DNA纯化方法和纯化的DNA
本发明要求申请日为1999年5月28日的、美国临时申请号60/136772的优先权,该申请的所有内容被收作本文参考。
本发明提供了用于纯化质粒DNA的方法,该方法包括从含有质粒DNA的水溶液中除去诸如内毒素、RNA、蛋白和宿主细胞DNA的杂质,以及利用疏水性相互作用介质从含有超螺旋和带切口的或松弛型质粒DNA的混合物的水溶液中分离并纯化超螺旋质粒DNA的方法。还提供了诸如实验室规模或桌面规模的小规模纯化DNA的改进方法,以及用于该方法的设备。本发明提供了纯化的和/或分离的DNA,如质粒,优选超螺旋DNA。
基因治疗提供了一种治疗人类疾病的新的治疗形式。利用DNA治疗包括囊性纤维化、各种类型的癌症在内的遗传性疾病和进行疾病的免疫,是目前被广泛采纳的有希望的治疗模式。与通过使用能与基因产物相互作用的制剂或者使用本身就是基因产物的制剂来改变疾病的表现型不同,从理论上讲,基因治疗可以修饰特定的基因,从而治愈或治疗疾病。基因治疗还可以被用作药物输送系统。为了实现这一目的,能产生有用的产物(RNA、肽、蛋白等)或它本身就是有用的产物(如使用反义DNA)的基因通过体内、来自体内、或体外方法插入一种个体的同源、异源或自身细胞或将被施用于个体的宿主细胞的DNA或细胞中。例如,在血管手术期间,可以将一种能产生抗凝血因子的基因插入血管内部细胞的DNA中,以便有助于防止形成危险的血液凝块。许多其他的症状也都可以用这种通用方法治疗。
预期基因治疗是适用于治疗超过4000种已知遗传学疾病中的很多种的有效工具,这些疾病包括囊性纤维化、心脏病、癌症、关节炎和其他疾病。基因治疗一般需要将遗传材料(DNA)转入个体。基因输送或遗传材料的输送可以通过将含有基因的病毒或质粒DNA直接用于血液或组织中而实现,通过导入在实验室中操作获得外源DNA的细胞而间接实现,或者通过本领域已知的各种包囊或载体技术实现。最近的报导表明,还可以直接输送DNA。有几种不同的系统已经被用于或者正被考虑用于体细胞基因转移。例如,其中包括DNA(裸露的或复合的)、RNA病毒(逆转录病毒)和DNA病毒(腺病毒、腺相关病毒[AAV]、疱疹病毒和痘病毒)。
诸如使用质粒DNA的基因治疗的非病毒模式的主要优点是容易大量制备,具有高度的安全性,一般不会有异源DNA整合到宿主细胞DNA中,以及可以使用实际上不受限制的大小和数量的基因或基因片段。另外,将质粒DNA用于基因治疗一般不涉及使用有可能在受体内引起不希望的免疫反应的外源基因或蛋白。另外,使用质粒DNA的替代形式如病毒载体其造价比较昂贵。
目前所使用的生产质粒DNA的方法通常所得到的是一种超螺旋质粒DNA和带切口的(或松弛型)DNA伪迹的混合物,这种伪迹通常不能用于最终使用的质粒DNA中。本发明的方法提供了一种非破坏性地分离超螺旋和带切口的质粒DNA的方法,这样,尽管本发明的方法是以回收并使用超螺旋质粒DNA为例进行说明的,本领域技术人员应当理解的是,任一种分离形式的质粒DNA都可以被视为本发明方法的有用产物。另外,尽管本发明强调了在基因治疗中,较大纯度超螺旋质粒DNA的必要性,本领域技术人员应当理解的是,质粒DNA被广泛用于除了基因治疗制剂以外的重组分子生物学,并且本文所披露的发明具有作为分离和纯化超螺旋质粒DNA的制备方法的广泛用途。
现有的分离两种形式DNA的方法使用离子交换层析(纯化用于基因治疗的质粒的新型快速方法,Bhikhabhai R.Ollivier M.和Blanche F.,Amersham Pharmacia Biotech R & D,75184Uppsala,瑞典和RPRGencell,Rhone-Poulenc Roer,Center de Recherche de Vitry Alfortville,13quai Jules Guesde,94400Vitry sur Siene,法国。出版号:18-1129-51;用阴离子交换层析制备性纯化超螺旋质粒DNA。Duarte MiguelPrazeres,Thomas Schleup,Charles Cooney,层析杂志A,606(1998),31-45)或大小排阻层析(Prageres,D.M.,用于质粒纯化的凝胶过滤层析支持物的比较,生物技术11卷,No.6,1997年6月,417-420页),同时结合使用诸如聚乙二醇(PEG)、洗涤剂、和诸如己胺钴、亚精胺、和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的其他成分的添加剂。最近批准了一份用PEG作添加剂纯化超螺旋质粒DNA的专利(Horn等,US5707812)。不过,现有的方法不能有效并且低成本地分离超螺旋的和带切口的(或松弛型)DNA。许多现有方法具有使用PEG或其他添加剂的缺陷,这些添加剂在生产质粒DNA时是不需要的,因为它们会需要额外的分离、处理和质量控制方法,这些方法可能是困难的,会花费更多的时间和更多的费用。
分离超螺旋和松弛型质粒DNA的另一种形式的已知方法使用非常昂贵的、拥有专利的树脂。在处理期间,还要使用诸如乙腈、乙醇和其他成分的溶剂,所述其他成分如三乙胺和四丁基磷酸胺。由于要使用溶剂,上述方法通常不适用于大规模生产。另外,不能将其用于具有大量松弛型质粒DNA的原材料上,因为原材料中大量的污染性松弛型质粒DNA会降低该树脂的分辨能力(Green,A.P.等,Bio.Pharm.10卷,No.5,52-62页,1997年5月)。
另一种分离超螺旋和松弛型DNA的方法依赖于大小排阻层析,该方法包括根据其体积上的小的差别分离两种形式的质粒DNA。这种柱一般相对较长,存在明显的放大问题,使其不可能用于大规模生产。另外,大小排阻方法需要浓缩样品溶液,在质粒DNA溶液上这种浓缩是不可行的,因为质粒DNA具有高粘稠性的特性。参见,用于质粒纯化的凝胶过滤层析支持物的比较,G.N.M.Ferreira,J.M.S.Cabral和D.M.F.Prageres,生物技术11卷,No.6,1997年6月,417-420页。
用细菌制剂生产的质粒DNA制剂通常含有松弛型和超螺旋质粒DNA的混合物,通常需要根据FDA的要求除去内毒素,因为已知由许多细菌宿主所产生的内毒素会导致炎性反应,如在接受该质粒DNA的宿主上引起发烧或败血症。所述内毒素通常是脂多糖或其片段,这种糖是格兰氏阴性细菌的外膜的成分,并且以宿主细胞的伪迹形式存在于DNA制剂中,或作为诸如宿主细胞膜或大分子的较大伪迹的一部分用于表达和生产用于基因治疗的质粒DNA。因此,在纯化用于治疗或预防目的的质粒DNA时,除去内毒素是一个关键的和必须的步骤。
