PL203013B1 - Sposób oczyszczania plazmidowego DNA, sposób oddzielania superskręconego plazmidowego DNA, sposób oddzielania endotoksyny od plazmidowego DNA, sposób wzbogacania ilości superskręconego DNA względem rozluźnionego DNA, sposób usuwania lipopolisacharydu - Google Patents
Sposób oczyszczania plazmidowego DNA, sposób oddzielania superskręconego plazmidowego DNA, sposób oddzielania endotoksyny od plazmidowego DNA, sposób wzbogacania ilości superskręconego DNA względem rozluźnionego DNA, sposób usuwania lipopolisacharyduInfo
- Publication number
- PL203013B1 PL203013B1 PL364051A PL36405100A PL203013B1 PL 203013 B1 PL203013 B1 PL 203013B1 PL 364051 A PL364051 A PL 364051A PL 36405100 A PL36405100 A PL 36405100A PL 203013 B1 PL203013 B1 PL 203013B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- plasmid dna
- dna
- supercoiled
- hydrophobic interaction
- mixture
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 239
- 238000000746 purification Methods 0.000 title abstract description 37
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 258
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims abstract description 128
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 118
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 29
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 claims abstract description 14
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical group N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 112
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 111
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 claims description 111
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 111
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 105
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 87
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 59
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 50
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 claims description 42
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 41
- 238000010828 elution Methods 0.000 claims description 36
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 36
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 21
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 claims description 19
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 claims description 18
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical group [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 17
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 16
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 claims description 16
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 16
- 125000004051 hexyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims description 15
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 claims description 12
- 125000002704 decyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 claims description 11
- 125000002347 octyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 11
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M Methacrylate Chemical compound CC(=C)C([O-])=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 10
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 10
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 10
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 9
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 9
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 claims description 9
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims description 9
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 9
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 claims description 9
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 claims description 9
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 claims description 9
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 9
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 9
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 8
- 230000004075 alteration Effects 0.000 claims description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 8
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 8
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 claims description 8
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 claims description 7
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 7
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical group OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 6
- 125000001400 nonyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 5
- 238000010924 continuous production Methods 0.000 claims description 4
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 claims description 4
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims description 2
- 125000003187 heptyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 claims description 2
- 125000001147 pentyl group Chemical group C(CCCC)* 0.000 claims 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 47
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 abstract description 23
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 abstract description 4
- 239000012560 cell impurity Substances 0.000 abstract 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 284
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 44
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 43
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 41
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 41
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 27
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 18
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 18
- 239000000463 material Substances 0.000 description 17
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 17
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 16
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 15
- 238000011013 endotoxin removal Methods 0.000 description 15
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 13
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 12
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 12
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 9
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 9
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 9
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 9
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 8
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 6
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 5
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 5
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 4
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 4
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methylglycine Chemical compound OCC(CO)(CO)[NH2+]CC([O-])=O SEQKRHFRPICQDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 238000002086 displacement chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 3
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 3
- 239000004627 regenerated cellulose Substances 0.000 description 3
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- SJHPCNCNNSSLPL-CSKARUKUSA-N (4e)-4-(ethoxymethylidene)-2-phenyl-1,3-oxazol-5-one Chemical compound O1C(=O)C(=C/OCC)\N=C1C1=CC=CC=C1 SJHPCNCNNSSLPL-CSKARUKUSA-N 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 2,2'-piperazine-1,4-diylbisethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 IHPYMWDTONKSCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 2
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 2
- FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine Chemical compound OCCN(CCO)CC(O)=O FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 2
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 229940111688 monobasic potassium phosphate Drugs 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N monopropylene glycol Natural products CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 2
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- OAYXUHPQHDHDDZ-UHFFFAOYSA-N 2-(2-butoxyethoxy)ethanol Chemical compound CCCCOCCOCCO OAYXUHPQHDHDDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 2-(2-methoxy-5-methylphenyl)ethanamine Chemical compound COC1=CC=C(C)C=C1CCN SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 2-Propenoic acid Natural products OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VLEIUWBSEKKKFX-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O VLEIUWBSEKKKFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUPXYSSGJWIURR-UHFFFAOYSA-N 3-octoxypropane-1,2-diol Chemical compound CCCCCCCCOCC(O)CO GUPXYSSGJWIURR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004491 Antisense DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 238000011050 LAL assay Methods 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 1
- VMJXPEQQNSGRNX-UHFFFAOYSA-N OS(=O)(=O)C(C)=C(N)CO Chemical compound OS(=O)(=O)C(C)=C(N)CO VMJXPEQQNSGRNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007990 PIPES buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004695 Polyether sulfone Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 108700025695 Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N Syringetin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2=C(C(=O)C3=C(O)C=C(O)C=C3O2)O)=C1 UZMAPBJVXOGOFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 239000007997 Tricine buffer Substances 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229940044197 ammonium sulfate Drugs 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 239000003816 antisense DNA Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000003637 basic solution Substances 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000007998 bicine buffer Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 235000010290 biphenyl Nutrition 0.000 description 1
- 239000004305 biphenyl Substances 0.000 description 1
- 125000006267 biphenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000003130 blood coagulation factor inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 229910010293 ceramic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012468 concentrated sample Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 229940111685 dibasic potassium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 229940061607 dibasic sodium phosphate Drugs 0.000 description 1
- KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N dihydrochrysin Natural products COC1=C(O)C(OC)=CC(C2OC3=CC(O)=CC(O)=C3C(=O)C2)=C1 KCFYHBSOLOXZIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 239000012525 endotoxin sample Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- ARRNBPCNZJXHRJ-UHFFFAOYSA-M hydron;tetrabutylazanium;phosphate Chemical compound OP(O)([O-])=O.CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC ARRNBPCNZJXHRJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- -1 hydroxypropyl Chemical group 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 229960003390 magnesium sulfate Drugs 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 125000001971 neopentyl group Chemical group [H]C([*])([H])C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000006259 organic additive Substances 0.000 description 1
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N phenylbenzene Natural products C1=CC=CC=C1C1=CC=CC=C1 ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 229920002492 poly(sulfone) Polymers 0.000 description 1
- 229920006393 polyether sulfone Polymers 0.000 description 1
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000011027 product recovery Methods 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 230000009834 selective interaction Effects 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- DBKCLWTWMFVXQN-UHFFFAOYSA-M sodium sulfuric acid chloride Chemical compound [Na+].[Cl-].OS(O)(=O)=O DBKCLWTWMFVXQN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 125000004079 stearyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229920000428 triblock copolymer Polymers 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000004304 visual acuity Effects 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
- C12N15/101—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by chromatography, e.g. electrophoresis, ion-exchange, reverse phase
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób oczyszczania plazmidowego DNA, sposób oddzielania superskręconego plazmidowego DNA, sposób oddzielania endotoksyny od plazmidowego DNA, sposób wzbogacania ilości superskręconego DNA względem rozluźnionego DNA oraz sposób usuwania lipopolisacharydu.
Rozwiązania według wynalazku umożliwiają oczyszczanie plazmidowego DNA, przez usuwanie zanieczyszczeń komórkowych z komórki gospodarza, takich jak endotoksyny, RNA, białka i DNA komórki gospodarza z wodnych roztworów zawierających plazmidowy DNA oraz oddzielanie i oczyszczanie superskręconego plazmidowego DNA z roztworów wodnych zawierających mieszaninę superskręconego (ang. supercoiled) i ciętego (ang. nicked) albo rozluźnionego (ang. relaxed) plazmidowego DNA przy użyciu podłoża oddziaływań hydrofobowych. Sposoby według wynalazku mogą znaleźć zastosowanie do oczyszczania DNA na małą skalę, na przykład skalę laboratoryjną. Niniejszym opisana została również aparatura odpowiednia do zastosowania w sposobie według wynalazku. Terapia genowa oferuje nowe możliwości leczenia chorób ludzkich. Zastosowanie DNA do leczenia chorób genetycznych, w tym mukowiscydozy, różnych rodzajów nowotworu itp. oraz immunizacji przeciwko chorobom, stanowi obiecujący sposób leczenia, który ostatnio zyskuje szerokie uznanie. Zamiast zmieniać fenotyp choroby, przez zastosowanie czynników, które oddziałują z produktem genowym, albo które same stanowią produkt genowy, terapia genowa teoretycznie może zmodyfikować konkretny gen powodując wyleczenie choroby. Terapię genową można również zastosować jako układ dostarczania leku. W tym celu, gen, który wytwarza przydatny produkt (RNA, peptyd, białko itp.) albo sam stanowi przydatny produkt (jak w przypadku zastosowania antysensownego DNA) wprowadza się do DNA albo komórki homologicznej, heterologicznej albo autologicznej osobnika albo komórki gospodarza, która ma być później podana osobnikowi, in vivo albo ex vivo albo in vitro. Przykładowo, podczas zabiegów na naczyniach krwionośnych, gen wytwarzający czynnik przeciwkrzepliwy można wprowadzić do DNA komórek wyściełających naczynia krwionośne, w celu zapobiegania powstawania niebezpiecznych zakrzepów krwi. Wiele innych stanów może również być leczonych z zastosowaniem takiego ogólnego podejścia.
Oczekuje się, że terapia genowa będzie stanowić potężne narzędzie do leczenia wielu spośród ponad 4000 znanych chorób genetycznych, w tym mukowiscydozy, chorób serca, nowotworów, zapalenia stawów i innych. Terapia genowa zasadniczo wymaga przeniesienia materiału genetycznego (DNA) do organizmu osobnika. Dostarczanie genu albo materiału genetycznego można osiągnąć przez bezpośrednie podanie wirusów zawierających gen albo plazmidowego DNA do krwi albo tkanki, pośrednio przez wprowadzenie komórek modyfikowanych laboratoryjnie przez wprowadzenie obcego DNA albo przez różne techniki enkapsulacji albo nośników znane w stanie techniki. Ostatnie doniesienia wskazują, że możliwe jest również bezpośrednie dostarczanie DNA. Obecnie stosuje się lub rozważa zastosowanie kilku różnych systemów transferu do komórek somatycznych. Obejmują one, przykładowo, DNA (nagi albo kompleksowany), wirusowy RNA (retrowirusy) oraz wirusy DNA (adenowirusy, wirusy towarzyszące adenowirusom [AAV], wirusy opryszczki oraz ospy).
