDTA。
pXL2725和pXL2726所得的产率分别为23%和31%。
实施例11
本实施例说明质粒中特定序列的长度对于纯化产率的影响。
这些实验中用于显示本发明的组合物的活性的报道基因是编码荧光素酶(Luc)的基因。
质粒pXL2621含有包含661bp巨细胞病毒(CMV)启动子的盒,其克隆在pGL基本质粒(Promega Corp.,Madison,WI)中荧光素酶编码基因的上游的MluI和HindIII位点。该质粒是使用标准分子生物学技术构建的。
质粒pXL2727-1和pXL2727-2按照下面的方式构建:
2微克的质粒pXL2621用BamHI线性化;65℃下处理10min灭活酶;同时,寡核苷酸6006和6008如质粒pXL2563构建所描述的杂交。
6006:5′-GATCT(GAA)17CTGCAGATCT-3′(SEQ ID NO:29)
6008:5′-GATCAGATCTGCAG(TTC)17A-3′(SEQ ID NO:30).
杂交混合物克隆到质粒pXL2621的BamHI末端,转化到DH5α中后,通过PstI限制性酶切分析鉴定重组克隆,因为这些寡核苷酸引入了PstI位点。选择了两个克隆,并且利用引物(6282,5′-ACAGTCATAAGTGCGGCGACG-3′(SEQ ID NO:31))作为测序反应引物来验证克隆片段的核苷酸序列(Viera J.andJ.MeSsing,1982)。pUC质粒M13mp7衍生的系统用于插入诱变和用通用引物测序(Gene19:259-268)。
第一个克隆(pXL2727-1)包含GAA序列的10个重复。第二个克隆(pXL2727-2)包含序列5′-GAAGAAGAG(GAA)7GGAAGAGAA-3′(SEQ ID NO:32)。
使用例如实施例3中所描述的柱子,其偶联寡核苷酸5′-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3′(SEQ ID NO:1)。
质粒pXL2727-1带有序列GAA的14个重复。因此,上述的仅含有相应的杂交序列CTT的7个重复的寡核苷酸可以在8个不同的位置和该质粒杂交。相反,质粒pXL2727-2具有杂交序列(GAA)7(SEQ IDNO:36),其长度与结合到柱上的寡核苷酸的长度相同。因此该寡核苷酸只能结合到pXL2727-2上的一个位置。
该实验和实施例4中描述的那个一样,使用下面的缓冲液:
缓冲液F:2M NaCl,0.2M乙酸盐,pH 4.5。
缓冲液E:I M Tris-HCl,pH 9,0.5mM EDTA。
纯化产率为,质粒pXL2727-1,29%;质粒pXL2727-2,19%。
所用的细胞为NIH 3T3细胞,在实验前一天以50,000细胞/孔的基准接种到24孔培养板中。质粒在150mM NaCl中稀释,并与脂质转染试剂(lipofectant)RPR115335混合。所用的脂质转染试剂正电荷/DNA负电荷比等于6。将该混合物涡旋混合,室温下放置10分钟,在不含胎牛血清的培养基中稀释,然后以每培养孔1μg的比例加到细胞中。37℃下2小时后,加入10%v/v的胎牛血清,细胞在5%CO2存在下37℃温育48小时。用PBS将细胞洗涤两次,然后根据描述的操作规范(Promega kit,Promega Corp.Madison,WI),在Lumat LB9501光度计(EG and G Berthold,Evry)上测量荧光素酶活性。按照实施8.2的描述纯化的质粒pXL2727-1的产率是用Wizard Megaprep试剂盒(Promega Corp.Madison,WI)纯化相同质粒所得产率的两倍。
实施例12
下面的实施例说明使用三螺旋亲和色谱纯化pCOR衍生质粒。已经证明该技术可将核酸污染物(尤其是宿主基因组DNA和RNA)去除到使用常规色谱方法尚未达到的水平。
