RO122855B1 - Metode de purificare a adn-ului şi adn-uri purificate - Google Patents

Abstract

Prezenta invenţie prezintă metode pentru purificarea plasmidei ADN, care includ îndepărtarea impurităţilor din celule gazdă, cum ar fi endotoxine, ARN, proteine şi ADN cromozomal, dintr-o soluţie apoasă care conţine ADN plasmidian, şi la metode pentru separarea şi purificarea plasmidei ADN superrăsucit dintr-o soluţie apoasă care conţine un amestec de ADN plasmidian superrăsucit şi relaxat, folosind suporturi cromatografice cu interacţiune hidrofobă.

Description

Prezenta invenție se referă la prezentarea de metode de purificare a ADN-ului plasmidic, care includ îndepărtarea impurităților celulei gazdă, cum ar fi endotoxine, ARN, proteine și ADN-ul celulei gazdă dintr-o soluție apoasă ce conține ADN plasmidian, precum și metode de separare și purificare a ADN-ului plasmidian superrăsucit dintr-o soluție apoasă care conține un amestec de ADN plasmidian superrăsucit sau relaxat, utilizând medii de interacțiune hidrofobă. De asemenea, se prezintă metode îmbunătățite de purificare a ADNului la scară mică, cum ar fi la nivel de laborator sau de masă de lucru, precum și echipamentul utilizat în cadrul acestor metode. Invenția de față prezintă ADN purificat și/sau separat, cum ar fi ADN-ul plasmidian, de preferință superrăsucit.

Este cunoscut faptul că terapia genică oferă o nouă paradigmă de tratament pentru vindecarea maladiilor umane. Utilizarea ADN-ului pentru tratamentul maladiilor genetice, cum ar fi fibroza chistică, variate tipuri de cancer etc., și pentru imunizarea împotriva maladiilor este o metodă de terapie promițătoare, care este urmărită pe scară largă. Mai degrabă decât alterarea fenotipului maladiei prin utilizarea de agenți care interacționează cu produșii genelor, sau care sunt ei înșiși produși ai genelor, terapia genică poate modifica teoretic genele specifice care rezultă prin tratamentul bolii. Terapia genică poate fi, de asemenea, utilizată ca sistem de eliberare a unui medicament. Pentru a realiza acest lucru, o genă care produce un produs util (ARN, peptide, proteine, etc.) sau care este ea însăși un produs util (cum ar fi în cazul utilizării ADN antisens) poate fi inserată în ADN-ul sau în celula omoloagă, heteroloagă sau autoloagă (din același organism) a unei celule individuale sau a unei celule gazdă, pentru a fi administrată ulterior unui individ, fie in vivo, ex vivo sau in vitro. De exemplu, în timpul intervențiilor chirurgicale pe vasele de sânge, o genă care produce un factor anticoagulant poate fi inserată în ADN-ul celulelor bazale ale vaselor de sânge, pentru a ajuta prevenirea formării trombusurilor sangvine periculoase. Multe alte stări pot, de asemenea, conduce la un tratament utilizând această manieră generală.

Se așteaptă ca terapia genică să fie un instrument puternic pentru tratamentul multora dintre cele mai mult de 4000 de maladii genetice cunoscute, incluzând fibroza chistică, bolile de inimă, cancerul, artrita și alte boli. Terapia genică necesită, în general, transferul materialului genetic (ADN) la un individ. Furnizarea genelor sau a materialului genetic se poate realiza fie prin administrare directă a virusurilor sau ADN-ului plasmidian care conțin gena, în sânge sau țesuturi, fie indirect prin introducerea celulelor manipulate în laboratoare, în scopul adăpostirii ADN-ului străin sau prin intermediul unor diverse tehnici de încapsulare sau purtător cunoscute în domeniu. Rapoartele recente au sugerat că poate fi de asemenea posibilă furnizarea directă de ADN. Sunt utilizate sau se au în vedere câteva sisteme diferite pentru transferul genelor somatice. Acestea includ, de exemplu, ADN (fie simple fie complexate), ARN virusurile (retrovirusurile) și ADN virusurile (adenovirusurile sau virusurile adenoasociate - [AAV] - virusul herpetic și virusul variolei).

Avantajele cheie ale modalității de terapie genică nonvirală, cum ar fi utilizarea ADNului plasmidian, este ușurința preparării în cantități mari, un mare grad de siguranță, lipsa integrării ADN-ului heterolog în ADN-ul celulei gazdă, și posibilitatea de a utiliza fragmentele de genă/gene sau a genei/genelor cu un număr și o varietate virtual nelimitate. Mai mult, utilizarea ADN-ului plasmidian în cadrul terapiei genice, în general, nu implică utilizarea genelor sau proteinelor străine care ar putea induce un răspuns imun nedorit la primitor. în plus, alternativele la utilizarea ADN-ului plasmidian, cum arfi vectorii virali, sunt relativ mai scumpe din punct de vedere al producerii.

Metodele curent utilizate de producere a ADN plasmidian furnizează, în general, un amestec de ADN plasmidian superrăsucit și ADN relaxat-artefact, care, în general, este inutil în cadrul aplicării finale a ADN-ului plasmidian. Metodele din invenția de față furnizează o separare nedistructivă a ADN-ului plasmidian superrăsucit de ADN-ul plasmidian relaxat,

RO 122855 Β1 astfel încât deoarece metodele invenției de față sunt exemplificate prin recuperarea și 1 utilizarea ADN-ului plasmidian superrăsucit, un specialist în domeniu va aprecia că, chiar și forma separată a ADN-ului plasmidian poate fi considerată produs util al metodelor descrise 3 acum. Mai mult, în timp ce descrierea de față evidențiază necesitatea unei purități mai avansate a ADN-ului plasmidian în contextul terapiei genice, cei din domeniu vor aprecia că 5 ADN-ul plasmidian este utilizat pe scară largă în cadrul biologiei moleculare recombinante dincolo de utilizarea în preparatele terapiei genice și invenția descrisă aici își găsește o largă 7 aplicabilitate ca metodă de preparare pentru ADN-ul plasmidian superrăsucit, izolat și purificat. 9

Metodele de separare ale celor două forme de ADN plasmidian, disponibile în mod obișnuit, utilizează cromatografia de schimb ionic (“Un nou și rapid procedeu de purificare 11 a plasmidelor pentru terapia genică”, Bhikhabhai R. Ollivier M. și Blanche F., Amersham Pharmacia Biotech R&D, 75184 Uppsala, Suedia, și RPR Gencell, Rhone-Poulenc Roer, 13 Centre de Recherche de Vitry-Alfortville, 13 quai Jules Guesde, 94400, Vitry sur Sienne, France. Numărul publicației: 18-1129-51; “Purificarea preparativă a ADN plasmidian 15 superrăsucit utilizând cromatografia de schimb ionic”, Duarte Miguel Prazeres, Thomas Schleup, Charles Cooney, Journal of Chromatography A, 606 (1998), 31-45) sau croma- 17 tografia de excludere sterică (Prazeres, D.M., “Compararea suporturilor pentru cromatografia de gel-filtrare pentru purificarea plasmidelor”, Biotechnology Techniques, Voi. 11, nr. 6, iunie 19 1997, p. 417-420), cuplate cu utilizarea unor aditivi cum ar fi polietilen glicolul (PEG), detergenții și alte componente cum ar fi hexaminocobaltul, spermidina și polivinilpirolidona 21 (PVP). Recent a fost acordat un brevet (Horn, și colab., (brevetul US 5707812)) pentru purificarea ADN-ului plasmidian superrăsucit utilizând PEG ca aditiv. Cu toate acestea, 23 metodele cunoscute în mod curent nu sunt capabile să ofere o separare eficientă și necostisitoare a ADN-ului plasmidian superrăsucit de cel relaxat. în plus, multe dintre metodele 25 cunoscute suferă de dezavantajul utilizării PEG sau a altor aditivi, care pot fi de nedorit pentru prepararea de ADN plasmidian, deoarece necesită separări adiționale, metode de 27 aranjare și control al calității, care pot fi dificile, cronofage și costisitoare.

Formele alternative ale metodelor cunoscute pentru separarea formelorsuperrăsucite 29 și relaxate ale ADN plasmidian utilizează rășini de firmă foarte scumpe, care, de asemenea, utilizează solvenți, cum arfi acetonitrilul, etanolul sau alte componente, cum arfi trietilamină 31 și fosfatul de tetrabutilamoniu, în timpul prelucrării. Metodele nu sunt, în general, utilizabile pentru producția pe scară largă, datorită utilizării solvenților. Mai mult, acestea nu pot fi apli- 33 cate pentru unele materiale inițiale care conțin o cantitate semnificativă de ADN plasmidian relaxat; cantitatea abundentă de ADN plasmidian relaxat contaminant din materialul inițial, 35 tinzând să reducă capacitățile rezolutive ale rășinilor. (Green, A. P. et al, Bio. Pharm., Voi.

10, nr. 5, pag. 52-62, mai 1997). 37

Metodele suplimentare de separare a ADN-ului superrăsucit de cel relaxat se bazează pe cromatografia de excludere sterică, ce implică separarea celor două forme de 39 ADN plasmidian pe baza unor mici diferențe de mărime. Aceste coloane tind să fie relativ lungi, punând probleme semnificative de ridicare la scară, făcând astfel imposibilă implemen- 41 tarea lor la scară mare. în plus, metodele de excludere sterică necesită soluții concentrate de probă, care sunt imposibil de obținut cu soluțiile de ADN plasmidian, datorită viscozității 43 ridicate a ADN-ului. Vezi, “Compararea suporturilor pentru cromatografia de gel-filtrare pentru purificarea plasmidelor”, G.N.M.Ferreira, J.M.S. Cabrai și D.M.F. Prazeres, Biotechnology 45 Techniques, voi. 11, nr. 6, iunie 1997, pp 417-420.

RO 122855 Β1

Preparatele de ADN plasmidian, care sunt produse din preparate bacteriene și adesea conțin un amestec de ADN plasmidian superrăsucit și relaxat, adesea necesită îndepărtarea endotoxinelor, conform cerințelor FDA, deoarece endotoxinele produse de multe gazde bacteriene sunt cunoscute că ar cauza reacții inflamatorii, cum ar fi febra sau sepsia primitorului ADN plasmidian.

Aceste endotoxine sunt, în general, lipopolizaharide sau fragmente ale acestora, care constituie componente ale membranei externe a bacteriilor Gram-negative, și sunt prezente în preparatele de ADN ca artefacte ale celulelor gazdă sau ca părți ale unor artefacte mai mari, cum arfi membranele sau macromoleculele celulelor gazdă, utilizate la exprimarea și prepararea ADN-ului plasmidian pentru terapie genică, de exemplu. De aceea, îndepărtarea endotoxinelor este o etapă crucială și necesară a purificării ADN-ului plasmidian pentru utilizare în terapie sau profilactică.

îndepărtarea endotoxinelor din soluțiile de ADN plasmidian a utilizat la început structura cu încărcare electrică negativă a endotoxinelor; cu toate acestea, ADN-ul plasmidian este de asemena încărcat negativ și de aceea separarea se realizează de obicei cu ajutorul rășinilor schimbătoare anionice care leagă ambele tipuri de molecule, și care, în anumite condiții, eluează preferențial ADN-ul plasmidian, în paralel legând endotoxinele. O asemenea separare are ca rezultat doar o îndepărtare parțială, deoarece cantități semnificative de endotoxine sunt eluate împreună cu ADN-ul plasmidian și/sau se realizează astfel o foarte scăzută recuperare a ADN-ului plasmidian. Alte metode brevetate utilizează detergenți, care pot ridica probleme. (“Procedeu pentru depleția sau îndepărtarea endotoxinelor, Coplan, Metin, Moritz, Peter, Schorr, Joachim, US 5747663). în plus, capacitatea de legare a acestor rășini este doar de ordinul a 10³ până la 10⁴ EU (unități endotoxinice)/ml rășină, deoarece rășina este ocupată atât de endotoxină, cât și de ADN-ul plasmidian; de exemplu în mod tipic necesită de la 3 la 80 I de rășină, pe baza capacităților raportate de 50000 EU/ml la 2000 EU/ml (Green, A. P. et al, Bio Pharm, voi. 10, nr. 5, pag. 52-62, mai 1997, Sterogene technical profite ADN Etox, Sterogene, 5922 Famsworth Cr., Carlsbad, CA 92008).

Problema pe care o rezolvă invenția constă în prezentarea de metode de purificare a ADN-ului plasmidian, de separare a ADN-ului plasmidian suprarăsucit, de separare a endotoxinelor de ADN plasmidian, de îmbogățire a cantității de AND suprarăsucit, de îndepărtare a lipopolizaharidei (LSP) dintr-o compoziție care conține ADN, metoda de îmbogățire a cantității de ADN suprarăsucit față de ADN-ul relaxat într-un amestec al acestora.

Metoda de purificare a ADN-ului plasmidian dintr-un amestec care conține cel puțin o impuritate a celulei gazdă conform invenției înlătură dezavantajele de mai sus, prin aceea că aceasta cuprinde următoarele etape:

(a) formarea unei soluții prin adăugarea unei cantități suficiente de sare la respectivul amestec pentru a permite legarea selectivă a respectivei cel puțin o impuritate a celulei gazdă la un mediu de interacțiune hidrofobă;

(b) punerea în contact a respectivei soluții ce conține ADN plasmidian cu mediul de interacțiune hidrofobă, în condiții în care respectiva cel puțin o impuritate se leagă la mediul de interacțiune hidrofobă pentru a forma un complex; și (c) colectarea ADN plasmidian nelegat din complexul menționat; în care metoda menționată se desfășoară în absența solvenților organici, detergenților, glicolilor, hexamino cobaltului, spermidinei și polivinilpirolidonei.