Kluczową zaletą terapii genowej opartej na niewirusowej terapii genowej, takiej jak zastosowanie plazmidowego DNA, jest łatwość wytwarzania dużych ilości, wysoki poziom bezpieczeństwa, zasadniczy brak integracji heterologicznego DNA do komórkowego DNA gospodarza oraz możliwość zastosowania genów albo fragmentów genów o praktycznie nieograniczonej wielkości i liczbie. Dalej, zastosowanie plazmidowego DNA w terapii genowej niekoniecznie obejmuje zastosowanie zewnątrzpochodnych genów albo białek, które mogą wywołać niepożądaną reakcję odpornościową u biorcy. Oprócz tego, uzyskanie alternatywnych rozwią zań wobec zastosowania plazmidowego DNA, takich jak wektory wirusowe, jest względnie droższe.
Sposoby obecnie stosowane do wytwarzania plazmidowego DNA w ogólności dostarczają mieszaniny superskręconego plazmidowego DNA oraz artefaktu w postaci ciętego (rozluźnionego) plazmidowego DNA, który jest zasadniczo nieodpowiedni do końcowego zastosowania. Sposoby według wynalazku umożliwiają rozdział superskręconego i ciętego plazmidowego DNA bez ich uszkodzenia, tak, że o ile niniejszy wynalazek przedstawiony jest przez odzyskiwanie i zastosowanie superskręconego DNA, specjalista w dziedzinie zauważy, że obie postaci plazmidowego DNA mogą stanowić przydatny produkt ujawnionych sposobów. Ponadto, o ile niniejsze ujawnienie jest skoncentrowane na uzyskaniu superskręconego plazmidowego DNA o wyższej czystości w odniesieniu do terapii genowej, specjalista w dziedzinie zauważy, że oprócz zastosowania w preparatach do terapii genowej
PL 203 013 B1 plazmidowy DNA jest szeroko stosowany w biologii molekularnej, zaś ujawniony wynalazek znajduje szerokie zastosowanie jako preparatywna metoda izolowania i oczyszczania superskręconego plazmidowego DNA.
Obecnie dostępne sposoby rozdzielania dwóch postaci plazmidowego DNA wykorzystują chromatografię jonowymienną (A novel, rapid process for purification of plasmids for gene therapy (Bhikhabhai R., Ollivier M. i Blanche F., Amersham Pharmacia Biotech R&D, 75184 Uppsala, Szwecja i RPR Gencell, Rhone Poulenc Roer, Center de Recherche de Vitry-Alfortville, 13 quai Jules Guesde, 94400 Vitry sur Siene, Francja. Numer publikacji 18-1129-51; Preparative purification of supercoiled plasmid DNA using anion exchange chromatography, Duarte Miguel Prazeres, Thomas Schleup, Charles Cooney, Journal of Chromatograpy A, 606 (1998), 31-45) albo chromatografię wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek (Prazeres D.M., A comparison of Gel Filtration Chromatographic Supports for Plasmid Purification, Biotechnology Techniques vol. 11, no 6, 1997, str. 417-420) w połączeniu z zastosowaniem dodatków, takich jak glikol polietylenowy (PEG), detergenty i inne składniki, takie jak heksaaminakobalt, spermidyna i poliwinylopirolidon (PVP). Ostatnio, przyznano patent (Horn i in., patent US nr 5707812) na oczyszczanie superskr ęconego plazmidowego DNA z zastosowaniem PEG jako dodatku. Jednakże, obecnie znane sposoby nie są w stanie zapewnić wydajnego i ekonomicznego wydzielania superskręconego i ciętego (albo rozluźnionego) DNA. Ponadto wadą wielu ze znanych sposobów jest zastosowanie PEG albo innych dodatków, które mogą być niepożądane podczas wytwarzania plazmidowego DNA, ponieważ wymagają dodatkowego oddzielania, usuwania i kontroli jakości, co może być trudne, czasochłonne i droższe.
Alternatywne postaci znanych sposobów oddzielania superskręconego i rozluźnionego plazmidowego DNA wykorzystują bardzo drogie, zastrzeżone żywice, które również wymagają zastosowania w trakcie procesu rozpuszczalników, takich jak acetonitryl, etanol, oraz innych skł adników, takich jak trietyloamina i fosforan tetrabutyloamoniowy. Ze względu na zastosowanie rozpuszczalników sposoby te zasadniczo nie nadają się do produkcji na dużą skalę. Ponadto, nie można ich zastosować wobec materiałów wyjściowych, które zawierają istotną ilość rozluźnionego plazmidowego DNA, ponieważ znaczna ilość zanieczyszczającego rozluźnionego plazmidowego DNA w materiale wyjściowym powoduje zmniejszanie zdolności rozdzielczej tych żywic (Green A.P. i in., Bio. Pharm. vol. 10, no 5, str. 52-62, 1997).
Dodatkowe sposoby rozdziału superskręconego i rozluźnionego DNA polegają na chromatografii wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek, która obejmuje rozdział dwóch postaci plazmidowego DNA na podstawie niewielkich różnic wielkości cząsteczki. Kolumny te są względnie długie, stanowiąc problem przy powiększeniu skali. Powoduje to, że ich wdrożenie w procesie wytwarzania na wielką skalę jest niewykonalne. Oprócz tego, sposoby oparte na chromatografii wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek wymagają stężonej próbki, co jest trudne do osiągnięcia w przypadku roztworów plazmidowego DNA, z powodu wysokiej lepkości DNA. Patrz „A comparison of gel filtration chromatographic supports for plasmid purification”, G.N.M Ferreira, J.M.S. Cabral i D.M.F Prazeres, Biotechnology Techniques, vol. 11, no 6, 1997, 417-420.
Przeparty plazmidowego DNA, które wytwarza się z preparatów bakteryjnych, często zawierające mieszaninę rozluźnionego i superskręconego plazmidowego DNA, wymagają usuwania endotoksyny, co jest wymogiem FDA, ponieważ endotoksyny wytwarzane przez wiele gospodarzy bakteryjnych powodują, jak wiadomo, reakcje zapalne, takie jak gorączka albo posocznica, u osobników otrzymujących plazmidowy DNA.
Endotoksyny te są zwykle lipopolisacharydami albo ich fragmentami, które stanowią składnik błony zewnętrznej bakterii Gram-ujemnych i występują w preparatach DNA jako artefakty komórek gospodarza albo jako część większych artefaktów, takich jak błony komórek albo makrocząsteczki, stosowanych do ekspresji i wytwarzania plazmidowego DNA, na przykład do terapii genowej. Tak więc, usuwanie endotoksyn jest kluczowym i koniecznym etapem w oczyszczaniu plazmidowego DNA do zastosowań terapeutycznych albo profilaktycznych.
Usuwanie endotoksyn z roztworów plazmidowego DNA wykorzystywało głównie ujemnie naładowaną strukturę endotoksyn; jednakże plazmidowy DNA jest również ujemnie naładowany, stąd rozdział zwykle przeprowadza się na żywicach anionowymiennych, które wiążą obie cząsteczki, zaś w pewnych warunkach, wybiórczo eluuje się plazmidowy DNA z jednoczesnym zatrzymaniem endotoksyn. Taki rozdział powoduje tylko częściowe usuwanie, ponieważ znaczna ilość endotoksyn eluuje z plazmidowym DNA i/lub odzyskiwanie plazmidowego DNA jest bardzo niewielkie. Inne opatentowane sposoby wykorzystują detergenty, które mogą powodować problemy (Process for the depletion
PL 203 013 B1 or removal of endotoxins, Coplan, Metin, Moritz, Peter, Schorr, Joachim, patent US nr 5747663). Oprócz tego, zdolność wiązania tych żywic wynosi jedynie od około 103 do 104 EU (jednostek endotoksyny)/ml żywicy, ponieważ żywica zajmowana jest zarówno przez endotoksynę, jak i przez DNA, co przykładowo wymaga 3 do 80 litrów żywicy, w oparciu o opisywaną wydajność 50000 EU/ml do 2000 EU/ml (Green A.P. i in., Bio. Pharm., vol. 10, nr 5, str. 52-62, maj 1997, Sterogene technical profile DNA Etox, Sterogene, 5922 Farnsworth Cr., Carlsbad, CA 92008).
Niniejszy wynalazek dostarcza sposobów rozdziału, izolowania i/lub oczyszczania plazmidowego DNA. Opisane tu sposoby można zastosować w kombinacji albo osobno. Konkretnie, niniejszy wynalazek dostarcza sposobów oddzielania, oczyszczania i/lub izolowania superskręconego i rozluźnionego plazmidowego DNA, jak również sposobów oddzielania, oczyszczania i/lub izolowania plazmidowego DNA od zanieczyszczeń komórki gospodarza, takich jak endotoksyna. Sposobami według wynalazku otrzymuje się oczyszczony, oddzielony i/lub izolowany plazmidowy DNA, w szczególności superskręcony plazmidowy DNA, który można stosować kompozycji, co zostało niniejszym opisane. Sposoby według wynalazku oraz opisana poniżej aparatura umożliwiają rozdział, izolowanie i/lub oczyszczanie plazmidowego DNA na skalę laboratoryjną.
Przedmiotem wynalazku jest sposób oczyszczania plazmidowego DNA z mieszaniny zawierającej przynajmniej jedno zanieczyszczenie z komórki gospodarza, korzystnie wybrane z grupy obejmującej RNA, endotoksynę, chromosomalny DNA i białko, a najkorzystniej będące endotoksyną, obejmujący następujące etapy:
a) wytwarzania roztworu przez dodanie odpowiedniej soli do mieszaniny w celu umożliwienia wybiórczego wiązania przynajmniej jednego zanieczyszczenia z komórki gospodarza z podłożem oddziaływań hydrofobowych;
b) doprowadzanie do kontaktu tego roztworu zawierającego plazmidowy DNA z podłożem oddziaływań hydrofobowych w warunkach umożliwiających związanie się przynajmniej jednego zanieczyszczenia z komórki gospodarza z podłożem oddziaływań hydrofobowych z wytworzeniem kompleksu; oraz
c) zebrania niezwiązanego w kompleksie plazmidowego DNA;
przy czym sposób przeprowadza się pod nieobecność rozpuszczalników organicznych, detergentów, glikoli, heksaaminakobaltu, spermidyny i poliwinylopirolidonu.