使用Sephacryl S-1000SF(Amersham-Pharmacia Biotech)作为色谱基质来合成三螺旋亲和凝胶。首先在0.2M乙酸钠(pH 4.7)中用偏高碘酸钠(sodium m-periodate)(3mM,室温,1h)来活化SephacrylS-1000。然后寡核苷酸在抗坏血酸(5mM)存在下进行还原性胺化,如先前用于偶联蛋白质的描述(Hornsey et al.,J.Immunol.Methods,1986,93,83-88),从而通过其5’-NH2终端部分偶联到活化基质的醛基上。这些实验中所用的同型嘧啶寡核苷酸(来自Eurogentec,HPLC纯化的)具有与pCOR质粒复制起点(oriγ)中短14体同型嘌呤序列(5′-AAGAAAAAAAAGAA-3′)(SEQ ID NO:10)(Soubrier et al.,GeneTherapy,1999,6,1482-1488)互补的序列。如上所述,该同型嘧啶的序列是5′-TTCTTTTTTTTCTT-3′(SEQ ID NO:11)。
对下列质粒进行色谱:pXL3296(无转基因的pCOR,2.0kbp),pXL3179(pCOR-FGF,2.4kbp),pXL3579(pCOR-VEGFB,2.5kbp),pXL3678(pCOR-AFP,3.7kbp),pXL3227(pCOR-lacZ 5.4kbp)和pXL3397(pCOR-B删除FVIII,6.6kbp)。所有的质粒都是从如实施例4所述得到的澄清裂解物中用两步阴离子交换纯化的。还研究了ColE1衍生的质粒pBKS+(pBluescript II KS+,来自Stratagene),其通过CsCl中超离心纯化。所有质粒都为其超螺旋(>95%)拓扑状态或形式。
在每个质粒DNA纯化实验中,溶于6ml的2M NaCl,0.2M乙酸钾(pH 5.0)中的300μg质粒DNA以30cm/h的流速加载到含有上述寡核苷酸5′-TTCTTTTTTTTCTT-3′(SEQ ID NO:11)亲和柱上。用5倍体积的相同缓冲液洗涤柱子后,结合的质粒用1M Tris/HCl,0.5mMEDTA(pH 9.0)洗脱并用紫外(260nm)和用Millipore Gen-Pak柱(Marquet et al.,BioPharm,1995,8,26-37)离子交换色谱来定量。从级分中收集的质粒回收为:pXL3296,207μg;pXL3179,196μg;pXL3579,192μg;pXL3678,139μg;pXL 3227,97μg;及pXL 3397,79μg。
当pBKS在该柱上进行色谱时检测不到质粒结合(<3μg)。这说明寡核苷酸5′-TTCTTTTTTTTCTT-3′(SEQ ID NO:11)与pCOR(oriγ)中互补的14体序列5′-AAGAAAAAAAAGAA-3′(SEQ ID NO:10)形成稳定的三螺旋结构,但并不与pBKS中紧密相关的序列5′-AGAAAAAAAGGA-3′(SEQ ID NO:8)形成这样的结构。这说明引入单个非不规则的三联体(这里是T*GC)就可能造成整个三螺旋结构失去稳定
作为对照,当pXL3179在空白柱上进行色谱时没有观察到质粒结合(<1μg),所述空白柱是在严格相似的,但没有寡核苷酸的条件下合成的。
通过在本文报道的条件下操作该亲和纯化柱,pXL3296制备物的宿主基因组DNA污染水平从2.6%下降到0.07%。类似地对于pXL3179制备物,当样品用相同的亲和柱进行色谱时,宿主基因组DNA污染水平从0.5%下降到0.008%。
实施例13
下面的实施例显示用三螺旋亲和色谱纯化ColE1衍生质粒。已经证明该技术可将核酸污染物(尤其是宿主基因组DNA和RNA)去除到使用常规色谱方法尚未达到的水平。
通过将具有5′-TCTTTTTTTCCT-3′(SEQ ID NO:9)序列的寡核苷酸偶联到如上面实施例所述高碘酸盐(periodate)氧化的Sephacryl S-1000SF上来合成三螺旋亲和凝胶。
在实施例9的条件下,将质粒pXL3296(无转基因的pCOR)和ColE1衍生的质粒pBKS在含有寡核苷酸5′-TCTTTTTTTCCT-3′(SEQID NO:9)的1ml柱上进行色谱。在收集的级分中的质粒回收为:pBKS,175μg;pXL3296,<1μg。这说明寡核苷酸5′-TCTTTTTTTCCT-3′(SEQID NO:9)与pBKS中互补的12体序列(5′-AGAAAAAAAGGA-3′)(SEQID NO:8)形成稳定的三螺旋结构,但并不与pCOR中紧密相关的12体序列(5′-AGAAAAAAAAGA-3′)(SEQ ID NO:34)形成这样的结构。这说明引入单个非不规则的三联体(这里是C*AT)就可能造成整个三螺旋结构失去稳定。