从质粒DNA溶液中除去内毒素主要是利用了内毒素的带负电荷的结构;不过,质粒DNA也是带负电荷的,因此,分离通常是通过阴离子交换树脂实现的,这种树脂能同时结合这两种分子,并且在特定条件下,能在结合内毒素的条件下优先洗脱质粒DNA。这种分离方法只能部分除去内毒素,因为大量内毒素与质粒DNA一起洗脱和/或质粒DNA的回收很差。其他专利方法使用洗涤剂,这会产生一些问题(消耗或清除内毒素的方法,Coplan,Metin,Moritz,Peter,Schorr,Joachim,US5747663)。另外,这些树脂的结合容量仅在103-104EU(内毒素单位)/毫升树脂的数量级上,因为该树脂同时被内毒素和质粒DNA所占据,例如,根据所报导的50000EU/毫升-2000EU/毫升的容量通常需要3-80升树脂(Green,A.P.等,Bio.Pharm.10卷,No.5,52-62页,1997年5月;立体基因技术特征DNAEtox,立体基因,5922 FarnsworthCr.Carlsbad,CA92008)。
本发明提供了分离、提取和/或纯化质粒DNA的方法,这些方法可以组合使用或单独使用。具体地讲,本发明提供了分离、纯化和/或提取超螺旋和松弛型质粒DNA的方法,以及从诸如含有内毒素的成分或片段的宿主细胞杂质中分离、纯化和/或提取质粒DNA的方法。本发明还提供了纯化的、分离的和/或提取的质粒DNA,特别是超螺旋质粒DNA,组合物。本发明还提供了用于实验室或桌面规模分离、提取和/或纯化质粒DNA的方法和装置。
本发明提供了从存在于含有所需类型的多核苷酸的混合物中的其他成分中分离所需类型多核苷酸的方法,得到了富集了所述类型的多核苷酸的组合物。该方法包括通过让含有所述多核苷酸的混合物与疏水性相互作用介质接触,从不需要的成分中分离该多核苷酸。所述多核苷酸与其他成分的分离,以及不同类型多核苷酸的分离,是由于所述多核苷酸和其他成分在不同离子条件下对所述疏水性相互作用介质的亲和力不同。因此,在本发明的方法中,所使用的疏水性相互作用介质对脂多糖和脂蛋白的结合优势远远高于对多核苷酸的结合;这种优势结合发生在用于该分离方法的离子条件范围内。本发明还包括分离超螺旋DNA和松弛型DNA的方法。该方法所使用的离子条件是,其中,超螺旋DNA对疏水性相互作用介质的结合相对松弛型DNA的结合而言具有优势。
可以理解的是,当说明用于本发明方法的盐浓度时,可以使用另一种盐的等离子强度。还应当理解的是,特别是对于消耗和/或消除内毒素的方法而言,所述方法适用于质粒以及非质粒DNA。
本发明的一个目的是提供从污染型的细胞宿主杂质中分离、提取和/或纯化质粒DNA的方法。
本发明的另一个目的是提供分离、纯化和/或提取含有质粒DNA和内毒素的成分或片段的方法。
本发明的另一个目的是提供分离、纯化和/或提取超螺旋和松弛型质粒DNA的方法。
本发明还提供了纯化的、分离和/或提取的质粒DNA,特别是超螺旋质粒DNA,组合物。
在一种实施方案中,本发明提供了一种从质粒DNA中分离内毒素和其他宿主细胞杂质(即RNA、染色体DNA、蛋白)的方法,包括让细胞裂解物与疏水性相互作用介质接触,接触条件为所述内毒素和其他污染性物质可以与疏水性相互作用介质结合形成一种复合物,以及分离所述质粒DNA和该复合物。在本实施方案的方法中所分离的内毒素包括来自格兰氏阴性微生物的内毒素,以及结合在该内毒素和内毒素片段上的片段和细胞和亚细胞成分。所述疏水相互作用介质还能结合包括t-RNA、r-RNA和mRNA在内的RNA、宿主细胞蛋白和染色体DNA。用于本发明的疏水性相互作用介质可以是树脂形式的、膜或其他支持介质。
该实施方案的一种优选形式包括将质粒DNA以及可能含有的包括内毒素在内的其他污染性宿主细胞成分的混合物加样到含有疏水性相互作用的介质的柱或床基质上,使得内毒素和宿主细胞杂质能优先结合或者被该疏水性相互作用介质保留,而质粒DNA以洗出物(流出物)形式从该加样过程中收集,或者随后可选地洗涤该疏水性相互作用介质,该洗涤不会干扰或破坏保留在疏水性相互作用介质上和/或内的宿主细胞杂质和内毒素。在收集质粒DNA之后,通过改变、更换或修饰所述柱或床的疏水性相互作用条件,例如,改进柱或床基质周围的盐浓度,洗脱结合的或保留的宿主细胞杂质和内毒素,对所述柱或床基质进行再生。
本发明的另一种实施方案提供了在不进行离子交换层析或大小排阻层析或不进行这两种层析的条件下进行分离的方法。
在该实施方案中的一种形式中,首先用硫酸铵反应溶液对所述柱或床体积进行平衡,硫酸铵的浓度使得所述污染性杂质能选择性地结合在该疏水性相互作用柱上,优选浓度为大约2M。可用于本发明方法中的盐包括选自下列一组的阴离子和阳离子的混合物,包括,但不限于乙酸根、磷酸根、碳酸根、SO4 2-、Cl-、Br-、NO3 -、Mg2+、Li+、Na+、K+、NH4 +。可以使用盐的混合物。另外,在与所述柱或床基质接触之前,优选用透析缓冲液对质粒DNA和诸如内毒素的其他污染性杂质的混合物进行透析,以便除去有可能在硫酸铵反应溶液中改变内毒素和质粒DNA以及诸如内毒素的其他污染性杂质的疏水性的盐和其他污染物。所述反应溶液优选用诸如Tris-HCl的物质进行缓冲,其pH在6.8-8.5的范围内,但不局限于此,优选为7.4。可以使用的其他污染物为本领域技术人员所公知,例如,但不局限于Tris、TES(N-3(羟甲基)-2-氨基乙烷-磺酸)、Tricine(N-3(羟甲基)甲基甘氨酸)、磷酸盐、PIPES(哌嗪-N,N’-二(乙烷磺酸),MOPS(3-(N-吗啉基)-丙烷磺酸)、MES(2-(N-吗啉基)-乙烷磺酸)。MEPES(3-N(N-吗啉基)乙基哌嗪-N’-2-乙烷磺酸),和Bicine(N,N-二(2-羟基乙基)甘氨酸)。
本发明的方法提供了提取的和/或纯化的质粒DNA,以及含有所述质粒DNA的组合物,该组合物具有明显减少了的内毒素含量,或者是不含内毒素,使得该质粒DNA的内毒素负荷减少了超过95%。优选超过98%,更优选超过99%,或者超过99.9%,最优选超过99.99%-99.999%。本发明的方法可用于分离具有大的起始内毒素负荷的溶液,如至少200000-400000内毒素单位(EU)/毫升溶液的容量,提供了至少600000-3000000EU/毫升疏水性基质的容量。另外,本发明的方法提供了一种产物质粒DNA组合物,它含有低于大约10-大约2500EU或低于1-大约300EU/毫克DNA。另外,本发明的方法提供了一种产物质粒DNA组合物,它含有低于大约50-大约1000内毒素单位(EU)或低于10-大约50EU/毫克DNA。本发明的方法还能将蛋白含量降低到低于0.1%(w/w),将RNA含量降低到低于1%(w/w),并将染色体DNA降低到低于1%(w/w)。