Metoda de separare a ADN-ului plasmidian suprarăsucit dintr-un amestec de ADN plasmidian suprarăsucit și ADN plasmidian relaxat și, opțional, cel puțin o impuritate a celulei gazde conform invenției înlătură dezavantajele de mai sus prin aceea că aceasta cuprinde următoarele etape:

RO 122855 Β1 (a) formarea unei soluții prin adăugarea unor săruri la amestecul de ADN plasmidian 1 suprarăsucit și ADN plasmidian relaxat și, când este prezent, respectiva cel puțin o impuritate a celulei gazdă; 3 (b) punerea în contact a soluției cu un mediu de interacțiune hidrofobă într-un prim tip de condiții în care atât ADN-ul plasmidian suprarăsucit, cât și ADN-ul plasmidian relaxat 5 se leagă la mediul de interacțiune hidrofobă, pentru a forma un prim amestec legat;

(c) schimbarea primului tip de condiții în care se găsește primul amestec legat într-un 7 al doilea tip de condiții, pentru a îndepărta ADN-ul plasmidian relaxat din primul amestec legat, pentru a forma componente separate conținând un al doilea amestec legat și ADN-ul 9 plasmidian relaxat; și (d) modificarea celui de-al doilea tip de condiții în care se găsește respectivul al 11 doilea amestec legat menționat într-un al treilea tip de condiții, pentru îndepărtarea ADN-ului plasmidian suprarăsucit din cel de-al doilea amestec legat, pentru a forma componente 13 separate care conțin mediul de interacțiune hidrofobă și ADN-ul plasmidian suprarăsucit.

Metoda de separare a endotoxinelor de ADN plasmidian, conform invenției, înlătură 15 de zavantajele de mai sus, prin aceea că aceasta cuprinde punerea în contact a unui amestec de endotoxine și ADN plasmidian cu un mediu de interacțiune hidrofobă, în condiții 17 în care endotoxinele menționate se leagă la mediul de interacțiune hidrofobă menționat, pentru a forma un complex și separarea ADN-ului plasmidian respectiv și a complexului 19 menționat.

Metoda de îmbogățire a cantității de ADN suprarăsucit față de ADN-ul relaxat într-un 21 amestec al acestora, conform invenției, înlătură dezavantajele de mai sus, prin aceea că aceasta cuprinde: 23 (1) interacțiunea amestecului care conține ADN suprarăsucit și ADN relaxat cu un mediu de interacțiune hidrofobă care conține o porțiune alchil în condiții în care ADN-ul 25 suprarăsucit se leagă preferențial la mediul de interacțiune hidrofobă;

(2) tratarea mediului de interacțiune hidrofobă care conține ADN relaxat și 27 suprarăsucit cu condiții care permit îndepărtarea selectivă a ADN-ului relaxat; și (3) eluarea ADN-ului suprarăsucit din mediul de interacțiune hidrofobă;29 în care respectiva metodă se desfășoară în absența solvenților organici, detergenților, glicolilor, hexamin cobaltului, spermidinei și polivinilpirolidonei.31

Metoda de îndepărtare a lipopolizaharidei (LPS) dintr-o compoziție care conține ADN, conform invenției, înlătură dezavantajele de mai sus, prin aceea că metoda cuprinde:33 (1) interacțiunea amestecului care conține ADN și LPS cu un mediu de interacțiune hidrofobă care conține o porțiune alchil, în care interacțiunea are loc în condiții în care LPS 35 se leagă preferențial la mediul de interacțiune hidrofobă față de ADN; și (2) tratarea mediului de interacțiune hidrofobă care conține ADN și LPS cu condiții 37 care permit îndepărtarea selectivă a ADN-ului.

Metodă de îmbogățire a cantității de ADN suprarăsucit față de ADN-ul relaxat într-un39 amestec al acestora, conform invenției, înlătură dezavantajele de mai sus, prin aceea că metoda cuprinde:41 (a) formarea unei soluții prin adăugarea unor săruri la amestecul de ADN suprarăsucit și ADN relaxat;43 (b) punerea în contact a soluției cu un mediu de interacțiune hidrofobă într-un prim tip de condiții în care atât ADN-ul suprarăsucit, cât și ADN-ul relaxat se leagă la mediul de 45 interacțiune hidrofobă, pentru a forma un prim amestec legat;

(c) schimbarea primului tip de condiții în care se găsește primul amestec legat într- 47 un al doilea tip de condiții, pentru a îndepărta ADN-ul relaxat din primul amestec legat, pentru a forma componente separate conținând un al doilea amestec legat și ADN-ul relaxat; și 49

RO 122855 Β1 (d) modificarea celui de-al doilea tip de condiții în care se găsește respectivul al doilea amestec legat menționat într-un al treilea tip de condiții pentru îndepărtarea ADN-ului suprarăsucit din cel de-al doilea amestec legat, pentru a forma componente separate care conțin mediul de interacțiune hidrofobă și ADN-ul suprarăsucit.

Prin aplicarea invenției, se obțin următoarele avantaje:

- ușurarea preparării în cantități mari;

- un mare grad de siguranță;

- lipsa integrării ADN-ului heterologîn ADN-ul celulei gazdă și posibilitatea de a utiliza fragmentele de genă/gene sau a genei/genelor cu un număr și o varietate virtuală nelimitată. Mai mult, utilizarea ADN-ului plasmidian în cadrul terapiei genice, în general, nu implică utilizarea genelor sau proteinelor străine care ar putea induce un răspuns imun nedorit la primitor;

- alternativele la utilizarea ADN-ului plasmidian sunt relativ mai scumpe din punct de vedere al producerii.

Invenția de față furnizează metode de separare, izolare și/sau purificare a ADN-ului plasmidian, care pot fi utilizate în combinații sau independent. în mod specific, invenția de față furnizează metode de separare, purificare și/sau izolare a ADN-ului plasmidian superrăsucit și relaxat, împreună cu metode de separare, purificare și/sau izolare a ADN-ului din impuritățile celulei gazdă, cum arfi componentele sau fragmentele care conțin endotoxine. Prezenta invenție furnizează de asemenea compoziții de ADN plasmidian purificate, separate și/sau izolate, în mod specific de ADN plasmidian superrăsucit. Prezenta invenție furnizează de asemenea metode și un aparat de separare, izolare și/sau purificare a ADN-ului plasmidian care poate fi utilizat mai ales în laboratoare.

Prezenta invenție furnizează metode de izolare a tipurilor dorite de polinucleotide de alte componente prezente în amestecurile care conțin aceste polinucleotide, rezultând compoziții îmbogățite în tipurile de polinucleotide dorite. Metodele includ separarea polinucleotidelor de componentele nedorite prin punerea în contact a amestecurilor ce conțin polinucleotidele cu medii de interacțiune hidrofobe. Separarea polinucleotidelor de alte componente, la fel ca și separarea tipurilor de polinucleotide rezultă din afinitățile diferite ale polinucleotidelor față de alte componente nedorite la mediile de interacțiune hidrofobă în diferite condiții ionice. Astfel, în metodele invenției, se utilizează un mediu de interacțiune hidrofobă care prezintă o legare preferențială ridicată a lipopolizaharidelor și lipoproteinelor față de polinucleotide; această legare preferențială se produce în condițiile ionice utilizate în procesul de separare. De asemenea, sunt incluse în invenție metode care separă ADN-ul superrăsucit de ADN-ulr relaxat. Metodele utilizează condiții ionice în care ADN-ul superrăsucit se leagă preferențial la mediul de interacțiune hidrofobă relativ la ADN-ul relaxat.

Se înțelege că atunci când se descrie concentrația de sare utilizată în metodele acestei invenții, se poate utiliza tăria ionică echivalentă unei sări diferite. Se înțelege de asemenea că, în special cu privire la metodele care depletează și/sau elimină endotoxinele, aceste metode pot fi aplicate la ADN-ul plasmidian, dar și la ADN-ul neplasmidian.

Unul dintre obiectivele acestei invenții este furnizarea de metode de separare, izolare și/sau purificare a ADN-ului plasmidian de impuritățile contaminante ale celulei gazdă.

Un alt obiectiv al prezentei invenții este fu mizarea de metode de separare, purificare și/sau izolare a ADN-ului plasmidian și a componentelor sau fragmentelor care conțin endotoxine.

încă un obiectivai prezentei invenții este furnizarea de metode de separare, purificare și/sau izolare a ADN-ului plasmidian superrăsucit și relaxat.

Compoziții de ADN plasmidian purificat, separat și/sau izolat, în special de ADN plasmidian superrăsucit, sunt furnizate de această invenție.

RO 122855 Β1 într-unul dintre aspecte, invenția de față furnizează o metodă de separare a endo- 1 toxinelor și a altor impurități ale celulei gazdă (adică ARN, ADN cromozomial, proteine) de ADN plasmidian, metodă care implică punerea în contact a unui lizat celular cu un mediu de 3 interacțiune hidrofobă în condiții în care endotoxinele și alte substanțe contaminante se leagă la mediul de interacțiune hidrofobă, pentru a forma un complex și pentru a separa 5 ADN-ul plasmidian și complexul. Endotoxinele separate prin metoda din acest aspect includ endotoxinele din microorganismele gram-negative și fragmentele și componentele celulare 7 și subcelulare legate la aceste endotoxine sau la fragmente de endotoxine. Mediul de interacțiune hidrofobă leagă de asemenea ARN, incluzând t-ARN, r-ARN, și m-ARN, pro- 9 teinele celulei gazdă și ADN cromozomial. Mediile de interacțiune hidrofobă utilizate în invenția de față pot fi sub formă de rășini, membrane sau alte medii de suport. 11

Una dintre formele preferate din acest aspect include încărcarea unui amestec de ADN plasmidian, care conține opțional alte componente contaminante ale celulei gazdă care 13 pot fi prezente, incluzând endotoxinele, pe o coloană sau pe o matrice în pat care conține mediile de interacțiune hidrofobă, într-o manieră în care endotoxinele și impuritățile celulei 15 gazdă se leagă preferențial sau sunt reținute de către mediile de interacțiune hidrofobă, iar ADN-ul plasmidian este colectat ca efluent (curge prin) din procesul de încărcare sau după 17 o spălare ulterioară opțională a mediilor de interacțiune hidrofobă, care nu deranjează sau nu întrerup retenția impurităților celulei gazdă și a endotoxinelor pe și/sau în mediile de 19 interacțiune hidrofobă. După colectarea ADN-ului plasmidian, coloana sau matricea în pat pot fi regenerate prin eluarea impurităților celulei gazdă reținute sau legate și a endotoxinelor 21 prin alterarea, schimbarea sau modificarea condițiilor de interacțiune hidrofobă din coloană sau pat, de exemplu prin alterarea concentrației de sare care înconjoară coloana sau 23 matricea în pat.

Un aspect alternativ al invenției de față furnizează metode de separare în absența 25 cromatografiei de schimb ionic și a cromatografiei de excluziune sferică, fie doar în absența uneia. 27 într-o formă preferată a acestei realizări, volumul coloanei sau patului este inițial echilibrat cu o soluție de reacție de sulfat de amoniu la o concentrație ce permite legarea 29 selectivă a impurităților contaminante la coloana de interacțiune hidrofobă, de preferință într-o concentrație de aproximativ 2 M. Sărurile care pot fi utilizate în metoda invenției de față 31 sunt amestecuri de anioni și cationi selectate din grupul constând din, dar care nu se limitează la, acetat, fosfat, carbonat, SO²'4, CI, Br‘, NO3‘, Mg²*, Li*, Na*, K*, NH4*. Se pot 33 utiliza amestecuri de săruri. Mai mult, amestecul de ADN plasmidian și alte impurități contaminante, cum arfi endotoxinele, sunt de preferință dializate cu un tampon de dializă ante- 35 rior punerii în contact cu coloana sau cu matricea în pat pentru a îndepărta sărurile și alte substanțe contaminatoare care pot altera hidrofobicitatea endotoxinelor și a ADN plasmidian 37 și a altor impurități contaminante, cum ar fi endotoxinele, în soluția de reacție de sulfat de amoniu. Soluția de reacție se tamponează de exemplu cu Tris-HCI, la un pH din domeniul 39 de, dar nelimitându-se la 6,8 până la 8,5, de preferință 7,4. Sunt cunoscute celor din domeniu și alte tampoane, cum arfi Tris, TES (acid N-tris(hidroximetil) metil-2- aminoetan- sulfo- 41 nic), Tricine (N-tris(hidroximetil)metilglicină), fosfat, PIPES (acid piperazin-N,N'-bis (2-etansulfonic), MOPS (acid 3-(N-morfolino)-propansulfonic), MES (acid 2-(N-morfolino)-etansulfo- 43 nic), MEPES (acid 3-N-(N-morfolinoetilpiperazin-N'-2-etansulfonic), și Bicine (N,N- bis(2hidroxietil)glicină) care pot fi utilizate. 45

Metodele din invenția de față furnizează ADN-ul plasmidian izolat și/sau purificat, și o compoziție care conține ADN plasmidian, care are un conținut de endotoxine substanțial 47 redus, sau nu are endotoxine, astfel încât încărcarea cu endotoxine a ADN-ului plasmidian

RO 122855 Β1 este redusă mai mult de 95%, de preferință mai mult de 98%, mai preferabil mai mult de 99%, ca alternativă mai mult de 99,9% și cel mai preferabil mai mult de 99,99 până la 99,999%. Metoda invenției de față poate fi utilizată pentru a separa încărcături inițiale mari de endotoxine, cum arfi cel puțin 200000 până al 400000 unități endotoxinice (EU)/mililitru, soluție furnizând o capacitate de cel puțin 600000 până la 3 milioane EU/ml de matrice hidrofobă. Mai mult, procedeul din invenția de față furnizează ca produs o compoziție de ADN plasmidian conținând un domeniu de la mai puțin de aproximativ 10 până la mai puțin de aproximativ 2500 EU sau un domeniu de mai puțin de aproximativ 1 până la mai puțin de aproximativ 300 EU/mg ADN. Ca alternativă, procedeul din invenția de față furnizează ca produs o compoziție de ADN plasmidian care conține un domeniu de la mai puțin de aproximativ 50 până la mai puțin de aproximativ 1000 EU sau un domeniu de mai puțin de aproximativ 10 până la mai puțin de aproximativ 50 EU/mg ADN. Metoda din prezenta invenție reduce de asemenea conținutul de proteină la mai puțin de 0,1% (gr/gr) ARN-ul până la mai puțin de 1% (gr/gr) și ADN-ul cromozomial la mai puțin de 1% (gr/gr).

