KR20020092778A - Ｄｎａ 정제방법 및 정제된 ｄｎａ - Google Patents
Ｄｎａ 정제방법 및 정제된 ｄｎａ Download PDFInfo
- Publication number
- KR20020092778A KR20020092778A KR1020017015298A KR20017015298A KR20020092778A KR 20020092778 A KR20020092778 A KR 20020092778A KR 1020017015298 A KR1020017015298 A KR 1020017015298A KR 20017015298 A KR20017015298 A KR 20017015298A KR 20020092778 A KR20020092778 A KR 20020092778A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- plasmid dna
- dna
- hydrophobic interaction
- medium
- endotoxin
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 138
- 238000000746 purification Methods 0.000 title description 33
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 241
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims abstract description 118
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims abstract description 102
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims abstract description 60
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 53
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 30
- 239000012535 impurity Substances 0.000 claims abstract description 23
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical group N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 87
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 87
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 87
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 43
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 40
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 40
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 38
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 35
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 33
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 33
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 27
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 25
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 21
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 18
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical group [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 14
- 125000004051 hexyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims description 14
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 12
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 11
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 10
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims description 10
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M Methacrylate Chemical compound CC(=C)C([O-])=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 8
- 125000002347 octyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 8
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 claims description 8
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000012560 cell impurity Substances 0.000 claims description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 7
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 claims description 6
- 125000002704 decyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims description 6
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 6
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 5
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 4
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims description 4
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 4
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 4
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 claims description 4
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 claims description 4
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 4
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 claims description 3
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000010299 hexamethylene tetramine Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000004312 hexamethylene tetramine Substances 0.000 claims description 3
- VKYKSIONXSXAKP-UHFFFAOYSA-N hexamethylenetetramine Chemical compound C1N(C2)CN3CN1CN2C3 VKYKSIONXSXAKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 claims description 3
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 claims description 2
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 claims 4
- 125000001400 nonyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims 4
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 claims 3
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 claims 2
- 230000003075 superhydrophobic effect Effects 0.000 claims 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 abstract description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 51
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 37
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 36
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 33
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 24
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 22
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 21
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 17
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 13
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 13
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 12
- 239000000463 material Substances 0.000 description 12
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 11
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 10
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 10
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 9
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 9
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 9
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 9
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 8
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 6
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 6
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 6
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 5
- 238000011013 endotoxin removal Methods 0.000 description 5
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 5
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 3
- 238000011021 bench scale process Methods 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- -1 genome DNA Proteins 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 3
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 239000012521 purified sample Substances 0.000 description 3
- 239000004627 regenerated cellulose Substances 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- SJHPCNCNNSSLPL-CSKARUKUSA-N (4e)-4-(ethoxymethylidene)-2-phenyl-1,3-oxazol-5-one Chemical compound O1C(=O)C(=C/OCC)\N=C1C1=CC=CC=C1 SJHPCNCNNSSLPL-CSKARUKUSA-N 0.000 description 2
- IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 2,2'-piperazine-1,4-diylbisethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 2
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCS(O)(=O)=O JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000012539 chromatography resin Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000002086 displacement chromatography Methods 0.000 description 2
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N monopropylene glycol Natural products CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 2
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 229920000428 triblock copolymer Polymers 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- OAYXUHPQHDHDDZ-UHFFFAOYSA-N 2-(2-butoxyethoxy)ethanol Chemical compound CCCCOCCOCCO OAYXUHPQHDHDDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 2-(2-methoxy-5-methylphenyl)ethanamine Chemical compound COC1=CC=C(C)C=C1CCN SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 2-Propenoic acid Natural products OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUPXYSSGJWIURR-UHFFFAOYSA-N 3-octoxypropane-1,2-diol Chemical compound CCCCCCCCOCC(O)CO GUPXYSSGJWIURR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004491 Antisense DNA Proteins 0.000 description 1
- 244000132059 Carica parviflora Species 0.000 description 1
- 235000014653 Carica parviflora Nutrition 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- 238000011050 LAL assay Methods 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 1
- FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine Chemical compound OCCN(CCO)CC(O)=O FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007990 PIPES buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 235000014443 Pyrus communis Nutrition 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003816 antisense DNA Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003637 basic solution Substances 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000007998 bicine buffer Substances 0.000 description 1
- 235000010290 biphenyl Nutrition 0.000 description 1
- 239000004305 biphenyl Substances 0.000 description 1
- 125000006267 biphenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012468 concentrated sample Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012850 discrimination method Methods 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000006481 glucose medium Substances 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- VIJMMQUAJQEELS-UHFFFAOYSA-N n,n-bis(ethenyl)ethenamine Chemical compound C=CN(C=C)C=C VIJMMQUAJQEELS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001971 neopentyl group Chemical group [H]C([*])([H])C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N phenylbenzene Natural products C1=CC=CC=C1C1=CC=CC=C1 ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 229920002492 poly(sulfone) Polymers 0.000 description 1
- 229920006393 polyether sulfone Polymers 0.000 description 1
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000014102 seafood Nutrition 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 1
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 125000004079 stearyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- HGJMXJABQKRULV-UHFFFAOYSA-K tetrabutylazanium;phosphate Chemical class [O-]P([O-])([O-])=O.CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC.CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC.CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC HGJMXJABQKRULV-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000007631 vascular surgery Methods 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
- C12N15/101—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by chromatography, e.g. electrophoresis, ion-exchange, reverse phase
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
본 발명은 플라스미드 DNA를 포함하는 수성용액에서 엔도톡신, RNA, 단백질, 호스트 세포 DNA와 같은 호스트 세포의 불순물을 제거하는 단계를 포함하는 플라스미드 DNA의 정제방법과 소수성 상호반응 크로마토그래피 지지체를 사용하여 수퍼코일형 및 흠집나거나 또는 풀려진형 플라스미드 DNA의 혼합물을 포함하는 수성 용액으로부터 수퍼코일형 플라스미드 DNA의 정제 및 단리방법을 제공한다.
Description
유전자치료는 인간 질병의 치료에 있어서 새로운 치료 패러다임을 제공한다. 시스틴 피브로 블라스트, 여러 유형의 암 등의 유전적인 질병 및 면역이상 질병의치료에 있어서 DNA의 사용은 현재 폭 넓게 적용될 수 있을 것으로 기대되고 있다. 유전자 산물 또는 그들 자체의 유전자 산물과 반응하는 약물의 사용에 의하여 질병의 표현형을 변화시킨 다기보다는, 유전자 치료는 질병의 치유에 있어서 특정 유전자 산물을 근본적으로 변화시킬 수 있다. 또한, 유전자 치료는 약물 전달 시스템으로서 사용된다. 이를 성취하기 위하여, 유용한 산물 (RNA, 펩티드, 단백질 등)을 생산하는 유전자 또는 그 자체로 유용한 산물 (안티센스 DNA의 사용과 같은)인 유전자가 인 비보, 익스 비보 또는 인 비트로 방법으로 개별적으로 나중에 투여된 개인이나 호스트 세포의 호모로고스, 헤테로로고스 또는 오토로고스 세포의 DNA 또는 세포 내부로 삽입된다. 예를 들어, 혈관수술 중에 고형화억제 인자를 만드는 유전자가 위험한 혈액응고를 저해하는 목적으로 혈관세포의 DNA에 삽입될 수도 있다. 많은 다른 조건들이 이처럼 일반적인 접근을 사용하여 치료할 목적으로 그들 자신을 빌려준다.
유전자치료는 시스틱 블라스트, 심장병, 암, 관절염 및 다른 질환 등의 4,000종 이상으로 알려진 유전적 질환의 치료를 위한 강력한 수단이 될 것으로 기대되고 있다. 유전자 치료는 일반적으로 개체에게 유전물질 (DNA)의 전달을 필요로 한다. 유전자 전달 또는 유전물질의 전달은 조직 또는 혈액에 유전자를 포함하는 바이러스 또는 플라스미드 DNA를 직접적으로 투여하거나, 다른 외부 DNA에 실험실에서 조작된 세포를 간접적으로 삽입시키거나 또는 당업계에서 알려진 여러 가지 캡술화 또는 담체 기술을 통하여 성취될 수 있다. 최근의 연구로는 DNA의 직접적인 전달이 가능한 것으로 보고되고 있다. 여러 가지 서로 다른 시스템이 소마틱 유전자 전달에 사용되거나 또는 고려되고 있다. 예를 들어 DNA (원래의 또는 복합된), RNA 바이러스 (레트로바이러스) 및 DNA 바이러스 (아데노바이러스, 아데노어소시에이트 바이러스 [AAV], 허피스 바이러스 및 폭스바이러스) 등이 이에 포함된다.
유전자 치료의 플라스미드 DNA의 사용과 같은 바이러스를 사용하지 않는 형태의 중요한 장점은 대량으로 생산하기 용이하고, 호스트 세포 DNA로 이형의 DNA가 삽입되지 않기 때문에 안전하며, 가상적으로 제한되지 않는 크기와 수의 유전자 또는 유전자 절편을 사용하는 것이 가능하다는 점이다. 아울러, 유전자 치료에서 플라스미드 DNA의 사용은 일반적으로 환자에게 원하지 않는 면역반응을 일으키는 외래성 유전자 또는 단백질을 사용하지 않는다. 추가적으로, 바이러스 벡터와 같은 플라스미드 DNA의 사용의 변형은 상대적으로 생산비가 많이 든다.
일반적으로, 플라스미드 DNA의 생산에 이용되는 현재의 방법은 수퍼코일형 플라스미드 DNA와 플라스미드 DNA의 최종 적용에 유용하지 않는 흠있는 (또는 풀려진) DNA 산물의 혼합물을 생산한다. 본 발명의 방법은 현재 수퍼코일형 플라스미드 DNA의 회수 및 사용에 의하여 예시된 수퍼코일형 및 흠집형 플라스미드 DNA의 비-파괴적인 분리방법을 제공하는데, 당업계에서는 본 발명에 개시된 플라스미드 DNA의 분리가 유용한 생산방법이라고 평가하게 될 것이다. 아울러, 현재에는 유전자 치료의 맥락에서 수퍼코일형 플라스미드 DNA의 높은 순도를 필요로 하지만, 플라스미드 DNA가 유전자치료에서의 사용을 넘어서 재조합 분자 생물학에서 폭 넓게 사용된다고 평가될 것이며, 본 발명에서는 단리되고 정제된 수퍼코일형 플라스미드 DNA를 위한 제조방법으로서 넓게 적용될 수 있음을 발견하였다.
현재, 플라스미드 DNA의 두 가지 형태를 구별하는 방법으로는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG0, 세제, 및 헥사민 코발트, 스퍼미딘 및 폴리비닐피롤리돈 (PVP) 같은 다른 요소들 같은 부가물을 사용한 이온 교환 크로마토그래피 (A Novel, rapid process for purification of plasmids for gene therapy (Bhikhabhai R. Olivier M. and Blanche F., Amersham Pharmacia Biotech R & D, 75184 Uppsala, Sweeden and RPR Gencell, Rhone-Poulenc Roer, Center de Recherche de Vitry-Alfortville, 13 quai Jules Guesde, 94400 Vitry sur Siene, France. Publication number: 18-1129-51; Preparative purification of supercoiled plasmid DNA using anion exchange chromatography, Duarte Miguel Prazeres, Thomas Schleup, Charles Cooney, Journal of Chromatography A, 606 (1998), 31-45) 또는 크기 구별 크로마토그래피 (Prazeres, D. M., A comparison of Gel Filtration Chromatographic Supports for Plasmid purification, Biotechnology Techniques Vol. 11, No. 6, June 1997, p 417-420)가 사용된다. 최근에는, 부가물로서 PEG를 사용한 수퍼코일형 플라스미드 DNA의 정제를 위한 하나의 특허가 발표되었다 (Horn, et al (미합중국특허 제 5,707,812)). 그러나, 현재 알려진 방법은 수퍼코일형 DNA와 흠집난 (또는 풀려진) DNA를 효과적이고 비용면에서 효율적인 분리를 제공하지 못한다. 추가적으로, 많은 알려진 방법이 PEG 또는 다른 부가물을 사용하는 단점으로 인해 고민하고 있는데, 이들은 플라스미드 DNA의 조작에 요구되지 않고, 그들은 매우 어려운 추가적인 분리, 처리 및 질 조절 방법을 요구하며, 추가적인 시간과 비용이 소요되기 때문이다.
플라스미드 DNA의 수퍼코일형과 풀려진형의 분리를 위한 알려진 방법의 변형은 매우 비싼 독점적인 레진을 사용하는데, 또한 처리과정 중에 아세토니트릴, 에탄올 등의 용매와 트리에틸렌아민 및 테트라부틸 암모늄 포스페이트 등의 다른 요소들을 사용한다. 이러한 방법은 용매의 사용 때문에 대규모로 사용할 수 없다. 더욱이, 그들은 출발물질에서 막대한 양의 오염된 풀려진형 플라스미드 DNA가 이들 레진의 해상도 용량을 감소시키는 경향 때문에, 풀려진형 플라스미드 DNA가 다량 존재하는 출발물질에는 적용할 수 없다 (Green, A. P. et al., Bio Pharm. Vol. 10, No. 5, pages 52-62, May 1997.).
수퍼코일형 및 풀려진형 DNA를 분리하는 추가적인 방법이 크기 구별 크로마토그래피에 연결되는데, 서로 다른 작은 크기에 근거하여 플라스미드 DNA의 두가지 형태를 구별한다. 이들 컬럼은 상대적으로 길어지기 때문에 대용량에 적용하기에는 불가능하다. 더욱이, 크기 구별 방법에는 농축된 시료용액이 요구되는데, DNA가 높은 점성을 가지고 있어 플라스미드 DNA를 얻기가 불가능하다. 참조, 젤 필트레이션 크로마토그래피와의 비교는 플라스미드 정제를 위하여 제공된다 (G.N.M. Ferreira, J.M.S. Cabral and D.M.F. Prazeres, Biotechnology Techniques, Volume 11, No. 6, June 1997, pp 417-420).
세균으로부터 생산되고 때로는 수퍼코일형과 풀려진형 DNA의 혼합물을 포함하는 플라스미드 DNA의 제조는 FDA에서 요구되는 것처럼, 엔도톡신을 제거해야 하는데, 많은 세균에서 생산되는 엔도톡신은 플라스미드 DNA를 제공받는 호스트에서발열 및 패혈증과 같은 염증반응의 원인이 되는 것으로 알려져 있다. 일반적으로, 이러한 엔도톡신은 그람-음성균의 외막의 요소인 당지질 또는 이들의 절편으로, 호스트 세포의 부가물 또는 호스트 세포막 또는 예를 들어 유전자 치료를 위한 플라스미드 DNA의 발현 및 가공에 사용되는 거대분자 같은 거대 부가물의 일부로서 DNA 제조물에 존재한다. 따라서, 엔도톡신의 제거는 치료 또는 예방의 옹도를 위한 플라스미드 DNA의 정제에 있어 필수적인 단계이다.