在另一种实施方案中,本发明提供了一种从松弛型质粒DNA中分离超螺旋质粒DNA的方法,该方法包括以下步骤:让超螺旋质粒DNA和松弛型质粒DNA的混合物与疏水性相互作用介质在第一种条件下接触,在这种条件下超螺旋质粒DNA和松弛型质粒DNA同时与所述疏水性相互作用介质结合,形成结合的第一种混合物,将所述结合的第一种混合物周围的第一种条件改变成第二种条件,以便从结合的第一种混合物中除去松弛型质粒DNA,形成含有第二种结合混合物和松弛型质粒DNA的分离成分,以及将所述第二种结合混合物周围的第二种条件调整为第三种条件,以便从第二种结合混合物中除去超螺旋质粒DNA,形成含有所述疏水性相互作用介质和超螺旋质粒DNA的分离成分。
在该实施方案的另一种形式中,所述条件的改变和调整可以通过改变洗脱缓冲液或溶液的pH条件而实现,其目的是使得松弛型和超螺旋形式能够在不同的pH条件下洗脱,而改变或不改变盐的条件。
在该实施方案的另一种形式中,所述改变和调整可以通过等度洗脱实现,其中,一种具有相同组成的溶液优选具有相同的盐浓度,它能同时洗脱两种形式的质粒DNA,当它通过含有结合的质粒的柱时,能够以不同的级份依次独立洗脱这两种形式的质粒。
在另一种实施方案中,可以对盐条件和/或其他条件进行改变,以便松弛型质粒能够以非结合级份形式收集,而超螺旋形式结合在树脂上。所述超螺旋形式可以在随后通过使用上述条件洗脱。
在该实施方案的另一种形式中,所述改变或调整可以通过使用能够竞争性结合配体的分子或分子的混合物(顶替物)而实现,并以分离成分形式从所述基质上除去结合的质粒DNA。
在该实施方案的另一种形式中,分子或分子混合物可以通过疏水性相互作用结合,或者可以与质粒DNA溶液混合,这样在加样到可以依次排出的柱上时,会导致不同形式的DNA发生分离。
在上述两种其他形式的实施方案中,通常被称为层析的“顶替”和“迎头”模式,所添加的分子可以与产物同时洗脱,而该分子在大多数情况下可以用本领域所公知的方法进行有效分离。
顶替层析是一种层析方式,其中,用对树脂有更高亲和力的顶替分子替代了与树脂结合的两种或两种以上分子,导致这两种分子被依次排出,并因此洗脱这两种或两种以上结合的分子。最近,业已鉴定了疏水性相互作用树脂的顶替物,它由三嵌段共聚物组成,包括聚甲基丙烯酸酯甲酯、丙烯酸和聚二甲基氨基乙基甲基丙烯酸酯酯(参见Ruaan等,用三嵌段共聚物作顶替物进行蛋白的疏水性顶替层析,1998年AIChE会议)。业已成功地开发了其他顶替物用于用疏水性相互作用树脂进行顶替层析(参见Shukla等,蛋白的疏水性顶替层析,1998年年度AIChE会议)。诸如2-(2-丁甲基乙氧基)乙醇的顶替物业已被用作反相层析的顶替物,这种顶替物是可以使用的。
在结合两种形式的质粒之后,可以用上述一种顶替物依次顶替从本文所披露的HIC(疏水性相互作用柱)树脂上的超螺旋和松弛型DNA。
在层析的“迎头”模式中,用一种二元混合物对所述柱进行加样,该混合物中的成分对树脂的亲和力不同,在连续地对所述柱进行超负荷加样时,一种成分被另一种成分所排出,导致这两种成分的顺序洗脱。在将该方法应用于本发明中时,例如,可以将两种形式的DNA加样到HIC柱上,并且过量用该样品过量加样可导致排斥作用,导致松弛形式被排出,这样可以将它与超螺旋形式分开收集。
在该实施方案的一种形式中,在对松弛型质粒DNA和超螺旋质粒DNA进行梯度洗脱的连续过程中组合进行改变和调整,将结合的第一种混合物与诸如硫酸铵溶液的盐溶液混合,与一种连续改变浓度的盐如硫酸铵混合,其浓度优选为大约3M-大约1M的盐,如硫酸铵。在本发明的该实施方案的这种形式中,松弛型质粒DNA是在第一洗脱体积中收集的,而超螺旋质粒DNA是在第二洗脱体积中收集的。
在该实施方案的另一种优选形式中,通过以下方式分离超螺旋和松弛型质粒DNA:首先将这两种形式的DNA结合在床或柱中的疏水性相互作用介质上,结合是在高盐浓度或等同的离子强度,如2.5-4M,优选3M的硫酸铵下进行的,然后以分级梯度或连续梯度形式洗脱,通过将盐的浓度或相当的离子强度改变到大约2.45-大约2.3 5M硫酸铵的第一种范围,然后改变到大约0(可能为1)-大约2.3M硫酸铵的第二种范围(在分级洗脱实施方案中)或通过连续改变硫酸铵的浓度从大约2.5-大约4M的范围到大约0(可能为1)至大约2.3M的第二个范围将两种分离形式的质粒DNA从柱上洗脱,所述洗脱是用大约1-大约30倍柱或床体积完成,优选至少6倍柱或床体积(在连续梯度实施方案中)。在这两种形式的任一种中,松弛型质粒DNA是在大约2.35-大约2.45M的盐(硫酸铵)浓度下从柱或床介质中洗脱的,而超螺旋质粒DNA是在大约0-大约2.3M的盐(硫酸铵)浓度范围内从柱或床介质上洗脱的。
在另一种实施方案中,本发明提供了分离超螺旋质粒DNA的方法,该方法包括:
在一种离子强度下,将含有超螺旋质粒的样品加样到疏水性相互作用介质上,在该离子条件下,相对非超螺旋质粒而言,超螺旋质粒对所述介质的结合具有优势;和
调整所述离子条件,使得所结合的超螺旋质粒被从所述介质上除去。
在另一种优选实施方案中,本发明提供了一种增加一种混合物中超螺旋DNA相对松弛型DNA的含量的方法,该方法包括(1)在一种离子强度下,让含有超螺旋DNA和松弛型DNA的混合物与含有烷基部分的疏水性相互作用介质相互作用,其中,超螺旋DNA与疏水性相互作用介质的结合具有优势;(2)在能优先除去松弛型DNA的离子条件下处理含有松弛型和超螺旋DNA的疏水性相互作用介质;和(3)从疏水性相互作用介质上洗脱超螺旋DNA。
在另一种优选实施方案中,本发明提供了一种从含有DNA的组合物中除去脂多糖(LPS)的方法,该方法包括以下步骤(1)在一种离子强度下,让含有DNA和LPS的混合物与含有烷基部分的疏水性相互作用介质相互作用,其中,相对DNA而言,LPS对疏水性相互作用介质的结合具有优势;和(2)在能选择性地除去DNA的离子条件下处理含有DNA和LPS的疏水性相互作用介质。
本发明的方法提供了分离的和/或纯化的超螺旋质粒DNA,以及含有超螺旋质粒DNA的组合物,这种组合物优选是不含内毒素的,以便通过本文所披露的方法所生产的组合物中的超螺旋质粒DNA的含量至少占总的质粒重量的大约50%-大约99%,优选至少大约60%-大约95%,更优选至少大约70%-至少大约90%,最优选至少大约75%-至少大约85%。
重量百分比可以按照本文所介绍的通过在DNA-NPR HPLC柱上的HPLC分离、通过一种梯度进行测定,所得到的峰的面积相当于一种成分的含量。超螺旋形式的百分比是以相当于超螺旋DNA的峰面积相对超螺旋和松弛型质粒DNA的峰的总面积的比例计算的。