într-un alt aspect, invenția de față furnizează o metodă de separare a ADN-ului plasmidian superrăsucit de ADN-ul plasmidian relaxat, care include etapele de punere în contact a unui amestec de ADN plasmidian superrăsucit și ADN plasmidian relaxat cu un mediu de interacțiune hidrofob într-un prim grup de condiții în care atât ADN-ul plasmidian superrăsucit, cât și ADN-ul plasmidian relaxat se leagă la mediul de interacțiune hidrofob, pentru a forma un prim amestec de legare, modificând primele condiții din jurul primului amestec de legare cu un al doilea grup de condiții, pentru a îndepărta ADN-ul plasmidian relaxat din primul amestec de legare, pentru a forma componente separate care conțin un al doilea amestec de legare și ADN-ul plasmidian relaxat, și modificând al doilea grup de condiții în care se găsește al doilea amestec de legare, pentru a obține un al treilea grup de condiții pentru îndepărtarea ADN-ului plasmidian superrăsucit din al doilea amestec de legare, pentru a forma componente separate care conțin mediul de interacțiune hidrofob și ADN-ul plasmidian superrăsucit.

într-o altă formă a acestui aspect, alterarea și modificarea pot fi realizate schimbând condițiile de pH ale tamponului sau soluției de eluare, într-un asemenea mod încât formele relaxată și superrăsucită să poată fi eluate în condiții diferite de pH, cu sau fără schimbarea condițiilor privitoare la sare.

într-altă formă a acestui aspect, alterarea și modificarea pot fi realizate prin eluare izocratică, în care o soluție de aceeași compoziție, de preferință la o concentrație de sare care poate elua ambele forme ale ADN-ului plasmidian, când trec prin coloana care conține plasmida legată, va elua secvențial cele două forme în mod distinct, în fracții separate.

într-o altă realizare, condițiile sării și/sau alte condiții pot fi modificate într-o asemenea manieră încât forma relaxată a plasmidei poate fi colectată ca fracție nelegată, în timp ce forma superrăsucită se leagă la rășină. Forma superrăsucită poate fi eluată ulterior prin utilizarea condițiilor expuse mai sus.

într-altă formă a acestei realizări, alterarea și modificarea pot fi realizate prin utilizarea de molecule sau a unui amestec de molecule care se leagă competitiv la liganzi (deplasatori”) și care îndepărtează formele ADN-ului plasmidian legat, de matrice, sub formă de componente separate.

într-o altă formă a acestui aspect, moleculele sau amestecul de molecule care se pot lega prin interacții hidrofobe sau altfel, pot fi amestecate cu soluții de ADN plasmidian, care, la încărcarea pe coloană pot fi deplasate secvențial, având ca rezultat separarea diferitelor forme de ADN.

RO 122855 Β1 în cele două forme alternative de realizare, la care se face referire prin termenii cro- 1 matografie “frontală” și “de deplasare”, molecula adăugată se poate co-elua cu produsul, care, în cele mai multe cazuri, poate fi separat eficient, utilizând metodele cunoscute în 3 domeniu.

Cromatografia de deplasare este o metodă cromatografică în care două sau mai 5 multe molecule legate de o rășină sunt deplasate prin utilizarea unei molecule deplasatoare care are o mai mare afinitate pentru rășină, ceea ce are ca rezultat deplasarea ulterioară și 7 deci eluarea celor două sau mai multe molecule legate. Recent au fost identificați deplasatori pentru rășinile de interacție hidrofobă, care constau în copolimeri tribloc, incluzând meta- 9 crilatul de polimetil, acidul acrilic și metacrilatul de polidimetilaminoetil (vezi Ruaan et al “Cromatografia de deplasare hidrofobă a proteinelor utilizând copolimeri tribloc ca depla- 11 satori”, mitingul AIChE din 1998). Alți deplasatori au fost dezvoltați cu succes în scopul utilizării în cromatografia de deplasare cu rășini de interacție hidrofobă (vezi Shukla et al., “Cro- 13 matografia de deplasare hidrofobă a proteinelor”, mitingul anual AIChE din 1998). Deplasatori ca 2-(2-butoxietoxi)etanolul au fost utilizați ca deplasatori în cadrul cromatografiei în 15 fază inversată, aceștia putând fi utili.

După legarea celor două forme ale plasmidului, poate fi utilizat un deplasator, cum 17 ar fi unul dintre cei amintiți mai sus, pentru deplasarea secvențială a ADN-ului superrăsucit față de cel relaxat de pe rășinile HIC (coloana de interacție hidrofobă) descrise aici. 19 în tehnica Frontală” de cromatografie, coloana este încărcată cu un amestec binar, diferit prin afinitatea acestora față de rășină, și, prin supraîncărcarea continuă a coloanei, un 21 component îl deplasează pe celălalt, rezultând eluarea secvențială a celor două componente. în cadrul aplicării acestei metode în invenția de față, cele două forme ale ADN-ului, 23 de exemplu, pot fi încărcate pe o coloană de HIC și supraîncărcarea cu probă poate avea ca rezultat un efect de deplasare care conduce la deplasarea formei relaxate, care poate fi 25 colectată separat de forma superrăsucită.

într-una din formele acestui aspect, alterarea și modificarea se combină într-un 27 proces continuu de eluare în gradient a ADN-ului plasmidian superrăsucit și a ADN-ului plasmidian relaxat, prin amestecarea primului amestec legat cu o soluție de sare, cum ar fi 29 o soluție de sulfat de amoniu, variind continuu concentrația de sare, cum ar fi sulfatul de amoniu, concentrația variind de preferință de la aproximativ 3 până la aproximativ 1 M sare, 31 cum ar fi sulfatul de amoniu. ADN-ul plasmidian relaxat este colectat în această formă a acestui aspect al invenției într-un prim volum eluat, iar ADN-ul plasmidian superrăsucit este 33 colectat într-un al doilea volum eluat.

într-o altă formă preferată a acestui aspect, formele ADN-ului plasmidian superrăsucit 35 și relaxat sunt separate prin legarea în prima fază a ambelor forme de ADN la mediul de interacție hidrofobă în pat sau coloană, la concentrații mari de sare, sau la tării ionice 37 echivalente, cum ar fi de la 2,5 la 4 M, de preferință 3 M sulfat de amoniu, și apoi eluarea de pe coloană, fie într-o manieră care implică un gradient în etape sau un gradient continuu, a 39 celor două forme separate ale ADN-ului plasmidian, prin schimbarea concentrației de sare sau a tăriilor ionice echivalente, într-un prim domeniu cuprins între aproximativ 2,45 și 2,35 41

M sulfat de amoniu, și apoi la un al doilea domeniu de la aproximativ OM (posibil 1 M) până la aproximativ 2,3 M sulfat de amoniu (în aspectul eluării în etape) sau prin schimbarea 43 continuă a concentrației sulfatului de amoniu din domeniul de la aproximativ 2,5 la aproximativ 4 M la un al doilea domeniu de la aproximativ OM (posibil 1 M) la aproximativ 2,3 M 45 peste un volum de aproximativ 1 la aproximativ 30 de volume de coloană sau de pat, de preferință cel puțin 6 volume de coloană sau de pat (în aspectul gradientului continuu). în fiecare 47 dintre aceste forme, ADN-ul plasmidian relaxat se eluează din mediul de pe coloană sau pat

RO 122855 Β1 la o concentrație de sare (sulfat de amoniu) în domeniul de la aproximativ 2,35 la aproximativ 2,45 M, în timp ce ADN-ul plasmidian superrăsucit se eluează din mediul de pe coloană sau pat la o concentrație de sare (sulfat de amoniu) în domeniul de la aproximativ OM la aproximativ 2,3 M.

în alt aspect, invenția furnizează metode de izolare a ADN-ului plasmidian superrăsucit, care includ:

- aplicarea unei probe care conține plasmid superrăsucit pe un mediu de interacțiune hidrofobă în condiții ionice, prin care plasmidul superrăsucit se leagă preferențial la mediu comparativ cu plasmidul nesuperrăsucit și

- ajustarea condițiilor ionice astfel încât plasmidul superrăsucit legat este îndepărtat din mediu.

într-un alt aspect preferat, invenția de față furnizează o metodă de îmbogățire a cantității de ADN superrăsucit față de ADN-ul relaxat dintr-un amestec al acestora, metoda incluzând (1) interacțiunea dintre amestecul care conține ADN superrăsucit și ADN relaxat cu un mediu de interacțiune hidrofobă care conține o parte alchilică în condiții ionice în care ADN-ul superrăsucit se leagă de preferință la mediul de interacțiune hidrofobă: (2) tratarea mediului de interacțiune hidrofobă care conține ADN superrăsucit și relaxat în condiții ionice care permit îndepărtarea preferențială a ADN-ului relaxat: și (3) eluarea ADN-ului superrăsucit de pe mediul de interacțiune hidrofobă.

într-un aspect suplimentar preferat, invenția de față furnizează o metodă de îndepărtare a lipopolizaharidelor (LPS) dintr-o compoziție care conține ADN, metoda incluzând etapele de (1) interacțiunea amestecului ce conține ADN și LPS cu un mediu de interacțiune hidrofobă care conține o parte alchil, în care interacțiunea are loc în condiții ionice în care LPS se leagă preferențial de mediul de interacțiune hidrofobă față de ADN; și (2) tratarea mediului de interacțiune hidrofobă care conține ADN și LPS cu condiții ionice care permit îndepărtarea selectivă a ADN-ului.

Metodele invenției de față furnizează ADN plasmidian superrăsucit izolat și/sau purificat, și o compoziție care conține ADN plasmidian superrăsucit, care este de preferință lipsit de endotoxine, astfel încât cantitatea de ADN plasmidian prezent în compoziție, produsă prin metodele descrise aici, este de la cel puțin aproximativ 50 din greutatea cantității totale de plasmid până la cel puțin aproximativ 99% din greutate, de preferință de la cel puțin aproximativ 60 din greutate la cel puțin aproximativ 95% din greutate, mai preferabil cel puțin aproximativ 70 din greutate până la cel puțin aproximativ 90% din greutate, cel mai preferabil de la cel puțin aproximativ 75 din greutate, până la cel aproximativ 85% din greutate ADN plasmidian superrăsucit.

Procentele de greutate pot fi măsurate, conform exemplificării de aici, prin rezoluție HPLC pe o coloană ADN-NPR HPLC, printr-un gradient, având ca rezultat picuri cu suprafețe ce corespund cantității din fiecare component. Procentajul de formă superrăsucită a fost calculat ca fracția din suprafața picului corespunzătoare ADN-ului superrăsucit supra suprafața totală a picurilor corespunzătoare ADN-ului plasmidian superrăsucit și relaxat.

Mediile de interacție hidrofobă preferate, care pot fi utilizate în metodele prezentei invenții, includ rășinile pentru cromatografie de interacție hidrofobă care, de exemplu, conțin schelete polimerice tip metacrilat sau copolimerice, cum ar fi copolimerii metacrilat/etilen glicol și/sau metacrilat/propilen glicol (TsooHaas, Montgomeryville, PA), și/sau agaroză cum ar fi Sefaroza (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), cum ar fi agaroza, Sepharoza, dextranul legate încrucișat sau neîncrucișat, polimer conținând silice, polimeri organici (naturali sau sintetici), un schelet care conține ceramică sau o matrice de gel, sau o combinație de oricare dintre acestea cu alchil de la C3 la C10, liniar sau ramificat, liganzi

RO 122855 Β1 cu catenă laterală suspendată. Liganzii suspendați preferați includ propil, butii, hexil sau/și 1 octil. Acești liganzi furnizează o interacție de legare preferențială care este exploatată în metodele de separare, purificare și/sau izolare ale prezentei invenții. Cei din domeniu vor 3 aprecia că rășinile de interacție hidrofobă pot include liganzi în plus la sau în locul acestor liganzi alchilici, care vor fi de asemenea utili în metodele invenției de față. Exemple de ase- 5 menea liganzi includ, dar nu se limitează la fenil, octil, butii, propil, neopentil, hidroxipropil, benzii, octadecil, difenil și metil, la fel ca și derivați substituiți sau nesubstituiți ai acelorași, 7 și combinații ale acestora. Materialele adecvate pentru rășinile sau mediul care se utilizează în invenția de față sunt cele descrise, de exemplu, în brevetul EP 964057, cererea de brevet 9 EP 99109441, JP 2000035423, 99127700 și 98127665 (Kitamura et al.), conținuturile fiecăruia fiind încorporate aici prin referință. 11

Mediul de interacțiune hidrofobă poate fi în formă de perle, care pot fi împachetate sau încărcate într-un reactor tip coloană sau pat, sau medii poroase legate încrucișat. 13

Mărimea perlelor din mediu poate fi în domeniul de la 2,5 până la mai mare sau egală cu

100 pm. Mărimea perlelor din mediu este de preferință în domeniul de la aproximativ 30 la 15 aproximativ 110 pm diametru, cum arfi de la aproximativ 35 la aproximativ 100 pm diametru, sau, ca alternativă, în domeniul de la 35 la 90 pm diametru. Mediul de interacțiune hidrofobă 17 poate fi prezent sub formă de membrane, cum ar fi schelete de celuloză sau de derivați de celuloză, polietersulfone, polisulfone și derivați ai acelorași și/sau alte materiale cunoscute 19 în cazul domeniilor filtrării și separării, incluzând masele plastice, cum arfi și incluzând plăci de microtitrare și vase Petri sau de cultură celulară și recipiente. 21

Perlele utilizate în coloanele “Streamline” (Amersham Pharmacia Biotech) în mod tipic sunt mai mari ca mărime și au diferite densități, și sunt fabricate de diferite întreprinderi, 23 incluzând Amersham Pharmacia Biotech, Biosepra Inc., dar nu se limitează la acestea, în care lizatul clarificat poate curge prin aceste coloane “pat expandat”, având ca rezultat înde- 25 părtarea contaminanților prin legarea la perlele care conțin liganzii de interacțiune hidrofobă.