플라스미드 DNA 용액으로부터의 엔도톡신의 제거는 기초적으로 엔도톡신의 음이온 구조가 사용된다; 그러나, 플라스미드 DNA 역시 음이온이기 때문에, 플라스미드 DNA는 우선적으로 용출되고, 엔도톡신은 결합되어 있는 조건 하에, 이들 분자가 결합할 수 있는 음이온 교환 레진으로 수행된다. 그러한 분리는 플라스미드 DNA와 다량의 엔도톡신 용출물에 의하여 부분적으로 제거되고, 및/또는 플라스미드 DNA의 저 수준의 회수율의 결과를 초래한다. 다른 방법으로는 세제를 이용하는데, 이 또한 문제점이 있다 (Process for the depletion or removal of endotoxins, Coplan, Metin, Moritz, Peter, Schorr, Joachim, 미합중국 특허 제 5,747,663). 아울러, 이들 레진의 결합용량은 엔도톡신과 플라스미드 DNA가 결합하는 레진 ml당 103 내지 104 EU (엔도톡신 유닛)에 불과한데, 예를 들어 전형적으로 사용되는 레진 3 내지 80 리터는 50,000 내지 2000 EU/ml인 것으로 보고되었다 (Green, A. P. et al. Bio. Pharm. Vol. 10, No. 5, pages 52-62, May 1997. Sterogene technical profile DNA Etox, Sterogene, 5922 Farnsworth Cr., Carlsbad, CA 92008).
본 발명은 1999년 5월 28일자로 출원된 미합중국 가특허출원 제 60/136,772호를 청구하고 있으며, 전체적인 내용은 참조문헌으로 포함되어 있다.
본 발명은 플라스미드 DNA를 포함하는 수성용액에서 엔도톡신, RNA, 단백질, 호스트 세포 DNA와 같은 호스트 세포의 불순물을 제거하는 단계를 포함하는 플라스미드 DNA의 정제방법과 소수성 상호반응 매질을 사용하여 수퍼코일형 및 흠집나거나 또는 풀려진형 플라스미드 DNA의 혼합물을 포함하는 수성 용액으로부터 수퍼코일형 플라스미드 DNA의 정제 및 단리방법을 제공한다. 또한, 제공되는 것은 DNA 정제의 실험실- 또는 벤치-규모와 같은 소규모를 위한 향상된 방법이다. 본 발명은 플라스미드 같은 바람직하게는 수퍼코일형 DNA의 정제 및/또는 분리방법을 제공한다.
도 1은 수퍼코일되고 풀려진 플라스미드 DNA를 분리하는 예시적인 방법을 수행하는데 관여하는 여러 단계의 플로우 다이아그램을 나타낸다.
도 2는 예시적인 방법에서 사용되는 리간드 화합물과 결합하는 여러 가지 소수성 반응 지지체의 개념적인 묘사를 나타낸다.
도 3은 플라스미드 DNA로부터 엔도톡신을 분리하는 예시적인 방법을 수행하는데 관여하는 여러 단계의 플로우 다이아그램을 나타낸다.
도 4는 (삽입도) SYBR GOLD로 염색된 실시예 5 (부틸 HIC) 의 아가로스 겔 이미지를 스캔한 것으로, 1번 레인은 수퍼코일 DNA 래더를 포함하고; 2번 및 3번 레인은 피크 1 (풀려진)의 시료를 포함하며; 3 내지 5레인은 피크 2의 시료 (수퍼코일)를 포함한다 (레인은 좌에서 우로 번호 매겼다). 부피당 흡광도를 나타내는 실시예 5의 크로마토그램은 풀려진 DNA (피크 1)와 수퍼코일 DNA (피크 2)가 분리되었음을 나타낸다.
도 5는 (삽입도) SYBR GOLD로 염색된 실시예 6 (부틸 HIC) 의 아가로스 겔 이미지를 스캔한 것으로, 1번 레인은 마커를 포함하고; 2번 및 3번 레인은 피크 1 (풀려진)의 시료를 포함하며; 4 내지 6번 레인은 피크 2의 시료 (수퍼코일)를 포함한다 (레인은 좌에서 우로 번호 매겼다). 실시예 6의 크로마토그램은 풀려진 DNA (피크 1)와 수퍼코일 DNA (피크 2)가 분리되었음을 나타낸다.
도 6은 (삽입도) 실시예 7의 아가로스 겔 이미지를 스캔한 것으로, 1번 레인은 마커를 포함하고; 2번 및 3번 레인은 컬럼에 가하여진 물질을 포함하며; 4번 레인은 인공피크를 나타내는 물질을 포함하고; 5번 레인은 2.4 M AS 용출 물질을 포함하며; 및 6번 레인은 1 M AS 용출 물질을 포함한다 (레인은 좌에서 우로 번호 매겼다). 상기 크로마토그램은 플라스미드 DNA의 풀려진 형태와 수퍼코일 형태가 분리됨을 나타내는 데, 인공피크는 넓은 첫 번째 (좌측) 피크이고, 오른쪽으로 풀려진 형태의 피크와 수퍼코일 형태의 피크가 가각각 나타낸다.
도 7은 (삽입도) 실시예 8 (헥실 HIC) 의 아가로스 겔 이미지를 스캔한 것으로, 1번 레인은 마커를 포함하고; 2 내지 4번 레인은 피크 1 (풀려진)의 시료를 포함하며; 및 5번과 6번 레인은 피크 2의 시료 (수퍼코일)를 포함한다 (레인은 좌에서 우로 번호 매겼다). 상기 크로마토그램은 수퍼코일 형태로부터 풀려진 형태가 분리됨을 나타낸다.
도 8은 SYBR GOLD로 염색된 실시예 9의 아가로스 겔 이미지를 스캔한 것으로, 1번 레인은 마커를 포함하고; 2번 레인은 컬럼에 적용된 물질을 포함하며; 3번, 4번 및 5번 레인은 각각 세척 1, 2, 및 3을 포함하고; 6번 레인은 1 M 용출액을 포함하며; 및 7번 레인은 물 용출액을 포함한다.
본 발명의 방법은 수퍼코일 플라스미드 DNA, 풀려진 플라스미드 DNA 및 엔도톡신과 같은 세포질 오염물의 소수성에서의 차이점을 개발한 것이다.
본 발명에 개시된 방법은 수퍼코일형 플라스미드 DNA, 코스미드 및 파지미드 벡터의 정제 및 분리에 유용하다. 상기 벡터 및 플라스미드 DNA는 어떠한 원천으로 부터라도 정제될 수 있다. 추가적으로, 엔도톡신, RNA, 단백질 및 크로모좀 DNA를 포함하는 오염물질의 유사한 혼합물이 이들 효모 및 포유동물 세포에 존재하는 것처럼, 효모 및 포유동물 세포에서 존재하는 플라스미드 DNA 및 코스미드는 또한 정제될 수 있다. 아울러, 이들 원천에서 플라스미드 및 코스미드 DNA의 수퍼코일형 형태를 수득하는 것이 필요하므로, 따라서, 본 명세서에 설명된 방법은 이러한 많은 적용에서 DNA의 정제시에 사용될 수 있다.
"소수성 상호작용 매질"은 (a) 지지체 부분과 (b) 지지체 부분에 직접 또는 간접적으로 결합된 소수성 부분을 포함하는 물질이다. 지지체 부위와 소수성 부위의 예는 본 명세서에 개시되어 있고, 당업계에 공지되어 있다. 상기 소수성 부위는 본 명세서에 개시된 분리방법에서 사용된 우성적인 결합을 위한 기초를 제공한다. "소수성 상호작용 매질"의 여러 가지 실례가 당업계에 공지되어 있고, 본 명세서에 개시되어 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 다른 단어인 "레진", "매트릭스", "컬럼", "미디어", "비드" 및 "소수성 반응 리간드" 는 소수성 상호작용 매질을 표시한다.
"DNA"는 제한되는 것은 아니나, 플라스미드 (수퍼코일형, 및/또는 플려진형 또는 흠집난형 중의 어떠한 형태), 코스미드, 또는 인공적인 크로모좀을 포함하는 디옥시리보누클레익산의 어떠한 형태를 의미한다.
"흠집난형" 또는 "풀려진형" DNA는 수퍼코일형이 아닌 DNA를 의미한다. "수퍼코일형" DNA는 당업계에 공지된 단어이다.
"오염된 불순물"은 DNA와 분리되거나 또는 단리되려는 어떠한 물질이다. 오염된 불순물은 호스트 세포 단백질, 엔도톡신, 호스트 세포 DNA 및/또는 RNA를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 오염된 불순물은 본 발명의 실행상황에 의존한다고 이해되었다. "오염된 불순물"은 호스트 세포에서 유래되거나 또는 유래되지 않는데, 즉, 호스트 세포 오염물이 존재하거나 또는 존재하지 않는다.
"단리" 또는 "정제"의 첫 번째 요소 (DNA의 경우)는 첫 번째 요소가 처음 발견되는 다른 요소로부터의 첫 번째 요소의 함량을 의미한다. 요구된 및/또는 수득가능한 정제의 정도는 본 명세서에서 제공된다. 바람직하게는, 본 발명의 방법은 5배 함량을 나타내고, 바람직하게는 약 10배 함량을 나타내며, 바람직하게는 약 20배 함량을 나타내고, 바람직하게는 약 50배 함량을 나타내며, 바람직하게는 약 100배 함량을 나타내고, 바람직하게는 약 200배 함량을 나타내며, 바람직하게는 약 500배 함량을 나타내고, 바람직하게는 약 1000배 함량을 나타낸다. 다시 말해서, 정제의 정도는 다른 요소에 대하여 또는 결과물의 관점에서, 첫 번째 요소의 퍼센트로서 표현된다. 그러한 퍼센트의 실례가 본 명세서에 개시되어 있다.
한 요소의 "우선적인" 또는 "선택적인" 결합 또는 제거는 주어진 환경에서 첫 번째 요소가 다른 요소의 관점에서 더욱 우수한 정도로 결합하거나 제거되는 것을 의미한다.
당업자에 의하여 이해되는 바와 같이, "제거" 또는 "결합"이 필수적인 것은 아니나, 바람직하게는 완벽하게, 또는 100%, 결합하거나 제거되는 것을 의미한다.
"수성" 용액은 일반적으로 물-기초적인 용액을 지칭하는데 (즉, 주 용매가 물이다), 용매로서 100% 물이 될 수도 있고, 또는 아닐 수도 있다.
재조합 세균 세포에서 생산된 플라스미드 DNA의 단리는 세포 용해단계와 세포질 찌꺼기의 제거단계를 포함하는데, 이는 여러 가지 방법으로 달성된다. 최종 용액은 플라스미드 DNA를 포함하는데, 전형적으로 다른 불순물 중에서 높은 함량의 엔도톡신을 포함한다. 본 발명의 방법은 첫 번째 단계로서 소수성 반응 크로마토그래피를 이용하여 RNA, 지놈 DNA, 단백질 및 엔도톡신 같은 키 불순물의 대부분의양을 제거를 제공하는데, 이때 플라스미드 DNA는 결합하지 않는다. 본 발명의 방법은 바람직하게는 10 mM 에틸렌디아민테트라아세트산 (EDTA)를 함유하거나 또는 함유하지 않는 2 M 암모늄셀페이트를 포함하는 pH 6.8 내지 8.5, 바람직하게는 pH 6.8 내지 7.4의 완충용액에서 세포 용해물로부터 수득한 혼합 용액을 투석하는 선택적인 단계와 프로필, 부틸, 옥틸 또느 헥실 리간드의 1종 또는 혼합물과 같은 소수성 반응 리간드를 가지고, 바람직하게는 사전에 10 mM EDTA를 함유하거나 또는 함유하지 않는 2 M 암모늄셀페이트를 역시 포함하는 pH 6.8 내지 8.5 (바람직하게는 pH 6.8 내지 7.4)의 완충용액으로 평형시킨 크로마토그래픽 지지체를 포함하는 충진된 크로마토그래피 컬럼에 선택적으로 투석된 용액을 흘려주는 단계를 포함한다. 흘려진 용액은 암모늄 설페이트 같은 염을 약 2 M 정도 함유하고, 불순물의 2% 미만의 플라스미드 DNA (수퍼코일형 및 풀려진형)를 포함한다. 이전의 단계에 여러 가지 영향을 받지만, 수퍼코일형 DNA의 함량은 50 내지 95 중량%, 전형적으로는 75 내지 85 중량%, 바람직하게는 80 내지 85 중량%의 범위이고, 혼합물로부터 풀려진형이 DNA를 제거하는 추가적인 정제과정을 필요로한다.
또한, 본 발명의 방법은 특정 수준 이하, 즉 < 10 EU/mg 플라스미드 DNA의 엔도톡신 수준을 가지는 정제된 플라스미드 DNA를 생산 가능하게 한다. 본 발명의 엔도톡신을 제거하는 방법은 대규모 또는 소규모에 적응시킬 수 있고, 치료용 및 연구용으로 경제적인 생산을 가능하게 한다. 상기 방법은 사용된 레진 밀리리터당 백만 유니트 이상의 용량을 가지는 대규모 생산을 위하여, 본 명세서에 개시된 소수성 레진에 대한 엔도톡신의 선택적 결합을 개발한 것이다.
엔도톡신을 제거하는 일반적으로 유용한 방법은 적은 용량 (1,000 내지 50,000 EU/레진 ml)을 가지고, 및/또는 플라스미드 DNA의 회수율이 낮으며 및/또는 화학물질을 사용하고 및/또는 치료용 등급으로 제조하는데 사용될 수 없다 (미합중국 특허 제 5,747,663호). 본 발명의 엔도톡신 제거방법은 플라스미드 DNA보다 엔도톡신의 소수성을 증가시키도록 약 2 M의 농도로 암모늄셀페이트 또는 염화나트륨 같은 염을 엔도톡신과 플라스미드 DNA가 함유된 용액에 현탁시켜서, 플라스미드 DNA에 비하여 부틸, 옥틸 및/또는 헥실기 같은 소수성 반응 리간드를 포함하는 레진에 엔도톡신이 결합하거나 우선적으로 반응하여 분리시킨다. 상기 염 농도는 RNA, 단백질 및 엔도톡신이 결합하기에 최적화되도록 처림함이 바람직하다. 낮은 염 농도는 엔도톡신이 본 명세서에 개시된 소수성 반응 리간드와 높은 친화도를 나타내어, 엔도톡신 혼자 결합하는데 중요하다.