可用于本发明方法中的优选的疏水性相互作用介质包括疏水性相互作用层析树脂,例如,它含有甲基丙烯酸酯聚合物或共聚物主链,如甲基丙烯酸酯/乙二醇和/或甲基丙烯酸酯/丙二醇共聚物(TosoHaas,Montgomeryville,PA),和/或琼脂糖或Sepharose(Amersham PharmaciaBiotech,Piscataway,NG),如交联或非交联的琼脂糖、Sepharose、葡聚糖、含有硅的聚合物,有机聚合物(天然的或合成的)、含有陶瓷的或凝胶基质、主链、或上述任一种成分与C3-C10烷基、分支的或直链或侧链配体的组合。优选的侧配体包括丙基、丁基、己基和/或辛基配体。这些配体提供了可用于本发明的分离、纯化和/或提取方法中的优势结合的相互作用。本领域技术人员可以理解的是,除了上述烷基配体之外,疏水性相互作用树脂可以包括其他配体作为补充或取代,这些配体也可用于本发明的方法中。所述配体的例子包括,但不限于苯基、辛基、丁基、丙基、新戊基、羟丙基、苄基、十八烷基、二苯基和甲基,及其取代的和非取代的衍生物和组合。可用于本发明的合适的树脂或介质材料包括披露于以下专利中的材料:EP专利号964057,EP申请号99109441,JP2000035423,JP99127700和JP98127665(Kitamura等),以上每一份专利的所有内容被收作本文参考。
所述疏水性相互作用介质可以是珠状,可将其包装或装载到柱或床反应器上,或者是一种交联的多孔介质。所述珠介质的大小可以在0.25到大于或等于100微米的范围内。珠介质的大小优选在直径为大约30-大约110微米范围内,如直径为大约35-大约100微米,或者直径在35-90微米范围内。所述疏水性相互作用介质可以膜的形式存在,如纤维素或纤维素衍生物主链,聚乙醚砜、聚砜及其衍生物和/或在过滤或分离技术领域所公知的其他材料,包括塑料,如包括微量滴定板或平皿或细胞培养皿和容器。
用于“流水线”(Amersham Pharmacia biotech)柱中的珠通常体积较大,具有不同的密度,并且是由多个生产商生产的,包括AmershamPharmacia Biotech,Biosepra公司,但并不限于这些公司,其中,澄清的裂解物可以流过这种“延长的床”柱,从而通过结合在含有疏水性相互作用配体的珠上除去污染物。
较小的珠体积通常被用于高性能分离中,包括HPLC,其中,本发明可用于提供对质粒DNA和/或不同形式DNA进行定量分析的方法。
用于本发明的珠,特别是用于分离两种形式的质粒DNA的珠没有必要是多孔的,因为质粒DNA通常太大,以至不能够占据这些小孔,并因此提供任何额外的能力。不过,这些小孔可以有效增强结合污染物的能力,因为诸如RNA、蛋白、内毒素和DNA片段的污染分子与这些孔的大小相当或小于这些孔。在这种情况下,孔隙度起着一定作用,因此可以使用多孔的树脂。
本发明的方法优选不需要有机溶剂,或添加剂或洗涤剂,如乙二醇、聚乙二醇己胺钴、亚精胺或聚乙烯吡咯烷酮。这些溶剂在超螺旋质粒DNA产物被用于诸如基因治疗的目的之前需要从产物中分离出去。
附图简述
图1表示实施分离超螺旋和松弛型质粒DNA的示例性方法所涉及的各种步骤的流程图。
图2表示被用于所述示例性方法中的在它上面结合有配体化合物的各种疏水性相互作用支持物的概念示意图。
图3表示实施从质粒DNA中分离内毒素的示例性方法所涉及的各种步骤的流程图。
图4(insert)表示来自例5的(丁基HIC)用SYBR GOLD染色的琼脂糖凝胶的扫描图象,其中,泳道1含有超螺旋DNA梯;泳道2和3含有来自1号峰的样品(松弛型),而泳道3-5含有来自2号峰(超螺旋)的样品。(泳道从左至右进行编号)。来自例5的吸收与体积的层析谱表示松弛型(1号峰)和超螺旋DNA(2号峰)的分离。
图5(insert)表示来自例6的(丁基HIC)用SYBR GOLD染色的琼脂糖凝胶的扫描图象,其中,泳道1含有标记;泳道2和3含有来自1号峰的样品(松弛型),而泳道4-6含有来自2号峰的级份(超螺旋)。(泳道从左至右进行编号)。来自例6的层析谱表示松弛型(1号峰)和超螺旋DNA(2号峰)形式的分离。
图6(insert)表示来自例7的琼脂糖凝胶的扫描图象,其中,泳道1含有一种标记物;泳道2和3含有加样到柱上的材料;泳道4含有来自伪迹峰的材料;泳道5含有来自2.4摩尔AS洗脱的材料;而泳道6含有1摩尔AS洗脱的材料(泳道从左至右进行编号)。层析谱表示松弛型和超螺旋形式质粒DNA的分离,其中,伪迹峰是宽的第一个(左侧)峰,其右侧分别是松弛型和超螺旋峰。
图7(insert)表示来自例8(己基HIC)的琼脂糖凝胶的扫描图象,其中,泳道1含有一种标记物;泳道2-4含有来自1号峰的材料(松弛型形式);而泳道5和6含有来自2号峰的级份(超螺旋形式)。(泳道和峰从左至右进行编号)。层析谱表示松弛型与超螺旋形式的分离。
图8表示来自例9的SYBR GOLD染色的样品的琼脂糖凝胶电泳的扫描图象,其中,泳道1是标记物;泳道2含有加样到柱上的材料;;泳道3、4和5分别含有1、2和3号洗出物;泳道6含有1M洗脱液;而泳道7含有水洗脱液。
本发明的方法利用了超螺旋质粒DNA、松弛型质粒DNA和诸如内毒素的细胞污染物之间的疏水性差异。
本文所披露的方法可用于纯化和分离超螺旋质粒DNA、粘粒和噬菌粒载体。所述载体和质粒DNA可以从任何来源中纯化。另外,还可以纯化存在于酵母和哺乳动物细胞中的质粒DNA和粘粒。因为在这些制剂中可能存在类似的包括内毒素、RNA、蛋白和染色体DNA在内的污染物的混合物。还有必要从这些来源中获得超螺旋形式的质粒和粘粒DNA。本文所披露的方法可用于在上述多种用途中纯化DNA。
“疏水性相互作用介质”是一种材料,它包括(a)一个支持部分和(b)一个直接或间接连接在所述支持部分上的疏水性部分。支持部分和疏水性部分的例子披露于本文中,并且为本领域所公知。所述疏水性部分提供了用于本文所述分离方法的优先结合的基础。“疏水性相互作用介质”的各种例子为本领域所公知,并披露于本文中。在本文中所使用的同样表示疏水性相互作用介质的术语的例子有,如“树脂”、“基质”、“柱”、“介质”、“珠”和“疏水性相互作用配体”。
“DNA”表示任何形式的脱氧核糖核酸,包括,但不限于质粒(超螺旋和/或松弛型或切口的),粘粒、或人工染色体。
“带切口的”或“松弛型”DNA表示不是超螺旋的DNA。“超螺旋DNA”是本领域所公知的术语。
“污染性杂质”是需要从DNA中分离、或提取的任何物质。污染性杂质包括,但不限于宿主细胞蛋白、内毒素、宿主细胞DNA和/或RNA。可以理解的是,污染性杂质的确定可取决于本发明方法所应用的场合。“污染性杂质”可以是或不是由宿主细胞产生的、即它可以是或不是宿主细胞杂质。
“提取”或“纯化”第一种成分(如DNA)表示从其他成分中富集所述第一种成分,第一种成分最初是存在于所述其他成分中的。在本文中提供了所需要的和/或可以实现的纯化程度。本发明的方法优选能产生大约5倍的富集,优选大约10倍的富集,优选大约20倍的富集,优选大约50倍的富集,优选大约100倍的富集,优选大约200倍的富集,优选大约500倍的富集,优选大约1000倍的富集。或者,纯化的程度可以第一种成分相对另一种成分的百分比表达,或者是相对所得制剂的百分比形式表示。在本文中提供了所述百分比的例子。