实施例14
按照下面的方法在没有挡板的锥形瓶中生产种子培养物。将工作细胞库(working cell bank)以0.2%v/v的接种率接种到含有M9modG5的锥形瓶中。将该菌株在220rpm,37°±1℃摇床上培养大约18±2小时直到葡萄糖耗尽。这样得到200ml的种子培养物。培养物的光密度预计为A600在2-3左右。
然后在第一发酵罐中形成预培养物(pre-culture)。无菌条件下将种子培养物转移到含有M9modG5培养基的预发酵罐(pre-fermentor)中,保证接种率为0.2%(v/v),并在通气和搅拌下培养。pO2维持在高于40%饱和度。16小时后葡萄糖耗尽时收集培养物。这样得到大约30升的预培养物。该培养物的光密度预计为A600在2-3左右。
然后在第二发酵罐中形成主培养物(main culture)。无菌条件下将30升的预培养物转移到装有270升灭菌的FmodG2培养基的发酵罐中,保证接种率为大约10%(v/v)。以分批模式开始培养以积累一些生物质。大约4小时后初始的糖一旦耗尽,则开始葡萄糖补料。对通气、搅拌、pO2(40%)、pH(6.9±0.1)、温度(37±1℃)和葡萄糖补料进行控制以维持接近0.09h-1的比生长速率。补料大约35小时后培养终止。这样得到大约400升培养物。该培养物的光密度预计为A600在100左右。
进行第一分离步骤,该步骤称为细胞收集。用disk stack centrifuge收集生物质。将培养液浓缩3到4倍以去除废培养基并连续地重悬于400升无菌的S1缓冲液中。这样得到大约500升的预处理的生物质。DCW=25±5g/L。
进行第二分离步骤,该步骤称为浓缩步骤。在S1缓冲液中重悬/均质后,用分离器再次处理细胞产生浓缩浆液。这样得到大约60-80升洗涤并浓缩的浆液。DCW=150±30g/L;pDNA=300±60mg/L。
然后进行冷冻步骤。无菌条件下将所述浆液分装到20L的FlexboyTM袋中(装满50%的容量),然后在进一步的下游加工前,在-20℃±5℃冷冻。这样得到冷冻的生物质。pDNA=300±60mg/L;超螺旋形式>95%。
然后进行细胞融解步骤。将冷冻的袋子加温到20℃,并用100mMTris盐酸,10mM EDTA,20mM葡萄糖将细胞浆液稀释到40g/L,pH8.0,在细胞裂解前,将该悬液在搅动下置于20±2℃1小时。这样得到融解的生物质浆液,pH=8.0±0.2。
该步骤中可以使用20℃左右的温度。
然后进行碱裂解步骤。细胞裂解步骤包括将稀释的细胞悬液和0.2N NaOH-35mM SDS(溶液S2)泵过在线的混合器,然后在盘管中进行连续接触步骤。连续接触步骤是为了保证细胞的完全裂解和基因组DNA及蛋白的完全变性。被裂解的细胞溶液在线与溶液3(S3):冷却的3M乙酸钾-2N乙酸混合,然后在冷却搅动的容器中收集。加入溶液S3造成基因组DNA、RNA、蛋白质和KDS的沉淀。
然后进行裂解物过滤。中和的裂解物在5±3℃无搅动下保温2到24小时,并通过3.5mm的栅网过滤器过滤以除去大部分的沉淀物质(絮凝相),然后进行深层过滤作为精滤步骤。由此得到澄清的裂解物,具有大于90%的超螺旋质粒浓度。
然后进行阴离子交换色谱。澄清的裂解物溶液用纯化水稀释到50mS/cm的目标电导率值,双层滤器(3μm-0.8μm)并加载到阴离子交换柱上。使用装填了11.0LTMAE HiCap(M)树脂(Merck;#1.10316.5000)的300mm柱。将澄清的裂解物加载到柱上并使用分步梯度(step gradient)的NaCl洗脱。大部分结合到柱上的污染物被大约61mS/cm的NaCl溶液洗脱,而DNA质粒用大约72mS/cm的NaCl溶液洗脱。这样得到具有高质粒DNA浓度的离子交换色谱洗脱物。