엔도톡신을 제거하는 이 방법의 장점은 약 1,000,000 EU/레진 ml에 이르는 앤도톡신 레진의 막대한 용량, 단순함 및 95%이상의 플라스미드 DNA 회수율이다. 예를 들어, 500 mg의 플라스미드와 1천만 EU의 엔도톡신을 포함하는 플라스미드 DNA 용액이 레진 10 ml를 사용하여 정제될 수 있으나, 반면에 플라스미드 DNA와 엔도톡신이 결합하는데 최소한 1,000 내지 4,000 ml의 음이온 교환 레진이 필요하고, 음이온 교환 레진을 사용할 경우, 회수율이 낮다는 단점도 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 레진 비용을 100 내지 400배 절약할 수 있고, 컬럼작업 비용을 추가적으로 절약할 수 있으며, 생산물의 회수율을 향상시킨다. 상업적으로 유용한 DNA 에톡스 레진 (Etox resin)은 본 발명에서 사용되는 레진에 비하여 최소한 8배가 비싸다. 엔도톡신 제거에 유용한 화학적 특성을 가지는 또 다른 상업적인 레진 (PolyFlo-PureSyn Inc., 87 Great Valley Pkwy Malvern, PA 19355)은 5 내지 10배가 비싸고, 용매와 이온-쌍 화합물의 사용이 요구된다.
본 발명의 방법은 낮은 순도 (풀발물질은 풀어진형과 수퍼코일형 DNA이 혼합물이다)의 출발 물질로부터 90% 이상의 수퍼코일형 플라스미드 DNA를 포함하느 고품질의 플라스미드 DNA를 제공한다. 추가적으로, 본 발명의 방법은 유전자 치료를 위한 플라스미드 DNA의 생산에 사용되는 대용량의 제조공정에 적용할 수 있다. 본 발명의 방법은 질적인 저하를 야기시키는 전형적인 변이체, 즉 플라스미드 DNA의 풀어진형/흠집형의 발생, 에 독립적으로 높은 품질의 플라스미드 DNA의 생산을 유진한다. 이러한 변이체는 플라스미드 DNA를 생산하는 박테리아의 성장과정 중 및 이어지는 단리단계 및 정제단계에서 발생한다.
본 발명의 수퍼코일형 및 풀어진형 플라스미드 DNA를 분리하는 방법과 플라스미드 DNA와 엔도톡신을 분리하는 방법은 플라스미드 DNA와 엔도톡신의 형태가 소수성 반응 크로마토그래피 레진, 예를 들어 C4 내지 C10 알킬, 가지친 또느 직선형의 리간드 및 바람직하게는 부틸 또는 헥실 리간드를 포함하는 레진에 대하여 서로 다른 반응특성을 나타낸다는 발견에 기초한다. 상기 리간드는 본 발명의 분리, 정제 및/또는 단리 방법에 사용되는 우선적인 결합반응을 제공한다. 이러한 알킬 리간드를 가지는 소수성 레진이 본 발명에 유용하게 사용될 수 있음은 당업계에 공지된 기술로 인식될 수 있을 것이다. 또한, 상기 리간드의 예시는 전술한 바와 같다. 하기의 제한되지 않는 실시예는 본 발명에 개시된 방법을 나타낸다. 다음의 일반적인 방법이 사용되었고, 사용될 수 있다.
유전자 치료에 사용되는 플라스미드는 배양된 적절한 호스트 세균, 예를 들어 대장균에서 단리되었다. 본 발명에 개시된 하기의 실시예에서는 플라스미드 pE1A-K2를 포함하는 대장균 STBL-2가 사용되었다. 플라스미드 pE1A-K2는 아데노바이러스 타입 5의 억제유전자와 선택 마커로서 카나마이신 유전자를 포함하는 pUC 플라스미드 유도체이다. 배양은 pH 6.5 내지 7.8, 바람직하게는 7.0에서, 37℃의 온도에서, 인산칼륨 모노 베이직, 인산나트륨 다이 베이직, 암모늄 설페이트 및 마그네슘설페이트 같은 무기염을 포함하는 적절한 효모 단리물/포도당 배지에서 호기적으로 수행되었다. 공기순환은 배지 부피당 동일한 부피의 공기로 설정하고, 800 rpm으로 교반하였다. 세포는 이상태에서 포도당이 고갈될 때까지 수행하고, 이후의 배양의 DO는 포도당 공급과 교반에 의하여 조절되었다. 먹이는 포도당 (160 g/L), 효모 단리물 (80 g/L) 및 염 (1.5 g/L 암모늄 설페이트, MgSO4, 1.5g/L을 포함하는 인산 완충용액)의 농축용액을 포함한다. 배양이 끈난 후, 상기 세포는 원심분리 및 한외 여과막을 통한 여과에 의하여 수확되고, TE 완충용액 (pH 7.4)으로 세척되었다. 세포는 0.15 내지 0.2 N NaOH 용액과 1% 소듐도데실 설페이트 (pH 11.5 내지 13) 용액의 혼합액과 부드럽게 현탁된 후, 용해되었다. 상기 염기성 용액은 포타슘 아세테이트 용액으로 중화되었다. 상기 물질은 원심분리 또는 일련의 여과단계를 통하여 투명하게 되었다. 플라스미드 용액은 한외 여과막을 통하여 농축되고 TE 완충용액 (pH 7)으로 투석되었다. 여과지에 남겨진 잔류물은 언급된 배지에 직접 적용되었다.
용해물 내의 플라스미드 DNA 함량은 RNA 또는 크로모좀 DNA를 대량을 포함하는 총 핵산의 2% 미만이다. 아울러, 용해물은 엔도톡신과 세포성 단백질로 오염되었다.
또한, 본 발명은 단리되거나 또는 정제된 소규모-, 실험실 규모- 또는 벤치-규모의 생산방법 및 이때 사용되는 컬럼 장비 및 분리기를 제공한다. 대규모 생산과 비교하여 사로다른 상태에서 플라스미드 DNA의 소규모 생산은 당업계에 공지된 지식으로 이해될 수 있다. 특히, 소규모의 분리는 출발물질에 오염된 RNA의 큰 분획의 분리를 수반하는데, 상술한 바와 같이 대규모의 출발물질에서 RNA에 대한 플라스미드의 비율은 약 2% (wt/wt)이지만, 소규모의 비율은 0.1% (wt/wt)이다. 더욱이, 소규모 시료의 배양 부피는 일반적으로 2 ml 내지 2 L이지만, 대규모에서는 5 내지 1000L이다. 본 발명에서 소규모의 분리는 1 내지 20 ml의 부피, 바람직하게는 10 내지 15 ml의 부피를 가지는 반응기 또는 컬럼에서 약 100 ㎍ 내지 1 mg의 플라스미들르 포함한다. 따라서, 본 발명은 단리된 및/또는 정제된 DNA, 바람직하게는 엔도톡신, RNA 및 풀려진형의 DNA 같은 불순물로부터 수퍼코일형 DNA의 효과적인 소규모의 생산방법을 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
본 발명은 조함되어 또는 독립적으로 플라스미드의 분리, 단리 및/또는 정제방법을 제공한다. 특별히, 본 발명은 수퍼코일형 및 풀러진형 플라스미드 DNA의 분리, 정제 및/또는 단리방법을 제공할 뿐만 아니라, 요소 또는 절편을 포함하는 엔도톡신 같은 호스트 세포 오염물로부터 플라스미드 DNA의 분리, 정제 및/또는 단리방법을 제공한다. 정제된, 분리된 및/또는 단리된 플라스미드 DNA, 특히 수퍼코일형 플라스미드 DNA, 조성물이 본 발명에 의하여 제공된다. 또한, 본 발명은 플라스미드 DNA의 실험실- 또는 벤치-규모의 분리, 단리 및/또는 정제를 위한 방법과 장비를 제공한다.
본 발명은 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 혼합물에 존재하는 다른 요소로부터 폴리뉴클레오티드의 요구하는 유형을 단리하는 방법 및 원하는 유형의 폴리뉴클래오티드를 대량생산하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 혼합물에 소수성 상호반응 매질을 부착시켜서 원치 않는 요소로부터 폴리뉴클레오티드를 분리하는 단계를 포함한다. 다른 요소로부터 폴리뉴클레오티드를 분리할 뿐만 아니라 서로 다른 이온 조건 하에서 소수성 상호반응 매질을 위한 폴리뉴클레오티드와 다른 요소의 사로 다른 친화도를 이용하여 폴리뉴클레오티드의 유형을 분리할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법에서, 소수성 상호반응 매질은 폴리뉴클레오티드에 비하여 당지질과 지질단백질이 상대적으로 높은 결합친화도를 가진다는 점에서 사용되는데; 이러한 우선적인 결합은 분리 과정에서 사용되는 이온 상태의 범위를 넘어서 발생한다. 또한, 본 발명에서 포함된 것은 수퍼코일형 DNA와 풀려진형 DNA를 분리하는 방법이다. 상기 방법은 수퍼코일형 DNA가 풀려진형 DNA에 비하여 소수성 상호반응 매질에 대하여 상대적으로 높은 결합을 나타내는 이온 조건을 이용한다.
본 발명의 방법에서 사용되는 염 농도는 서로 다른 염의 이온 세기가 사용되는 것으로 이해될 수 있다. 또한, 엔도톡신을 말소시키거나 및/또는 제거하는 방법의 관점에서, 이러한 방법은 플라스미드 뿐만 아니라 비 플라스미드 DNA에도 적용될 수 있다.
본 발명의 주된 목적은 호스트 세포 불순물의 오염으로부터 플라스미드 DNA의 분리, 단리 및/또는 정제방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 요소 또는 절편을 포함하는 엔도톡신과 플라스미드 DNA의 분리, 단리 및/또는 정제방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 수퍼코일형과 풀려진형 플라스미드 DNA의 분리, 단리 및/또는 정제방법을 제공하는 것이다.
정제되고, 분리되거나 및/또는 단리된 플라스미드 DNA, 특히 수퍼코일형 플라스미드 DNA, 조성물은 본 발명에서 제공된다.
본 발명의 일 실시 양태에 의하면, 본 발명은 엔도톡신과 다른 오염물질이 복합체를 형성하도록 소수성 상호반응 매질과 결합하고, 상기 복합체와 플라스미드를 분리하는 조건 하에서 소수성 상호반응 매질과 세포 용해물이 접촉하는 단계에 의하여 플라스미드 DNA로부터 엔도톡신과 호스트 세포의 불순물 (즉, RNA, 크로모좀 DNA, 단백질)을 분리하는 방법을 제공한다. 이러한 실시 양태의 방법으로 분리된 상기 엔도톡신은 그람-음성균 뿐만 아니라 이들 엔도톡신과 결합하는 세포질 절편 및 엔도톡신 절편을 포함한다. 또한, 상기 소수성 상호반응 매질은 t-RNA, r-RNA 및 m-RNA를 포함하는 RNA, 호스트 세포 단백질 및 크로모좀 DNA와 결합한다. 본 발명에서 유용한 상기 소수성 상호반응 매질은 레진, 막 또는 지지체의 형태가 될 수 있다.
실시 양태의 바람직한 형태는 엔도톡신을 포함하는 오염된 호스트 세포 요소를 가지는 플라스미드 DNA의 혼합물을, 소수성 상호반응 매질을 포함하는 컬럼 또는 베드 매트릭스에 적용하는데, 엔도톡신과 호스트 세포 오염물이 소수성 상호반응 매질에 결합되어 잔류하며, 플라스미드 DNA는 적용과정으로부터 효율적으로 (플로우 쓰루) 수집되거나 또는 선택적인 소수성 상호반응 매질의 세척에 의하여 얻어지는데, 엔도톡신 및 다른 호스트 세포 오염물은 소수성 상호반응 매질에 잔류하게 된다. 플라스미드 DNA의 수집 후, 컬럼 또는 베드 매트릭스는 잔류하는 호스트 세포 오염물 및 엔도톡신을 제거하여 재활용되는데, 소수성 반응 조건을 변화시켜서 수행하며, 예를 들면 컬럼 또는 베드 매트릭스를 둘러싸는 염의 농도를 변화시킨다.
본 발명의 변형된 실시양태는 이온 교환 크로마토그래피와 크기 구별 크로마토그래피를 한 또는 둘다 사용하지 않는 분리방법을 제공한다.
바람직한 실시 양태로는, 소수성 반응 컬럼에 호스트 세포 불순물이 선택적으로 결합하는 농도, 바람직하게는 약 2 M의 농도의 암모늄 설페이트 반응용액으로 평형화시킨다. 본 발명의 방법에서 사용되는 염은 특별히 제한되는 것은 아니나, 아세테이트, 포스페이트, 카보네이트, SO42-, Cl-, Br-, NO3-, Mg2+, Li+, Na+, K+ 및 NH4+로 구성된 군으로부터 선택되는 음이온 및 양이온의 혼합물을 포함한다. 염의 혼합물이 사용된다. 더욱이, 플라스미드 DNA와 엔도톡신 같은 다른 오염물질의 혼합물은 암모늄 설페이트 반응용액에서 엔도톡신 같은 다른 오염물질, 엔도톡신 및 플라스미드 DNA의 소수성을 변화시키도록, 컬럼이나 베드매트릭스에 접촉하기 전에 투석 완충용액으로 투석함이 바람직하다. 상기 반응용액은 완충용액을 사용함이 바람직한데, 예를 들면, 제한되는 것은 아니나, pH 6.8 내지 8.5, 바람직하게는 pH 7.4의 트리스-염산 완충용액이다. 당업계에 알려진 다른 완충용액으로는 제한되는 것은 아니나, 트리스 TES (N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethane-sulfonic acid), Tricine (N-tris(hydroxymethyl)methylglycine), 인산, PIPES (Piperazine-N, N'-bis(2-ethane sulfonic acid), MOPS (3-(N-morpholino)-propanesulfonic acid), MES (2-(N-morpholino)-ethanesulfonic acid), MEPES (3-N(N-Morpholino)ethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid) 및 Bicine (N, N-bis(2-hyroxyethyl)glycine)이 사용된다.
본 발명의 방법은 단리된 및 또는 정제된 플라스미드 DNA와 플라스미드 DNA를 함유하는 조성물을 제공하는데, 엔도톡신은 감소되거나 또는 완전히 제거되며, 플라스미드 DNA에 포함된 엔도톡신은 95%이상, 바람직하게는 98%이상, 좀 더 바람직하게는 99% 이상, 더욱 바람직하게는 99.9% 이상 가장 바람직하게는 99.99% 내지 99.999% 이다. 본 발명의 방법은 최소한 시료 ml당 200,000 내지 400,000 엔도톡신 유닛 (EU)의 대량의 초기 엔도톡신을 제거하는데, 소수성 매트릭스 ml당 600,000 내지 3백만 EU의 용량을 제공한다. 아울러, 본 발명의 방법은 DNA mg 당 1 내지 300 EU 미만의 범위 또는 10 내지 2500 EU 미만의 범위를 포함하는 플라스미드 DNA 조성물을 제공한다. 변형적으로, 본 발명의 방법은 DNA mg 당 10 내지 50 EU 미만의 범위 또는 50 내지 1000 EU 미만의 범위를 포함하는 플라스미드 DNA 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명의 방법은 0.1% (w/w)미만의 단백질, 1% (w/w)미만의 RNA 및 1% (w/w) 미만으로 크로모좀 DNA를 감소시킨다.