Mărimile mai mici ale perlelor care sunt în mod tipic utilizate la separările de înaltă 27 performanță, incluzând HPLC, unde se poate utiliza această invenție pentru a furniza o metodă analitică cantitativă pentru ADN plasmidian și/sau pentru alte forme diferite de ADN. 29 Perlele care se utilizează în această invenție, în special la separarea celor două forme ale ADN-ului plasmidian, nu trebuie să fie poroase, deoarece ADN-ul plasmidian este 31 în general prea mare, pentru a fi capabil să ocupe porii. Cu toate acestea, în scopul legării contaminanților, porii pot crește în mod eficace capacitatea, deoarece moleculele conta- 33 minante, cum arfi ARN, proteinele, fragmentele de ADN și endotoxinele, sunt comparabile sau sunt mai mici ca dimensiuni față de mărimea porilor. în acest caz, porozitatea va juca 35 un rol important și de aceea rășinile poroase pot fi utile.

Metodele invenției de față, de preferință nu necesită solvenți organici, aditivi sau 37 detergenți, cum ar fi glicolii, polietilen glicolul, hexaminocobaltul, spermidina sau polivinilpirolidona, care vor necesita mai târziu separarea de produsul ADN plasmidian superrăsucit, 39 înaintea utilizării de exemplu în terapia genică.

Metodele din invenția de față exploatează diferențele de hidrofobicitate ale ADN-ului 41 plasmidian superrăsucit, ale ADN-ului plasmidian relaxat și ale contaminanților celulari, cum ar fi endotoxinele. 43

Medodele descrise aici sunt utile pentru purificarea și izolarea ADN-ului plasmidian superrăsucit, a cosmidelor și a vectorilor fagemidici. Acești vectori și ADN-ul plasmidian pot 45 fi purificați din orice sursă. în plus, ADN-ul plasmidian și cosmidele prezente în celulele drojdiilor și ale mamiferelor pot fi de asemenea purificate, la fel ca și mixturile similare de conta 47

RO 122855 Β1 minanți, incluzând endotoxinele, ARN, proteinele și ADN cromozomal, care pot fi prezente în aceste preparate. Există de asemenea necesitatea de a se obține forma superrăsucită a ADN-ului plasmidian și a ADN-ului cosmidian din aceste surse, și de aceea, metodele descrise aici pot fi utilizate la purificarea ADN-ului în multe dintre aceste aplicații.

“Mediul de interacțiune hidrofobă” este un material care conține (a) o parte suport și (b) o parte hidrofobă, atașată fie direct, fie indirect la partea suport. Exemple de părți suport și părți hidrofobe sunt descrise aici și sunt cunoscute în domeniu. Partea hidrofobă furnizează baza pentru legarea preferențială utilizată în cadrul metodelor de separare descrise aici. Se cunosc în domeniu variate exemple de medii de interacțiune hidrofobă” și sunt descrise și aici. Alți termeni utilizați aici denotă de asemenea mediul de interacțiune hidrofobă și exemple de un astfel de mediu, cum arfi “rășină”, “matrice”, “coloană”, “mediu”, “perle” și “ligand de interacțiune hidrofobă”.

“ADN” înseamnă orice formă de acid dezoxiribonucleic, incluzând, dar nelimitându-se la plasmidian (fie superrăsucit și/sau relaxat sau tăiat), cosmidian, sau din cromozomi artificiali.

ADN “relaxat” sau “tăiat” semnifică ADN care nu este superrăsucit. ADN “Superrăsucit” este un termen binecunoscut în domeniu.

“Impuritate contaminantă” este orice substanță care se dorește să fie separat sau izolat ADN. Impuritățile contaminante sunt, dar nu se limitează la proteine ale celulei gazdă, endotoxine, ADN și/sau ARN din celula gazdă. Se înțelege că ceea ce este considerat ca impuritate contaminantă poate depinde de contextul în care metodele din invenție sunt practicate. O “impuritate contaminantă” poate să fie sau poate să nu fie un derivat al celulei gazdă, adică poate să fie sau poate să nu fie impuritate pentru celula gazdă.

Izolarea” sau “purificarea” primului component (cum arfi ADN) semnifică îmbogățirea în prima componentă, față de alte componente, împreună cu care prima componentă se găsea inițial. Gradele de purificare dorite și/sau care pot fi obținute sunt furnizate aici. De preferință, metodele din invenție au ca rezultat o îmbogățire cam de cinci ori, de preferință o îmbogățire de aproximativ 10 ori, de preferință o îmbogățire de aproximativ 20 de ori, de preferință o îmbogățire de aproximativ 50 de ori, de preferință o îmbogățire de aproximativ 100 de ori, de preferință o îmbogățire de aproximativ 200 de ori, de preferință o îmbogățire de aproximativ 500 de ori, de preferință o îmbogățire de aproximativ 1000 de ori. Ca alternativă, gradul de purificare poate fi exprimat ca procent din primul component față de alt component sau față de preparatul rezultat. Exemple de asemenea procente sunt furnizate și aici.

Legarea sau îndepărtarea “preferențială” sau “selectivă” a unui component semnifică aceea că, pentru condiții date, prima componentă se leagă sau este îndepărtată într-un grad mai mare față de un alt component.

Cei din domeniu vor înțelege că “îndepărtarea” sau “legarea” nu semnifică în mod necesar sau chiar dezirabil completa, sau legarea sau îndepărtarea 100%.

Soluție “apoasă” indică în general o soluție care are ca bază apa (adică, solventul principal este apa), care poate să fie sau poate să nu fie apă 100% ca solvent.

Izolarea ADN-ului plasmidian produs în celulele bacteriene recombinante implică liza celulelor și îndepărtarea resturilor celulare, ceea ce se poate realiza prin metode variate. Soluția finală conține ADN plasmidian, care conține în mod tipic cantități extrem de mari de endotoxine printre alți contaminanți. Metodele din invenția de față asigură îndepărtarea unor cantități semnificative de contaminanți cheie, cum ar fi ARN, ADN genomic, proteine și endotoxine, utilizând cromatografia de interacțiune hidrofobă ca primă etapă, în care ADN-ul plasmidian curge nelegat. Metoda din invenția de față implică, opțional, dializa soluției amestecate obținută din liza bacteriană, cu un tampon în domeniul de pH de la 6,8 până la

RO 122855 Β1

8,5, de preferință un pH de la 6,8 la 7,4, care conține de preferință sulfat de amoniu 2 M, cu 1 sau fără acid etilendiaminotetraacetic (EDTA) 10 mM, și trecând soluția opțional dializată printr-o coloană cromatografică umplută care conține un suport cromatografie cu un 3 ligand/liganzi de interacțiune hidrofobă, cum ar fi, oricare dintre, sau un amestec de ligand propil, butii, octil sau hexil, care de preferință a fost echilibrat în prealabil cu un tampon în 5 domeniul de pH de la 6,8 la 8,5 (de preferință de la 6,8 la 7,4), care conține de asemenea sulfat de amoniu 2 M, cu sau fără EDTA 10 mM. Soluția de curgere este în mod tipic la o 7 concentrație de aproximativ 2 M săruri, cum arfi sulfatul de amoniu, și conține predominant ADN plasmidian (amestec de superrăsucit și relaxat) cu mai puțin de 2% contaminanți. 9 Depinzând de variația etapelor din amonte, procentul de ADN superrăsucit poate varia oriunde în domeniul de la 50 și 95% din greutate, în mod tipic de la aproximativ 75 la 85%, 11 ca alternativă de la 80 la 85%, necesitând purificări ulterioare, implicând îndepărtarea formei relaxate a ADN-ului plasmidian din amestec. 13

Metodele din această invenție fac posibilă de asemenea producerea ADN-ului plasmidian purificat, care are nivelul de endotoxine sub nivelul specificat, adică în mod tipic 15 <10 EU/mg ADN plasmidian. Metodele de îndepărtare a endotoxinelor din invenția de față sunt adaptate fie producției la scară mare, fie la scară mică, făcând posibilă producerea eco- 17 nomică a materialului cu prioritate de grad pentru laboratoare sau terapeutic. Aceste metode exploatează legarea selectivă a endotoxinelor la rășinile hidrofobe descrise aici care, pentru 19 producție la scară mare, pot conține o capacitate ce depășește un milion de unități per mililitru de rășină utilizată. 21

Metodele disponibile convențional pentru îndepărtarea endotoxinelor au capacitate mică (de la 1000 la 50000 EU/mililitru de rășină) și/sau au ca rezultat recuperări mici de ADN 23 plasmidian și sau implică utilizarea de componenți chimici și/sau metode care nu pot fi rapid utilizate la prepararea materialului de grad terapeutic (US 5747663). Metoda de îndepărtare 25 a endotoxinelor din invenția de față implică suspendarea soluției care conține endotoxine și ADN plasmidian într-o sare, cum ar fi sulfatul de amoniu sau clorura de sodiu într-o con- 27 centrație de aproximativ 2 M, care face endotoxina să fie mai hidrofobă decât ADN-ul plasmidian, și prin aceasta asigură legarea sau interacțiunea preferențială și separarea 29 preferențială a endotoxinelor pe o rășină care conține liganzi de interacțiune hidrofobă, cum ar fi grupe butii, octil și/sau hexil, comparativ cu ADN-ul plasmidian. Concentrația de sare 31 utilizată poate fi de preferință optimizată pentru a lega ARN, proteina și endotoxina. O concentrație mai mică de sare poate fi suficientă pentru a produce legarea doar a endotoxinelor, 33 deoarece endotoxinele au o afinitate mai mare pentru liganzii de interacțiune hidrofobă descriși aici. 35

O caracteristică atractivă a acestei metode de îndepărtare a endotoxinelor este capacitatea imensă a rășinii pentru legarea endotoxinelor, adică aproximativ 1000000 EU/ml 37 de rășină, în plus, simplitatea și recuperarea >95% a ADN-ului plasmidian. De exemplu, o soluție de ADN plasmidian care conține 500 mg plasmidă și 10 milioane EU de endotoxina 39 poate fi purificată utilizând 10 de rășină, în timp ce sunt necesari cel puțin 1000 până la 4000 ml de rășină schimbătoare de anioni pentru legarea ADN-ului plasmidian și a endotoxinei, 41 cu dezavantajul suplimentar al recuperării slabe care are loc utilizând o asemenea rășină schimbătoare de anioni. Metoda din invenția de față are ca rezultat, de aceea, salvarea cu 43 de la 100 de ori până la 400 de ori a costurilor pentru rășină, și economii suplimentare la costul coloanei și recuperarea îmbunătățită a produsului. Rășina ADN Etox comercial dis- 45 ponibilă este în mod curent de cel puțin 8 ori mai scumpă decât rășinile utilizate în invenția de față. O altă rășină comercială (PolyFlo-PureSyn Inc., 87 Great Valley Pkwy Malvern, PA 47 19355) de firmă care se utilizează la îndepărtarea endotoxinelor este de la 5 la 10 ori mai scumpă și necesită utilizarea de solvenți și substanțe chimice cu ioni pereche. 49

RO 122855 Β1

Metodele din invenția de față furnizează ADN plasmidian defoarte bună calitate, care conține mai mult de 90% ADN plasmidian superrăsucit dintr-un material inițial de mai slabă calitate (adică un material inițial compus dintr-un amestec de ADN relaxat și superrăsucit). în plus, metodele invenției de față sunt aplicabile pentru procedee pe scară largă, ce se utilizează în mod tipic pentru producerea de ADN plasmidian pentru terapie genică. Metodele invenției de față fac posibilă producerea de ADN plasmidian de bună calitate, independent de variațiile care conduc în mod tipic la reducerea calității, adică generarea formei relaxate a ADN-ului plasmidian. Aceste variații pot apărea în timpul creșterii bacteriilor care produc ADN plasmidian și în timpul etapelor de purificare ulterioare.

Metodele de separare a ADN-ului plasmidian superrăsucit și relaxat, și metodele de separare a ADN-ului plasmidian de endotoxine din prezenta invenție se bazează pe descoperirea că formele de ADN plasmidian și endotoxinele prezintă specificități de legare diferite la rășinile cromatografice de interacțiune hidrofobă, care conțin, de exemplu, liganzi alchilici cu C4 până la C10, liniari sau ramificați, și de preferință conțin fie un ligand butii fie hexil. Acești liganzi furnizează interacțiunea de legare preferențială care este exploatată în cadrul metodelor de separare, izolare și/sau purificare ale invenției de față. Cineva din domeniu va aprecia că rășinile hidrofobe pot include liganzi suplimentar la sau în locul acestor liganzi alchilici, ceea ce poate fi de asemena folositor în cadrul metodelor invenției de față. Exemple de asemena liganzi sunt de asemenea descrise mai sus. Următoarele exemple nonlimitatoare ilustrează metodele invenției descrise aici. Următoarele metode generale pot fi sau au fost utilizate.