Korzystnie sól stosowana w sposobie według wynalazku obejmuje anion albo kation wybrany z grupy obejmującej octan, fosforan, węglan, SO4 2-, Cl-, Br-, NO3-, Mg2+, Li+, Na+, K+ i NH4+, korzystniej jest siarczanem amonu w stężeniu od 2M do 4M, a najkorzystniej siarczanem amonu w stężeniu 2M. Również korzystnie roztwór w sposobie według wynalazku zawiera sole sodowe w stężeniu od 2M do 4M, korzystnie chlorek sodu, a najkorzystniej chlorek sodu w stężeniu 2M. Ponadto pH roztworu jest korzystnie w zakresie od 6,8 do 7,4, a korzystniej wynosi 7,4.
Przedmiotem wynalazku jest również sposób oddzielania superskręconego plazmidowego DNA z mieszaniny superskrę conego i rozluź nionego plazmidowego DNA i ewentualnie przynajmniej jednego zanieczyszczenia z komórki gospodarza, korzystnie wybranego z grupy obejmującej RNA, endotoksynę, chromosomalny DNA i białko, a najkorzystniej będącego endotoksyną, obejmujący następujące etapy:
a) wytworzenia roztworu przez dodanie soli do mieszaniny superskręconego i rozluźnionego plazmidowego DNA i ewentualnie, przynajmniej jednego zanieczyszczenia z komórki gospodarza;
b) doprowadzenia do kontaktu tego roztworu z podłożem oddziaływań hydrofobowych w początkowych warunkach, w których superskręcony i rozluźniony plazmidowy DNA wiążą się z podłożem oddziaływań hydrofobowych z wytworzeniem pierwszej związanej mieszaniny;
c) zmiany początkowych warunków wokół pierwszej związanej mieszaniny na drugie warunki, w celu uwolnienia rozluź nionego plazmidowego DNA z pierwszej zwią zanej mieszaniny, z wytworzeniem oddzielnych składników zawierających drugą związaną mieszaninę i uwolniony rozluźniony plazmidowy DNA; oraz
d) modyfikowania drugich warunków wokół drugiej związanej mieszaniny na trzecie warunki, w celu usunięcia superskrę conego plazmidowego DNA z drugiej zwią zanej mieszaniny z wytworzeniem oddzielnych składników zawierających podłoże oddziaływań hydrofobowych i uwolniony superskręcony plazmidowy DNA.
Korzystnie sól stosowana w sposobie według wynalazku obejmuje anion albo kation wybrany z grupy obejmującej octan, fosforan, wę glan, SO4 2-, Cl-, Br-, NO3-, Mg2+, Li+, Na+, K+ i NH4+, a korzystnie jest siarczanem amonu w stężeniu od 2,5M do 4M. Również korzystnie począ tkowe
PL 203 013 B1 warunki w sposobie według wynalazku obejmują równoważenie podłoża w etapie (b) roztworem soli zawierającym siarczan amonu w stężeniu od 2,5M do 4M, drugie warunki obejmują przemywanie podłoża roztworem soli zawierającym siarczan amonu w stężeniu od 2,35M do 2,45M, a trzecie warunki obejmują przemywanie drugiej związanej mieszaniny roztworem soli zawierającym siarczan amonu w stężeniu od 1M do 2,3M. Alternatywnie zmiana i modyfikacja w sposobie wedł ug wynalazku są połączone w ciągły proces obejmujący elucję rozluźnionego plazmidowego DNA i superskręconego plazmidowego DNA w gradiencie przez zmieszanie pierwszej związanej mieszaniny z roztworem zawierającym siarczan amonu o ciągle zmieniającym się stężeniu siarczanu amonu, przy czym stężenie zmienia się od 3M do 1M siarczanu amonu, zaś rozluźniony plazmidowy DNA zbiera się w pierwszej eluowanej objętości, a superskręcony DNA zbiera się w drugiej eluowanej objętości.
Wynalazek dostarcza ponadto sposobu oddzielania endotoksyny od plazmidowego DNA obejmującego doprowadzenie do kontaktu mieszaniny endotoksyny i plazmidowego DNA z podłożem oddziaływań hydrofobowych w warunkach, w których endotoksyna wiąże się z podłożem oddziaływań hydrofobowych z wytworzeniem kompleksu, oraz oddzielenie plazmidowego DNA od kompleksu. Korzystnie warunki w sposobie według wynalazku obejmują zawartość soli, której anion albo kation wybrany z grupy obejmującej octan, fosforan, węglan, SO4 2-, Cl-, Br-, NO3-, Mg2+, Li+, Na+, K+ i NH4+, a korzystniej mieszanina ponadto zawiera sól amonową w stężeniu od 1,5M do 4M, a najkorzystniej siarczan amonu w stężeniu 2M. Również korzystnie pH roztworu w sposobie według wynalazku jest w zakresie od 6,8 do 7,4, a korzystniej wynosi 7,4.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób oddzielania superskręconego plazmidowego DNA od rozluźnionego plazmidowego DNA obejmujący doprowadzanie do kontaktu mieszaniny superskręconego plazmidowego DNA i rozluźnionego plazmidowego DNA z podłożem oddziaływań hydrofobowych w początkowych warunkach, w których zarówno superskręcony jak i rozluźniony plazmidowy DNA wiążą się z podłożem oddziaływań hydrofobowych z wytworzeniem pierwszej związanej mieszaniny, zmianę początkowych warunków wokół pierwszej związanej mieszaniny na warunki drugie, w celu usunię cia rozluź nionego plazmidowego DNA z pierwszej zwią zanej mieszaniny z wytworzeniem oddzielnych składników zawierających drugą związaną mieszaninę i uwolniony rozluźniony plazmidowy DNA, oraz modyfikowanie drugich warunków wokół drugiej związanej mieszaniny na trzecie warunki, w celu usunięcia superskręconego plazmidowego DNA z drugiej związanej mieszaniny z wytworzeniem oddzielnych skł adników obejmujących podł o ż e oddział ywań hydrofobowych i uwolniony superskręcony plazmidowy DNA;
przy czym sposób przeprowadza się pod nieobecność rozpuszczalników organicznych, detergentów, glikoli, heksaaminakobaltu, spermidyny i poliwinylopirolidonu.
Korzystnie początkowe warunki obejmują równoważenie podłoża roztworem soli zawierającym siarczan amonu o stężeniu w zakresie od 2,5M do 4M, drugie warunki obejmują przemywanie pierwszej związanej mieszaniny roztworem soli zawierającym siarczan amonu w stężeniu od 2,35M do 2,45M, a trzecie warunki obejmują przemywanie drugiej związanej mieszaniny roztworem soli zawierającym siarczan amonu w stężeniu od 1M do 2,3M. Również korzystnie zmiana i modyfikacja w sposobie według wynalazku są połączone w ciągły proces obejmujący elucję rozluźnionego plazmidowego DNA i superskręconego plazmidowego DNA w gradiencie przez zmieszanie pierwszej związanej mieszaniny z roztworem zawierającym siarczan amonu o ciągle zmieniającym się stężeniu siarczanu amonu, przy czym stężenie zmienia się od 3M do 1M siarczanu amonu, zaś rozluźniony plazmidowy DNA zbiera się w pierwszej eluowanej objętości, a superskręcony DNA zbiera się w drugiej eluowanej objętości. Korzystnie otrzymany w sposobie według wynalazku oddzielny składnik zawierający uwolniony rozluźniony plazmidowy DNA lub superskręcony DNA zbiera się i izoluje.
Ponadto przedmiotem wynalazku jest sposób wzbogacania ilości superskręconego DNA względem rozluźnionego DNA obejmujący:
1) poddanie mieszaniny zawierającej superskręcony DNA i rozluźniony DNA oddziaływaniu z podłożem oddziaływań hydrofobowych, obejmującym ugrupowanie alkilowe w warunkach, w których superskręcony DNA w sposób uprzywilejowany wiąże się z podłożem oddziaływań hydrofobowych;
2) traktowanie podłoża oddziaływań hydrofobowych, zawierającego superskręcony i rozluźniony DNA w warunkach, które umożliwiają wybiórcze usuwanie rozluźnionego DNA; oraz
3) eluowanie superskręconego DNA z podłoża oddziaływań hydrofobowych;
przy czym sposób przeprowadza się pod nieobecność rozpuszczalników organicznych, detergentów, glikoli, heksaaminakobaltu, spermidyny i poliwinylopirolidonu.
PL 203 013 B1
Wynalazek dotyczy również sposobu usuwania lipopolisacharydu (LPS) z kompozycji zawierającej DNA obejmującego:
1) poddanie mieszaniny zawierającej DNA i LPS oddziaływaniu z podłożem oddziaływań hydrofobowych, obejmującym ugrupowanie alkilowe, w warunkach, w których LPS w sposób uprzywilejowany wiąże się z podłożem oddziaływań hydrofobowych; oraz
2) traktowanie podłoża oddziaływań hydrofobowych, zawierającego DNA i LPS w warunkach, które umożliwiają wybiórcze usuwanie DNA.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto sposób wzbogacania ilości superskręconego DNA względem rozluźnionego DNA obejmujący:
a) wytworzenie roztworu przez dodanie soli do mieszaniny superskręconego DNA i rozluźnionego DNA;
b) doprowadzenie do kontaktu tego roztworu z podłożem oddziaływań hydrofobowych w początkowych warunkach, w których superskręcony i rozluźniony plazmidowy DNA wiążą się z podłożem oddziaływań hydrofobowych z wytworzeniem pierwszej związanej mieszaniny;
c) zmianę początkowych warunków wokół pierwszej związanej mieszaniny na drugie warunki, w celu uwolnienia rozluźnionego plazmidowego DNA z pierwszej mieszaniny związanej, z wytworzeniem oddzielnych składników zawierających drugą związaną mieszaninę i uwolniony rozluźniony plazmidowy DNA; oraz
d) modyfikowanie drugich warunków wokół drugiej związanej mieszaniny na trzecie warunki w celu usunię cia superskrę conego plazmidowego DNA z drugiej zwią zanej mieszaniny z wytworzeniem oddzielnych składników zawierających podłoże oddziaływań hydrofobowych i uwolniony superskręcony plazmidowy DNA.