다른 실시 양태에서는, 본 발명은 소수성 상호반응 매질에 수퍼코일형 플라스미드 DNA 및 풀러진형 플라스미드 DNA가 결합하는 첫 번째 반응 조건 하에서, 소수성 상호반응 매질을 플라스미드 DNA 및 풀러진형 플라스미드 DNA의 혼합물과 접촉시켜 첫 번째 결합 혼합물을 형성하는 단계, 첫 번째 결합 혼합물로부터 풀러진 플라스미드 DNA를 제거하는 두 번째 조건으로 첫 번째 결합 혼합물을 둘러싸도록 첫 번째 조건을 변형시켜서, 두번째 결합 혼합물을 포함하는 요소와 풀려진형 플라스미드 DNA를 분리하는 단계 및
두 번째 결합 혼합물로부터 수퍼코일형 플라스미드 DNA를 제거하는 세 번째 조건으로 두 번째 결합 혼합물을 둘러싸도록 두 번째 조건을 수정하여, 소수성 상호반응 매질을 포함하는 요소와 수퍼코일형 플라스미드 DNA를 분리하는 단계를 포함하는 풀러진형 플라스미드 DNA로부터 수퍼코일형 플라스미드 DNA를 분리하는 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 양태에서는, 변형단계와 수정단계가 용출 완충용액 또는 용액의 pH 조건을 변화시켜서 수행될 수 있으며, 이에 따라 풀려진형 및 수퍼코일형 형태가 염 조건의 변화에 의하여 또는 변화없이 서로 다른 pH 조건에서 용출된다.
본 발명의 다른 양태에서는, 변형단계와 수정단계가 등장 용출을 통하여 수행될 수 있는데, 결합된 플라스미드를 포함하는 컬럼을 통과할 때, 동일한 조성의 용액 바람직하게는 플라스미드 DNA의 두 형태를 용출할 수 있는 염 농도에서 분리된 분획으로 두가지 형태가 구별되어 연속적으로 용출된다.
본 발명의 다른 양태에서는, 염의 농도 및/또는 다른 조건은 플라스미드 DNA의 풀려진형이 결합되지 않은 분획에 수집되지만 반면에 수퍼코일형 형태는 레진에 결합하는, 그런 방식으로 변형될 수 있다. 상기 수퍼코일형 형태는 상술한 조건을 사용하여 연속적으로 용출될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서는, 변형단계와 수정단계가 리간드와 경쟁적으로 결합하는 분자 또는 분자의 혼합물의 사용으로 인하여 수행될 수 있고, 분리 요소처럼 매트릭스로부터 결합된 플라스미드 DNA 형태를 제거할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서는, 소수성 반응을 통하여 결합할 수 있는 분자 또는 분자 혼합물이 플라스미드 DNA 용액과 혼합될 수 있는데, 컬럼에 적용은 순서적으로 치환되어, DNA의 서로 다른 형태로 분리되는 결과를 나타낸다.
본 발명의 다른 양태의 변형된 두 가지 형태에서, 보통 크로마토그래피의 "치환"과 "프론탈" 형식이 언급되는데, 추가된 분자는 생산물과 함께 용출될 수 있고, 대부분의 경우, 당업계에 공지된 방법을 이용하여 효과적으로 분리될 수 있다.
치환 크로마토그래피는 레진에 결합된 둘 또는 그 이상의 분자가 순차적으로 치환되어, 결과적으로 둘 또는 그 이상의 결합된 분자가 용출되는 결과를 얻기 위하여, 높은 친화도를 가지는 치환 분자를 사용하여 치환되는 크로마토그래피의 유형이다. 최근에, 소수성 반응 레진을 위한 치환자가 결정되었는데, 폴리메틸 메타아크릴리에트, 아크릴산 및 폴리디메틸아미노에틸 메타크릴레이트 (참조: Ruaan et al., "Hydrophobic displacement chromatography of proteins using triblock copolymers as displacers, 1998 AIChE meeting)를 포함하는 트리블록 공중합체로 구성된다. 다른 치환자가 소수성 반응 레진을 사용하는 치환 크로마토그래피용으로 성공적으로 개발되었다 (참조: Shukla et al. Hydrophobic displacement chromatography of proteins in 1998 annual AIChE meeting). 2-(2-부톡시에톡시)에탄올 같은 치환자는 유용하게 사용되는 역상 크로마토그래피에 사용되었다.
플라스미드의 두가지 형태가 레진에 결합한 다음, 상기 언급된 치환자가 본 명세서에 언급된 HIC (hydrophobic interaction column, 소수성 반응 컬럼)으로부터 수퍼코일형 및 풀러진형 DNA를 대치하도록 사용될 수 있다
크로마토그래피의 "프론탈" 유형에서, 상기 컬럼은 레진에 대하여 그들의 친화도가 상이한 바이너리 혼합물을 적용하고, 컬럼에 연속적을 h적용하면 한가지 요소가 다른 것으로 치환되고, 결과적으로 두 요소가 순차적으로 용출된다. 본 발명에서는 예를 들어, DNA의 두 가지 형태가 HIC 컬럼에 적용될 수 있고, 시료의 과적용은 풀려진 형태의 효과적인 치환을 유도하는데, 수퍼코일형 형태와 구별되어수집된다.
한가지 실시양태에서, 변형단계와 수정단계는 암모늄 설페이트 같은 염의 연속적으로 변화하는 농도를 가지는 암모늄 설페이트와 같은 염 용액과 첫 번째 결합 혼합물의 혼합에 의하여 풀려진형 플라스미드 DNA와 수퍼코일형 DNA의 농도구배 용출의 연속적인 과정에서 조합되는데, 상기 농도는 바람직하게는 암모늄 설페이트 같은 염이 3 내지 1 M로 변화한다. 풀려진형 플라스미드 DNA는 이러한 실시태양의 첫 번째 용출액에 서 수집되고, 수퍼코일형 플라스미드 DNA는 두 번째 용출액에서 수집된다.
본 발명의 실시 양태의 또 다른 바람직한 유형에서는, 플라스미드 DNA의 수퍼코일형 및 풀려진형이 높은 염 농도 또는 2.5 내지 4 M 같은 동등한 이온력으로, 바람직하게는 3 M 암모늄 설페이트로 베드 또는 컬럼에서 소수성 반응 매질에 DNA의 두 가지 형태의 첫 번째 결합에 의하여 분리되고, 용출된 후에 염 농도의 변화 또는 2.45 내지 2.35 M의 첫 번째 범위, 0 M (가능한한 1 M) 내지 2.3 M의 암모늄 설페이트 (단계별 용출의 실시태양에서)의 두 번째 범위 또는 2.5 내지 4M의 암모늄 설페이트의 연속적인 변화, 컬럼 부피의 1 내지 30배 부피, 바람직하게는 6배 부피 (단계별 용출의 실시태양에서)의 0 M (가능한한 1 M) 내지 2.3 M의 암모늄 설페이트 (단계별 용출의 실시태양에서)의 두 번째 범위의 동등한 이온력으로, 단계별 농도구배 또는 연속적인 농도구배 방식으로 플라스미드 DNA의 두 가지 분리 형태가 컬럼에서 제거된다. 이들 형태 각각에서, 풀려진형 플라스미드 DNA는 약 2.35 M 내지 약 2.45 M의 범위의 염 (암모늄 설페이트)농도에서 컬럼 또는 베드 매질에서 용출되지만, 수퍼코일형 플라스미드는 약 0 M 내지 약 2.3 M의 범위의 염 (암모늄 설페이트)농도에서 컬럼 또는 베드 매질에서 용출된다.
다른 실시 양태에서는, 본 발명은 비-수퍼코일형 플라스미드의 측면에서 매질에 우선적으로 수퍼코일형 플라스미드가 결합하는 이논 조건하에서 소수성 반응 매질에 수퍼코일형 플라스미드를 포함하는 시료를 적용하는 단계; 및 결합된 수퍼코일형 플라스미드가 매질로부터 제거되는 이온조건으로 적정하는 단계를 포함하는 수퍼코일형 플라스미드의 단리방법을 제공한다.
다른 실시 양태에서는, 혼합물에서 풀려진형 플라스미드 DNA 보다 상대적으로 다량의 수퍼코일형 플라스미드 DNA를 수득하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 다음 단계를 포함한다: (1) 수퍼코일형 DNA 및 풀려진형 DNA를 포함하는 혼합물과 수퍼코일형 DNA가 소수성 상호작용 매질에 우선적으로 결합하는 이온 조건하에서 알킬 부분을 포함하는 소수성 상호작용 매질을 반응시키는 단계; (2) 풀려진형 DNA의 우선적인 제거를 가능하게 하는 이온 조건하에 풀려진형 DNA 및 수퍼코일형 DNA를 포함하는 소수성 상호작용 매질을 처리하는 단계; 및 (3) 소수성 상호작용 매질로부터 수퍼코일형 DNA를 용출하는 단계.
다른 실시 양태에서는, DNA를 함유하는 조성물로부터 당지질 (lipopolysaccharide, LPS)를 제거하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: (1) DNA 및 LPS를 포함하는 혼합물과 DNA에 비하여 상대적으로 LPS가 소수성 상호작용 매질에 우선적으로 결합하는 이온 조건하에서 알킬 부분을 포함하는 소수성 상호작용 매질을 반응시키는 단계; 및 (2) DNA의 선택적인 제거를가능하게 하는 이온 조건하에 DNA 및 LPS를 포함하는 소수성 상호작용 매질을 처리하는 단계.
본 발명의 방법은 단리된 및/또는 정제된 수퍼코일형 플라스미드 움 및 수퍼코일형 플라스미드 움를 포함하는 조성물을 제공하는데, 바람직하게는 엔도톡신이 없고, 본 ㅁ여세서에 개시된 방법에 의하여 생산된 조성물에 존재하는 수퍼코일형 플라스미드 DNA의 양은 총 플라스미드 중량에 의하여 최소한 약 50중량% 내지 최소한 약 99중량%, 바람직하게는 최소한 약 60중량% 내지 최소한 약 95중량%, 더욱 바람직하게는 최소한 약 70중량% 내지 최소한 약 90중량%, 가장 바람직하게는 최소한 약 75중량% 내지 최소한 약 85중량%의 수퍼코일형 플라스미드 DNA이다.
중량 비는 실시예에서와 같이, 농도구배를 통한 DNA-NPR HPLC 컬럼에서 HPLC 해상도에 의하여 측정되는데, 각 요소의 양은 피크의 해당영역으로 결정된다. 수퍼코일형 형태의 비율은 수퍼코일형 및 풀려진형 플라스미드 DNA 피크의 총면적에 대한 수퍼코일형 DNA의 해당면적의 분획으로 계산되었다.
본 발명의 방법에서 사용되는 바람직한 소수성 상호작용 매질은, 예를 들어 메타크릴레이트/에틸렌글리콜 같은 메타크릴레이트 중합체 또는 공중합체 구조 및/또는 메타크릴레이트/프로필렌글리콜 공중합체 (TosoHaas, Montgomeryville, PA) 및/또는 가교된 또는 가교되지 않은 아가로스 또는 세파로스 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), 아가로스, 세파로스, 덱스트란, 실리카 함유 중합체, 유기 중합체 (천연적인 또는 함성된), 세라믹-함유물, 또는 젤 매트릭스, 구조물, 또는 C3 내지 C10 알킬기를 가지고 가지친 또는 직쇄형의 부가적 측쇄사슬 리간드를 가지는 이들의 복합체 등의 소수성 산호작용 크로마토그래피 레진을 포함한다. 이들 리간드는 본 발명의 분리, 정제 및/또는 단리방법을 개발하기 위한 우선적인 결합반응을 제공한다. 당업자는 소수성 상호작용 매질이 이러한 알킬 리간드에 추가하거나 또는 이들의 위치에 리간드를 포함할 수 있는데, 또한 본 발명의 방법에 유용하다. 그러한 리간드의 실시예는 제한되지는 않으나, 페밀, 옥틸, 부틸, 프뢸, 네오펜틸, 히드록시프로필, 벤질, 옥타데실, 디페닐, 및 메틸 뿐만 아니라 이들의 치환체 또는 치환되지 않은 형태 및 이들의 조합을 포함한다. 본 발명에 유용한 적절한 레진 또는 매질 물질은 예를 들어, 유럽특허 제 964057호, 유럽특허출원 제 99109441호, 일본특허 제 2000035423호, 일본특허 제 99127700호 및 일본특허 제 98127665 (Kitamura et al.)의 인용문헌에 개시된 전체 물질이다.
상기 소수성 상호작용 매질은 비드형태로 될 수 있는데, 컬럼 ,베드 반응기 또는 가교된 다공성 매질에 충진될 수 있다. 비드 매질의 크기는 2.5 ㎛ 내지 100 ㎛이상의 범위를 가진다. 비드 매질의 크기는 바람직하게는 직경이 30 내지 110 ㎛, 35 내지 100 ㎛ 또는 35 내지 90 ㎛의 범위를 가진다. 소수성 상호작용 매질은 셀룰로스 또는 셀룰로스 유도된 구조, 폴리에테르 설폰, 폴리설폰 및 이들의 유도체 및 /또는 마이크로타이터 플레이트 및 페트리 또는 세포 배양 접시 또는 보관기를 포함하는 플라스틱을 포함하는 여과 및 분리 분야에서 알려진 물질처럼 막형태로 존재할 수 있다.
"스트림라인" (Amersham Pharmacia biotech) 컬럼에서 사용되는 비드는 서로다른 밀도를 가지며 크기가 크고, 제한되는 것은 아니나, 아머샴 파마시아 바이오텍, 바이오세프라 인코포레이티드 등의 여러 가지 가공업체에 의하여 제조되는데, 투명화된 용해물이 이들 "확장된 베드" 컬럼을 통하여 흘려진 후, 소수성 상호작용 리간드를 포함하는 비드에 결합하여 오염물질이 제거된다.
더 작은 크기의 비드는 전형적으로 HPLC를 포함하는 고 효율 분리에 사용되는데, 본 발명은 플라스미드 DNA 및/또는 DNA의 서로다른 형태의 정량 분석에 사용할 수도 있다.
본 발명에서는, 플라스미드 DNA가 구멍에 적용되기에는 너무크기 때문에, 어떠한 추가적인 용량을 제공하더라도, 특별히 플라스미드 DNA의 두가지 형태의 분리에 필요하지는 않다. 그러나, 오염물질의 결함을 목적으로 구멍은 RNA, 단백질 엔도톡신 및 DNA 절편과 같은 구멍크기보다 작은 오염물질의 용량을 효과적을 ㅗ증가시킬 수 있다. 이 경우, 공극율은 역할을 하며 공극성 레진이 유용할 것이다.