Plasmidele pentru aplicații terapeutice cu gene au fost extrase dintr-o bacterie gazdă adecvată, de exemplu Escherichia coli, după fermentație. în următoarea exemplificare a invenției descrise, a fost utilizată E. co//STBL-2, care conține plasmida pE 1A-K2. Plasmida pE 1A-K2 este un derivat al plasmidei pUC care conține o genă supresoare de adenovirus Tip 5, și conține o genă pentru sinteza Kanamicinei ca marker. Fermentația a fost realizată aerob într-un mediu adecvat, cu extract de drojdie/glucoză care conține săruri anorganice, cum ar fi fosfat monobazic de potasiu, fosfat dibazic de potasiu, sulfat de amoniu și sulfat de magneziu la un pH de la 6,5 la 7,8, de preferință 7,0, la o temperatură de 37’C. Aerarea a fost fixată la un volum de aer per volum de mediu, iar agitarea a fost fixată la 800 rpm. Celulele au fost crescute în acest mod până când glucoza a fost îndepărtată din mediu, apoi OD din fermentator a fost controlat prin alimentare cu glucoză și agitare. Alimentarea a conținut o soluție concentrată de glucoză (160 g/l) și extract de drojdie (80 g/l) și săruri (1,5 g/l sulfat de amoniu, sulfat de magneziu 1,5 g/l în tampon fosfat). După terminarea fermentației, celulele au fost recoltate prin centrifugare sau prin filtrare prin membrane ultra- sau microfiltrante, și spălate cu tamponTE (vezi dedesubt), pH 7,4. Celulele au fost lizate prin punerea în contact a suspensiei cu un volum egal de soluție de NaOH de la 0,15 N la 0,2 N și 1% dodecilsulfat de sodiu (pH de la 11,5 la 13), amestecând ușor. Soluția alcalină a fost neutralizată cu o soluție de acetat de potasiu. Materialul a fost apoi clarificat fie prin centrifugare, fie prin trecerea suspensiei printr-o serie de filtre de adâncime. Soluțiile de plasmid se concentrează prin membrane ultrafiltrante și se diafiltrează folosind tampon TE, pH 7. Ceea ce se reține de la diafiltrare se poate aplica direct pe mediul descris aici.

Conținutul de ADN plasmidian al lizatului este în general mai mic de 2% din acidul nucleic total, acesta mai conținând și ARN sau ADN cromozomial. în plus, lizatul este contaminat cu endotoxine și proteine celulare.

Invenția de față furnizează de asemenea metode de producere pe scară mică, de laborator sau treapta următoare a ADN-ului izolat și purificat, precum și echipamentul constând din coloane și separatoare. Cei din domeniu vor aprecia că producerea ADN-ului plasmidian la scară mică ridică probleme diferite comparativ cu producerea la scară mare.

RO 122855 Β1 în mod specific, separarea la scară mică are drept consecință separarea unei proporții mai 1 mari de ARN contaminant din materialul inițial, astfel încât deoarece raportul dintre plasmid și ARN într-un material inițial de prelucrat la scară mare poate fi de aproximativ 2% (gr/gr), 3 conform observației de mai sus, raportul la scară mică este de aproximativ 0,1% (gr/gr). Mai mult, volumul de cultură al probelor la scară mică este în general de aproximativ 2 ml până 5 la aproximativ 2L, comparativ cu de la aproximativ 5 L până la aproximativ 1000 L, în cazul separării la scară mare. Separările la scară mică din prezenta invenție implică de la 7 aproximativ 100 pg până la aproximativ 1 mg plasmid cu un volum al reactorului sau al patului de la aproximativ 1 la aproximativ 20 ml; de obicei în domeniul de la aproximativi 109 la aproximativ 15 ml. De aceea, invenția de față furnizează o producere eficientă la scară mică a ADN-ului izolat și/sau purificat, de preferință a ADN-ului superrăsucit, de impurități, 11 cum ar fi endotoxinele, RNA și ADN relaxat.

Deoarece se utilizează diferite proceduri în exemplificarea de față, cineva din dome- 13 niu va aprecia că pot fi utilizate și alte metode și materiale inițiale în cadrul invenției descrise aici.15 în continuare, se prezintă 10 exemple de realizare a invenției, în legătură cu figurile care reprezintă:17

- fig. 1 prezintă o diagramă în flux a variatelor etape implicate în realizarea metodei de separare a ADN-ului plasmidian superrăsucit și relaxat, exemplificate;19

- fig. 2 prezintă o descriere conceptuală a variatelor suporturi de interacțiune hidro- fobă cu liganzii atașați de ele, care au fost utilizate în metoda exemplificată;21

- fig. 3 prezintă o diagramă în flux a variatelor etape implicate în realizarea metodei de separare a ADN-ului plasmidian de endotoxinele exemplificate;23

- fig. 4 (inserția) prezintă o imagine scanată a gelului de agaroză din exemplul 5 (butii

HIC) colorat cu SYBR GOLD, unde zona 1 conține scara de ADN superrăsucit; zonele 2 și 25 3 conțin probe de la picul 1 (relaxat) și zonele 3-5 conțin probe de la picul 2 (superrăsucit), zonele fiind numărate de la stânga la dreapta. Cromatograma din exemplul 5 absor- 27 banță-volum prezintă separarea ADN relaxat (picul 1) și a ADN superrăsucit (picul 2);

- fig. 5 (inserția) prezintă o imagine scanată a gelului de agaroză din exemplul 6 (butii 29 HIC) colorat cu SYBER GOLD, în care zona 1 conține un marker; zonele 2 și 3 conțin probe de la picul 1 (relaxat), iar zonele de la 4 la 6 conțin fracții de la picul 2 (forma superrăsucită), 31 zonele fiind numărate de la stânga la dreapta. Cromatograma din exemplul 6 prezintă separarea formelor ADN relaxat (picul 1) și ADN superrăsucit (picul 2); 33

- fig. 6 (inserția) prezintă o imagine scanată a gelului de agaroză din exemplul 7, în care zona 1 conține un marker, zonele 2 și 3 conțin materialul încărcat pe coloană; zona 4 35 conține materialul picului artefactului; zona 5 conține materialul de la eluarea cu AS 2,4 M; iar zona 6 conține materialul de la eluarea cu AS 1 M (zonele fiind numărate de la stânga la 37 dreapta). Cromatograma prezintă separarea formelor ADN plasmidian superrăsucite și relaxate în care picul artefactului este picul lat (stânga), urmat către dreapta de picurile 39 relaxat și superrăsucit, respectiv;

- fig. 7 (inserția) prezintă imaginea scanată a gelului de agaroză din exemplul 8 (hexil 41

HIC), în care zona 1 conține un marker; zonele 2-4 conțin material de la picul 1 (forma relaxată), iar zonele 5 și 6 conțin fracții de la picul 2 (forma superrăsucită), (zonele și picurile 43 fiind numărate de la stânga la dreapta). Cromatograma demonstrează separarea formei relaxate de cea superrăsucită; 45

- fig. 8 prezintă o imagine scanată a elecroforezei pe gel de agaroză a eșantioanelor colorate cu SYBR GOLD din exemplul 9, în care zona 1 este markerul; zona 2 conține mate- 47 rialul încărcat pe coloană; zonele 3,4 și 5 conțin spălările 1,2 și 3, respectiv; zona 6 conține eluarea cu 1 M, iar zona 7 conține eluarea cu apă. 49

RO 122855 Β1

Exemplul 1. îndepărtarea endotoxinelor, utilizând cromatografia de interacțiune hidrofobă cu butii (scară mică)

Au fost crescute celule de E. coli care conțin plasmidul pE1A-K2 și au fost lizate utilizând metode chimice, apoi au fost clarificate prin metode de filtrare. Toate tampoanele folosite au fost filtrate printr-un filtru de 0,2 pm și probele pentru endotoxină au fost depozitate în tuburi de polistiren pentru probe.

Partea reținută de de la diafiltrare (aproximativ 400 ml) a fost dializată în TE pH 7,4 (50 mM Tris, 10 mM EDTA ajustat la pH 7,4 cu HCI), fiind utilizată pentru experiment. Sulfatul de amoniu (AS) conform necesităților pentru a realiza proba 2 M a fost adăugat la 100 ml TE plus AS 2 M, tampon cu pH 7,4, și a fost parțial dizolvat. Această soluție a fost adăugată la proba dializată pentru a realiza un volum final de 575 ml, din care 475 au fost utilizați pentru experiment.

O coloană Butyl 650S (rășină Butyl 650S de la TosoHaas Inc., 156 Keystone Drive, Montgomeryville, PA 18936) cu un diametru de 2,6 cm și înălțime a patului de 15 cm, cu un volum aproximativ al patului de 75 ml a fost umplută și echilibrată cu tampon TE, pH 7,4, care conținea AS 2 M. Proba a fost încărcată la o viteză de curgere de 5 ml/min. Eluatul a fost colectat și s-au luat probe pentru analiză (analiza concentrației de ADN, a gelului de agaroză și a endotoxinei. Analiza endotoxinei a fost realizată prin creșteri rapide, iar probele au fost diluate corespunzător, pentru a se obține recuperări pentru PPC (Control Pozitiv al Produsului) în domeniul considerat acceptabil. Concentrațiile de endotoxină au fost determinate utilizând determinarea Bio Whittaker Kinetic-QCL Chromogenic LAL, care este descrisă în publicația BW nr. P50-650U-5, Kinetic-QCL Test Kit Manual. După încărcarea probei, TE conținând sulfat de amoniu 2 M a fost lăsat să curgă prin coloană, colectat și aranjat în probe. Ulterior, coloana a fost spălată cu tampon TE cu pH 7,4, cu apă purificată conform USP (Farmacopeea SUA), și curățată cu hidroxid de sodiu 0,5 NM, și clătită cu >15 volume apă purificată conform USP. Endotoxină a fost prezentă în fiecare dintre aceste spălări conform cu datele din tabelul 1. în plus față de eficiența crescută a îndepărtării endotoxinei, au fost îndepărtate cantități semnificative de ARN, proteine și fragmente de ADN, lăsând proba purificată în mod semnificativ.

Tabelul 1

Proba	Conc. ADN (mg/ml)	Endotoxină EU/ml	Unități EU totale	% Endotoxină	EU per mg ADN
încărcat	0,70	472200	22400000	100	674571
Eluat	0,38	1,64	771	0,003	4,31
Spălare	0,56	7,48	1,196	0,005	13,42

Capacitatea endotoxinică per ml rășină: ...................3 milioane EU/ml

Reducerea endotoxinei în probă ............................... 99,992%

Exemplul 2. îndepărtarea endotoxinelor, utilizând cromatografia de interacțiune hidrofobă cu butii (scară mare)

Au fost crescute celule de E. coli care conțin plasmidul pE1A-K2 și au fost lizate utilizând metode chimice, apoi au fost clarificate prin metode de filtrare.

Partea reținută de la diafiltrare (aproximativ 650 ml) a fost dializată în TE pH 7,4 (50 mM Tris, 10 mM EDTA ajustat la pH 7,4 cu HCI), și sulfat de amoniu conform necesităților pentru a realiza proba 2 M și a fost adăugată la 1200 ml TE care conține AS 2 M, tampon cu pH 7,4, și a fost dizolvată. Volumul soluției a fost adus la 1300 ml. Această soluție a fost adăugată la proba dializată pentru a realiza un volum final de 1950 ml, iarpH-ul a fost ajustat la 7,4, utilizând HCI.

RO 122855 Β1

O coloană Butyl 650S cu un diametru de 5 cm și înălțime a patului de 15 cm, cu un volum aproximativ al patului de 275 ml a fost umplută și echilibrată cu tampon TE, pH 7,4, care conținea AS 2 M. Proba a fost încărcată la o viteză de curgere de 20 ml/min. Eluatul a fost colectat și s-au luat probe pentru analiză (analiza concentrației de ADN, a gelului de agaroză și a endotoxinei, conform descrierii de mai sus). După încărcarea probei, TE conținând sulfat de amoniu 2 M a fost lăsat să curgă prin coloană, colectat și aranjat în probe. Ulterior, coloana a fost spălată cu tampon TE cu pH 7,4, cu apă purificată USP, și curățată cu hidroxid de sodiu 0,5 N, și clătită cu >15 volume apă purificată USP. Endotoxina a fost prezentă în fiecare dintre aceste ape de spălare conform cu datele din tabelul 2. în plus față de eficiența extrem de crescută a îndepărtării endotoxinei, au fost îndepărtate cantități semnificative de ARN, lăsând proba purificată în mod semnificativ.

Tabelul 2

Proba	Conc. ADN (mg/ml)	Endotoxina EU/ml	Unități EU totale	% Endotoxină	EU per mg ADN
încărcat	1,59	271500	176475	100	170754
Eluat + spălare	0,34	<0,5	1325	0,007	1,45

Capacitatea endotoxinică per ml rășină:.................0,64 milioane EU/ml

Reducerea endotoxinei în probă................................ 99,993%

Exemplul 3. Îndepărtarea endotoxinelor, utilizând cromatografia de interacțiune hidrofobă cu hexil (scară mică)

Au fost crescute celule de E. coli care conțin plasmidul pE1A-K2 și au fost Uzate utilizând metode chimice, apoi au fost clarificate prin metode de centrifugare. Supernatantul a fost dializat în tampon fosfat de potasiu 20 mM (soluție de fosfat monobazic de potasiu 20 mM combinat cu fosfat dibazic, astfel încât să se obțină un pH de 6,8) și sulfat de amoniu conform necesităților, pentru a realiza proba 2 M a fost adăugat la 20 ml KPB (tampon fosfat de potasiu 20 mM) care conține tampon AS 2 M cu pH 7,4, și a fost dizolvat. Această soluție a fost adăugată la 5 ml probă dializată pentru a realiza un volum final de 25 ml, iarpH -ul a fost ajustat la 6,8.