Korzystnie sól stosowana w sposobie według wynalazku obejmuje anion albo kation wybrany z grupy obejmującej octan, fosforan, węglan, SO4 2-, Cl-, Br-, NO3-, Mg2+, Li+, Na+, K+ i NH4+, korzystniej jest siarczanem amonu w stężeniu od 2,5M do 4M. Ponadto korzystnie początkowe warunki obejmują równoważenie podłoża roztworem soli zawierającym siarczan amonu w stężeniu od 2,5M do 4M, drugie warunki obejmują przemywanie podłoża roztworem soli zawierającym siarczan amonu w stężeniu od 2,35M do 2,45M, a trzecie warunki obejmują przemywanie drugiej związanej mieszaniny roztworem soli zawierającym siarczan amonu w stężeniu od 1M do 2,3M.
Podłoże oddziaływań hydrofobowych wykorzystywane w sposobach według wynalazku obejmuje podłoże chromatograficzne z dołączonymi grupami hydrofobowymi, korzystnie wybranymi z grupy obejmującej grupy alkilowe C3 do C10 i ich mieszaniny. Korzystniej podłoże oddziaływań hydrofobowych jest wybrane z grupy obejmującej szkielet polimeru metakrylanowego lub kopolimeru związany z przynajmniej jedną propylową, butylową , heksylową , heptylową, oktylową, nonylową albo decylową grupą hydrofobową. Również korzystnie podłoże zawiera przynajmniej jeden szkielet kopolimeru metakrylanu i glikolu etylenowego lub szkielet sieciowanej agarozy. Alternatywnie podłoże jest w postaci perełek o wielkości w zakresie od 15 do 100 μm.
Zatem opisano niniejszym sposoby izolowania pożądanego rodzaju polinukleotydów od innych składników występujących w mieszaninie zawierającej te polinukleotydy, otrzymując kompozycje wzbogacone w pożądany rodzaj polinukleotydów. Sposoby obejmują rozdział polinukleotydów od niepożądanych składników przez doprowadzenie do kontaktu mieszanin zawierających polinukleotydy z podłożem oddziaływań hydrofobowych. Oddzielenie polinukleotydów od innych składników, jak również rozdział rodzajów polinukleotydów wynika z różnych powinowactw polinukleotydów i innych niepożądanych składników wobec podłoża oddziaływań hydrofobowych w różnych warunkach jonowych. Tak więc, w sposobach według wynalazku stosuje się podłoże oddziaływań hydrofobowych, które wykazuje silniejsze powinowactwo wiązania wobec lipopolisacharydów i lipoprotein względem polinukleotydów; przy czym to wiązanie selektywne zachodzi w różnych warunkach jonowych zastosowanych w procesie rozdziału. Wynalazek obejmuje sposoby rozdzielania superskręconego i rozluźnionego DNA. Sposoby wykorzystują warunki jonowe, w których superskręcony plazmidowy DNA wiąże się preferencyjnie z podłożami oddziaływań hydrofobowych w porównaniu z rozluźnionym DNA.
Należy rozumieć, że podczas gdy opisano stężenie soli zastosowane w sposobach według wynalazku, można zastosować równoważną siłę jonową innych soli. Należy również rozumieć, że szczególnie w odniesieniu do sposobów, które zubażają i/lub eliminują endotoksyny, sposoby te stosuje się wobec plazmidowego DNA jak i nieplazmidowego DNA.
Sposoby według wynalazku umożliwiają oddzielanie, izolowanie i/lub oczyszczanie plazmidowego DNA z zanieczyszczających pozostałości komórki gospodarza, w szczególności składników albo
PL 203 013 B1 fragmentów zawierających endotoksynę. Ponadto sposoby według wynalazku umożliwiają oddzielanie, oczyszczanie i/lub izolowanie superskręconego i rozluźnionego plazmidowego DNA. Niniejszym opisano również kompozycje zawierające oczyszczony, oddzielony i/lub izolowany plazmidowy DNA, szczególnie superskręcony plazmidowy DNA.
W jednej postaci wykonania, wynalazek dostarcza sposobu oddzielania endotoksyny i innych zanieczyszczeń z komórki gospodarza (tj. RNA, chromosomalnego DNA, białek) od plazmidowego DNA, obejmującego doprowadzenie do kontaktu lizatu komórkowego z podłożem oddziaływań hydrofobowych w warunkach, w których endotoksyna i inne substancje zanieczyszczające wiążą się z podłożem oddziaływań hydrofobowych z wytworzeniem kompleksu oraz rozdzielenie plazmidowego DNA i kompleksu. Endotoksyna oddzielona sposobem wedł ug wynalazku obejmuje endotoksynę mikroorganizmu Gram-ujemnego, jak również fragmenty i składniki komórkowe i sub-komórkowe związane z tymi endotoksynami i fragmentami endotoksyn. Podłoże oddziaływań hydrofobowych wiąże również RNA, w tym t-RNA, r-RNA i m-RNA, białka komórki gospodarza i chromosomalne DNA. Podłoże oddziaływań hydrofobowych przydatne według wynalazku może mieć postać żywicy, błon albo innych podłoży.
Korzystna postać tego wykonania obejmuje ładowanie mieszaniny plazmidowego DNA z ewentualnie zanieczyszczającymi składnikami komórki gospodarza, w tym endotoksyną, na kolumnę albo matrycę złoża zawierającą podłoże oddziaływań hydrofobowych, w taki sposób, że endotoksyna albo zanieczyszczenia komórkowe selektywnie wiążą się albo zatrzymują na podłożu oddziaływań hydrofobowych, zaś plazmidowy DNA jest zbierany jako frakcja przepływająca procesu ładowania albo podczas ewentualnego płukania podłoża oddziaływań hydrofobowych, który nie zakłóca albo nie przerywa retencji zanieczyszczeń z komórek gospodarza i endotoksyny na i/lub w podłożu oddziaływań hydrofobowych. Po zebraniu plazmidowego DNA, kolumnę albo matrycę złoża można regenerować przez wymywanie związanych albo zatrzymanych zanieczyszczeń z komórek gospodarza i endotoksyn przez zmianę albo modyfikację warunków oddziaływań hydrofobowych kolumny albo złoża, przez, przykładowo, zmianę stężenia soli w otoczeniu kolumny albo matrycy złoża.
Alternatywne wykonania wynalazku dostarczają sposobów oddzielania pod nieobecność jednej albo obu chromatografii: jonowymiennej albo wykluczania zależnego od wielkości cząsteczek.
W korzystnym wykonaniu, objętość kolumny albo złoża jest początkowo równoważona roztworem reakcyjnym siarczanu amonu w stężeniu, które umożliwia wybiórcze wiązanie zanieczyszczeń z kolumną oddziaływań hydrofobowych, korzystnie stężeniu około 2M. Sole, które można wykorzystać według wynalazku obejmują mieszaniny anionów i kationów wybrane z grupy obejmującej, choć nieograniczonej do octanu, fosforanu, węglanu, SO4 2-, Cl-, Br-, NO3-, Mg2+, Li+, Na+, K+ i NH4+. Można zastosować mieszaniny soli. Ponadto, mieszaninę plazmidowego DNA oraz innych zanieczyszczeń, takich jak endotoksyna, korzystnie dializuje się buforem dializacyjnym przed doprowadzeniem do kontaktu z kolumną albo matrycą złoża w celu usunięcia soli i innych zanieczyszczeń, które mogą zmienić hydrofobowość endotoksyn albo plazmidowego DNA i innych zanieczyszczeń, w roztworze reakcyjnym siarczanu amonu. Roztwór reakcyjny jest korzystnie buforowany przykładowo przez Tris-HCl o pH w zakresie od okoł o 6,8 do okoł o 8,5, korzystnie 7,4. Inne bufory znane są specjalistom w dziedzinie obejmujące: Tris, TES (kwas N-tris(hydroksymetylo)metylo-2-aminoetenosulfonowy), Tricine (N-tris(hydroksymetylo)metyloglicynę), fosforan, PIPES (kwas piperazyno-N,N'-bis(2-etanosulfonowy)), MOPS (kwas 3-(N-morfolino)propanosulfonowy), MES (kwas 2-(N-morfolino)etanosulfonowy), MEPES (kwas 3-N(N-morfolino)etylopiperazyno-N'-2-etanosufonowy) i Bicine (N,N-bis(2-hydroksyetylo)glicynę), mogą być zastosowane.
Sposoby według wynalazku dostarczają izolowanego i/lub oczyszczonego plazmidowego DNA i kompozycji zawierających plazmidowy DNA o zasadniczo zmniejszonej zawartoś ci endotoksyny albo pozbawionych endotoksyny, tak, że zawartość endotoksyny towarzysząca plazmidowemu DNA jest zmniejszona o ponad 95%, korzystnie ponad 98%, korzystniej ponad 99%, ewentualnie ponad 99,9%, zaś alternatywnie od ponad 99,99% do 99,999%. Sposób według wynalazku można zastosować do oddzielania początkowo dużych ilości endotoksyny, takich jak przynajmniej 200000 do 400000 jednostek endotoksyny (EU)/ml roztworu, zapewniając wydajność matrycy hydrofobowej przynajmniej 600000 do 3 milionów EU/ml. Ponadto, sposób według wynalazku dostarcza kompozycji plazmidowego DNA zawierającej mniej niż około 10 do mniej niż około 2500 EU albo mniej niż około 1 do mniej niż około 300 EU/mg DNA. Alternatywnie, sposób według wynalazku dostarcza kompozycji otrzymanego plazmidowego DNA zawierającej mniej niż około 50 do mniej niż około 1000 jednostek endotoksyny (EU) albo mniej niż około 10 do mniej niż około 50 EU/mg DNA. Sposób według wynalazku
PL 203 013 B1 zmniejsza również zawartość białka do mniej niż około 0,1% (wag./wag.), RNA do mniej niż około 1% (wag./wag.) i chromosomalnego DNA do mniej niż 1% (wag./wag.).