본 발명의 방법은 바람직하게는 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 헥사민 코발트, 스퍼미딘 또는 폴리비닐 피롤리돈 같은 유기용매 또는 세제가 필요하지 않은데, 추후의 유전자치료를 위한 수퍼코일형 플라스미드 DNA의 생산물로 부터 분리할 때 요구된다.
실시예 1: 부틸 소수성 반응 크로마토그래피를 이용한 엔도톡신의 제거 (소규모)
플라스미드 pE1A-K2를 포함하는 대장균 세포는 생육되고, 화학적인 방법으로 용해되었으며, 여과방법을 통하여 투명화되었다. 사용된 모든 완충용액은 0.2 ㎛의 여과지로 여과되었고, 엔도톡신을 위한 시료는 폴리스티렌 튜브에 보관되었다.
여과된 결과물 (-400 ml)은 시험에 사용된 TE 완충용액 (50 mM Tris, 10 mM EDTA, 염산으로 pH 7.4로 적정)으로 투석되었다. 시료를 2 M로 만드는데 요구되는 암모늄 설페이트 (AS)는 2 M AS pH 7.4 완충용액이 가해진 TE 100ml에 첨가되고, 부분적으로 용해되었다. 이러한 용액은 최종적으로 575 ml이 되도록 투석된 시료에 첨가되는데, 이중 475 ml을 실험에 이용하였다.
직경 2.6 cm, 높이 15 cm, 베드 부피가 약 75 ml인 부틸 650S 컬럼 (부틸 650S 레진, TosoHaas Inc., 156 Keystone Drive, Montgomeryville, PA 18936)은 충진되고, 2 M AS를 포함하는 TE 완충용액 (pH 7.4)으로 평형시켰다. 상기 시료는 5 ml/분의 속도로 적용하였다. 통과된 시료를 수집하고, 시료를 분석하였다 (DNA 농도, 아가로스 전기영동 및 엔도톡신 분석). 엔도톡신 분석은 스파이크 (spike)로 수행되고, 상기 시료는 허용가능한 범위로 PPC (Positive Product control)를 얻을 수 있도록 적절히 희석시킨다. 엔도톡신 농도는 BW 제 P50-650U-5, 키네틱-QCL 테스트 킷 매뉴얼 (BW publication No. P50-650U-5, Kinetic-QCL Test Kit Manual)에 묘사된 대로, 바이오 하이테커 키네틱-QCL 크로모제닉 LAL 분석법 (BioWhittaker Kinetic-QCL Chromogenic LAL assay)을 사용하여 결정되었다. 시료의 적용 후, 2 M 암모늄 설페이트를 포함하는 TE 완충용액을 컬럼에 흘려주고, 수집한 후 샘플링하였다. 이어, 상기 컬럼은 TE 완충용액 (pH 7.4), USP 정제수로 세척되고, 0.5 N NaOH로 씻어낸 다음, 15 부피 이상의 USP 정제수로 세척하였다. 엔도톡신은 하기 표 1에서 보듯이 이들 세척액 각각에서 존재한다. 이처럼 방출된 엔도톡신 제거 효율과 더불어, 상당량의 RNA, 단백질 및 DNA 절편이 제거되어, 시료는 상당히 정제된다.
| 시료 | DNA 농도(mg/ml) | 엔도톡신EU/ml | 총 EU 유닛 | % 엔도톡신 | DNA mg 당 EU |
| 로드 | 0.70 | 472,200 | 22,400,000 | 100 | 674,571 |
| 플로우 쓰루 | 0.38 | 1.64 | 771 | 0.003 | 4.31 |
| 와쉬 | 0.56 | 7.48 | 1,196 | 0.005 | 13.42 |
레진 ml 당 엔도톡신 용량:3백만 EU/ml
시료에서 엔도톡신의 감소율:99.992%
실시예 2: 부틸 소수성 반응 크로마토그래피를 이용한 엔도톡신의 제거 (대규모)
플라스미드 pE1A-K2를 포함하는 대장균 세포는 생육되고, 화학적인 방법으로용해되었으며, 여과방법을 통하여 투명화되었다.
여과된 결과물 (-650 ml)은 시험에 사용된 TE 완충용액 (50 mM Tris, 10 mM EDTA, 염산으로 pH 7.4로 적정)으로 투석되고, 시료를 2 M로 만드는데 요구되는 암모늄 설페이트는 2 M AS pH 7.4 완충용액이 가해진 TE 1200ml에 첨가되고, 용해되었다. 이러한 용액의 부피는 1300ml이었다. 상기 용액은 최종적으로 1950 ml이 되도록 투석된 시료에 첨가되는데, 염산을 가하여pH를 7.4로 적정하였다.
직경 5 cm, 높이 15 cm, 베드 부피가 약 275 ml인 부틸 650S 컬럼은 충진되고, 2 M AS를 포함하는 TE 완충용액 (pH 7.4)으로 평형시켰다. 상기 시료는 20 ml/분의 속도로 적용하였다. 통과된 시료를 수집하고, 시료를 분석하였다 (상술한 바와 같이 DNA 농도, 아가로스 전기영동 및 엔도톡신 분석). 시료의 적용 후, 2 M 암모늄 설페이트를 포함하는 TE 완충용액을 컬럼에 흘려주고, 수집한 후 샘플링하였다. 이어, 상기 컬럼은 TE 완충용액 (pH 7.4), USP 정제수로 세척되고, 0.5 N NaOH로 씻어낸 다음, 15 부피 이상의 USP 정제수로 세척하였다. 엔도톡신은 하기 표 2에서 보듯이 이들 세척액 각각에서 존재한다. 이처럼 방출된 엔도톡신 제거 효율과 더불어, 상당량의 RNA, 단백질 및 DNA 절편이 제거되어, 시료는 상당히 정제된다.
| 시료 | DNA 농도(mg/ml) | 엔도톡신EU/ml | 총 EU 유닛 | % 엔도톡신 | DNA mg 당 EU |
| 로드 | 1.59 | 271500 | 176,475,000 | 100 | 170,754 |
| 플로우 쓰루+ 와쉬 | 0.34 | < 0.5 | 1325 | 0.007 | 1.45 |
레진 ml 당 엔도톡신 용량:64만 EU/ml
시료에서 엔도톡신의 감소율:99.993%
실시예 3: 헥실 소수성 반응 크로마토그래피를 이용한 엔도톡신의 제거 (소규모)
플라스미드 pE1A-K2를 포함하는 대장균 세포는 생육되고, 화학적인 방법으로 용해되었으며, 원심분리를 통하여 투명화되었다. 상층액은 20 mM 인산칼륨 완충용액 (20 mM 인산칼륨 모노베이직 용액과 20 mM 인산칼륨 다이베이직이 pH 6.8에 맞도록 혼합되었다), pH 6.8 로 투석되고, 시료를 2 M로 만드는데 요구되는 암모늄 설페이트 (AS)는 2 M AS를 함유하는 20 ml KPB (20 mM 인산칼륨 완충용액) pH 6.8 완충용액에 가해지고, 용해되었다. 이러한 용액은 최종적으로 25 ml이 되도록 투석된 시료 5 ml에 첨가되는데, pH는 6.8로 적정되었다.
직경 1.6 cm, 높이 4 cm, 베드 부피가 약 8 ml인 헥실 650C 컬럼 (TosoHaas)은 충진되고, 2 M AS를 포함하는 KPB 완충용액 (pH 6.8)으로 평형시켰다. 상기 시료는 2 ml/분의 속도로 적용하였다. 통과된 시료를 수집하고, 시료를 분석하였다 (상술한 바와 같이 DNA 농도, 아가로스 전기영동 및 엔도톡신 분석). 시료의 적용 후, 2 M 암모늄 설페이트를 포함하는 KPB 완충용액을 컬럼에 흘려주고, 수집한 후 샘플링하였다. 이어, 상기 컬럼은 KPB 완충용액 (pH 6.8), USP 정제수로 세척되고, 0.5 N NaOH로 씻어낸 다음, 15 부피 이상의 USP 정제수로 세척하였다.엔도톡신은 하기 표 3에서 보듯이 이들 세척액 각각에서 존재한다. 이처럼 방출된 엔도톡신 제거 효율과 더불어, 상당량의 RNA, 단백질 및 DNA 절편이 제거되어, 시료는 상당히 정제된다.
| 시료 | DNA 농도(mg/ml) | 엔도톡신EU/ml | 총 EU 유닛 | % 엔도톡신 | DNA mg 당 EU |
| 로드 | 2.43 | 593500 | 29,675,000 | 100 | 244,238 |
| 플로우 쓰루+ 와쉬 | 0.037 | 0.5 | 35 | 0.0001 | 14 |
레진 ml 당 엔도톡신 용량:370만 EU/ml
시료에서 엔도톡신의 감소율:99.999%
실시예 4: 옥틸 소수성 반응 크로마토그래피를 이용한 엔도톡신의 제거 (소규모)
상술한 바와 같이, 플라스미드 pE1A-K2를 포함하는 대장균 세포는 생육되고, 화학적인 방법으로 용해되었으며, 원심분리를 통하여 투명화되었다. 상층액이 실험에 사용되었다.
시료를 2 M로 만드는데 요구되는 암모늄 설페이트 (AS)는 2 M AS pH 7.4 완충용액이 가해진 TE 20 ml에 첨가되고, 용해되었다. 이러한 용액은 최종적으로 25 ml이 되도록 투석된 시료 10 ml에 첨가되는데, pH는 7.4로 적정되었다.
직경 1.0 cm, 높이 10 cm, 베드 부피가 약 8 ml인 옥틸 세파로스 4 패스트플로우 컬럼 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)은 충진되고, 2 M AS를 포함하는 TE 완충용액 (pH 7.4)으로 평형시켰다. 상기 시료는 2 ml/분의 속도로 적용하였다. 통과된 시료를 수집하고, 시료를 분석하였다 (DNA 농도, 아가로스 전기영동 및 엔도톡신 분석). 시료의 적용 후, 2 M 암모늄 설페이트를 포함하는 TE 완충용액을 컬럼에 흘려주고, 수집한 후 샘플링하였다. 이어, 상기 컬럼은 TE 완충용액 (pH 7.4), USP 정제수로 세척되고, 0.5 N NaOH로 씻어낸 다음, 15 부피 이상의 USP 정제수로 세척하였다. 엔도톡신은 하기 표 4에서 보듯이 이들 세척액 각각에서 존재한다.
| 시료 | DNA 농도(mg/ml) | 엔도톡신EU/ml | 총 EU 유닛 | % 엔도톡신 | DNA mg 당 EU |
| 로드 | 2.43 | 593500 | 59,350,000 | 100 | 244,238 |
| 플로우 쓰루+ 와쉬 | 0.037 | 32 | 2240 | 0.004 | 280 |
레진 ml 당 엔도톡신 용량:741만 EU/ml
시료에서 엔도톡신의 감소율:99.996%
실시예 5: 부틸 소수성 반응 크로마토그래피를 이용한 플라스미드 DNA의 수퍼코일형과 풀려진형 형태의 분리-농도구배 용출
상술한 바와 같이, 플라스미드 pE1A-K2를 포함하는 대장균 세포는 생육되고, 화학적인 방법으로 용해되었으며, 여과방법을 통하여 투명화되었다. 엔도톡신,RNA, 단백질, 크로모좀 DNA 등의 주된 불순물을 제거하기 위한 플라스미드 DNA의 철저한 정제는 부틸 소수성 반응 크로마토그래피를 사용하여 수행되는데, 이때 2 M 암모늄 설페이트 농도에서 플라스미드 DNA는 컬럼을 통과하고, 불순물은 컬럼에 결합한다 (상술한 부분 참조).
플라스미드 DNA를 포함하는 플로우 쓰루는 투석되고 어떠한 추가적인 정제과정을 제공하지 않는 음이온 교환 (Bio Sepra) 컬럼에서 진행된다. 이러한 진행은 Q 음이온 교환 컬럼을 통하여 수행되고, 여과는 부틸컬럼상에서 분리되었기에 필요하지 않다. Q 음이온 교환 컬럼에서의 용출물은 30 kDa 재생산 셀룰로스 막 (0.1 ㎡, Millipore Corporation)을 이용하여 여과되었다. 상기 투석된 물질은 고체 암모늄 설페이트를 이용하여 3 M 암모늄 설페이트로 적정되었다.
직경 2.6 cm, 높이 15 cm인 부틸 (Toyopearl Butyl 650S - TosoHaas) 컬럼은 분당 15 내지 20 ml의 속도로 충진되었다. 상기 컬럼은 3 M 암모늄 설페이트를 포함하는 트리스 EDTA 완충용액 (pH 7.4)로 평형되었다. 상기 시료는 5 ml/분의 속도로 적용하였다. 상기 플라스미드는 3 M의 암모늄 설페이트 농도에서 컬럼에 결합되었다. 상기 컬럼은 3 M 암모늄 설페이트 용액을 포함하는 완충용액으로 컬럼의 2 내지 3부피로 세척되었다. 그 후, 상기 컬럼은 6 베드 부피의 3 M 내지 1 M의 암모늄 설페이트 농도구배에 의하여 용출되었다. 농도구배 용출 중에, 두 개의 피크가 나타나게 되는데, 각 분획의 아가로스 전기영동 결과에서 보듯이 (도 4A), 첫 번째 피크는 플라스미드 DNA의 풀려진형을 포함하고, 두 번째 피크는 플라스미드 DNA의 수퍼코일형을 포함한다. 상기 크로마토그램은 도 4B에 나타난다.상기 결과는 두 형태의 함량을 결정하는데 사용된 HPLC 분석법에 의하여 확정되었다 (표 5).
분석 민감도의 한계안에서, 두 번째 피크가 85%의 수퍼코일형 DNA를 포함하는데 반하여, 출발물질에는 단지 50 내지 60%의 수퍼코일형만을 포함한다. 출발 수퍼코일형 플라스미드 DNA의 최소한 90%가 회수되었다. 피크의 해상도는 비록 15 cm 높이의 컬럼을 사용할 지라도 적절하였다. 이는 부틸 소수성 반응 크로마토그래피를 사용하여 플라스미드의 수퍼코일형과 풀어진형을 효과적으로 분리할 수 있음을 나타낸다. 최상의 분리에 더하여, 잔류하는 RNA, 단백질 및 엔도톡신의 양은 유전자 치료용 가공과정에서 제거될 수 있다.
| 시료 | % 수퍼코일형 |
| 출발물질 | 63 |
| 피크 1 분획 | 8 |
| 피크 2 분획 | 83 |
실시예 6: 부틸 소수성 반응 크로마토그래피를 이용한 플라스미드 DNA의 수퍼코일형과 풀려진형 형태의 분리-긴 컬럼 농도구배 용출
상술한 바와 같이, 플라스미드 pE1A-K2를 포함하는 대장균 세포는 생육되고, 화학적인 방법으로 용해되었으며, 여과방법을 통하여 투명화되었다. 엔도톡신, RNA, 단백질, 크로모좀 DNA 등의 주된 불순물을 제거하기 위한 플라스미드 DNA의 철저한 정제는 부틸 소수성 반응 크로마토그래피를 사용하여 수행되는데, 이때 2 M암모늄 설페이트 농도에서 플라스미드 DNA는 컬럼을 통과하고, 불순물은 컬럼에 결합한다 (상술한 부분 참조). 플라스미드 DNA를 포함하는 플로우 쓰루는 투석되고 어떠한 추가적인 정제과정을 제공하지 않는 음이온 교환 컬럼에서 진행된다. Q 음이온 교환 컬럼에서의 용출물은 30 kDa 재생산 셀룰로스 막을 이용하여 여과되었다. 실시예 5에서 상술한 바와 같이, 상기 투석된 물질은 고체 암모늄 설페이트를 이용하여 3 M 암모늄 설페이트로 적정되었다.