一种成分的“优先”或“选择性的”结合或除去表示对于一种特定条件来说,第一种成分相对另一种成分而言以较大的程度结合或者被除去。
正如本领域技术人员所理解的,“除去”或“结合”没有必要,甚至是不需要表示完全的或百分之百的除去或结合。
“含水的”溶液通常表示以水为基础的溶液(即主要溶剂是水),它可以是或者不是以百分之百的水作为溶剂。
分离在重组细菌细胞中所产生的质粒DNA包括裂解细胞和除去细胞碎片,这一目的可以通过各种方法实现。最终的溶液含有质粒DNA,除了其他污染物之外,它通常含有很大量的内毒素。本发明的方法可以通过用疏水性相互作用层析作为第一个步骤除去大量的关键性污染物,如RNA、基因组DNA、蛋白和内毒素,其中,质粒DNA可以流过而不结合。本发明的方法包括将从细菌裂解物中所获得的混合溶液可选地透析到pH6.8-8.5,优选6.8-7.4的缓冲液中,该缓冲液优选含有2M的硫酸铵,含或不含10mM EDTA,让所述可选地透析过的溶液流过一个装填过的层析柱,该柱含有层析支持物和疏水性相互作用配体,如下列成分中的任一种或其混合物:丙基、丁基、辛基或已基配体,所述柱优选预先用pH为6.8-8.5(优选为6.8-7.4)的同样含有2M硫酸铵,含或不含10mM EDTA的缓冲液平衡过。流出溶液通常是浓度为大约2M的盐,如硫酸铵,并且主要含有质粒DNA(超螺旋和松弛型的混合物)和低于2%的污染物。根据其上游步骤的变化,超螺旋DNA的重量百分比可以在50-95%,通常为大约75-85%,或者80-85%,需要进行进一步的纯化,包括从该混合物中除去松弛型质粒DNA。
本发明的方法还可以生产出内毒素含量低于规定水平,即通常为小于10EU/毫克质粒DNA的纯化质粒DNA。本发明的清除内毒素的方法既适应大规模又适应小规模生产,能够低成本地生产治疗和实验室等级的材料。这些方法利用了内毒素与本文所述疏水性树脂的选择性结合,这些树脂在用于大规模生产时,可能包括超过1000000单位/毫升所用树脂的能力。
现有的常规除去内毒素的方法具有低的能力(1000-50000EU/毫升树脂)和/或具有低的质粒DNA回收率和/或涉及到使用化学成分和/或不能方便地用于制备治疗等级的材料的方法(US5747663)。本发明的除去内毒素的方法包括将含有内毒素和质粒DNA的溶液悬浮在浓度为大约2M的诸如硫酸铵的盐溶液中,使得内毒素具有明显高于质粒DNA的疏水性,以确保与质粒DNA相比,内毒素在含有诸如丁基、辛基和/或己基的疏水性相互作用配体的树脂上的结合或优先相互作用和分离。所使用的盐浓度可优选进行优化,以便结合RNA、蛋白和内毒素。低盐浓度可能就足于提供内毒素的单独结合,因为内毒素对本文所披露的疏水性相互作用配体具有较高的亲和力。
这种内毒素清除方法的诱人的特征在于树脂对内毒素的巨大的容量,大约为1000000EU/毫升树脂,此外,还具有简便性和超过95%的质粒DNA回收率。例如,含有500毫克质粒和10000000EU内毒素的质粒DNA溶液可以用10毫升树脂纯化,而要结合这些质粒DNA和内毒素至少需要1000-4000毫升的阴离子交换树脂,并且在这种阴离子树脂上还具有回收率较差的缺陷。因此,本发明的方法可以节省100-400倍的树脂成本,并额外节省柱的成本,并提高产品的回收率。市场上出售的DNA Etox树脂目前至少比本发明方法所使用的树脂贵8倍。用于除去内毒素的具有专利化合物的另一种商业树脂(PolyFlo-PureSyn公司,87Great Valley Pkwy Malvern,PA19355)要贵5-10倍,并且需要使用溶剂和离子配对化合物。
本发明的方法提供了来自质量较差的原材料(即由松弛型和超螺旋DNA的混合物组合的原材料)的含有超过90%超螺旋质粒DNA的优质质粒DNA。另外,本发明的方法可应用于通常被用于生产用于基因治疗的质粒DNA的大规模工艺中。本发明的方法能够可靠地生产优质质粒DNA,不受通常会导致质量降低的波动的影响,即产生松弛型/带切口的质粒DNA。所述波动可以发生在产生质粒DNA的细菌的生长期间以及在随后的分离和纯化步骤中。
本发明的分离超螺旋和松弛型质粒DNA的方法以及分离质粒DNA和内毒素的方法基于以下发现:质粒的不同形式和内毒素对疏水性相互作用层析树脂具有不同的结合专一性,例如,所述树脂含有C4-C10烷基,分支的或直链的配体,并优选含有丁基或己基配体。这些配体提供了优先结合相互作用,这种结合被用于本发明的分离、纯化和/或提取方法中。本领域技术人员可以理解的是,所述疏水性树脂可以包括补充或取代上述烷基配体的配体,这些配体也可用于本发明的方法中。所述配体的例子同样披露于上文中。以下的非限定性实施例说明了本文所披露的本发明的方法。使用或者可以使用以下一般性方法。
用于基因治疗目的的质粒是从发酵以后的合适的宿主细菌中提取的。在以下的对本发明的说明中,使用了含有质粒pE1A-K2的大肠杆菌STBL-2。质粒pE1A-K2是pUC质粒衍生物,它含有源于腺病毒5型抑制基因,并含有卡那霉素基因作为选择标记。发酵是在37℃下在合适的酵母提取物/葡萄糖培养基中在有氧条件下进行的。所述培养基含有无机盐,如磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、硫酸铵和硫酸镁,pH为6.5-7.8,优选7.0。通气条件被设定为每体积培养基1个体积的空气,搅拌速度设定为800rpm。在这种模式下让细胞生长到培养基中的葡萄糖被耗尽,然后通过补充葡萄糖饲养物和搅拌控制发酵罐的DO。所述饲养物含有葡萄糖(160克/升)和酵母提取物(80克/升)和盐(1.5克/升硫酸铵和硫酸镁,1.5克/升磷酸缓冲液)的浓缩溶液。在发酵结束之后,通过离心或者通过超滤或微量过滤膜过滤收获细胞,并用pH7.4的TE(见下文)缓冲液洗涤。通过让所述悬浮液接触等体积的0.15-0.2N氢氧化钠和1%十二烷基硫酸钠(pH11.5-13)接触并温和混合裂解细胞。用乙酸钾溶液中和这种碱性溶液。通过离心或者通常让该悬浮液通过一系列的深度过滤器澄清所述材料。通过超滤膜浓缩质粒溶液,并用pH7的TE缓冲液渗滤。渗滤保留物可以直接加样到上文所述的介质上。
所述裂解物的质粒DNA含量通常低于总核酸量的2%,总的核酸包括大量RNA或染色体DNA。另外,所述裂解物含有内毒素和细胞蛋白。
本发明还提供了小规模、实验室规模或桌面规模生产分离的或纯化的DNA的方法,以及该方法所使用的设备柱和分离器。本领域技术人员可以理解的是,小规模生产质粒DNA与大规模相比会遇到不同的挑战。具体地讲,小规模分离需要分离原始材料中较大比例的污染性RNA,在大规模原材料中质粒与RNA的比例为大约2%(w/w),如上文所述,而小规模的比例为大约0.1%(w/w)。另外,小规模样品的培养体积通常为2毫升至大约2升,而大规模分离中的培养体积大约为5-大约1000升。本发明的小规模分离用床体积为大约1-大约20毫升,通常大约10-大约15毫升的反应器或柱只能分离大约100微克至大约1毫克质粒。因此,本发明提供了高效率地生产诸如内毒素、RNA和松弛型DNA中生产提取的和/或纯化的DNA,优选超螺旋DNA的方法。