然后进行三螺旋亲和色谱。阴离子交换色谱柱的洗出物用大约0.5倍体积的含4.8M NaCl的500mM乙酸钠(pH4.2)溶液稀释,然后泵过用含2M NaCl的50mM乙酸钠(pH 4.5)平衡的三螺旋亲和色谱柱。该柱的直径为300mm,并含有10.0L的THAC SephacrylTM S-1000凝胶(Amersham Biosciences;Piscataway,NJ)。用含有1M NaCl的50mM乙酸钠(pH 4.5)冲洗柱子,并用含0.5mM EDTA的100mM Tris(pH9.0)洗脱NV1FGF。这样得到具有高质粒浓度的三螺旋亲和色谱洗脱物。
然后进行疏水相互作用色谱。三螺旋亲和色谱洗脱物用3.6倍体积的Tris(8.0)中的3.8M硫酸铵溶液稀释。通过0.45μm滤器过滤后,将滤液以60cm/h加载到装填了9.0L的Butyl-650S树脂(TosoH corp.,Grove City,OH)的疏水相互作用柱(直径300mm)上。柱子用大约240mS/cm的硫酸铵溶液冲洗,且NV1FGF用约220mS/cm的硫酸铵洗脱。这样得到没有松环(relax)形式的HIC洗脱物。
根据一个优选的实施方式,还进一步进行渗滤步骤。根据本领域的已知技术,标准的、商业上可以得到的渗滤材料适用于该过程。优选的渗滤方法是,根据质粒的大小,使用具有30,000到500,000范围的分子量截留的超滤膜来进行渗滤。该渗滤步骤可以交换缓冲液,然后进行浓缩。步骤12的洗脱物通过切向流过滤(膜截留,30kDa)浓缩3到4倍到大约2.5到3.0mg/mL的目标浓度,且该浓缩液通过用10倍的盐水恒定体积渗滤交换缓冲液,并用盐水调节到目标质粒浓度。根据浓缩液样品的260nm吸收计算NV1FGF浓度。NV1FGF溶液通过0.2μm囊式过滤器过滤,并保存在2-8℃冷室的容器中直到进一步加工。这样得到纯化的浓缩液,其超螺旋质粒的质粒DNA浓度为70%,75%,80%,85%,90%,95%和优选99%左右。本方法的总质粒回收率为至少35%,40%,45%,50%,55%,60%,65%,70%和80%,平均回收率为60%。
实施例15
在更纯化的质粒DNA制备物中,将包含离子交换色谱(AEC)步骤、三螺旋亲和色谱步骤(THAC)和疏水色谱步骤(HIC)的上述实施例的方法的结果与先前已知的方法进行比较。此新方法已经与先前已知的方法进行了比较并且产生了具有少得多的量的基因组DNA、RNA、蛋白质和内毒素的pDNA制备物。这由图3反映出来。这些实验显示,对于有效地去除所有的污染物,AEC、THAC和HIC与一些2步组合相比,提供了令人惊异的更高的纯化产率。这些步骤的组合,对于将质粒DNA与其他生物物质和污染物,例如蛋白质和内毒素,RNA和基因组DNA,及开环质粒分离的效率,提供了明显的协同作用。另外,这些协同步骤的组合,即根据本发明的AEC/THAC/HIC,不但可以获得高度纯化的药物级质粒DNA,还可以获得高度纯化的、完全超螺旋的、多于80%,85%,90%,95%和多于99%的质粒DNA的组合物。
实施例16
上述实施例的方法包括离子交换色谱步骤,三螺旋亲和色谱步骤及疏水色谱步骤,用于制备高度纯化的质粒DNA制备物;将该方法与先前已知的方法作比较。如图4所示,令人惊讶的是,本发明产生的pDNA制备物所具有的基因组DNA,RNA,蛋白质和内毒素的量低得多,在低于ppm的范围。图4还显示,本发明的方法显示所得的产品质量高达10g。
实施例17
如实施例14所述的渗滤步骤按下面的条件进行:步骤a的缓冲液和步骤b的缓冲液被用来确定最佳的条件来进行:
iii)第一步渗滤(步骤a),对12.5到13.0倍体积的50mM Tris/HCl,150mM NaCl,pH 7.4(名为缓冲液I)和
iv)对上面步骤a)的渗余物进行第二步渗滤(步骤b),对3.0到3.5倍体积的盐水赋形剂(150mM NaCl)渗滤。
这个根据本发明的可供选择的渗滤步骤高效地、大量地去除硫酸铵和EDTA。而且,本渗滤步骤后,可获得150mM左右的合适的NaCl目标浓度和400μM-1mM的Tris终浓度。质粒DNA制剂的组成的例子如下面表6所示,和