직경 2.6 cm, 높이 30 cm인 부틸 (Toyopearl Butyl 650S - TosoHaas) 컬럼은 분당 15 내지 20 ml의 속도로 충진되었다. 상기 컬럼은 3 M 암모늄 설페이트를 포함하는 트리스 EDTA 완충용액 (pH 7.4)로 평형되었다. 상기 시료는 5 ml/분의 속도로 적용하였다. 상기 플라스미드는 3 M의 암모늄 설페이트 농도에서 컬럼에 결합되었다. 상기 컬럼은 3 M 암모늄 설페이트 용액을 포함하는 완충용액으로 컬럼의 2 내지 3부피로 세척되었다. 그 후, 상기 컬럼은 6 베드 부피의 3 M 내지 1 M의 암모늄 설페이트 농도구배에 의하여 용출되었다. 농도구배 용출 중에, 두 개의 피크가 나타나게 되는데, 각 분획의 아가로스 전기영동 결과에서 보듯이 (도 5A), 첫 번째 피크는 플라스미드 DNA의 풀려진형을 포함하고, 두 번째 피크는 플라스미드 DNA의 수퍼코일형을 포함한다. 상기 크로마토그램은 도 5B에 나타난다. 상기 결과는 두 형태의 함량을 결정하는데 사용된 HPLC 분석법에 의하여 확정되었다 (표 6).
분석 민감도의 한계안에서, 두 번째 피크가 90%의 수퍼코일형 DNA를 포함하는데 반하여, 출발물질에는 단지 50%의 수퍼코일형만을 포함한다. 출발 수퍼코일형 플라스미드 DNA의 최소한 90%가 회수되었다. 피크의 기본 해상도가 좀더 긴 컬럼에서 얻어졌다. 이번 실시예는 부틸 소수성 반응 크로마토그래피를 사용하여 플라스미드의 수퍼코일형과 풀어진형을 효과적으로 분리할 수 있음을 명확히 나타낸다. 최상의 분리에 더하여, 잔류하는 RNA, 단백질 및 엔도톡신의 양은 유전자 치료용 가공과정에서 제거될 수 있다.
| 시료 | % 수퍼코일형 |
| 출발물질 | 53 |
| 피크 1 분획 36 | 15 |
| 피크 2 분획 47 | 83 |
| 피크 3 분획 49 | 95 |
| 피크 4 분획 52 | 91 |
실시예 7: 부틸 소수성 반응 크로마토그래피를 이용한 플라스미드 DNA의 수퍼코일형과 풀려진형 형태의 분리-긴 컬럼 단계 용출
상술한 바와 같이, 플라스미드 pE1A-K2를 포함하는 대장균 세포는 생육되고, 화학적인 방법으로 용해되었으며, 여과방법을 통하여 투명화되었다. 엔도톡신, RNA, 단백질, 크로모좀 DNA 등의 주된 불순물을 제거하기 위한 플라스미드 DNA의 철저한 정제는 부틸 소수성 반응 크로마토그래피를 사용하여 수행되는데, 이때 2 M 암모늄 설페이트 농도에서 플라스미드 DNA는 컬럼을 통과하고, 불순물은 컬럼에 결합한다 (상술한 실시예 1 참조). 플로우 쓰루 및 세척액은 혼합되고 접선 플로우 필터를 사용한 30 kDa 한외 여과막을 사용하여 농축되었다. 농축된 플라스미드DNA는 고체 암모늄 설페이트를 이용하여 3 M 암모늄 설페이트로 적정되었다.
직경 1 cm, 높이 약 30 cm인 부틸 (Toyopearl Butyl 650S - TosoHaas) 컬럼은 분당 6 ml의 속도로 충진되었다. 상기 컬럼은 3 M 암모늄 설페이트를 포함하는 트리스 EDTA 완충용액 (pH 7.4)로 평형되었다. 상기 시료는 2 ml/분의 속도로 적용하였다. 상기 플라스미드는 3 M의 암모늄 설페이트 농도에서 컬럼에 결합되었다. 상기 컬럼은 3 M 암모늄 설페이트 용액을 포함하는 완충용액으로 컬럼의 2 내지 3부피로 세척되었다. 그 후, 상기 컬럼은 2 내지 3 베드 부피의 2.8 M, 2.7 M, 2.6 M, 2.5 M, 2.4 M, 1 M의 암모늄 설페이트에 의하여 용출되었다. 피크는 2.4 M 과 1 M 용출액에서 관찰되었다. 상기 피크의 아가로스 절 전기영동은 도 6A에 나타내었다. 2.4 M 용출액은 풀려진형을 포함하는데 반하여, 1 M 용출액은 수퍼코일형을 포함한다. 상기 크로마토그램은 도 6B에 나타난다. 상기 결과는 두 형태의 함량을 결정하는데 사용된 HPLC 분석법에 의하여 확정되었다 (표 7).
분석 민감도의 한계안에서, 두 번째 피크가 93%의 수퍼코일형 DNA를 포함하는데 반하여, 출발물질에는 단지 62%의 수퍼코일형만을 포함한다. 이러한 결과는 계속적인 실험에 의하여 확정되었는데, 2.3 M과 2.2 M 용출액은 해상도를 제공하지 않았고, 2.4 M 용출액은 반복적으로 풀려진형 형태의 주요한 제거를 제공하였으므로, 따라서 1 M 용출액에선느 수퍼코일형 형태가 존재하였다. 단계 용출을 이용하여 수행된 상기 분리는 단계 용출을 사용하여 수행할 때 더욱 신뢰할 수 있는 대규모의 분리과정에 있어서 중요하다. 이번 실시예는 부틸 소수성 반응 크로마토그래피의 단계 용출을 사용하여 플라스미드의 수퍼코일형과 풀어진형을 효과적으로분리할 수 있음을 명확히 나타낸다. 최상의 분리에 더하여, 잔류하는 RNA, 단백질 및 엔도톡신의 양은 유전자 치료용 가공과정에서 제거될 수 있다.
| 시료 | % 수퍼코일형 |
| 출발물질 | 62 |
| 2.4 M 용출액 | 8 |
| 1 M 용출액 | 93 |
실시예 8: 헥실 소수성 반응 크로마토그래피를 이용한 플라스미드 DNA의 수퍼코일형과 풀려진형 형태의 분리-긴 컬럼 농도구배 용출
상술한 바와 같이, 플라스미드 pE1A-K2를 포함하는 대장균 세포는 생육되고, 화학적인 방법으로 용해되었으며, 여과방법을 통하여 투명화되었다. 엔도톡신, RNA, 단백질, 크로모좀 DNA 등의 주된 불순물을 제거하기 위한 플라스미드 DNA의 철저한 정제는 부틸 소수성 반응 크로마토그래피를 사용하여 수행되는데, 이때 2 M 암모늄 설페이트 농도에서 플라스미드 DNA는 컬럼을 통과하고, 불순물은 컬럼에 결합한다 (상술한 실시예 1 참조). 플라스미드 DNA를 포함하는 플로우 쓰루는 투석되고 어떠한 추가적인 정제과정을 제공하지 않는 음이온 교환 컬럼에서 진행된다. Q 음이온 교환 컬럼에서의 용출물은 30 kDa 재생산 셀룰로스 막을 이용하여 여과되었다. 상술한 바와 같이, 상기 투석된 물질은 고체 암모늄 설페이트를 이용하여 3 M 암모늄 설페이트로 적정되었다.
직경 1 cm, 높이 30 cm인 헥실 (Toyopearl Hexyl 650C - TosoHaas) 컬럼은분당 15 내지 5 ml의 속도로 충진되었다. 상기 컬럼은 3 M 암모늄 설페이트를 포함하는 트리스 EDTA 완충용액 (pH 7.4)로 평형되었다. 상기 시료는 2 ml/분의 속도로 적용하였다. 상기 플라스미드는 3 M의 암모늄 설페이트 농도에서 컬럼에 결합되었다. 상기 컬럼은 3 M 암모늄 설페이트 용액을 포함하는 완충용액으로 컬럼의 2 내지 3부피로 세척되었다. 그 후, 상기 컬럼은 6 베드 부피의 3 M 내지 1 M의 암모늄 설페이트 농도구배에 의하여 용출되었다. 농도구배 용출 중에, 두 개의 피크가 나타나게 되는데, 각 분획의 아가로스 전기영동 결과에서 보듯이 (도 7A), 첫 번째 피크는 플라스미드 DNA의 풀려진형을 포함하고, 두 번째 피크는 플라스미드 DNA의 수퍼코일형을 포함한다.
상기 크로마토그램은 도 5B에 나타난다. 정성적으로, 두 번째 피크는 아가로스 겔 전기영동에 근거한 출발물질보다 더 많은 수퍼코일형 분획을 포함한다. 부틸의 35 :m에 비하여, 헥실의 비드 크기가 100 :m임을 감안한다면, 상기 피크의 최상의 해상도가 얻어졌다.
실시예 9: 부틸 소수성 반응 크로마토그래피를 이용한 엔도톡신의 제거 (염화나트륨을 이용하여)
플라스미드 pE1A-K2를 포함하는 대장균 세포는 생육되고, 화학적인 방법으로 용해되었으며, 원심분리를 통하여 투명화되었다. 상층액이 실험에 사용되었다. 상기 시료는 음이온 교환 컬럼 (Q Hyper D - BIOSEPRA Inc.)을 통하여 정제되었다. 컬럼의 2 M 염화나트륨 용출액이 실험에 사용되었다. 상기 시료는 2 M NaCl이 포함된 50 mM 트리스, 10 mM EDTA pH 7.4 완충용액에서 존재한다. 직경 1.0 cm, 높이 20 cm, 베드 부피가 약 10 ml인 부틸 HIC 컬럼 (Butyl 650S 레진 - TosoHaas을 이용하여)은 충진되고, 2 M NaCl를 포함하는 TE 완충용액 (pH 7.4)으로 평형시켰다. 상기 시료는 2 ml/분의 속도로 적용하였다. 통과된 시료를 수집하고, 시료를 분석하였다 (DNA 농도, 아가로스 전기영동 및 엔도톡신 분석). 시료의 적용 후, 2 M 암모늄 설페이트를 포함하는 TE 완충용액을 컬럼에 흘려주고, 수집한 후 샘플링하였다. 이어, 상기 컬럼은 TE 완충용액 (pH 7.4)으로 세척되었다.
| 시료 | DNA 농도(mg/ml) | 엔도톡신EU/ml | 총 EU 유닛 | % 엔도톡신 | DNA mg 당 EU |
| 로드 | 0.27 | 642 | 16,050 | 100 | 2377 |
| 와쉬 | 0.13 | 5 | 350 | 2 | 38 |
레진 ml 당 엔도톡신 용량:1570 EU/ml
시료에서 엔도톡신의 감소율:98%
실시예 10: 부틸 소수성 반응 크로마토그래피를 이용한 소규모의 플라스미드 정제
소규모의 플라스미드 DNA 정제는 퀴아젠 미니프렙 킷이라 알려진 상업적으로 유용한 킷을 사용하여 수행되었다. 본 명세서에 기재된 방법은 상업적인 킷의 여러 가지 장점을 제공하는 플라스미드 DNA의 정제에 사용될 수 있다. 이어지는 실시예는 소규모로 플라스미드 DNA의 정제를 위한 본 발명의 소수성 반응 크로마토그래피의 이용을 나타낸다.
정제의 출발물질은 기본적인 방법으로 수득되었다. 특히, 약 4.65 Kb 크기의 플라스미드를 가지는 대장균 세포는 37℃, 100 ㎍/ml의 앰피실린을 포함하는 루리아 브로쓰 배지에서 생육되었다. 상기 세포는 OD 2.7에서 수확되었다. 상기 세포는 원심분리를 통하여 배지에서 제거되었다. 이어, 세포 침전물은 50 mM 트리스-염산, 10 mM EDTA pH 8.0 완충용액으로 현탁되었다. 동일 부피의 200 mM NaOH, 1% SDS 용액이 첨가되고, 잘 혼합된 다음, 상온에서 5 분간 방치되었다. 이 과정은 플라스미드 DNA를 포함한 세포 내용물을 해리시키는 세포용해를 유발시킨다. 3.1 M 포타슘 아세테이트 (pH 5.5)로 구성된 중화 용액이 동일부피 (원래의)로 첨가되고, 잘 혼합되었다. 중화된 용해물은 잔유물 제거용 치즈천 및 여과지로 여과하였다. 투명화된 용해물은 79% 이소프로판올 (투명화된 용해물 3 ml 당 2.1 ml의 이소프로판올 첨가)로 침전되었다. 상기 침전물은 원심분리로 분리되고, 침전물은 70% 에탄올로 세척된 다음, 건조되고, 10 mM 트리스-여만, 0.1 mM EDTA 완충용액 (pH 8.0)에 용해되었다. 이러한 제조물은 사용할 때까지 -20℃에 냉동되고, 정제 실험을 위한 출발물질로 사용되었다.
20 ml의 베드 부피와 높이 10 cm를 가지는 부틸 650S 컬럼은 1.6 cm의 직경을 가지는 커럼 (Pharmacia XK16/20)에 충진되고, 2.2 M 암모늄 설페이트 (AS)를 가지는 50 mM 트리스-염산, 10 mM EDTA (TE) 완충용액 (pH 7.4)으로 평형화되었다. 적용될 상기 시료는 최종 2.2 M 암모늄 설페이트 농도가 되도록 고체 암모늄 설페이트를 처가하였다. 상기 시료는 2.2 M AS를 가지는 트리스-염산 pH 7.4 완충용액 10 ml에 희석되었다.
정제 조건은 플로우 쓰루에 수집된 플라스미드 DNA에 적용가능하도록 준비되고, 불순물은 레진에 결합되었다.