尽管在本说明书中使用了各种方法,但本领域技术人员应当理解的是,可以将其他制备方法和原材料用于本文所披露的发明中。例1:用丁基疏水性相互作用层析除去内毒素(小规模)
生长获得了质粒pE1A-K2的大肠杆菌细胞,并用化学方法裂解,并通过过滤方法澄清。所使用的所有缓冲液都通过0.2微米的滤膜过滤,而内毒素的样品被保存在聚苯乙烯样品试管中。
将渗滤保留物(大约400毫升)透析到pH7.4的TE中(50毫升Tris,10mM EDTA,用盐酸调整到pH7.4),并将其用于实验中。根据需要将硫酸铵(AS)添加到含有2M AS的100毫升TE,pH7.4的缓冲液中,使得样品为2M,并部分溶解。将该溶液添加到透析样品,使得最终体积为575毫升,将其中的475毫升用于该实验。
填装丁基650S柱(购自TosoHaas公司的丁基650S树脂,156Keystone Drive,Montgomeryville,PA18936),柱的直径为2.6厘米,床高为15厘米,床体积大约75毫升,并用含有2M AS的pH7.4的TE缓冲液平衡。以5毫升/分钟的流速加样。收集流出液,并取样进行分析(DNA浓度,琼脂糖凝胶和内毒素测定)。内毒素测定是用spikes进行的,并对样品进行适当稀释,以便使PPC(阳性产物对照)回收率达到被认为可以接受的范围内。内毒素浓度用Bio Whittaker Kinetic-QCL生色LAL测定测定的,该方法披露于BW公开号P50-650U-5中,Kinertic-QCL测试试剂盒手册。在加样之后,让含有2M硫酸铵的TE流过该柱,并回收和取样。然后用pH7.4的TE缓冲液、USP纯净水依次洗涤该柱,并用0.5N氢氧化钠清洗,用大于15倍体积的USP纯净水漂洗。在下面的表1中给出了存在于上述各种洗涤液中的内毒素。除了突出的内毒素清除效率之外,还除去的大量的RNA、蛋白和DNA片段,所得到的样品是相当纯净的。
表1
样品 |
DNA浓度(mg/ml) |
内毒素EU/ml |
总EU单位 |
内毒素% |
每毫克DNA中的EU |
加样 |
0.70 |
472,200 |
22,400,000 |
100 |
674,571 |
流出物 |
0.38 |
1.64 |
771 |
0.003 |
4.31 |
洗出物 |
0.56 |
7.48 |
1.196 |
0.005 |
13.42 |
每毫升树脂的内毒素容量:3百万EU/毫升样品中内毒素的减少: 99.992%例2:用丁基疏水性相互作用层析除去内毒素(大规模)
生长携带质粒pE 1A-K2的大肠杆菌细胞,用化学方法裂解,并通过过滤方法澄清。
将渗滤保留物(大约650毫升)透析到pH7.4的TE中(50毫升Tris,10mM EDTA,用盐酸调整到pH7.4),并将其用于实验中。根据需要将硫酸铵添加到含有2M AS的1200毫升TE,pH7.4的缓冲液中,并溶解,制备2M的样品。将该溶液的体积调整到1300毫升。将该溶液添加到透析样品,使得最终体积为1950毫升,用盐酸将pH调整到7.4。
填装丁基650S柱,柱的直径为5厘米,床高为15厘米,床体积大约275毫升,并用含有2M AS的pH7.4的TE缓冲液平衡。以20毫升/分钟的流速加样。收集流出液,并取样进行分析(如上文所述对DNA浓度,琼脂糖凝胶和内毒素进行测定)。在加样之后,让含有2M硫酸铵的TE流过该柱,并收集和取样。然后用pH7.4的TE缓冲液、USP纯净水依次洗涤该柱,并用0.5N氢氧化钠清洗,用大于15倍体积的USP纯净水漂洗。在下面的表2中给出了存在于上述各种洗涤液中的内毒素。除了极突出的内毒素清除效率之外,还除去的大量的RNA、蛋白和DNA片段,所得到的样品是相当纯净的。
表2
样品 |
DNA浓度(mg/ml) |
内毒素EU/ml |
总EU单位 |
内毒素% |
每毫克DNA中的EU |
加样 |
1.59 |
271500 |
176,475,000 |
100 |
170,754 |
流出物+洗出物 |
0.34 |
<0.5 |
1325 |
0.007 |
1.45 |
每毫升树脂的内毒素容量:0.64百万EU/毫升样品中内毒素的减少: 99.993%例3:用己基疏水性相互作用层析除去内毒素(小规模)
生长获得了质粒pE1A-K2的大肠杆菌细胞,并用化学方法裂解,并通过离心方法澄清。让上清液透析到pH6.8的20mM磷酸钾缓冲液(20mM磷酸氢二钾溶液,与20mM磷酸二氢钾以一定比例混合,以便pH为6.8)中,并根据需要将硫酸铵添加到20毫升含有2M As pH6.8的KPB(20mM磷酸钾缓冲液)中,并溶解,制备2M的样品。将该溶液添加到5毫升透析样品中,使得最终体积为25毫升,并将pH调整到6.8。
填装丁基650C(TosoHaas)柱,柱的直径为1.6厘米,床高为4厘米,床体积大约8毫升,并用含有2M AS的pH6.8的KPB平衡。以2毫升/分钟的流速加样。收集流出液,并取样进行分析(DNA浓度,琼脂糖凝胶和内毒素测定,见上文)。在加样之后,让含有2M硫酸铵的KPB流过该柱,并收集和取样。然后用pH6.8的KPB缓冲液、USP纯净水依次洗涤该柱,并用0.5N氢氧化钠清洗,用大于15倍体积的USP纯净水漂洗。在下面的表3中给出了存在于上述各种洗涤液中的内毒素。除了极突出的内毒素清除效率之外,还除去的大量的RNA、蛋白和DNA片段,所得到的样品是相当纯净的。
表3
样品 |
DNA浓度(mg/ml) |
内毒素EU/ml |
总EU单位 |
内毒素% |
每毫克DNA中的EU |
加样 |
2.43 |
593500 |
29,675,000 |
100 |
244,238 |
流出物+洗出物 |
0.037 |
0.5 |
35 |
0.0001 |
14 |
每毫升树脂的内毒素容量:3.7百万EU/毫升样品中内毒素的减少: 99.999%例4:用辛基疏水性相互作用层析除去内毒素(小规模)
按照上述方法生长获得了质粒pE1A-K2的大肠杆菌细胞,并用化学方法裂解,并通过离心方法澄清。将上清液用于该实验中。将硫酸铵添加到pH7.4的含有2M AS的TE中,并溶解,制备2M的样品。将该溶液的体积调整到10毫升,使得最终体积为25毫升,用将pH调整到7.4。
填装辛基Sepharose4速流柱(Amersham Pharmacia Biotech,Piscataway,NJ),柱的直径为1厘米,床高为10厘米,床体积大约8毫升,并用含有2M AS的pH7.4的TE平衡。以2毫升/分钟的流速加样。收集流出液,并取样进行分析(DNA浓度,琼脂糖凝胶和内毒素测定)。在加样之后,让含有2M硫酸铵的TE流过该柱,收集和取样。然后用pH7.4的TE缓冲液、USP纯净水依次洗涤该柱,并用0.5N氢氧化钠清洗,用大于15倍体积的USP纯净水漂洗。在下面的表4中给出了存在于上述各种洗涤液中的内毒素。