实施例18
根据实施例13生产了技术批次的质粒DNA NV1FGF API(活性药物成分),称为LS06,其中使用了实施例17中描述的渗滤过程步骤。洗脱物首先以大约2mg API/mL对大约13倍体积的缓冲液I渗滤,所得的渗余物对大约3倍体积的盐水赋形剂渗滤。然后用0.2μm滤器过滤最终的渗余物并将其调节到1mg/mL。最终的API(pH 7.24)在Duran玻璃瓶中+5℃下保存直到DP生产。
对保存在Duran玻璃瓶中(API)和8-mL小瓶中用于药品生产(DrugProduct manufacturing)的LS06样品进行稳定性研究。+5℃下90天后,所有样品的脱嘌呤化和开环的程度几乎检测不到(0.3%)。+25℃下90天后脱嘌呤化和开环的程度也相当低。根据该研究计算的脱嘌呤化和开环速率为1%每月(图8)。
该研究显示质粒DNA NV1FGF的稳定性特征在本发明的制剂中是非常稳定的,在本发明的制剂中的pH值维持在7-7.5左右。虽然脱嘌呤率和质粒缺口率(nicking rate)在+25℃下一般大大加速,但本申请人已证明质粒DNA甚至在室温下也可在长时间内保持稳定和不降解。
本说明书应当根据本说明书内引用的参考文献的教导来理解。本说明书内的实施方式部分提供了本发明的实施方式的说明,其不应被理解为限制本发明的范围。本领域的技术人员容易认识到,许多其他的实施方式也为本发明所涵盖。本公开中所引用的所有出版物和专利都以其全文并入本文作为参考。只要并入本文作为参考的材料与本说明书抵触或不一致,本说明书当优先于任何这样的材料。本文对任何参考文献的引用不等于承认该参考文献构成对于本发明的先有技术。
除非另有说明,所有表示本说明书包括权利要求中所用的成分的量、反应条件等等的数字,应被理解为在一切情况下均被术语“大约”所修饰。因此,除非另有相反的说明,数字表示的参数都是近似值,而且可能取决于本发明寻求获得的所希望的性质而变化。在最低限度上,并且不作为将等同原则的适用限制于权利要求的范围的企图,每个数字表示的参数应该根据有效位数和普通的舍入方法来理解。
除非另有说明,位于一系列元素前面的术语“至少”应当理解为指的是该系列中的每一个元素。本领域的技术人员仅利用常规实验就将认识到或者能够发现本文中描述的该发明的具体实施方式的等价方案。这些等价方案当为下面的权利要求所涵盖。
参考文献
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Claims (13)
1.分离自细胞的药物级质粒DNA组合物,其包含少于约0.01%的染色体DNA或基因组DNA。
2.权利要求1的药物级质粒DNA组合物,其包含少于约0.001%的染色体DNA或基因组DNA。
3.权利要求1或2的药物级质粒DNA组合物,其包含少于约0.0001%的染色体DNA或基因组DNA。
4.权利要求1-3中任一项的药物级质粒DNA组合物,其包含少于约0.00008%的染色体DNA或基因组DNA。
5.权利要求1-4中任一项的药物级质粒DNA组合物,其包含少于约0.01%的宿主细胞RNA污染物。
6.权利要求1-5中任一项的药物级质粒DNA组合物,其包含少于约0.0001%的宿主细胞蛋白质污染物。
7.权利要求1-6中任一项的药物级质粒DNA组合物,其基本上不含有可测量到的内毒素污染物。
8.权利要求7的药物级质粒DNA组合物,其含有少于0.1EU/mg的内毒素。
9.权利要求1-8中任一项所要求保护的药物级质粒DNA组合物,包括基本上为超螺旋形式的质粒DNA。
10.权利要求1-9中任一项所要求保护的药物级质粒DNA组合物,包括大约或多于99%的闭环形式的质粒DNA。
11.权利要求1-10中任一项所要求保护的药物级质粒DNA组合物,其中所述质粒包括条件性复制起点。
12.权利要求1-10中任一项所要求保护的药物级质粒DNA组合物,其中所述质粒编码成纤维细胞生长因子。
13.权利要求1-12中任一项所要求保护的药物级质粒DNA组合物,其中所述质粒是名为NV1FGF的质粒。
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