O coloană Hexyl 6500 (TosoHaas) cu un diametru de 1,6 cm și înălțime a patului de 4 cm, cu un volum al patului de aproximativ 8 ml a fost umplută și echilibrată cu KPB, pH 6,8, care conține AS 2 M. Proba a fost încărcată la o viteză de curgere de 2 ml/min. Eluatul a fost colectat, și s-au luat probe pentru analiză (analiza concentrației de ADN, a gelului de agaroză și a endotoxinei, conform descrierii de mai sus). După încărcarea probei, KPB conținând sulfat de amoniu 2 M a fost lăsat să curgă prin coloană, colectat și aranjat în probe. Ulterior, coloana a fost spălată cu tampon KPB cu pH 6,8, cu apă purificată USP, și curățată cu hidroxid de sodiu 0,5 N, și clătită cu >15 volume apă purificată USP. Endotoxina a fost prezentă în fiecare dintre aceste ape de spălare conform cu datele din tabelul 3. în plus față de eficiența extrem de crescută a îndepărtării endotoxinei, au fost îndepărtate cantități semnificative de ARN, proteine și fragmente de ADN, lăsând proba purificată în mod semnificativ.

Tabelul 3

Proba	Conc. ADN (mg/ml)	Endotoxina EU/ml	Unități EU totale	% Endotoxină	EU per mg ADN
încărcat	2,43	593500	29675000	100	244238
Eluat + spălare	0,037	0,5	35	0,0001	14

RO 122855 Β1

Capacitatea endotoxinică per ml rășină: ................. 3,7 milioane EU/ml

Reducerea endotoxinei în probă ............................... 99,999%

Exemplul 4. îndepărtarea endotoxinelor, utilizând cromatografia de interacțiune hidrofobă cu octil (scară mică)

Au fost crescute celule de E. coli care conțin plasmidul pE1A-K2 și au fost lizate utilizând metode chimice, apoi au fost clarificate prin metodele de centrifugare descrise mai sus. Supernatantul a fost utilizat pentru experiment. Sulfatul de amoniu, conform necesităților pentru a realiza proba 2 M, a fost adăugat la 20 ml TE plus tampon AS 2 M cu pH 7,4, și a fost dizolvat. Această soluție a fost adăugată la 10 ml probă dializată pentru a realiza un volum final de 25 ml, iar pH -ul a fost ajustat la 7,4.

O coloană Octyl Sepharose 4 de curgere rapidă (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) cu un diametru de 1,0 cm și înălțime a patului de 10 cm, cu un volum al patului de aproximativ 8 ml a fost umplută și echilibrată cu TE, pH 7,4 care conține AS 2 M. Proba a fost încărcată la o viteză de curgere de 2 ml/min. Lichidul de curgere a fost colectat, și s-au luat probe pentru analiză (analiza concentrației de ADN, a gelului de agaroză și a endotoxinei). După încărcarea probei, TE conținând sulfat de amoniu 2 M a fost lăsat să curgă prin coloană, colectat și aranjat în probe. Ulterior, coloana a fost spălată cu tampon TE cu pH 7,4, cu apă purificată USP, și curățată cu hidroxid de sodiu 0,5 N, și clătită cu >15 volume apă purificată USP. Endotoxina a fost prezentă în fiecare dintre aceste ape de spălare conform cu datele din tabelul 4 de mai jos.

Tabelul 4

Proba	Conc. ADN (mg/ml)	Endotoxina EU/ml	Unități EU totale	% Endotoxină	EU per mg ADN
încărcat	2,43	593500	59350000	100	244238
Eluat + spălare	0,037	32	2240	0,004	280

Capacitatea endotoxinică per ml rășină: 7,41 milioane EU/ml

Reducerea endotoxinei în probă 99,996%

Exemplul 5. Separarea formelor superrăsucită și relaxată ale ADN-ului plasmidian, utilizând cromatografia de interacțiune hidrofobă cu butil-eluare în gradient

Au fost crescute celule de E. coli care conțin plasmidul pE 1 A-K2 și au fost lizate utilizând metode chimice, apoi au fost clarificate prin metodele de filtrare descrise mai sus. Purificarea grosieră a ADN-ului plasmidian pentru a elimina contaminanții majori, cum ar fi endotoxinele, ARN, proteinele, ADN cromozomial etc., a fost realizată utilizând cromatografia de interacțiune hidrofobă, în cadrul căreia, la o concentrație de sulfat de amoniu 2 M, ADN-ul plasmidian curge prin coloană, deoarece contaminanții se leagă de coloană (vezi mai sus).

Eluatul conținând ADN plasmidian a fost dializat și prelucrat pe o coloană schimbătoare de anioni (Bio Sepra) ceea ce nu a avut ca rezultat vreo purificare suplimentară. Prelucrarea prin coloana cu schimbători de anioni Q și diafiltrările nu sunt necesare pentru realizarea separării prin coloana butilică. Eluatul de pe coloana cu schimbători de anioni Q a fost diafiltrat utilizând o membrană de celuloză regenerată de 30 kD (0,1 mp, Milipore Corporation). Materialul dializat a fost ajustat la sulfat de amoniu 3 M, utilizând sulfat de amoniu solid.

O coloană Butyl (Toyopearl Butyl 650S-TosoHaas) cu un diametru de 2,6 cm și înălțime a patului de 15 cm a fost umplută la o viteză de curgere de 15-20 ml/min. Coloana a fost echilibrată cu sulfat de amoniu 3 M în tampon Tris-EDTA cu pH 7,4. Proba a fost încărcată la o viteză de curgere de 5 ml/min. Plasmidul s-a legat de coloană la 3 M sulfat de

RO 122855 Β1 amoniu. Coloana a fost apoi spălată cu 2-3 volume de soluție de sulfat de amoniu 3 M în tampon. Coloana a fost apoi eluată cu un gradient de concentrație de sulfat de amoniu de la 3 la 1 M peste 6 volume ale patului. în timpul eluării în gradient, au rezultat două picuri, primul conținând forma relaxată a ADN-ului plasmidian, iar al doilea pic conținând forma superrăsucită a ADN-ului plasmidian conform evidențierii din fracțiunile de pe gelul de agaroză (fig. 4). Cromatograma este prezentată în fig. 4. Rezultatele au fost confirmate suplimentar de analiza HPLC utilizată pentru a determina procentul celor două forme (tabelul 5).

în limitele sensibilității determinării, se confirmă că al doilea pic conține 85% formă superrăsucită, în timp ce materialul inițial conține doar 50-60% formă superrăsucită. Cel puțin 90% din ADN-ul plasmidian superrăsucit a fost recuperat. Rezoluția picurilor a fost adecvată pentru a efectua separarea, chiar și cu o coloană de 15 cm. Aceasta demonstrează eficacitatea separării formelor superrăsucită și relaxată ale plasmidului, utilizând cromatografia de interacțiune hidrofobă butilică. în plus față de separarea excelentă, cantitatea reziduală de ARN, proteine și endotoxine poate fi îndepărtată, rezultând un produs care îndeplinește cerințele pentru terapia genică.

Tabelul 5

Proba	Superrăsucit %
Materialul inițial	63
Fracțiunea picului 1	8
Fracțiunea picului 2	83

Exemplul 6. Separarea formelor superrăsucită și relaxată ale ADN-ului plasmidian, utilizând cromatografia de interacțiune hidrofobă cu butil-coloană lungă de eluare în gradient

Au fost crescute celule de E. coli care conțin plasmidul pE1A-K2, și au fost lizate utilizând metode chimice, apoi au fost clarificate prin metodele de filtrare descrise mai sus. Purificarea grosieră a ADN-ului plasmidian pentru a elimina contaminanții majori, cum arfi endotoxinele, ARN, proteinele, ADN cromozomial etc., a fost realizată utilizând cromatografia de interacțiune hidrofobă butilică, în cadrul căreia, la o concentrație de sulfat de amoniu 2 M, ADN-ul plasmidian curge prin coloană, deoarece contaminanții se leagă de coloană (vezi mai sus).

Eluatul conținând ADN plasmidian a fost dializat și prelucrat pe o coloană schimbătoare de anioni, ceea ce nu a avut ca rezultat vreo purificare suplimentară. Eluatul de pe coloana Q a fost diafiltrat utilizând o membrană de celuloză regenerată de 30 kD. Materialul dializat a fost ajustat la sulfat de amoniu 3 M, utilizând sulfat de amoniu solid, conform cu descrierea din exemplul 5.

O coloană Butyl (Toyopearl Butyl 650S-TosoHaas) cu un diametru de 2,6 cm și înălțime de aproximativ 30 cm a fost umplută la o viteză de curgere de 15-20 ml/min. Coloana a fost echilibrată cu sulfat de amoniu 3 M în tampon Tris-EDTA cu pH 7,4. Proba a fost încărcată la o viteză de curgere de 5 ml/min. Coloana a fost apoi spălată cu 2-3 volume de soluție sulfat de amoniu 3 M în tampon. Coloana a fost apoi eluată cu un gradient de concentrație de sulfat de amoniu de la 3 la 1 M peste 6 volume ale patului. în timpul eluării în gradient, au rezultat două picuri, primul conținând forma relaxată a ADN-ului plasmidian, iar al doilea pic conținând forma superrăsucită a ADN-ului plasmidian conform evidențierii din fracțiunile de pe gelul de agaroză (fig. 5). Cromatograma este prezentată în fig. 5. Rezultatele au fost confirmate suplimentar de analiza HPLC utilizată pentru a determina procentul celor două forme (tabelul 6).

RO 122855 Β1 în limitele sensibilității determinării, se confirmă că al doilea pic conține 90% formă superrăsucită, în timp ce materialul inițial conține doar 50% formă superrăsucită. Rezoluția liniei de bază a picurilor a fost obținută cu coloana mai lungă. Acest exemplu demonstrează clar eficacitatea separării formelor superrăsucită și relaxată a plasmidului utilizând cromatografia de interacțiune hidrofobă butilică. în plus față de separarea excelentă, cantitatea reziduală de ARN, proteine și endotoxine poate fi îndepărtată, rezultând un produs care îndeplinește cerințele pentru terapia genică.

Tabelul 6

Proba	Superrăsucit %
Materialul inițial	53
Fracțiunea 36 a picului 1	15
Fracțiunea 47 a picului 2	83
Fracțiunea 49 a picului 2	95
Fracțiunea 52 a picului 2	91

Exemplul 7. Separarea formelor superrăsucită și relaxată ale ADN-ului plasmidian, utilizând cromatografia de interacțiune hidrofobă cu butil-coloană lungă de eluare în etape

Au fost crescute celule de E. coli care conțin plasmidul pE1A-K2, și au fost lizate utilizând metode chimice, apoi au fost clarificate prin metode de filtrare conform descrierii de mai sus. Purificarea grosieră a ADN-ului plasmidian pentru a elimina contaminanții majori, cum arfi endotoxinele, ARN, proteinele, ADN cromozomial etc., a fost realizată utilizând cromatografia de interacțiune hidrofobă butilică, în cadrul căreia, la o concentrație de sulfat de amoniu 2 M, ADN-ul plasmidian curge prin coloană, deoarece contaminanții se leagă de coloană (vezi exemplul 1 de mai sus). Eluatul și spălarea au fost culese și concentrate, utilizând o membrană de ultrafiltrare de 30 kD, utilizând filtrarea de curgere tangențială. ADN-ul plasmidian concentrat a fost ajustat la sulfat de amoniu 3 M utilizând sulfat de amoniu solid.

O coloană Butyl (Toyopearl Butyl 650S-TosoHaas) cu un diametru de 1 cm și înălțime de aproximativ 30 cm a fost umplută la o viteză de curgere de 6 ml/min. Coloana a fost echilibrată cu sulfat de amoniu 3 M în tampon Tris-EDTA cu pH 7,4. Proba a fost încărcată la o viteză de curgere de 2 ml/min. Plasmidul s-a legat de coloană la 3 M sulfat de amoniu. Coloana a fost apoi spălată cu 2-3 volume de pat de soluție sulfat de amoniu 3 M tampon. Coloana a fost apoi eluată cu concentrații variate de sulfat de amoniu - 2,8 M, 2,7 M, 2,6 M, 2,55 M, 2,5 M, 2,4 M, 1 M - utilizând 2-3 volume de coloană. S-au observat picuri la eluarea cu 2,4 M și cu 1 M. Electroforeza pe gel de agaroză a picurilor este prezentată în fig. 6. Gelul indică cu claritate separarea formelor relaxată și superrăsucită. Eluția 2,4 M conține forma relaxată, în timp ce eluția 1 M conține ADN superrăsucit. Cromatograma este prezentată în fig. 6. Rezultatele au fost confirmate suplimentar de analiza HPLC utilizată pentru a determina procentul celor două forme (tabelul 7).

în limitele sensibilității determinării, se confirmă că al doilea pic conține 93% formă superrăsucită, în timp ce materialul inițial conține doar62% formă superrăsucită. Rezultatele au fost confirmate de experimentele ulterioare în care eluțiile 2,3 și 2,2 M nu au furnizat rezoluția, iar eluția 2,4 M a furnizat repetat o îndepărtare semnificativă a formei relaxate, prin aceasta îmbunătățind forma superrăsucită în eluția 1 M. Separarea realizată utilizând eluarea în etape este semnificativă la separările pe scară largă. Acest exemplu demonstrează clar

RO 122855 Β1 eficacitatea separării formelor superrăsucită și relaxată a plasmidului, utilizând cromatografia de interacțiune hidrofobă butilică. în plus față de separarea excelentă, cantitatea reziduală de ARN, proteine și endotoxine poate fi îndepărtată rezultând un produs care îndeplinește cerințele pentru terapia genică.