表4
样品 |
DNA浓度(mg/ml) |
内毒素EU/ml |
总EU单位 |
内毒素% |
每毫克DNA中的EU |
加样 |
2.43 |
593500 |
59,350,000 |
100 |
244,238 |
流出物+洗出物 |
0.037 |
32 |
2240 |
0.004 |
280 |
每毫升树脂的内毒素容量:7.41百万EU/毫升样品中内毒素的减少: 99.996%例5:用丁基疏水性相互作用层析分离超螺旋和松弛型质粒DNA——梯度洗脱
按照上述方法生长获得了质粒pE1A-K2的大肠杆菌细胞,并用化学方法裂解,并通过过滤方法澄清。对质粒DNA进行大体上的纯化,以便除去主要的污染物,如内毒素、RNA、蛋白、染色体DNA等,这一目的是用丁基疏水性相互作用层析实现的,其中,硫酸铵的浓度为2M,质粒DNA能从该柱中流过,而污染物结合到柱上(见上文)。
对含有质粒DNA的流出液进行透析,并在阴离子交换(Bio Sepra)柱上处理,这种处理不能够提供进一步的纯化。为了实现在丁基柱上的分离,通过Q阴离子交换柱和渗滤进行处理是没有必要的。用30kD再生纤维素膜(0.1平方米,Millipore公司)对来自Q阴离子交换柱的洗脱液进行渗滤。用固体硫酸铵将透析材料调整到硫酸铵的浓度为3M。
以15-20毫升/分钟的流速填装丁基(Toyopearl丁基650S-TosoHaas)柱,柱的直径为2.6厘米,高度大约为15厘米。用溶解在pH7.4的Tris-EDTA缓冲液中的3M硫酸铵平衡该柱。以5毫升/分钟的流速加样。在3M硫酸铵浓度下,质粒结合在该柱上。然后用2-3倍柱体积的溶解在缓冲液中的3M硫酸铵溶液洗涤该柱。然后用从3M到1M的硫酸铵浓度梯度以6倍的床体积洗脱该柱。在梯度洗脱期间得到了2个峰,通过琼脂糖凝胶分离证实第一个峰含有松弛型质粒DNA,而第二个峰含有超螺旋形式的质粒DNA(图4A)。层析谱示于图4B中。通过HPLC进一步证实了上述结果,该分析用于测定这两种形式的百分比(表5)。
在该测定的灵敏度极限范围内,证实了所述第二个峰含有85%的超螺旋形式,而原材料中仅含有50-60%的超螺旋形式。至少90%的原始超螺旋质粒DNA得到了回收。所述峰的分离程度适合进行分离,甚至是用15厘米柱进行的。这证实了用丁基疏水性相互作用层析对超螺旋和松弛型形式的质粒的有效分离。除了这种良好的分离之外,可以除去残余量的RNA、蛋白和内毒素,得到满足基因治疗要求的产品。
表5
样品 |
超螺旋的百分比% |
原材料 |
63 |
1号峰级份 |
8 |
2号峰级份 |
83 |
例6:用丁基疏水性相互作用层析分离超螺旋和松弛型质粒DNA——梯度洗脱长柱
按照上述方法生长获得了质粒pE1A-K2的大肠杆菌细胞,并用化学方法裂解,并通过过滤方法澄清。对质粒DNA进行大体上的纯化,以便除去主要的污染物,如内毒素、RNA、蛋白、染色体DNA等,这一目的是用丁基疏水性相互作用层析实现的,其中,硫酸铵的浓度为2M,质粒DNA能从该柱中流过,而污染物结合到柱上(见上文)。对含有质粒DNA的流出液进行透析,并在阴离子交换柱上处理,这种处理不能够提供进一步的纯化。用30kD再生纤维素膜,对来自Q阴离子交换柱的洗脱液进行渗滤。用固体硫酸铵将透析材料调整到硫酸铵的浓度为3M,如在例5中所述。
以15-20毫升/分钟的流速填装丁基(Toyopearl丁基650S-TosoHaas)柱,柱的直径为2.6厘米,高度大约为30厘米。用溶解在pH7.4的Tris-EDTA中的3M硫酸铵平衡该柱。以5毫升/分钟的流速加样。在3M硫酸铵浓度下,质粒结合在该柱上。然后用2-3倍床体积的3M硫酸铵缓冲液洗涤该柱。然后用从3M到1M的硫酸铵浓度梯度以6倍的床体积洗脱该柱。在梯度洗脱期间得到了2个峰,通过琼脂糖凝胶分离证实第一个峰含有松弛型质粒DNA,而第二个峰含有超螺旋形式的质粒DNA(图5A)。层析谱示于图5B中。通过HPLC进一步证实了上述结果,该分析用于测定这两种形式的百分比(表6)。
在该测定的灵敏度极限范围内,证实了所述第二个峰含有90%的超螺旋形式,而原材料中仅含有50%的超螺旋形式。所述峰的本底分辨是用较长的柱获得的。该实施例清楚地表明,用丁基疏水性相互作用层析能有效分离超螺旋和松弛型形式的质粒。除了这种良好的分离之外,还可以除去残余量的RNA、蛋白和内毒素,得到满足基因治疗要求的产品。表6
样品 |
超螺旋的% |
原材料 |
53 |
1号峰级份36 |
15 |
2号峰级份47 |
83 |
2号峰级份49 |
55 |
2号峰级份52 |
91 |
例7:用丁基疏水性相互作用层析分离超螺旋和松弛型质粒DNA——分级洗脱长柱
按照上述方法生长获得了质粒pE1A-K2的大肠杆菌细胞,并用化学方法裂解,并通过过滤方法澄清。对质粒DNA进行大体上的纯化,以便除去主要的污染物,如内毒素、RNA、蛋白、染色体DNA等,这一目的是用丁基疏水性相互作用层析实现的,其中,硫酸铵的浓度为2M,质粒DNA能从该柱中流过,而污染物结合到柱上(参见上面的例1)。收集流出液和洗涤液,用30kD超滤膜切向流过滤进行浓缩。用固体硫酸铵将浓缩的质粒DNA调整到3M的硫酸铵浓度。
以6毫升/分钟的流速填装丁基(Toyopearl丁基650S-TosoHaas)柱,柱的直径为1厘米,高度大约为30厘米。用溶解在pH7.4的Tris-EDTA中的3M硫酸铵平衡该柱。以2毫升/分钟的流速加样。在3M硫酸铵浓度下,质粒结合在该柱上。然后用2-3倍床体积的3M硫酸铵缓冲液洗涤该柱。然后用各种浓度的硫酸铵-2.8M、2.7M、2.6M、2.55、2.5M、2.4M、1M以2-3倍的柱体积洗脱该柱。在图6A中示出了洗脱峰的琼脂糖凝胶电泳。该凝胶证实了超螺旋和松弛型形式的明显分离。2.4M的洗脱液含有松弛型形式,而1M的洗脱液含有超螺旋DNA。层析谱示于图6B中。通过HPLC进一步证实了上述结果,该分析用于测定这两种形式的百分比(表7)。
在该测定的灵敏度极限范围内,证实了所述第二个峰含有93%的超螺旋形式,而原材料中仅含有62%的超螺旋形式。通过随后的实验证实了上述结果,其中,2.3M和2.2M的洗脱液无法分辨,而2.4M的洗脱液能反复提供对松弛型形式的明显清除,因此在1M洗脱液中对超螺旋形式进行了富集。用分级洗脱所实现的分离在大规模分离中是显著的,大规模分离用分级洗脱能更可靠地完成。该实施例清楚地表明,通过丁基疏水性相互作用层析的分级洗脱能有效分离超螺旋和松弛型形式的质粒。除了这种良好的分离之外,还可以除去残余量的RNA、蛋白和内毒素,得到满足基因治疗要求的产品。