상기 시료는 2 ml/분의 속도로 저용되고, 플로우 쓰루는 수집되었다. 상기 컬럼은 2.2 AS를 포함하는 TE 완충용액 (pH 7.4) 35 ml로 세척되고 외쉬 1 (10 ml), 와쉬 2 (14.5 ml) 및 와쉬 3 분획 (10 ml)을 수집하였다. 한 피크가 세척중에 나타났다. 상기 컬럼은 1 M AS를 포함하는 TE 완충용액 (pH 7.4) 55 ml로 용출되고, 1 M 와쉬 1 (10 ml) 및 1 M 와쉬 2 (45 ml)로 수집되었다. 하나의 피크가 1 M As 용출중에 나타났다. 상기 커럼은 USP 정제수 50 ml로 용출되었다. 하나의 피크가 나타났다. 하기의 표는 상기 각 분획에 존재하는 총 핵산을 나타낸다. 농도는 260 nm에서의 흡광도를 바탕으로 계산되었다. (농도 (㎍/ml) = A260 * 50).
| 컬럼 분획 | 농도 | 질량 |
| (㎍/ml) | (㎍) | |
| 적용시료 | 550.0 | 5503 |
| 와쉬 1 | 7.6 | 76 |
| 와쉬 2 | 40.4 | 607 |
| 와쉬 3 | 5.0 | 50 |
| 와쉬 풀 (플라스미드 DNA) | 20.9 | 733 |
| 1 M 용출물 | 35.8 | 1611 |
| 물 용출물 | 30.5 | 1523 |
시료의 아가로스 젤 전기영동이 수행되었다. 도 8은 젤사진을 나타낸다. 상기 젤사진은 외쉬 분획내에 플라스미드 DNA를 보여준다 (3, 4, 5 레인). 적용시료 (2 레인)와 비교할 때, 외쉬 분획에서는 RNA가 보이지 않는다. 용출분힉은 6 및 7 레인에서 보듯이 RNAffm 포함한다. 와쉬 풀에서의 엔도톡신은 키네틱 QCL 엔도톡신 분석방법으로 측정되었다. 어떠한 엔도톡신도 분석방법의 민감한 수준 (0.005 EU/ml)으로 시료에서 검출되지 않았다. 플라스미드의 수율은 상업적인 키트와 유사하게 배양물 100 ml로부터 733 ㎍이었다.
본 명세서에 인용된 참조문헌의 전체적인 내용은 참조문헌에 의하여 삽입되어 있다.
의약적 등급의 플라스미드 DNA의 생산은 마그다 마켓, 낸시 혼, 제니퍼 미크, 그레그 부다하지, 미합중국특허 제 5,561,064호
다공성 매질에서 핵산과 바이러스의 농도와 크기-분획은 콜, 케네디 디., 미합중국 특허 제 5,707,850호
컬럼 크로마토그래피 중의 플라스미드 DNA의 정제, 낸시 혼, 그레그 부다하지, 마그다 마켓, 미합중국 특허 제 5,707,812
Claims (53)
- 하기의 단계를 포함하며, 용매, 세제, 글리콜, 헥사민 코발트, 스퍼미딘 및 폴리비닐피롤리돈의 부재하에서 수행되는 것을 특징으로 최소한 하나의 호스트 세포 불순물을 포함하는 혼합물로부터 플라스미드 DNA를 정제하는 방법:(a) 소수성 상호작용 매질에 최소한 하나의 호스트 세포 불순물이 선택적으로 결합하도록 상기 혼합물에 충분한 양의 염을 첨가하여 용액을 형성하는 단계;(b) 상기 최소한 하나의 불순물이 소수성 상호작용 매질과 결합하여 복합체를 형성하는 조건 하에서 플라스미드 DNA를 포함하는 상기 용액을 상기 소수성 상호작용 매질에 접촉시키는 단계; 및(c) 상기 복합체 및 소수성 상호작용 매질로부터 결합하지 않은 플라스미드 DNA를 수집하는 단계.
- 제 1 항에 있어서, 상기 최소한 하나의 불순물은 RNA, 엔도톡신, 크로모좀 DNA 및 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA를 정제하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 최소한 하나의 불순물은 엔도톡신인 것을 특징으로하는 플라스미드 DNA를 정제하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 염은 아세테이트, 포스페이트, 카보네이트, SO4 2-, Cl-, Br-, NO3 -, Mg2+, Li+, Na+, K+및 NH4 +로 구성된 군으로부터 선택되는 음이온 또는 양이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA를 정제하는 방법.
- 제 4 항에 있어서, 상기 염은 약 2 M 내지 약 4 M의 농도 범위의 암모늄 설페이트인 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA를 정제하는 방법.
- 제 5 항에 있어서, 상기 암모늄 설페이트는 약 2 M의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA를 정제하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 용액은 약 2 M 내지 약 4 M의 농도 범위의 나트륨 염을 포함하는 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA를 정제하는 방법.
- 제 7 항에 있어서, 상기 나트륨 염은 염화나트륨인 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA를 정제하는 방법.
- 제 8 항에 있어서, 상기 나트륨 염은 약 2 M 농도의 염화나트륨인 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA를 정제하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 용액의 pH는 약 6.8 내지 약 7.4의 범위인 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA를 정제하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 용액의 pH는 약 7.4인 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA를 정제하는 방법.
- 제 1 항에 있어서, 상기 소수성 상호작용 매질은 소수성 그룹이 결합된 크로마토그래피 지지체를 포함하는 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA를 정제하는 방법.
- 제 12 항에 있어서, 상기 결합된 그룹은 C3내지 C10알킬 그룹 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA를 정제하는 방법.
- 제 12 항에 있어서, 상기 소수성 상호작용 매질은 메타크릴레이트 중합체 구조, 또는 프로필, 부틸, 헥실, 옥틸, 노닐 또는 데실 리간드의 최소한 하나와 결합된 공중합체 구조으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA를 정제하는 방법.
- 제 14 항에 있어서, 상기 매질은 메타크릴레이트 에틸렌 글리콜 공중합체 구조 또는 가교된 아가로스 구조의 최소한 하나인 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA를 정제하는 방법.
- 제 12 항에 있어서, 상기 레진은 15 내지 100 ㎛의 크기를 가지는 비드로 형성된 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA를 정제하는 방법.
- 하기의 단계를 포함하는 최소한 하나의 호스트 세포 불순물에서 선택적으로, 수퍼코일형 플라스미드 DNA와 풀려진형 플라스미드 DNA의 혼합물로부터 수퍼코일형 플라스미드 DNA를 분리하는 방법:(a) 수퍼코일형 플라스미드 DNA 및 풀려진형 플라스미드 DNA 그리고, 선택저인 최소한 하나의 호스트 세포 불순물의 혼합물에 염을 첨가하여 용액을 형성하는 단계;(b) 상기 수퍼코일형 플라스미드 DNA와 풀려진형 플라스미드 DNA가 모두 소수성 상호작용 매질과 결합하여, 첫 번째 결합 복합체를 형성하는 첫 번째 조건하에 상기 용액을 소수성 상호작용 매질에 접촉시키는 단계; 및(c) 첫 번째 결합 복합체로부터 풀려진형 플라스미드 DNA를 제거하는 두 번째 조건으로 첫 번째 결합 복합체를 둘러싸는 첫 번째 조건을 변형시켜서, 두 번째 결합 복합체 및 풀려진형 플라스미드 DNA를 포함하는 분리된 성분들을 형성하는 단계; 및(d) 상기 두 번째 결합 복합체로부터 수퍼코일형 플라스미드 DNA를 제거하는 세 번째 조건으로 상기 두 번째 결합 복합체를 둘러싸는 상기 두 번째 조건을 수정시켜서, 소수성 상호작용 매질 및 수퍼코일형 플라스미드 DNA를 포함하는 분리된성분들을 형성하는 단계.
- 제 17 항에 있어서, 상기 최소한 하나의 호스트 세포 불순물은 RNA, 엔도톡신, 크로모좀 DNA 및 단백질로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 수퍼코일형 플라스미드 DNA를 분리하는 방법.
- 제 17 항에 있어서, 상기 최소한 하나의 불순물은 엔도톡신인 것을 특징으로 하는 수퍼코일형 플라스미드 DNA를 분리하는 방법.
- 제 17 항에 있어서, 상기 소수성 상호작용 매질은 소수성 그룹이 결합된 크로마토그래피 지지체를 포함하는 것을 특징으로 하는 수퍼코일형 플라스미드 DNA를 분리하는 방법.
- 제 20 항에 있어서, 상기 결합된 그룹은 C3내지 C10알킬 그룹 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 수퍼코일형 플라스미드DNA를 분리하는 방법.
- 제 20 항에 있어서, 상기 소수성 상호작용 매질은 메타크릴레이트 중합체, 또는 프로필, 부틸, 헥실, 옥틸, 노닐 또는 데실 리간드의 최소한 하나와 결합된 공중합체 구조으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 수퍼코일형 플라스미드 DNA를 분리하는 방법.
- 제 20 항에 있어서, 상기 매질은 메타크릴레이트 에틸렌 글리콜 공중합체 구조 또는 가교된 아가로스의 최소한 하나인 것을 특징으로 하는 수퍼코일형 플라스미드 DNA를 분리하는 방법.
- 제 20 항에 있어서, 상기 레진은 15 내지 100 ㎛의 크기를 가지는 비드로 형성된 것을 특징으로 하는 수퍼코일형 플라스미드 DNA를 분리하는 방법.
- 제 17 항에 있어서, 상기 염은 아세테이트, 포스페이트, 카보네이트, SO4 2-,Cl-, Br-, NO3 -, Mg2+, Li+, Na+, K+및 NH4 +로 구성된 군으로부터 선택되는 음이온 또는 양이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 수퍼코일형 플라스미드 DNA를 분리하는 방법.
- 제 25 항에 있어서, 상기 염은 2.5 M 내지 4 M의 농도 범위의 암모늄 설페이트인 것을 특징으로 하는 수퍼코일형 플라스미드 DNA를 분리하는 방법.
- 제 17 항에 있어서, 상기 첫 번째 조건은 2.5 M 내지 4 M의 농도의 암모늄 설페이트를 포함하는 염 용액으로 상기 매질을 평형화하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 수퍼코일형 플라스미드 DNA를 분리하는 방법.
- 제 17 항에 있어서, 상기 두 번째 조건은 2.35 M 내지 2.45 M의 농도의 암모늄 설페이트를 포함하는 염 용액으로 상기 매질을 세척하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 수퍼코일형 플라스미드 DNA를 분리하는 방법.
- 제 17 항에 있어서, 상기 세 번째 조건은 1 M 내지 2.3 M의 농도의 암모늄 설페이트를 포함하는 염 용액으로 상기 두 번째 결합 복합체를 세척하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 수퍼코일형 플라스미드 DNA를 분리하는 방법.
- 엔도톡신이 소수성 반응매질과 복합체를 형성하는 조건 하에, 엔도톡신 및 플라스미드 DNA의 혼합물과 소수성 상호작용 매질을 접촉시키는 단계, 그리고 상기 플라스미드 DNA 및 상기 복합체를 분리시키는 단계를 포함하는 플라스미드 DNA로부터 엔도톡신을 분리하는 방법.
- 제 30 항에 있어서, 상기 염은 아세테이트, 포스페이트, 카보네이트, SO4 2-, Cl-, Br-, NO3 -, Mg2+, Li+, Na+, K+및 NH4 +로 구성된 군으로부터 선택되는 음이온 또는 양이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA로부터 엔도톡신을 분리하는 방법.
- 제 30 항에 있어서, 상기 혼합물은 1.5 M 내지 4 M의 농도 범위의 암모늄 염을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA로부터 엔도톡신을 분리하는 방법.
- 제 32 항에 있어서, 상기 암모늄 염은 약 2 M의 농도로 존재하는 암모늄 설페이트인 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA로부터 엔도톡신을 분리하는 방법.
- 제 30 항에 있어서, 상기 소수성 상호작용 매질은 소수성 그룹이 결합된 크로마토그래피 지지체를 포함하는 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA로부터 엔도톡신을 분리하는 방법.
- 제 34 항에 있어서, 상기 결합된 그룹은 C3내지 C10알킬 그룹 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA로부터 엔도톡신을 분리하는 방법.
- 제 34 항에 있어서, 상기 소수성 상호작용 매질은 메타크릴레이트 중합체,또는 프로필, 부틸, 헥실, 옥틸, 노닐 또는 데실 리간드의 최소한 하나와 결합된 공중합체 구조으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA로부터 엔도톡신을 분리하는 방법.
- 제 34 항에 있어서, 상기 매질은 메타크릴레이트 에틸렌 글리콜 공중합체 구조 또는 가교된 아가로스의 최소한 하나인 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA로부터 엔도톡신을 분리하는 방법.
- 제 34 항에 있어서, 상기 레진은 15 내지 100 ㎛의 크기를 가지는 비드로 형성된 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA로부터 엔도톡신을 분리하는 방법.
- 제 30 항에 있어서, 상기 용액의 pH는 약 6.8 내지 7.4의 범위인 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA로부터 엔도톡신을 분리하는 방법.
- 제 35 항에 있어서, 상기 용액의 pH는 약 7.4인 것을 특징으로 하는 플라스미드 DNA로부터 엔도톡신을 분리하는 방법.
- 수퍼코일형 플라스미드 DNA와 풀려진형 플라스미드 DNA가 모두 소수성 상호작용 매질과 결합하는 첫 번째 조건 하에 수퍼코일형 플라스미드 DNA와 풀려진형 플라스미드 DNA의 혼합물을 소수성 상호작용 매질에 접촉시켜 첫 번째 결합 복합체를 형성하는 단계, 첫 번째 결합 복합체로부터 상기 풀려진형 플라스미드 DNA를 제거하는 두 번째 조건으로 첫 번째 결합 복합체를 둘러싸는 첫 번째 조건을 변형시켜서, 두 번째 결합 복합체 및 풀려진형 플라스미드 DNA를 포함하는 분리된 성분들을 형성하는 단계 및 상기 두 번째 결합 복합체로부터 수퍼코일형 플라스미드 DNA를 제거하는 세 번째 조건으로 상기 두 번째 결합 복합체를 둘러싸는 상기 두 번째 조건을 수정시켜서, 소수성 상호작용 매질 및 수퍼코일형 플라스미드 DNA를 포함하는 분리된 성분들을 형성하는 단계를 포함하는 풀려진형 플라스미드 DNA로부터 수퍼코일형 플라스미드 DNA를 분리하는 방법.
- 제 41 항에 있어서, 상기 소수성 상호작용 매질은 소수성 그룹이 결합된 크로마토그래피 지지체를 포함하는 것을 특징으로 하는 수퍼코일형 플라스미드 DNA를 분리하는 방법.
- 제 41 항에 있어서, 상기 결합된 그룹은 C3내지 C10알킬 그룹 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 수퍼코일형 플라스미드 DNA를 분리하는 방법.