Tabelul 7

Proba	Superrăsucit %
Materialul inițial	62
Eluția 2,4 M	8
Eluția 1 M	93

Exemplul 8. Separarea formelor superrăsucită și relaxată ale ADN-ului plasmidian, 11 utilizând cromatografia de interacțiune hidrofobă cu hexil-coloană lungă de eluare în gradient

Au fost crescute celule de E. coli care conțin plasmidul ρΕ1 A-K2, și au fost lizate 13 utilizând metode chimice, apoi au fost clarificate prin metode de filtrare descrise mai sus. Purificarea grosieră a ADN-ului plasmidian pentru a elimina contaminanții majori, cum ar fi 15 endotoxinele, ARN, proteinele, ADN cromozomial etc., a fost realizată utilizând cromatografia de interacțiune hidrofobă butilică, în cadrul căreia, la o concentrație de sulfat de amoniu 2 M, 17 ADN-ul plasmidian curge prin coloană, deoarece contaminanții se leagă de coloană (vezi, de exemplu, exemplul 1 de mai sus). Eluatul conținând ADN plasmidian a fost dializat și prelucrat 19 pe o coloană schimbătoare de anioni, ceea ce nu a avut ca rezultat vreo purificare suplimentară. Eluatul de pe coloana Q a fost diafiltrat utilizând o membrană de celuloză regenerată de 21 30 kD. Materialul dializat a fost ajustat la sulfat de amoniu 3 M, utilizând sulfat de amoniu solid (vezi mai sus). 23

O coloană Hexyl (Toyopearl Butyl 650S-TosoHaas) cu un diametru de 1 cm și înălțime de aproximativ 30 cm a fost umplută la o viteză de curgere de 5 ml/min. Coloana a fost echi- 25 librată cu sulfat de amoniu 3 M în tampon Tris-EDTA cu pH 7,4. Proba a fost încărcată la o viteză de curgere de 2 ml/min. Plasmidul s-a legat de coloană la 3 M sulfat de amoniu. 27

Coloana a fost apoi spălată cu 2-3 volume de pat de soluție sulfat de amoniu 3 M tampon. Coloana a fost apoi eluată cu un gradient de concentrație de sulfat de amoniu de la 3 M la 1 29

M peste 6 volume ale patului. în timpul eluării în gradient, au rezultat două picuri, primul conținând forma relaxată a ADN-ului plasmidian, iar al doilea pic conținând forma superrăsucită 31 a ADN-ului plasmidian, conform evidențierii din fracțiunile de pe gelul de agaroză (fig. 7).

Cromatograma este prezentată în fig. 7. Cantitativ, al doilea pic a conținut o proporție 33 semnificativ crescută de plasmid superrăsucit decât materialul inițial pe baza electroforezei în gel. S-au obținut rezoluții excelente ale picurilor, considerând faptul că mărimea periei a 35 fost de 100 :m pentru Hexyl, comparativ cu 35 :m pentru Butyl.

Exemplul 9. îndepărtarea endotoxinei, utilizând cromatografia de interacțiune hidro- 37 fobă cu butii (utilizând clorura de sodiu)

Au fost crescute celule de E. coli care conțin plasmidul pE1A-K2, și au fost lizate 39 utilizând metode chimice, apoi au fost clarificate prin metode de centrifugare. Supernatantul a fost utilizat pentru experiment. Proba a fost purificată printr-o coloană cu schimbători de 41 anioni (Q Hyper D - BIOSPHERA Inc.). S-a utilizat pentru acest experiment o eluție de clorură de sodiu 2 M. Proba a fost prezentă în tampon Tris 50 mM și EDTA 10 mM la pH 7,4 cu NaCI 43

M. A fost umplută și echilibrată cu TE conținând clorură de sodiu 2 M o coloană Butyl HIC (utilizând rășini Butyl 650S-TosoHaas) cu diametrul de 1 cm și cu aproximativ 20 cm înălțime 45

RO 122855 Β1 cu aproximativ 10 ml volum. Proba a fost încărcată la o rată de curgere de 2 ml/min. Eluatul a fost colectat, iar probele au fost luate pentru analiză (analiza concentrației ADN, a gelului de agaroză, și a endotoxinei). După încărcarea cu probă, s-a introdus TE conținând sulfat de amoniu 2 M, a fost colectat și repartizat în probe. Coloana a fost spălată ulterior cu TE pH 7,4.

Tabelul 8

Proba	Conc. ADN (mg/ml)	Endotoxina EU/ml	Unități EU totale	% Endotoxină	EU per mg ADN
încărcat	0,27	642	16050	100	23377
Spălat	0,13	5	350	2	38

Capacitatea endotoxinică per ml de rășină:..................... 1570 EU/ml

Reducerea endotoxinei în probă:...................................98%

Exemplul 10. Purificarea pe scară mică a plasmidei prin cromatografie de interacțiune hidrofobă cu butii

Purificarea pe scară mică a plasmidei se realizează utilizând truse disponibile comercial, dintre care cea mai cunoscută este trusa Quiagen's Miniprep. Metodele descrise aici pot fi utilizate pentru purificarea ADN-ului plasmidian pentru a furniza câteva avantaje asupra truselor comerciale. Următorul exemplu demonstrează utilizarea metodei de cromatografie de interacțiune hidrofobă din invenția de față pentru purificarea ADN-ului plasmidian la scară mică.

Materialul inițial pentru purificare a fost obținut prin metode standard. în mod specific, celule de E. coli care conțin o plasmidă de aproximativ 4,65 Kb au fost crescute în Luria Broth conținând 100 pg/ml ampicilină la 37°C. Celulele au fost hrănite la un OD de 2,7. Celulele au fost îndepărtate din mediu prin centrifugare. Ulterior, peleta de celule a fost resuspendată în Tris-HCI 50 mM, EDTA 10 mM, pH 8. Un volum egal de 200 mM soluție NaOH 1% SDS a fost adăugat, amestecat bine și incubat la temperatura camerei timp de 5 min. Această etapă a avut ca rezultat liza celulelor, eliberând conținutul celular, incluzând ADN-ul plasmidian. Soluția de neutralizare constând din acetat de potasiu 3,1 M (pH 5,5) a fost adăugată în volum egal (original) și amestecat bine. Lizatul neutralizat a fost apoi filtrat pentru a îndepărta precipitatul. Lizatul clarifiat a fost precipitat cu izopropanol 70% (adăugând 2,1 ml izopropanol per 3 ml lizat clarificat). Precipitatul a fost separat prin centrifugare, iar peleta a fost spălată cu etanol 70%, uscată și dizolvată în tampon Tris-HCI 10 mN, EDTA 0,1 mM, pH 8,0. Acest preparat a fost congelat la -20°C până la utilizare și a constituit materialul inițial pentru experimentele de purificare.

O coloană Butyl 650S cu un volum al patului de 20 ml și cu o înălțime a patului de 10 cm a fost umplută într-o coloană cu un diametru de 1,6 cm (Pharmacia XK16/20) și a fost echilibrată cu tampon Tris-HC110 mN, EDTA (TE) 10 mM, pH 7,4. Proba de încărcat a fost preparată prin adăugare de sulfat de amoniu solid până la o concentrație finală de 2,2 M. Proba a ost diluată cu AS 2,2 M în Tris-EDTA, pH 7,4 până la 10 ml.

Condițiile de purificare au permis ADN-ului plasmidian să fie colectat în lichidul de curgere, iar contaminanții s-au legat de rășină.

Proba a fost încărcată la 2 ml/min și lichidul de curgere a fost colectat. Coloana a fost spălată cu 35 ml AS 2,2 M în tampon TE și au fost colectate fracțiile spălare 1 (10 ml), spălare 2 (14,5 ml) și spălare 3 (10 ml). în timpul spălării a rezultat un pic. Coloana a fost eluată cu 55 ml AS 1 M în tampon TE, pH 7,4 și colectate spălarea 1 (10 ml) și spălarea 2 (45 ml).

RO 122855 Β1

A rezultat un pic în timpul eluării cu AS 1 M. Coloana a ost eluată cu 50 ml apă purificată1 conform USP. A rezultat un pic. Tabelul de mai jos arată acidul nucleic total prezent în fiecare dintre fracțiile de mai sus. Concentrațiile au fost calculate pe baza absorbantei la 2603 nm (conc. (pg/ml) = A260*50)

Tabelul 95

Fracțiile coloanei	Concentrația	Masă
	pg/ml	M9
încărcare	550,0	5503
Spălare 1	7,6	76
Spălare 2	40,4	607
Spălare 3	5,0	50
Spălare principală (ADN plasmidian)	20,9	733
Eluare 1 M	35,8	1611
Eluare cu apă	30,5	1523

S-a realizat electroforeza pe gel de agaroză a probelor. Fig. 8 arată o fotocopie a gelului. Fotografia gelului arată ADN-ul plasmidian din fracțiunile spălare (zona 3, 4, 5).17

Comparativ cu proba de încărcare (zona 2) nu a existat ARN vizibil în fracțiunile spălare. Fracțiunile eluare conțin ARN după cum se poate vedea în zonele 6 și 7. Endotoxina din 19 spălarea principală a fost măsurată prin determinarea Kinetic QCL pentru endotoxine. Nu a fost detectată nici o endotoxina în probă la nivelul de sensibilitate al analizei, care a fost 21 0,005 EU/ml. Randamentul în plasmidă a fost de 733 pg din 100 ml de cultură, ceea ce este similar cu ceea ce a fost obținut cu ajutorul truselor comerciale. 23 întregul conținut al referințelor citate aici și mai jos sunt încorporate în întregime prin referință.25

Producția de plasmid ADN de grad farmaceutic, Magda Marquet, Nancy Horn, Jennifer Meek, Gregg Budahazi, brevetul US 5561064.27

Concentrarea și fracționarea acizilor nucleici și virusurilor în medii poroase, Cole,

Kenneth D., brevetul US 5707850.29

Purificarea ADN-ului plasmidian în timpul cromatografiei pe coloană, Nancy Horn,

Greg Budahazi, Magda Marquet, brevetul US 5707812.31

Claims (64)

1. Metodă de purificare a ADN-ului plasmidian dintr-un amestec care conține cel puțin o impuritate a celulei gazdă, care cuprinde următoarele etape:

(a) formarea unei soluții prin adăugarea unei cantități suficiente de sare la respectivul amestec, pentru a permite legarea selectivă a respectivei cel puțin unei impurități a celulei gazdă la un mediu de interacțiune hidrofobă;

(b) punerea în contact a respectivei soluții ce conține ADN plasmidian cu mediul de interacțiune hidrofobă, în condiții în care respectiva cel puțin o impuritate se leagă la mediul de interacțiune hidrofobă pentru a forma un complex; și (c) colectarea ADN-ului plasmidian nelegat din complexul menționat;

în care metoda menționată se desfășoară în absența solvenților organici, detergenților, glicolilor, hexamino cobaltului, spermidinei și polivinilpirolldonei.

(2) tratarea mediului de interacțiune hidrofobă care conține ADN-ul relaxat și supra- 23 răsucit cu condiții care permit îndepărtarea preferențială a ADN-ului relaxat; și (3) eluarea ADN-ului suprarăsucit din mediul de interacțiune hidrofobă;25 în care respectiva metodă se desfășoară în absența solvenților organici, detergenților, glicolilor, hexamin cobaltului, spermidinei și polivinilpirolidonei.27

2. Metodă conform revendicării 1, în care respectiva cel puțin o impuritate este selectată din grupul constând din ARN, endotoxină, ADN cromozomial și proteină.

3. Metodă conform revendicării 1, în care respectiva cel puțin o impuritate este o endotoxină.

4. Metodă conform revendicării 1, în care sarea cuprinde un anion sau un cation selectat din grupul constând din acetat, fosfat, carbonat, SO₄ ²' CI', Br’, NO3‘, Mg²⁺, Li*, Na⁺, K⁺, NH4⁺.

5. Metodă conform revendicării 4, în care sarea este sulfat de amoniu în domeniul de concentrație de la 2 la 4 M.

6. Metodă conform revendicării 5, în care sulfatul de amoniu este prezent într-o concentrație de 2 M.

7. Metodă conform revendicării 1, în care soluția cuprinde săruri de sodiu în domeniul de concentrație de la 2 la 4 M.

8. Metodă conform revendicării 7, în care sarea de sodiu este clorură de sodiu.

9. Metodă conform revendicării 8, în care sarea de sodiu este clorură de sodiu în concentrație de 2 M.

10. Metodă conform revendicării 1, în care pH-ul soluției este situat în domeniul de la 6,8 la 7,4.

11. Metodă conform revendicării 1, în care pH-ul soluției este 7,4.

12. Metodă conform revendicării 1, în care mediul de interacțiune hidrofobă conține un suport de cromatografie cu grupări hidrofobe disponibile.

13. Metodă conform revendicării 12, în care grupările disponibile menționate sunt selectate din grupul constând din grupări alchil cu C3 până la C10 și amestecuri ale acestora.

14. Metodă conform revendicării 12, în care mediile de interacțiune hidrofobă sunt selectate din grupul constând dintr-un schelet de polimer metacrilat sau copolimer, legat la cel puțin o grupare hidrofobă propil, butii, hexil, octil, nonil sau decil.

15. Metodă conform revendicării 12, în care mediul conține cel puțin unul dintre un schelet de copolimer metacrilat etilen glicol sau un schelet de agaroză legată încrucișat.

16. Metodă conform revendicării 12, în care rășina se găsește sub formă de perle cu dimensiunea cuprinsă între 15 până la 100 pm.