W innym wykonaniu, wynalazek dostarcza sposobu oddzielania superskręconego plazmidowego DNA od rozluźnionego DNA, który obejmuje etapy kontaktowania mieszaniny superskręconego plazmidowego DNA i rozluźnionego plazmidowego DNA z podłożem oddziaływań hydrofobowych w pierwszych warunkach, w których oba plazmidowe DNA wiążą się z podłożem oddziaływań hydrofobowych tworząc pierwszą mieszaninę związaną, zmiany pierwszych warunków otaczających pierwszą mieszaninę związaną na drugie warunki w celu usunięcia rozluźnionego plazmidowego DNA ze związanej pierwszej mieszaniny, z wytworzeniem osobnych składników zawierających drugą mieszaninę związaną i rozluźniony plazmidowy DNA i modyfikowanie warunków do trzecich warunków w celu usunięcia superskręconego plazmidowego DNA z drugiej mieszaniny związanej z wytworzeniem osobnych składników zawierających podłoże oddziaływań hydrofobowych i superskręcony plazmidowy DNA.
W innej postaci wykonania, zmianę i modyfikację można przeprowadzić przez zmianę pH bufora albo roztworu wymywającego w taki sposób, aby postać rozluźniona i superskręcona mogły być wymywane w różnych warunkach pH, ze zmianą albo bez zmiany warunków stężenia soli.
W innej postaci wykonania, zmianę albo modyfikację można przeprowadzić przez elucję izokratyczną, przy czym roztwór o tym samym składzie, korzystnie o zawartości soli, która wymywa obie postaci plazmidowego DNA, kiedy przepuszczany przez kolumnę zawierającą związany plazmid, wymywa kolejno obie postaci oddzielnie w osobnych frakcjach.
W innym wykonaniu, warunki związane z obecnością soli i/lub inne warunki moż na modyfikować w taki sposób, że postać rozluźnioną plazmidu można zbierać jako frakcję niezwiązaną, podczas gdy postać superskręcona wiąże się z żywicą. Postać superskręconą można następnie wymywać przez zastosowanie warunków podanych wyżej.
W innej postaci wykonania, zmianę albo modyfikację moż na przeprowadzić przez zastosowanie cząsteczek albo mieszaniny cząsteczek, które kompetytywnie wiążą się z ligandem („czynniki rugujące” (ang. „displacer”)) i usuwają związane postaci plazmidowego DNA z matrycy jako oddzielne składniki.
W innej postaci wykonania, cząsteczki albo mieszaninę cząsteczek, które mogą wiązać się przez oddziaływanie hydrofobowe lub w inny sposób, można zmieszać z roztworami plazmidowego DNA, które po umieszczeniu na kolumnie mogą być kolejno rugowane, co prowadzi do rozdziału różnych postaci DNA.
W powyższych dwóch postaciach wykonania, określanych powszechnie jako chromatografia „przez rugowanie” albo „czołowa”, dodana cząsteczka może być wymywana równocześnie z produktem, który w większości przypadków może być skutecznie oddzielany przy użyciu sposobów znanych w stanie techniki.
Chromatografia przez rugowanie stanowi odmianę chromatografii, w której dwie lub więcej cząsteczek związanych z żywicą jest wypierane przez cząsteczkę wypierającą o wyższym powinowactwie wobec żywicy, powodując kolejne wypieranie i wymywanie dwóch lub większej liczby cząsteczek. Ostatnio, ujawniono czynniki rugujące dla żywic oddziaływań hydrofobowych składające się z triblokowych kopolimerów obejmujących polimetylo metakrylan, kwas akrylowy i polidimetyloaminoetylo metakrylan (Ruaan i in., „Hydrophobic displacement chromatography of proteins using triblock copolymers as a displacers”, 1998 AIChE Meeting). Opracowano również inne czynniki rugujące do chromatografii przez rugowanie z żywic oddziaływań hydrofobowych (Shukla i in., „Hydrophobic displacement chromatography of proteins” 1998 Annual AIChE Meeting). Czynniki rugujące, takie jak 2-(2-butoksyetoksy)etanol zastosowano do rugowania w chromatografii z odwróconym układem faz.
Po związaniu obu postaci plazmidu można zastosować czynniki rugujące, takie jak wymienione wyżej, do wypierania kolejno superskręconego i rozluźnionego plazmidowego DNA z opisanych tu HIC (kolumn oddziaływań hydrofobowych).
W „czołowej” odmianie chromatografii, na kolumnę nanosi się mieszaniną dwuskładnikową różniącą się powinowactwem wobec żywicy i podczas ciągłego nanoszenia na kolumnę jeden składnik wypiera inny i powoduje wymywanie kolejno dwóch składników. W zastosowaniu tej metody w niniejszym wynalazku, dwie postaci DNA można nanosić na kolumnę HIC, zaś przeładowanie kolumny może dać efekt wypierania postaci rozluźnionej, którą można zbierać osobno od superskręconej postaci.
PL 203 013 B1
W jednej z postaci wykonania, zmianę i modyfikację łączy się w proces cią g ł y wymywania gradientem rozluźnionego i superskręconego plazmidowego DNA przez mieszanie związanej pierwszej mieszaniny z roztworem soli, takiej jak siarczan amonu, o zmieniającym się w sposób ciągły stężeniu soli pomiędzy około 3M i około 1M. Rozluźniona postać plazmidowego DNA jest zbierana w tej postaci wykonania w pierwszej objętości wymywanej, zaś postać superskręcona jest zbierana w drugiej objętości wymywanej.
W innej korzystnej postaci wykonania, postać superskręconą i rozluź nioną DNA oddziela się przez związanie obu postaci z podłożem oddziaływań hydrofobowych w złożu albo kolumnie przy wysokich stężeniach soli albo ekwiwalentnej sile jonowej, jak 2,5M do 4M, korzystnie 3M, siarczanu amonu, a następnie wymywanie obu postaci gradientem ciągłym lub skokowo, przez zmianę stężenia soli albo ekwiwalentnej siły jonowej do pierwszego zakresu od około 2,45M do około 2,35M siarczanu amonu, a następnie do drugiego zakresu od około 0 (ewentualnie 1M) do około 2,3M siarczanu amonu (przy skokowym wymywaniu) albo przez ciągłą zmianę stężenia siarczanu amonu z zakresu od 2,5M do około 4M do drugiego zakresu od około 0 (ewentualnie 1M) do około 2,3M w objętości wynoszącej od około 1 do około 30 objętości kolumny, korzystnie w przynajmniej 6 objętościach kolumny (przy gradiencie ciągłym). W każdej z postaci, rozluźniony plazmidowy DNA ulega wymywaniu z kolumny albo złoża przy stężeniu soli (siarczan amonu) w zakresie od około 2,35M do około 2,45M, podczas gdy postać superskręcona ulega wymywaniu przy stężeniu soli (siarczan amonu) w zakresie od około 0 do około 2,3M.
W innej postaci wykonania wynalazku, dostarczono sposobu izolowania superskręconego plazmidowego DNA, który obejmuje:
wprowadzenie próbki zawierającej plazmid superskręcony na podłoże oddziaływań hydrofobowych w warunkach jonowych, w których plazmid superskręcony selektywnie wiąże się z podłożem w porównaniu z niesuperskręconym plazmidem; i dostosowanie warunków jonowych w taki sposób, aby związany plazmid superskręcony był usuwany z podłoża.
W innej korzystnej postaci wykonania, wynalazek dostarcza sposobu wzbogacania iloś ci plazmidu superskręconego względem rozluźnionego DNA w mieszaninie, przy czym sposób obejmuje 1) oddziaływanie mieszaniny zawierającej superskręcony DNA i rozluźniony DNA z podłożem oddziaływań hydrofobowych obejmującym ugrupowanie alkilowe w warunkach jonowych, przy czym superskręcony DNA preferencyjnie wiąże się z podłożem oddziaływań hydrofobowych; 2) traktowanie podłoża oddziaływań hydrofobowych, zawierającego superskręcony i rozluźniony DNA w warunkach jonowych, które umożliwiają selektywne usuwanie rozluźnionego DNA; i 3) wymywanie superskręconego DNA z podłoża oddziaływań hydrofobowych.
W dalszej korzystnej postaci wykonania, wynalazek dostarcza sposobu usuwania lipopolisacharydu (LPS) z kompozycji, obejmującego 1) oddziaływanie mieszaniny zawierającej DNA i LPS z podłożem oddziaływań hydrofobowych obejmującym ugrupowanie alkilowe w warunkach jonowych, w których LPS wybiórczo wiąże się z podłożem oddziaływań hydrofobowych; i 2) traktowanie podłoża oddziaływań hydrofobowych, zawierającego DNA i LPS, warunkami jonowymi, które umożliwiają wybiórcze usuwanie DNA.
Sposoby według wynalazku dostarczają izolowanego i/lub oczyszczonego superskręconego plazmidowego DNA i kompozycji go zawierających, które korzystnie są pozbawione endotoksyny, zaś ilość superskręconego plazmidowego DNA w kompozycji otrzymanej zgodnie z ujawnionymi niniejszym sposobami wynosi przynajmniej około 50% wagowo całkowitej zawartości plazmidu do około 99% wagowo, korzystnie przynajmniej około 60% wagowo do około 95% wagowo, korzystniej przynajmniej około 70% wagowo do około 90%, najkorzystniej przynajmniej około 75% do przynajmniej około 85% wagowo superskręconego plazmidowego DNA.
Procent wagowy może być zmierzony, jak zilustrowano niniejszym, przez rozdzielanie HPLC na kolumnie HPLC DNA-NPR, w gradiencie, co prowadzi do powstania pików o polu powierzchni odpowiadającym ilości każdego ze składników. Procent superskręconej postaci obliczono jako ułamek pola powierzchni piku odpowiadający superskręconemu DNA do całkowitego pola powierzchni pików odpowiadających superskręconemu i rozluźnionemu plazmidowemu DNA.