表7
样品 |
超螺旋的% |
原材料 |
62 |
2.4M洗脱液 |
8 |
例8:用己基疏水性相互作用层析分离超螺旋和松弛型质粒DNA——梯度洗脱长柱
按照上述方法生长获得了质粒pE1A-K2的大肠杆菌细胞,并用化学方法裂解,并通过过滤方法澄清。对质粒DNA进行大体上的纯化,以便除去主要的污染物,如内毒素、RNA、蛋白、染色体DNA等,这一目的是用丁基疏水性相互作用层析实现的,其中,硫酸铵的浓度为2M,质粒DNA能从该柱中流过,而污染物结合到柱上(例如,参见上文的例1)。对含有质粒DNA的流出液进行透析,并在阴离子交换柱上处理,这种处理不能够提供进一步的纯化。用30kD再生纤维素膜,对来自Q柱的洗脱液进行渗滤。用固体硫酸铵将透析材料调整到硫酸铵的浓度为3M(参见上文)。
以5毫升/分钟的流速填装己基(Toyopearl己基650C-TosoHaas)柱,柱的直径为1厘米,高度大约为30厘米。用溶解在pH7.4的Tris-EDTA缓冲液这中的3M硫酸铵平衡该柱。以2毫升/分钟的流速加样。在3M硫酸铵浓度下,质粒结合在该柱上。然后用2-3倍床体积的3M硫酸铵缓冲液洗涤该柱。然后用从3M到1M的硫酸铵浓度梯度以6倍的柱体积洗脱该柱。在梯度洗脱期间得到了2个峰,通过琼脂糖凝胶分离证实第一个峰主要含有松弛型质粒DNA,而第二个峰主要含有超螺旋形式的质粒DNA(图7A)。
层析谱示于图7B中。通过凝胶电泳,从定性角度讲,第二个峰含有明显高于原材料的超螺旋质粒的比例。考虑到以下事实,即己基的珠体积为100m,而丁基的珠体积为35m,获得了所述峰的良好的分离。例9:用丁基疏水性相互作用层析除去内毒素(使用氯化钠)
生长获得了质粒pE1A-K2的大肠杆菌细胞,并用化学方法裂解,并通过离心方法澄清,将上清液用于该实验。通过阴离子交换柱(QHyper D-BIOSEPRA公司)纯化样品。将来自所述柱的的2M的氯化钠洗脱液用于该实验中。样品存在于含有2M氯化钠的pH7.4的50mMTris、10mM EDTA缓冲液中。填装丁基HIC柱(使用丁基650S树脂-TosoHaas),柱的直径为1厘米,高度为20厘米,体积大约为10毫升,并用含有2M氯化钠的TE平衡该柱。以2毫升/分钟的流速加样收集流出液,并取样进行分析(DNA浓度、琼脂糖凝胶和内毒素测定)。在加样之后,让含有2M硫酸铵的TE流过该柱,收集并取样。然后用pH7.4的TE洗涤该柱。
表8
样品 |
DNA浓度(mg/ml) |
内毒素EU/ml |
总EU单位 |
内毒素% |
每毫克DNA中的EU |
加样 |
0.27 |
642 |
16,050 |
100 |
2377 |
洗出物 |
0.13 |
5 |
350 |
2 |
38 |
每毫升树脂的内毒素容量:1570EU/毫升样品中内毒素的减少: 98%例10:用丁基疏水性相互作用层析进行小规模质粒纯化
小规模质粒DNA纯化是用市售试剂盒进行的,其中,最常见的是Qiagen’s微量制备试剂盒。本文所披露的方法可用于纯化质粒DNA,它具有好于商业试剂盒的若干优点。下面的实施例证实了用本发明的疏水性相互作用层析方法小规模纯化质粒DNA。
用于纯化的原材料是通过标准方法获得的。具体地讲,在37℃下在含有100微克/毫升氨苄青霉素的LB中生长获得了大约4.65kb的大肠杆菌细胞。在OD为2.7时收获细胞。通过离心从培养基中除去细胞。然后,将细胞沉淀重新悬浮在pH8.0的50mMTris-HCl,10mM EDTA中。添加等体积的200mM氢氧化钠,1%SDS溶液,充分混合并在室温下培养5分钟。这一步骤会导致细胞裂解,释放出包括质粒DNA在内的细胞内含物。添加等体积的(原始体积)由3.1M乙酸钾(pH5.5)组成的中和溶液并充分混合。通过纱布和滤膜过滤中和过的裂解液,以便除去沉淀。用70%的异丙醇沉淀澄清的裂解物(每3毫升澄清的裂解液添加2.1毫升异丙醇)。通过离心分离沉淀物,并用70%的乙醇洗涤沉淀,干燥并溶解在pH8.0的10mM Tris-HCl,0.1mM EDTA缓冲液中。在-20℃下保存该制剂待用,并将其用作纯化实验的原材料。
填装丁基650S柱(Pharmacia XK16/20)柱,柱的直径为1.6厘米,床体积为20毫升,床高为10厘米,并用溶解在pH7.4的50mMTris-HCl,10mM EDTA(TE)缓冲液中的2.2M硫酸铵(AS)平衡。通过添加固体硫酸铵至2.2M的终浓度制备加样样品。用溶解在pH7.4的Tris-EDTA中的2.2M AS将该样品稀释到10毫升。
对纯化条件进行设计,以便能够在流出液收集质粒DNA,而污染物结合在树脂上。
以2毫升/分钟的流速加样,并收集流出液。用35毫升溶解在TE缓冲液中的2.2M AS洗涤该柱,并收集1号洗涤级份(10毫升),2号洗涤级份(45毫升)和3号洗涤级份(10毫升)。在洗涤期间得到了一个峰。用55毫升溶解在pH7.4的TE缓冲液中的1M AS洗涤该柱,并收集1M的1号洗脱液(10毫升)和1M的2号洗脱液(45毫升)。在1M AS洗脱期间得到了一个峰。用50毫升USP-纯净水洗脱该柱。得到了一个峰。下面的表示出了存在于上述每一种级份中的总的核酸。核酸的浓度是根据在260nm波长下的吸收值计算的(浓度(微克/毫升)=A260*50)。
表9
柱级份 |
浓度 |
质量 |
|
(μg/ml) |
(μg) |
加样 |
550.0 |
5503 |
洗出物1 |
7.6 |
76 |
洗出物2 |
40.4 |
607 |
洗出物3 |
5.0 |
50 |
洗涤柱(质粒DNA) |
20.9 |
733 |
1M洗脱 |
35.8 |
1611 |
水洗脱 |
30.5 |
1523 |
对样品进行琼脂糖凝胶电泳。图8表示该凝胶的照片复制件。该凝胶的照片显示了在洗涤级份中的质粒DNA(泳道3、4、5)。与加样样品(泳道2)相比,在洗涤级份中没有可见的RNA。在泳道6和7中可以看出在洗脱级份中含有RNA。通过Kinetic QCL内毒素测定测定洗涤收集物中的内毒素。在该测定的灵敏度水平上,在样品中没有检测到内毒素。该检测的灵敏度水平为0.005EU/毫升。从100毫升培养物中得到了733微克质粒,这一结果类似于用商业试剂盒所获得的结果。
本文所引用的以及下面的参考文献的完整内容以其整体形式收作本文参考。
药物级质粒DNA的生产,Magda Marquet,Nancy Horn,JenniferMeek,Gregg Budahazi,US5561064
在多孔介质中对核酸和病毒进行浓缩和大小分离,Cole,KennethD.,US5707850
在柱层析期间纯化质粒DNA,Nancy Horn,Gregg Budahazi,MagdaMarquet,US5707812