17. Metodă de separare a ADN-ului plasmidian suprarăsucit dintr-un amestec de ADN plasmidian suprarăsucit și ADN plasmidian relaxat și, opțional, cel puțin o impuritate a celulei gazde, cuprinzând următoarele etape:

(a) formarea unei soluții prin adăugarea unor săruri la amestecul de ADN plasmidian suprarăsucit și ADN plasmidian relaxat și, când este prezent, respectiva cel puțin o impuritate a celulei gazdă;

RO 122855 Β1 (b) punerea în contact a soluției cu un mediu de interacțiune hidrofobă într-un prim 1 tip de condiții în care atât ADN-ul plasmidian suprarăsucit, cât și ADN-ul plasmidian relaxat se leagă la mediul de interacțiune hidrofobă, pentru a forma un prim amestec legat;3 (c) schimbarea primului tip de condiții în care se găsește primul amestec legat într-un al doilea tip de condiții pentru a îndepărta ADN-ul plasmidian relaxat din primul amestec legat5 pentru a forma componente separate, conținând un al doilea amestec legat și ADN plasmidian relaxat; și7 (d) modificarea celui de-al doilea tip de condiții în care se găsește respectivul al doilea amestec legat într-un al treilea tip de condiții pentru îndepărtarea ADN-ului plasmidian9 suprarăsucit din cel de-al doilea amestec legat, pentru a forma componente separate care conțin mediul de interacțiune hidrofobă și ADN-ul plasmidian suprarăsucit.11

18. Metodă conform revendicării 17, în care respectiva cel puțin o impuritate a celulei gazdă este selectată din grupul constând din ARN, endotoxină, ADN cromozomial și 13 proteină.

19. Metodă conform revendicării 17, în care respectiva cel puțin o impuritate a celulei 15 gazdă este o endotoxină.

20. Metodă conform revendicării 17, în care mediul de interacțiune hidrofobă cuprinde 17 un suport de cromatografie cu grupări hidrofobe disponibile.

21. Metodă conform revendicării 20, în care grupările disponibile menționate sunt 19 selectate din grupul constând din grupări aichil cu C3 până la C10.

22. Metodă conform revendicării 20, în care mediul de interacțiune hidrofobă este 21 selectat din grupul constând dintr-un schelet de polimer sau copolimer metacrilat legat de cel puțin o grupare propil, butii, hexil, octil, nonil sau un amestec al acestora ca grupări 23 hidrofobe disponibile.

23. Metodă conform revendicării 20, în care mediul conține cel puțin unul dintre un 25 schelet de copolimer metacrilat etilenglicol sau o agaroză legată încrucișat.

24. Metodă conform revendicării 20, în care mediul este o rășină sub formă de perle 27 cu dimensiunea cuprinsă între 15 până la 100 pm.

25. Metodă conform revendicării 17, în care sarea cuprinde un anion sau un cation 29 selectat din grupul constând din acetat, fosfat, carbonat, SO₄ ²’ CI', Br’, NO₃‘, Mg²⁺, Li⁺, Na⁺,

K⁺, NH₄ ⁺. 31

26. Metodă conform revendicării 25, în care sarea este sulfatul de amoniu în domeniul de concentrație de la 2,5 la 4 M. 33

27. Metodă conform revendicării 17, în care primul tip de condiții cuprinde echilibrarea mediului respectiv din etapa (b) cu o soluție de sare care conține sulfat de amoniu, prezent 35 într-un domeniu de concentrație de la 2,5 la 4 M.

28. Metodă conform revendicării 17, în care al doilea tip de condiții cuprinde spălarea 37 mediului cu o soluție de sare care conține sulfat de amoniu într-o concentrație de la 2,35 până la 2,45 M. 39

29. Metodă conform revendicării 17, în care al treilea tip de condiții cuprinde spălarea celui de-al doilea amestec menționat legat cu o soluție de sare care conține sulfat de amoniu 41 într-o concentrație de la 1 la 2,3 M.

30. Metodă de separare a endotoxinelor de ADN plasmidian, cuprinzând punerea în 43 contact a unui amestec de endotoxine și ADN plasmidian cu un mediu de interacțiune hidrofobă, în condiții în care endotoxinele menționate se leagă la mediul de interacțiune 45 hidrofobă menționat pentru a forma un complex și separarea ADN-ului plasmidian respectiv și a complexului respectiv. 47

31. Metodă conform revendicării 30, în care condițiile cuprind condiții de sare în care sarea conține un anion sau un cation selectat din grupul constând din acetat, fosfat, 49 carbonat, SO₄ ²’ CI’, Br, NO3‘, Mg²⁺, Li+, Na+, K+, NH4⁺.

32. Metodă conform revendicării 30, în care amestecul menționat cuprinde suplimentar o sare de amoniu în domeniul de concentrație de la 1,5 la 4 M.

33. Metodă conform revendicării 32, în care respectiva sare de amoniu este sulfatul de amoniu care este prezent într-o concentrație de 2 M.

34. Metodă conform revendicării 30, în care mediul de interacțiune hidrofobă cuprinde un suport de cromatografie cu grupări hidrofobe disponibile.

35. Metodă conform revendicării 34, în care grupările disponibile menționate sunt selectate din grupul constând din grupări alchil cu C3 până la C10.

36. Metodă conform revendicării 34, în care mediul de interacțiune hidrofobă este selectat din grupul constând dintr-un schelet de polimer sau copolimer metacrilat legat la cel puțin o grupare propil, butii, hexil, octil, nonil sau un amestec al acestora ca grupări hidrofobe disponibile.

37. Metodă conform revendicării 34, în care mediul conține cel puțin unul dintre un schelet de copolimer metacrilat etilenglicol sau o agaroză legată încrucișat.

38. Metodă conform revendicării 34, în care mediul este o rășină sub formă de perle cu dimensiunea cuprinsă între 15 până la 100 pm.

39. Metodă conform revendicării 30, în care respectivul amestec are un pH situat în domeniul de la 6,8 la 7,4.

40. Metodă conform revendicării 39, în care pH-ul este 7,4.

41. Metodă de separare a unui ADN plasmidian suprarăsucit de ADN-ul plasmidian relaxat, cuprinzând punerea în contact a unui amestec de ADN plasmidian suprarăsucit și ADN plasmidian relaxat cu un mediu de interacțiune hidrofobă într-un prim tip de condiții în care atât ADN-ul plasmidian suprarăsucit, cât și ADN-ul plasmidian relaxat se leagă la mediul de interacțiune hidrofobă menționat, pentru a forma un prim amestec legat, schimbarea primului tip de condiții în care se găsește primul amestec legat într-un al doilea tip de condiții pentru a îndepărta ADN-ul plasmidian relaxat respectiv din primul amestec legat menționat, pentru a forma componente separate conținând un al doilea amestec legat și ADN-ul plasmidian relaxat respectiv, și modificarea celui de-al doilea tip de condiții în care se găsește respectivul al doilea amestec legat într-un al treilea tip de condiții pentru îndepărtarea respectivului ADN plasmidian suprarăsucit din cel de-al doilea amestec legat menționat pentru a forma componente separate care conțin mediul menționat de interacțiune hidrofobă și respectivul ADN plasmidian suprarăsucit;

în care respectiva metodă se desfășoară în absența solvenților organici, detergenților, glicolilor, hexamin cobaltului, spermidinei și polivinilpirolidonei.

42. Metodă conform revendicării 41, în care mediul respectiv de interacțiune hidrofobă cuprinde un suport cromatografie cu grupări hidrofobe disponibile.

43. Metodă conform revendicării 42, în care grupările disponibile menționate sunt selectate din grupul constând din grupări alchil cu C3 până la C10 și amestecuri ale acestora.

44. Metodă conform revendicării 41, în care mediul menționat de interacțiune hidrofobă este un schelet de polimer sau copolimer metacrilat, legat de cel puțin una din grupările hidrofobe propil, butii, pentil, hexil, heptil, octil, nonil sau decil.

45. Metodă conform revendicării 41, în care mediul menționat de interacțiune hidrofobă este cel puțin unul dintre un schelet de copolimer metacrilat și etilenglicol sau o agaroză legată încrucișat.

46. Metodă conform revendicării 41, în care mediul menționat de interacțiune hidrofobă este sub formă de perle cu dimensiunea cuprinsă între 15 până la 100 pm.

47. Metodă conform revendicării 41, în care primul tip menționat de condiții cuprinde echilibrarea mediului respectiv cu o soluție de sare care conține sulfat de amoniu într-o concentrație de la 2,5 la 4 M.

RO 122855 Β1

48. Metodă conform revendicării 47, în care al doilea tip menționat de condiții 1 cuprinde spălarea primului amestec menționat legat cu o soluție de sare care conține sulfat de amoniu într-o concentrație de la 2,35 până la 2,45 M. 3

49. Metodă conform revendicării 48, în care al treilea tip menționat de condiții cuprinde spălarea celui de-al doilea amestec menționat legat cu o soluție de sare care 5 conține sulfat de amoniu într-o concentrație de la 1 la 2,3 M.

50. Metodă conform oricăreia din revendicările 17 și 41, în care respectivele schim- 7 bare și modificare sunt combinate într-un proces continuu care cuprinde eluția cu gradient a respectivilor ADN plasmidian relaxat și ADN plasmidian suprarăsucit, prin amestecarea 9 primului amestec menționat legat cu o soluție de sare care conține sulfat de amoniu, cu o concentrație variabilă continuu de sulfat de amoniu, respectiva concentrație variind de la 3 11 la 1 M sulfat de amoniu, și ADN-ul plasmidian relaxat menționat este colectat într-un prim volum eluat și ADN-ul plasmidian suprarăsucit menționat este colectat într-un al doilea volum13 eluat.

51. Metodă conform revendicării 41, în care componenta respectivă separată de 15

ADN-ul plasmidian relaxat și ADN-ul plasmidian suprarăsucit menționat sunt colectate și izolate.17

52. Metodă de îmbogățire a cantității de ADN suprarăsucit față de ADN-ul relaxat într-un amestec al acestora, metoda cuprinzând:19 (1) interacțiunea amestecului care conține ADN suprarăsucit și ADN relaxat cu un mediu de interacțiune hidrofobă care conține o porțiune alchil, în condiții în care ADN-ul 21 suprarăsucit se leagă preferențial la mediul de interacțiune hidrofobă;

53. Metodă de îndepărtare a lipopolizaharidei (LPS) dintr-o compoziție care conține

ADN, metoda cuprinzând:29 (1) interacțiunea amestecului care conține ADN și LPS cu un mediu de interacțiune hidrofobă care conține o porțiune alchil, în care interacțiunea are loc în condiții în care LPS 31 se leagă preferențial la mediul de interacțiune hidrofobă față de ADN; și (2) tratarea mediului de interacțiune hidrofobă care conține ADN și LPS cu condiții 33 care permit îndepărtarea selectivă a ADN-ului.

54. Metodă de îmbogățire a cantității de ADN suprarăsucit față de ADN-ul relaxat 35 într-un amestec al acestora, metoda cuprinzând:

(a) formarea unei soluții prin adăugarea unor săruri la amestecul de ADN suprarăsucit37 și ADN relaxat;

(b) punerea în contact a soluției cu un mediu de interacțiune hidrofobă într-un prim 39 tip de condiții de sare în care atât ADN-ul suprarăsucit, cât și ADN-ul relaxat se leagă la mediul de interacțiune hidrofobă pentru a forma un prim amestec legat;41 (c) schimbarea primului tip de condiții de sare în care se găsește primul amestec legat într-un al doilea tip de condiții pentru a îndepărta ADN-ul relaxat din primul amestec 43 legat, pentru a forma componente separate conținând un al doilea amestec legat și ADN relaxat; și45 (d) modificarea celui de-al doilea tip de condiții în care se găsește respectivul al doilea amestec legat într-un al treilea tip de condiții pentru îndepărtarea ADN-ului 47 suprarăsucit din cel de-al doilea amestec legat menționat pentru a forma componente separate care conțin mediul de interacțiune hidrofobă și ADN suprarăsucit. 49

RO 122855 Β1

55. Metodă conform revendicării 54, în care mediul de interacțiune hidrofobă cuprinde un suport de cromatografie cu grupări hidrofobe disponibile.

56. Metodă conform revendicării 55, în care grupările disponibile menționate sunt selectate din grupul constând din grupări alchil cu C3 până la C10.

57. Metodă conform revendicării 55, în care mediul de interacțiune hidrofobă este selectat din grupul constând dintr-un schelet de polimer sau copolimer metacrilat legat de cel puțin o grupare propil, butii, hexil, octil, nonil sau un amestec al acestora ca grupări hidrofobe disponibile.

58. Metodă conform revendicării 55, în care mediul este cel puțin unul dintre un schelet de copolimer metacrilat etilen glicol sau o agaroză legată încrucișat.

59. Metodă conform revendicării 55, în care mediul este o rășină sub formă de perle cu dimensiunea cuprinsă între 15 până la 100 pm.

60. Metodă conform revendicării 54, în care sarea cuprinde un anion sau un cation selectat din grupul constând din acetat, fosfat, carbonat, SO₄ ²’ CI; Br, NO3; Mg²⁺, Li+, Na+, K+, NH4⁺.

61. Metodă conform revendicării 60, în care sarea este sulfatul de amoniu într-un domeniu de concentrație de la 2,5 la 4 M.

62. Metodă conform revendicării 54, în care primul tip de condiții de sare cuprinde echilibrarea mediului cu o soluție de sare care conține sulfat de amoniu prezent într-un domeniu de concentrație de la 2,5 la 4 M.

63. Metoda conform revendicării 55, în care al doilea tip de condiții cuprinde spălarea mediului cu o soluție de sare care conține sulfat de amoniu într-o concentrație de la 2,35 până la 2,45 M.

64. Metodă conform revendicării 54, în care al treilea tip menționat de condiții cuprinde spălarea celui de-al doilea amestec menționat, legat cu o soluție de sare care conține sulfat de amoniu într-o concentrație de la 1 la 2,3 M.