Korzystne podłoża oddziaływań hydrofobowych, które mogą być niniejszym stosowane, obejmują żywice oddziaływań hydrofobowych zawierające, przykładowo, szkielet polimeru metakrylanowego albo kopolimeru, takiego jak kopolimer metakrylan/glikol etylenowy i/lub kopolimer metakrylan/glikol propylenowy (TosoHaas, Montgomeryville, PA), i/lub agarozę albo podłoże Sepharose
PL 203 013 B1 (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), na przykład sieciowaną albo niesieciowaną agarozę, Sepharose, dekstran, polimery zawierające krzemionkę, polimery organiczne (naturalne albo syntetyczne), szkielet zawierający materiał ceramiczny lub matryce żelowe, albo ich kombinacje z będącymi łańcuchami bocznymi dołączonymi ligandami alkilowymi C3 do C10, rozgałęzionymi albo prostymi. Korzystne dołączone ligandy obejmują ligandy propylowe, butylowe, heksylowe i/lub oktylowe. Ligandy te umożliwiają selektywne oddziaływanie przez wiązanie, które jest wykorzystywane w sposobach rozdzielania, oczyszczania i/lub izolowania według wynalazku. Specjalista w dziedzinie dostrzeże, że żywice oddziaływań hydrofobowych mogą zawierać inne ligandy oprócz wyżej wymienionych lub zamiast nich, które również będą użyteczne w sposobie według wynalazku. Przykłady takich ligandów obejmują, ale nie ograniczają się do grupy fenylowej, oktylowej, butylowej, propylowej, neopentylowej, hydroksypropylowej, benzylowej, oktadecylowej, difenylowej i metylowej, jak również ich podstawionych i niepodstawionych pochodnych oraz ich kombinacji. Odpowiednie materiały na żywice i podłoża użyteczne w rozwiązaniach według wynalazku obejmują te opisane, na przykład, w patencie EP 964057, zgłoszeniu EP 99109441, JP 2000035423, JP 99127700 i JP 98127665 (Kitamura i in.), których ujawnienia są niniejszym włączone na drodze odniesienia.
Podłoża oddziaływań hydrofobowych mogą być w postaci perełek, które można upakować lub załadować do kolumny albo reaktora, albo sieciowanych porowatych podłoży. Wielkość perełek może się zawierać w zakresie od 2,5 μm do 100 μm i więcej. Wielkość perełek zawiera się korzystnie w zakresie od około 30 do około 110 μm średnicy, jak np. 35 do około 100 μm średnicy lub alternatywnie w zakresie od 35 do 90 μm średnicy. Podłoże oddziaływań hydrofobowych może mieć postać membran, takich jak szkielet z celulozy albo pochodnych celulozy, polieterosulfonu, polisulfonów i ich pochodnych i/lub innych materiałów znanych w dziedzinie filtrowania i rozdzielania, w tym tworzyw sztucznych, takich jak płytki do mikromiareczkowania i szalki Petri'ego albo szalki i pojemniki do hodowli komórek.
Perełki stosowane w kolumnach „Streamline” (Amersham Pharmacia biotech) są zwykle większe i o różnych gęstościach i są wytwarzane przez różnych producentów, w tym Amersham Pharmacia Biotech, Biosepra, Inc., ale nie ograniczają się jedynie do takich, przez które można przepuszczać sklarowany lizat na kolumnie o rozwiniętym złożu, powodując usuwanie zanieczyszczeń przez związanie z perełkami, które zawierają ligandy oddziaływania hydrofobowego.
Mniejsze rozmiary perełek, są zazwyczaj stosowane do rozdziałów wysokosprawnych, łącznie z HPLC, w których niniejszy wynalazek może być stosowany do dostarczenia ilościowych sposobów analitycznych dla plazmidowego DNA i/lub różnych postaci DNA.
Perełki do zastosowania w rozwiązaniach według wynalazku, szczególnie do rozdzielania dwóch postaci plazmidowego DNA nie muszą być porowate, ponieważ plazmidowe DNA jest zazwyczaj zbyt duże, aby wypełniać pory, a tym samym pozwolić na uzyskanie dodatkowej wydajności. Jednakże, pory mogą skutecznie zwiększyć wydajność dla celów wiązania cząsteczek będących zanieczyszczeniami, takich jak RNA, białka i endotoksyny oraz fragmenty DNA, które są wielkością porównywalne albo mniejsze niż rozmiar porów. W takim przypadku porowatość będzie odgrywała rolę, a porowate żywice mogą okazać się przydatne.
Sposoby według wynalazku nie wymagają rozpuszczalników organicznych albo dodatków czy detergentów, takich jak glikole, glikole polietylenowe, heksaaminakobalt, spermidyna czy poliwinylopirolidon, które później wymagają oddzielania od produktu przed zastosowaniem go, przykładowo, w terapii genowej.
Krótki opis rysunków
Fig. 1 przedstawia schemat przepływowy obejmujący różne etapy związane z przeprowadzeniem sposobu oddzielenia superskręconego i rozluźnionego plazmidowego DNA.
Fig. 2 przedstawia schemat poglądowy oddziaływania różnych podłoży oddziaływań hydrofobowych z przyłączonymi do nich ligandami, które zastosowano w przykładach.
Fig. 3 przedstawia schemat przepływowy różnych etapów związanych z przeprowadzeniem sposobu oddzielania endotoksyny od plazmidowego DNA.
Fig. 4 (wstawka) przedstawia zeskanowany obraz żelu agarozowego z Przykładu 5 (butylo-HIC) barwionego SYBR GOLD; ścieżka 1 zawiera drabinkę superskręconego plazmidowego DNA; ścieżka 2 i 3 zawiera próbki z piku 1 (rozluźniony), zaś ścieżki 3-5 zawierają próbki z piku 2 (superskręcony). Ścieżki numerowano od lewej do prawej. Chromatogram z Przykładu 5 przedstawiający absorbancję względem objętości, pokazuje rozdział DNA rozluźnionego (pik 1) i superskręconego (pik 2).
PL 203 013 B1
Figura 5 (wstawka) przedstawia zeskanowany obraz żelu agarozowego z Przykładu 6 (butylo-HIC) barwionego SYBR GOLD; ścieżka 1 zawiera znacznik, ścieżka 2 i 3 zawiera próbki z piku 1 (rozluźniony), zaś ścieżki 4-6 zawierają próbki z piku 2 (superskręcony). Ścieżki numerowano od lewej do prawej. Chromatogram z Przykładu 6 pokazuje rozdział DNA rozluźnionego (pik 1) i superskręconego (pik 2).
Figura 6 (wstawka) przedstawia zeskanowany obraz żelu agarozowego z Przykładu 7; ścieżka 1 zawiera znacznik, ścieżka 2 i 3 zawiera materiał wprowadzony na kolumnę; ścieżka 4 zawiera materiał z piku artefaktu; ścieżka 5 zawiera materiał z wymywania 2,4M AS, zaś ścieżka 6 zawiera materiał z wymywania 1M AS. Ścieżki numerowano od lewej do prawej. Chromatogram pokazuje rozdział rozluźnionego i superskręconego plazmidowego DNA, przy czym pik artefaktu jest pierwszym szerokim pikiem (od lewej), po czym następują piki, rozluźnionego i superskręconego DNA odpowiednio.
Figura 7 (wstawka) przedstawia zeskanowany obraz żelu agarozowego z Przykładu 8 (heksyloHIC); ścieżka 1 zawiera znacznik, ścieżka 2-4 zawiera materiał z piku 1 (postać rozluźniona); zaś ścieżki 5 i 6 zawierają frakcję z piku 2 (postać superskręcona). Ścieżki numerowano od lewej do prawej. Chromatogram pokazuje rozdział DNA rozluźnionego i superskręconego.
Figura 8 przedstawia zeskanowany obraz żelu agarozowego z Przykładu 9 barwionego SYBR GOLD; ścieżka 1 zawiera znacznik, ścieżka 2 zawiera materiał wprowadzony na kolumnę, ścieżki 3, 4 i 5 zawierają materia ł odpowiadają cy wymywaniom 1, 2 i 3 odpowiednio; ś cież ka 6 zawiera materiał z wymywania przy 1M, zaś ścieżka 7 zawiera elucję wodą.
Sposoby według wynalazku wykorzystują różnice hydrofobowości superskręconego, rozluźnionego plazmidowego DNA i zanieczyszczeń komórkowych, takich jak endotoksyna.
Sposoby ujawnione niniejszym są użyteczne do oczyszczania i izolowania superskręconego plazmidowego DNA, kosmidów, oraz wektorów fagmidowych. Wektory te oraz plazmidowy DNA z dowolnego źródła mogą być oczyszczane. Ponadto, obecne w drożdżach i komórkach ssaka plazmidowy DNA i kosmidy mogą być również oczyszczone, ponieważ podobne mieszaniny zanieczyszczeń, łącznie z endotoksynami, RNA, białkami i chromosomalnym DNA mogą być obecne w tych preparatach. Ze względu na fakt, że istnieje także zapotrzebowanie na otrzymywanie superskręconych postaci plazmidowego i kosmidowego DNA z tych źródeł opisane niniejszym sposoby mogą być stosowane do oczyszczania DNA w wielu z tych zastosowań.
„Podłoże oddziaływań hydrofobowych” jest materiałem obejmującym (a) ugrupowanie stanowiące nośnik oraz (b) ugrupowanie hydrofobowe przyłączone pośrednio lub bezpośrednio do ugrupowania stanowiącego nośnik. Przykłady ugrupowań nośnikowych oraz hydrofobowych są niniejszym opisane oraz są znane w dziedzinie. Ugrupowanie hydrofobowe zapewnia wybiórcze wiązanie w opisanych tu sposobach rozdziału. Różne przykłady „podłoża oddziaływań hydrofobowych” są znane w dziedzinie oraz opisane niniejszym. Inne stosowane tu określenia, takie jak „żywica”, „matryca”, „kolumna”, „podłoże”, „perełki” i „ligand oddziaływania hydrofobowego”, także oznaczają podłoże oddziaływań hydrofobowych i jego przykłady.
„DNA” oznacza dowolną postać kwasu dezoksyrybonukleinowego, w tym, choć niewyłącznie, plazmidowy (superskręcony i/lub rozluźniony lub cięty), kosmidowy albo DNA sztucznego chromosomu.
Określenie „cięty” albo „rozluźniony” DNA oznacza DNA, który nie jest superskręcony. „Superskręcony” DNA jest określeniem dobrze rozumianym w dziedzinie.
Określenie „zanieczyszczenie” oznacza dowolną substancję, z której należy oddzielić albo odizolować DNA. Zanieczyszczenia obejmują, ale nie ograniczają się do białek komórki gospodarza, endotoksyn, DNA i/lub RNA komórki gospodarza. Należy rozumieć, że to co jest uważane za zanieczyszczenie zależy od sytuacji, w której stosowane są sposoby według wynalazku. „Zanieczyszczenie” może, ale nie musi pochodzić z komórki gospodarza, tj. może, ale nie musi być zanieczyszczeniem komórkowym z komórki gospodarza.