- 제 41 항에 있어서, 상기 소수성 상호작용 매질은 메타크릴레이트 중합체, 또는 프로필, 부틸, 헥실, 옥틸, 노닐 또는 데실 리간드의 최소한 하나와 결합된 공중합체 구조로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 수퍼코일형 플라스미드 DNA를 분리하는 방법.
- 제 44 항에 있어서, 상기 매질은 메타크릴레이트 에틸렌 글리콜 공중합체 구조 또는 가교된 아가로스의 최소한 하나인 것을 특징으로 하는 수퍼코일형 플라스미드 DNA를 분리하는 방법.
- 제 41 항에 있어서, 상기 레진은 35 내지 100 ㎛의 크기를 가지는 비드로 형성된 것을 특징으로 하는 수퍼코일형 플라스미드 DNA를 분리하는 방법.
- 제 41 항에 있어서, 상기 첫 번째 조건은 약 2.5 M 내지 약 4 M의 농도의 암모늄 설페이트를 포함하는 염 용액으로 상기 매질을 평형화하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 수퍼코일형 플라스미드 DNA를 분리하는 방법.
- 제 47 항에 있어서, 상기 두 번째 조건은 약 2.35 M 내지 약 2.45 M의 농도의 암모늄 설페이트를 포함하는 염 용액으로 상기 매질을 세척하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 수퍼코일형 플라스미드 DNA를 분리하는 방법.
- 제 48 항에 있어서, 상기 세 번째 조건은 약 1 M 내지 약 2.3 M의 농도의 암모늄 설페이트를 포함하는 염 용액으로 상기 두 번째 결합 복합체를 세척하는 과정을 포함하는 것을 특징으로 하는 수퍼코일형 플라스미드 DNA를 분리하는 방법.
- 제 17 항 및 제 41 항의 어느 한 항에 있어서, 상기 변형과정 및 수정과정은 연속적으로 변하는 암모늄 설페이트의 농도를 가지는 염 용액을 포함하는 암모늄 설페이트를 상기 첫 번째 결합 복합체와 혼합하여, 상기 풀려진형 플라스미드 DNA와 수퍼코일형 플라스미드 DNA의 농도구배 용출시키는 단계를 포함하는 일련의 과정으로 조합되는데, 상기 변화하는 농도는 3 M 내지 1 M의 암모늄 설페이트가고, 상기 풀려진형 플라스미드 DNA는 첫 번째 용출분획에서 수집되며, 상기 수퍼코일형 플라스미드 DNA는 첫 번째 용출분획에서 수집되는 것을 특징으로 하는 수퍼코일형 플라스미드 DNA를 분리하는 방법.
- 제 41 항에 있어서, 상기 풀려진형 플라스미드 DNA의 분리 성분 및 상기 수퍼코일형 플라스미드 DNA의 분리성분은 수집되고 단리되는 것을 특징으로 하는 수퍼코일형 플라스미드 DNA를 분리하는 방법.
- 다음의 단계를 포함하는, 혼합물에서 풀려진형 DNA 보다 상대적으로 다량의 수퍼코일형 DNA를 수득하는 방법:(1) 수퍼코일형 DNA 및 풀려진형 DNA를 포함하는 혼합물과 수퍼코일형 DNA가 소수성 상호작용 매질에 우선적으로 결합하는 이온 조건하에서 알킬 부분을 포함하는 소수성 상호작용 매질을 반응시키는 단계;(2) 풀려진형 DNA의 우선적인 제거를 가능하게 하는 이온 조건하에 풀려진형 DNA 및 수퍼코일형 DNA를 포함하는 소수성 상호작용 매질을 처리하는 단계; 및(3) 소수성 상호작용 매질로부터 수퍼코일형 DNA를 용출하는 단계.
- 하기의 단계를 포함하는, DNA를 함유하는 조성물로부터 당지질 (lipopolysaccharide, LPS)를 제거하는 방법:(1) DNA 및 LPS를 포함하는 혼합물과 DNA에 비하여 상대적으로 LPS가 소수성 상호작용 매질에 우선적으로 결합하는 이온 조건하에서 알킬 부분을 포함하는 소수성 상호작용 매질을 반응시키는 단계; 및(2) DNA의 선택적인 제거를 가능하게 하는 이온 조건하에 DNA 및 LPS를 포함하는 소수성 상호작용 매질을 처리하는 단계.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US13677299P | 1999-05-28 | 1999-05-28 | |
| US60/136,772 | 1999-05-28 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20020092778A true KR20020092778A (ko) | 2002-12-12 |
| KR100688349B1 KR100688349B1 (ko) | 2007-02-28 |
Family
ID=22474295
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020017015298A KR100688349B1 (ko) | 1999-05-28 | 2000-05-26 | Ｄｎａ 정제방법 및 정제된 ｄｎａ |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1187840B2 (ko) |
| JP (2) | JP5320528B2 (ko) |
| KR (1) | KR100688349B1 (ko) |
| CN (1) | CN1264854C (ko) |
| AT (1) | ATE433456T1 (ko) |
| AU (1) | AU782153B2 (ko) |
| BR (1) | BR0011033A (ko) |
| CA (1) | CA2375215C (ko) |
| CZ (1) | CZ20014274A3 (ko) |
| DE (1) | DE60042366D1 (ko) |
| DK (1) | DK1187840T4 (ko) |
| ES (1) | ES2328008T5 (ko) |
| HU (1) | HUP0301869A2 (ko) |
| IL (3) | IL146695A0 (ko) |
| MX (1) | MXPA01012213A (ko) |
| NO (1) | NO20015703L (ko) |
| NZ (1) | NZ515645A (ko) |
| PL (1) | PL203013B1 (ko) |
| RO (1) | RO122855B1 (ko) |
| RU (1) | RU2001135838A (ko) |
| WO (1) | WO2000073318A1 (ko) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100612869B1 (ko) * | 2004-11-08 | 2006-08-14 | 삼성전자주식회사 | 고정화된 금속-리간드 복합체에 의한 세포 용해 방법 |
| KR20190018467A (ko) * | 2016-06-14 | 2019-02-22 | 바이오젠 엠에이 인코포레이티드 | 올리고뉴클레오타이드의 정제를 위한 소수성 상호 작용 크로마토그래피 |
| US11865480B2 (en) | 2019-05-07 | 2024-01-09 | Electronics and Telecommunications Research Institute Cancer Rop Co., Ltd. | Nucleic acid purification device and nucleic acid purification method |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL203013B1 (pl) * | 1999-05-28 | 2009-08-31 | Cambrex Bio Science Baltimore | Sposób oczyszczania plazmidowego DNA, sposób oddzielania superskręconego plazmidowego DNA, sposób oddzielania endotoksyny od plazmidowego DNA, sposób wzbogacania ilości superskręconego DNA względem rozluźnionego DNA, sposób usuwania lipopolisacharydu |
| GB0107634D0 (en) * | 2001-03-27 | 2001-05-16 | Fermentas Ab | Nucleic acid purification |
| GB0127803D0 (en) * | 2001-11-20 | 2002-01-09 | Glaxo Group Ltd | Processing nucleic acid |
| KR100463415B1 (ko) * | 2001-12-12 | 2004-12-23 | 씨제이 주식회사 | 세균내ｄｎａ 또는 ｒｎａ로부터 리포폴리사카라이드를제거하는 방법 |
| SE0200543D0 (sv) | 2002-02-21 | 2002-02-21 | Amersham Biosciences Ab | Method of separation using aromatic thioether ligands |
| US20040127648A1 (en) * | 2002-12-31 | 2004-07-01 | Ciphergen Biosystems, Inc. | Sorbent and method for the separation of plasmid DNA |
| MXPA06003004A (es) * | 2003-09-17 | 2006-06-23 | Centelion | Metodo de preparacion de acido desoxirribonucleico plasmidico de grado farmaceutico. |
| CA2559368A1 (en) * | 2004-04-19 | 2005-10-27 | Centelion | Method for purifying plasmid dna |
| JP4811773B2 (ja) * | 2005-06-08 | 2011-11-09 | 肇 柄谷 | 核酸の精製法 |
| US20090047734A1 (en) * | 2006-03-31 | 2009-02-19 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Method of separation of deoxyribonucleic acids |
| US20120220729A1 (en) | 2011-02-28 | 2012-08-30 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Liquid phase separation of plasmid dna isoforms and topoisomers |
| WO2015050191A1 (ja) | 2013-10-03 | 2015-04-09 | 協和発酵バイオ株式会社 | 二重鎖リボ核酸の精製方法 |
| KR20200132893A (ko) * | 2018-03-15 | 2020-11-25 | 인터갈락틱 테라퓨틱스, 인크. | 합성 dna 벡터 및 사용 방법 |
| GB2606844A (en) | 2019-09-18 | 2022-11-23 | Intergalactic Therapeutics Inc | Synthetic DNA vectors and methods of use |
| CN111721871A (zh) * | 2020-06-24 | 2020-09-29 | 南京济群生物科技有限公司 | 一种质粒超螺旋dna含量的高分离度检测方法 |
| KR20220018185A (ko) | 2020-08-06 | 2022-02-15 | 주식회사 바이오솔루션 | 플라스미드 dna 추출방법 |
| KR20220018187A (ko) | 2020-08-06 | 2022-02-15 | 주식회사 바이오솔루션 | 플라스미드 dna 추출키트 |
| WO2022073995A1 (en) * | 2020-10-05 | 2022-04-14 | Bia Separations D.O.O. | Improved removal of rna and contaminants from dna plasmid preparations by hydrophobic interaction chromatography |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5622960A (en) * | 1992-04-14 | 1997-04-22 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Topoisomerase II inhibitors and therapeutic uses therefor |
| US5561064A (en) | 1994-02-01 | 1996-10-01 | Vical Incorporated | Production of pharmaceutical-grade plasmid DNA |
| CA2182388C (en) | 1994-02-07 | 2007-08-07 | Metin Colpan | Process for producing endotoxin-free or endotoxin-poor nucleic acids and/or oligonucleotides for gene therapy |
| US5707850A (en) | 1995-11-09 | 1998-01-13 | Cole; Kenneth D. | Concentration and size-fractionation of nucleic acids and viruses in porous media |
| US5707812A (en) | 1996-08-06 | 1998-01-13 | Vical Incorporated | Purification of plasmid DNA during column chromatography |
| US6214586B1 (en) * | 1997-12-08 | 2001-04-10 | Genzyme Corporation | Method for purifying plasmid DNA and plasmid DNA substantially free of genomic DNA |
| EP0964057B1 (en) * | 1998-05-11 | 2004-12-22 | Tosoh Corporation | Method for separating nucleic acids by means of liquid chromatography |
| JP2000035423A (ja) * | 1998-05-11 | 2000-02-02 | Tosoh Corp | 液体クロマトグラフィ―による核酸の分離法 |
| PL203013B1 (pl) * | 1999-05-28 | 2009-08-31 | Cambrex Bio Science Baltimore | Sposób oczyszczania plazmidowego DNA, sposób oddzielania superskręconego plazmidowego DNA, sposób oddzielania endotoksyny od plazmidowego DNA, sposób wzbogacania ilości superskręconego DNA względem rozluźnionego DNA, sposób usuwania lipopolisacharydu |
-
2000
- 2000-05-26 PL PL364051A patent/PL203013B1/pl unknown
- 2000-05-26 AT AT00936329T patent/ATE433456T1/de active
- 2000-05-26 IL IL14669500A patent/IL146695A0/xx unknown
- 2000-05-26 ES ES00936329T patent/ES2328008T5/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-26 AU AU51655/00A patent/AU782153B2/en not_active Expired
- 2000-05-26 RU RU2001135838/04A patent/RU2001135838A/ru not_active Application Discontinuation
- 2000-05-26 NZ NZ515645A patent/NZ515645A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-05-26 KR KR1020017015298A patent/KR100688349B1/ko active IP Right Grant
- 2000-05-26 DK DK00936329.2T patent/DK1187840T4/da active
- 2000-05-26 DE DE60042366T patent/DE60042366D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-26 JP JP2001500643A patent/JP5320528B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-26 HU HU0301869A patent/HUP0301869A2/hu unknown
- 2000-05-26 MX MXPA01012213A patent/MXPA01012213A/es active IP Right Grant
- 2000-05-26 RO ROA200101276A patent/RO122855B1/ro unknown
- 2000-05-26 CZ CZ20014274A patent/CZ20014274A3/cs unknown
- 2000-05-26 CN CNB008109486A patent/CN1264854C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-26 EP EP00936329A patent/EP1187840B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-26 CA CA2375215A patent/CA2375215C/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-26 WO PCT/US2000/014527 patent/WO2000073318A1/en active IP Right Grant
- 2000-05-26 BR BR0011033-7A patent/BR0011033A/pt not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-11-22 NO NO20015703A patent/NO20015703L/no not_active Application Discontinuation
- 2001-11-22 IL IL146695A patent/IL146695A/en not_active IP Right Cessation
-
2011
- 2011-12-07 JP JP2011267892A patent/JP2012050463A/ja active Pending
-
2012
- 2012-10-29 IL IL222755A patent/IL222755A/en not_active IP Right Cessation
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100612869B1 (ko) * | 2004-11-08 | 2006-08-14 | 삼성전자주식회사 | 고정화된 금속-리간드 복합체에 의한 세포 용해 방법 |
| KR20190018467A (ko) * | 2016-06-14 | 2019-02-22 | 바이오젠 엠에이 인코포레이티드 | 올리고뉴클레오타이드의 정제를 위한 소수성 상호 작용 크로마토그래피 |
| US11865480B2 (en) | 2019-05-07 | 2024-01-09 | Electronics and Telecommunications Research Institute Cancer Rop Co., Ltd. | Nucleic acid purification device and nucleic acid purification method |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR100688349B1 (ko) | Ｄｎａ 정제방법 및 정제된 ｄｎａ | |
| US6410274B1 (en) | Plasmid DNA purification using divalent alkaline earth metal ions and two anion exchangers | |
| US5747663A (en) | Process for the depletion or removal of endotoxins | |
| JPH07501223A (ja) | 核酸を単離する装置及び方法 | |
| EP0969090A1 (en) | Rapid and simple process for isolation of circular nucleic acids | |
| EP3663401B1 (en) | Purification process for biological molecules such as plasmid dna using anionic exchange chromatography | |
| US6953686B1 (en) | Methods of DNA purification and purified DNA | |
| KR20240034791A (ko) | 아데노-연관 바이러스 캡시드를 분리하는 방법, 상기 방법에 의해 수득되는 조성물 및 그의 용도 | |
| US7659392B2 (en) | Method of separation using aromatic thioether ligands | |
| WO2023170028A1 (en) | Method for reducing endotoxin levels in nucleic acid purification | |
| JP2024510907A (ja) | 関心対象のタンパク質を精製するための方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| N231 | Notification of change of applicant | ||
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20130204 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20140204 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20150119 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20160121 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20170119 Year of fee payment: 11 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20171215 Year of fee payment: 12 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20181218 Year of fee payment: 13 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20200128 Year of fee payment: 14 |