„Izolowanie” albo „oczyszczanie” pierwszego składnika (takiego jak DNA) oznacza wzbogacenie pierwszego składnika spośród innych składników, z którymi pierwszy składnik początkowo występował. Zakres pożądanego i/lub możliwego do otrzymania oczyszczania jest niniejszym dostarczony. Korzystnie, sposoby według wynalazku prowadzą do około pięciokrotnego wzbogacenia, korzystnie do około dziesięciokrotnego wzbogacania, korzystnie do około dwudziestokrotnego wzbogacania, korzystnie do około pięćdziesięciokrotnego wzbogacania, korzystnie do około stukrotnego wzbogacania, korzystnie do około dwustukrotnego wzbogacania, korzystnie do około pięćsetkrotnego wzbogacania, korzystnie do około tysiąckrotnego wzbogacania. Alternatywnie stopień oczyszczania może być wyrażony jako zawartość procentowa pierwszego składnika w odniesieniu do innego składnika
PL 203 013 B1 lub w odniesieniu do powstającego preparatu. Przykłady zawartości procentowych są niniejszym dostarczone.
„Preferencyjne” lub „selektywne/wybiórcze” wiązanie lub usuwanie składnika oznacza, że w danych warunkach pierwszy składnik ulega związaniu lub jest usuwany w większym stopniu niż inny składnik.
Jak będzie to zrozumiane przez specjalistę w dziedzinie „usuwanie” lub „wiązanie” nie oznacza koniecznie, ani nieodzownie, całkowitego lub stuprocentowego usuwania lub wiązania.
Roztwór „wodny” zasadniczo oznacza roztwór, którego podstawę stanowi woda (tj. woda jest głównym rozpuszczalnikiem), co może, ale nie musi oznaczać, że woda stanowi 100% rozpuszczalnika.
Izolowanie plazmidowego DNA wytworzonego w rekombinowanych komórkach bakteryjnych obejmuje lizę komórek oraz usuwanie resztek komórkowych, co można zrealizować na szereg sposobów. Końcowy roztwór zawiera plazmidowy DNA oraz zazwyczaj wyjątkowo duże ilości endotoksyn wśród innych zanieczyszczeń. Sposoby według wynalazku zapewniają usunięcie znaczących ilości kluczowych zanieczyszczeń, takich jak RNA, genomowy DNA, białko i endotoksyny, z zastosowaniem chromatografii oddziaływań hydrofobowych jako pierwszego etapu, w którym plazmidowy DNA przepływa niezwiązany. Opisany niniejszym sposób może ewentualnie obejmować dializowanie roztworu mieszaniny uzyskanej z lizy bakteryjnej do buforu o pH w zakresie 6,8 do 8,5, korzystnie pH wynoszącego od 6,8 do 7,4, zawierającego korzystnie 2M siarczan amonu w obecności lub w nieobecności 10 mM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA), przepuszczanie ewentualnie dializowanego roztworu przez wypełnioną kolumnę chromatograficzną zawierającą podłoże chromatograficzne z ligandami oddziaływań hydrofobowych, takim jak dowolny spośród lub mieszanina grupy propylowej, butylowej, oktylowej lub heksylowej, która to kolumna korzystnie była wcześniej równoważona buforem o pH w zakresie od 6,8 do 8,5 (korzystnie 6,8 do 7,4) także zawierającym 2M siarczanu amonu wraz z lub w nieobecności 10 mM EDTA. Roztworem przepływającym jest zazwyczaj roztwór soli, na przykład siarczanu amonu, o stężeniu 2M, który w przeważającym stopniu zawiera plazmidowy DNA (mieszaninę superskręconego i rozluźnionego) z mniej niż 2% zanieczyszczeń. Zależnie od zmian wprowadzonych we wcześniejszych etapach, zawartość procentowa superskręconego DNA może zawierać się w zakresie od 50 do 95% wagowo, zazwyczaj około 75 do 85%, alternatywnie 80 do 85%, co wymaga dalszego oczyszczania, łącznie z usuwaniem rozluźnionego plazmidowego DNA z mieszaniny.
Sposoby według wynalazku umożliwiają wytworzenie oczyszczonego plazmidowego DNA, który wykazuje poziom endotoksyn poniżej specyficznego, tj. zazwyczaj <10 EU/mg plazmidowego DNA. Sposoby usuwania endotoksyn według wynalazku mogą być adaptowane w procesie wytwarzania na dużą lub niewielką skalę, umożliwiając ekonomiczne wytwarzanie materiału jakości terapeutycznej lub laboratoryjnej. Sposoby te wykorzystują selektywne wiązanie endotoksyn do żywic hydrofobowych opisanych niniejszym, które do wytwarzania na dużą skalę mogą wykazywać wydajność przekraczającą jeden milion jednostek na mililitr zastosowanej żywicy.
Tradycyjnie dostępne sposoby usuwania endotoksyn wykazują niską wydajność (1000 do 5000 EU/mililitr żywicy) i/lub prowadzą do odzyskiwania niewielkich ilości plazmidowego DNA i/lub wymagają stosowania czynników chemicznych i/lub nie mogą być bezpośrednio stosowane do wytwarzania materiałów o jakości terapeutycznej, (patent US nr 5747663). Sposoby usuwania endotoksyn według wynalazku wykorzystują zawieszanie roztworów zawierających endotoksyny i plazmidowy DNA w soli, np. siarczanie amonu lub chlorku sodu, w stężeniu około 2M, co powoduje, że endotoksyny stają się znacznie bardziej hydrofobowe niż plazmidowy DNA i zapewnia ich wiązanie lub preferencyjne oddziaływanie oraz rozdział na żywicy zawierającej ligandy oddziaływania hydrofobowego, takie jak grupa butylowa, oktylową i/lub heksylową, w porównaniu z plazmidowym DNA. Stężenie soli stosowane może być korzystnie zoptymalizowane do wiązania RNA, białek i endotoksyn. Niższe stężenie soli może być wystarczające, aby zapewnić wiązanie samych endotoksyn, ponieważ endotoksyny mają wyższe powinowactwo do opisanych tu ligandów oddziaływań hydrofobowych.
Atrakcyjną cechą niniejszego sposobu usuwania endotoksyn, oprócz jego prostoty i >95% odzyskiwania plazmidowego DNA, jest ogromna wydajność żywicy wobec endotoksyny, wynosząca około 1000000 EU/ml żywicy. Na przykład, roztwór plazmidowego DNA zawierający 500 mg plazmidu i 10 milionów EU endotoksyny może być oczyszczony z zastosowaniem 10 ml żywicy, podczas gdy około 1000 do 4000 ml żywicy jonowymiennej byłoby wymagane do związania plazmidowego DNA i endotoksyny, nie wspominając juz o innych niedogodnościach wynikających z zastosowania takiej żywicy jonowymiennej, takich jak niski poziom odzysku. Sposób według wynalazku prowadzi zatem do
PL 203 013 B1
100 - 400 krotnych oszczędności w kosztach żywicy i dodatkowych oszczędności w związku z kosztami kolumny oraz zwiększonym poziomem odzyskiwania produktu. Handlowo dostępna żywica DNA Etox jest obecnie ponad ośmiokrotnie droższa niż żywica stosowana w sposobie według wynalazku. Inna dostępna na rynku żywica (PolyFlo-PureSyn Inc., 87 Great Vally Pkwy, Malvern, PA 19355), działająca w oparciu o chronioną technologię użyteczną do usuwania endotoksyny, jest 5 do 10 krotnie droższa i wymaga zastosowania rozpuszczalników oraz środków chemicznych tworzących pary jonowe.
Sposoby według wynalazku dostarczają plazmidowy DNA o wysokiej jakości obejmujący ponad 90% superskręconego plazmidowego DNA z materiału wyjściowego niższej jakości (tj. materiału wyjściowego składającego się z mieszaniny rozluźnionego i superskręconego DNA). Ponadto sposoby według wynalazku mogą być stosowane w procesach na dużą skalę, które są zazwyczaj stosowane do wytwarzania plazmidowego DNA do terapii genowej. Sposoby według wynalazku umożliwiają wytwarzanie plazmidowego DNA wysokiej jakości w sposób niezawodny, niezależnie od zmian, które zazwyczaj prowadzą do zmniejszenia jakości, tj. generowania rozluźnionych/ciętych postaci plazmidowego DNA. Takie zmiany mogą następować podczas wzrostu bakterii wytwarzających plazmidowy DNA oraz podczas następujących kolejno etapów izolowania i oczyszczania.
Sposoby rozdzielania superskręconego i rozluźnionego plazmidowego DNA oraz sposoby rozdzielania plazmidowego DNA i endotoksyn według wynalazku mają podstawę w ujawnieniu, że postaci plazmidowego DNA oraz endotoksyny wykazują różne charakterystyki wiązania na chromatograficznych żywicach oddziaływania hydrofobowego, które na przykład zawierają ligandy alkilowe C4 do C10, rozgałęzione lub proste, a korzystnie zawierają albo ligand butylowy albo heksylowy. Ligandy te umożliwiają selektywne oddziaływanie i wiązanie, które jest wykorzystywane w sposobach rozdziału, oczyszczania i/lub izolowania według wynalazku. Specjalista w dziedzinie doceni, że żywice hydrofobowe mogą obejmować dodatkowo, albo w zamian, inne ligandy, co również będzie użyteczne w sposobach według wynalazku. Przykłady takich ligandów są również wskazane powyżej. Poniższe przykłady nieograniczająco ilustrują sposoby według wynalazku. Następujące ogólne metody były lub mogą być zastosowane.
Plazmidy do zastosowania w terapii genowej były po fermentacji ekstrahowane z odpowiedniego gospodarza bakteryjnego, na przykład z Escherichia coli. W poniższych przykładach ilustrujących ujawnienie wynalazku stosowano E. coli STBL-2 zawierające plazmid pE1A-K2. Plazmid pE1A-K2 jest plazmidem pochodnym pUC zawierającym gen supresorowy z adenowirusa Typu 5 oraz gen kanamycyny jako selekcyjny marker. Fermentację prowadzono w warunkach aerobowych w odpowiedniej pożywce - wyciąg drożdży/glukoza - zawierającej sole nieorganiczne, takie jak monozasadowy fosforan potasu, dwuzasadowy fosforan sodu, siarczan amonowy oraz siarczan magnezu, przy pH od 6,5 do 7,8, korzystnie 7,0, i w temperaturze 37°C. Napowietrzanie było ustalone w proporcji jedna objętość powietrza na objętość pożywki, a mieszanie ustawiono na 800 rpm. Komórki hodowano w takim trybie do momentu wykorzystania glukozy z pożywki. Następnie DO fermentatora było kontrolowane przez odżywianie glukozą oraz mieszanie. Odżywka zawierała stężony roztwór glukozy (160 g/l), wyciąg z drożdży (80 g/l) oraz sole (1,5 g/l siarczanu amonu, MgSO4, 1,5 g/l w buforze fosforanowym). Po zakończeniu fermentacji komórki zbierano przez odwirowanie lub filtrację przez membrany ultra i mikrofiltracyjne oraz przemywano buforem TE (patrz poniżej), pH 7,4. Komórki poddawano lizie przez doprowadzenie do kontaktu zawiesiny z równą objętością roztworu 0,15N do 0,2N NaOH oraz 1% dodecylosiarczanem sodu (pH 11,5 do 13) z jednoczesnym delikatnym mieszaniem. Zasadowy roztwór neutralizowano roztworem octanu potasu. Materiał następnie klarowano albo przez wirowanie, albo przez przepuszczanie zawiesiny przez szereg filtrów. Roztwory plazmidów zagęszczano przez ultrafiltrację oraz diafiltrowano względem buforu TE, pH 7. Retentat diafiltrowania może być nakładany na podłoże opisane niniejszym.
Zawartość plazmidowego DNA lizatu jest zazwyczaj mniejsza niż 2% całkowitej ilości kwasu nukleinowego, przy czym większość składników stanowią RNA i chromosomalny DNA. Ponadto lizat jest zanieczyszczony endotoksynami i białkami komórkowymi.
Niniejszy wynalazek dostarcza również sposobów wytwarzania izolowanego lub oczyszczonego DNA na małą skalę oraz skalę laboratoryjną. Opisano niniejszym również aparaturę - kolumny oraz separatory użyteczne w sposobach według wynalazku. Specjalista w dziedzinie doceni, że wytwarzanie plazmidowego DNA na małą skalę prezentuje odmienne wyzwania niż wytwarzanie na dużą skalę. W szczególności rozdział na małą skalę wymaga oddzielenia większej proporcji zanieczyszczenia RNA w materiale wyjściowym. Podczas gdy proporcja plazmidu do RNA w materiale wyjściowym stosowanym w sposobie na dużą skalę może wynosić około 2% wagowo, jak wskazano powyżej.
PL 203 013 B1
Proporcja ta w procesie prowadzonym na małą skalę wynosi około 0,1% wagowo. Ponadto objętość hodowli w próbkach na małą skalę wynoszą zazwyczaj około 2 ml do około 2 l, w przeciwieństwie do około 5 l do 1000 l przy prowadzeniu rozdziału na dużą skalę. W rozdzielaniu na małą skalę według wynalazku bierze udział około 100 μg do około 1 mg plazmidu z reaktorem lub objętością złoża kolumny wynoszącą od 1 do około 20 ml; zazwyczaj w zakresie od około 10 do około 15 ml. Wynalazek dostarcza zatem wydajnego sposobu wytwarzania na małą skalę izolowanego i/lub oczyszczanego DNA, korzystnie superskręconego DNA, oczyszczonego od zanieczyszczeń, takich jak endotoksyna, RNA i rozluźniony DNA. O ile możliwe różne procedury są stosowane w przykładzie realizacji, specjalista w dziedzinie zauważy, że inne sposoby przygotowawcze i materiały wyjściowe można również zastosować w obecnie ujawnionym wynalazku.
P r z y k ł a d 1:
Usuwanie endotoksyny przy użyciu chromatografii oddziaływania hydrofobowego z grupami butylowymi (mała skala)
Komórki E. coli niosące plazmid pE1A-K2 hodowano i poddawano lizie sposobem chemicznym, po czym klarowano lizat przez filtrację. Wszystkie stosowane bufory filtrowano przez filtr 0,2 um, zaś próbki endotoksyny przechowywano w probówkach polistyrenowych.
Retentat z diafiltracji (około 400 ml) dializowany wobec TE pH 7,4 (50 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 7,4) zastosowano do dalszych doświadczeń. Siarczan amonu (AS) konieczny do sporządzenia 2M roztworu dodano do 100 ml TE zawierającego 2M AS, bufor o pH 7,4, i częściowo rozpuszczono. Roztwór dodano do dializowanej próbki uzyskując objętość końcową 575 ml, z której 475 ml stosowano w doświadczeniu.
Kolumnę butylową 650S (żywica Butyl 650S, TosoHaas, Inc., 156 Keystone Drive, Montgomeryvile, PA) o średnicy 2,6 cm, wysokości złoża 15 cm, i objętości złoża około 75 ml upakowano i zrównoważono buforem TE, pH 7,4, zawierającym 2M AS. Próbkę załadowano przy prędkości przepływu równej 5 ml/min. Frakcję przepływającą zebrano i pobrano próbki do analizy (stężenie DNA, żel agarozowy i test endotoksynowy). Test endotoksynowy wykonano za pomocą ostrza, a próbki rozcieńczono odpowiednio, aby otrzymać PPC (pozytywną kontrolę produktu, ang. positive produkt control) w zakresie uważanym za dopuszczalny. Stężenia endotoksyny oznaczono stosując test BioWhittaker Kinetic QCL Chromogenic LAL, jak opisany w publikacji nr P50-650U-5, w instrukcji obsługi do zestawu Kinetic-QLC. Po załadowaniu próbki, przepuszczono przez kolumnę TE zawierający 2M siarczan amonu, który zbierano i próbkowano. Następnie kolumnę płukano TE o pH 7,4, wodą oczyszczoną USP, i czyszczono 0,5N wodorotlenkiem sodu. Po czym płukano >15 objętościami wody oczyszczonej USP. Endotoksyna występowała w każdej z płukanek, jak przedstawiono w Tabeli 1 poniżej. Oprócz znakomitej skuteczności w usuwaniu endotoksyny, usunięta została znaczna ilość RNA, białek oraz fragmentów DNA, pozostawiając próbkę zasadniczo oczyszczoną.
T a b e l a 1
| Próbka | stęż. DNA (mg/ml) | Endotoksyna EU/ml | Całkowita liczba jednostek EU | % endotoksyny | EU na mg DNA |
| załadowana | 0,7 | 472200 | 22400000 | 100 | 674571 |
| przepływająca | 0,38 | 1,64 | 771 | 0,003 | 4,31 |
| płukanka | 0,56 | 7,48 | 1196 | 0,005 | 13,42 |
Pojemność względem endotoksyny na ml żywicy: 3 mln EU/ml
Obniżenie zawartości endotoksyny w próbce: 99,992%
P r z y k ł a d 2:
Usuwanie endotoksyny przy użyciu chromatografii oddziaływań hydrofobowych z grupami butylowymi (duża skala)
Komórki E. coli niosące plazmid pE1A-K2 hodowano i poddawano lizie sposobem chemicznym, po czym klarowano lizat przez filtrację.
Retentat diafiltracji (około 650) dializowano wobec TE pH 7,4 (50 mM Tris, 10 mM EDTA, pH 7,4 regulowano przez dodanie HCl), a siarczan amonu (AS) konieczny do sporządzenia 2M roztworu dodano do 1200 ml bufor o pH 7,4 TE zawierającego 2M AS, i rozpuszczono. Objętość tego
PL 203 013 B1 roztworu doprowadzono do 1300 ml. Roztwór ten dodano do dializowanej próbki uzyskując objętość końcową 1950 ml, i doprowadzając pH do 7,4 z zastosowaniem HCl.
Kolumnę butylową 650S (żywica Butyl 650S, TosoHaas, Inc., Montgomeryvile, PA) o średnicy 5 cm i wysokoś ci zł o ż a 15 cm, oraz obję tości okoł o 275 ml upakowano i zrównoważ ono buforem TE, pH 7,4, zawierającym 2M AS. Próbkę załadowano przy prędkości przepływu równej 20 ml/min. Frakcję przepływającą zebrano i pobrano próbki do analizy (stężenie DNA, żel agarozowy i test endotoksynowy jak opisano powyżej). Po załadowaniu próbki, przepuszczono przez kolumnę TE zawierający 2M siarczan amonu, który zebrano i próbkowano. Następnie kolumnę płukano buforem TE o pH 7,4, wodą oczyszczoną USP, i czyszczono 0,5N wodorotlenkiem sodu, po czym płukano >15 objętościami wody oczyszczonej USP. Endotoksyna występowała w każdej z płukanek, jak przedstawiono w Tabeli 2. Oprócz znakomitej skuteczności w usuwaniu endotoksyny, usunięta została znaczna ilość RNA, białek oraz fragmentów DNA, pozostawiając próbkę zasadniczo oczyszczoną.
T a b e l a 2
| Próbka | stęż. DNA (mg/ml) | Endotoksyna EU/ml | Całkowite EU | % endotoksyny | EU na mg DNA |
| załadowana | 1,59 | 271500 | 176475000 | 100 | 170754 |
| przepływająca + płukanka | 0,34 | <0,5 | 1325 | 0,007 | 1,45 |
Pojemność względem endotoksyny na ml żywicy: 0,64 mln EU/ml
Obniżenie zawartości endotoksyny w próbce; 99,993%
P r z y k ł a d 3:
Usuwanie endotoksyny przy użyciu chromatografii oddziaływania hydrofobowego z grupami heksylowymi (mała skala)
Komórki E. coli niosące plazmid pE1A-K2 hodowano i poddawano lizie sposobem chemicznym, po czym klarowano lizat przez odwirowanie. Nadsącz dializowano wobec 20 mM buforu fosforanu potasu (20 mM jednozasadowego fosforanu potasu z 20 mM dizasadowym fosforanem potasu w proporcjach umoż liwiających uzyskanie pH 6,8), pH 6,8 i siarczan amonu konieczny do sporzą dzenia 2M próbki dodano do 20 ml KPB (20 mM bufor fosforanu potasu) zawierającego 2M AS, pH 6,8 i rozpuszczono. Roztwór dodano do 5 ml dializowanej próbki uzyskując objętość końcową 25 ml, po czy pH dostosowano do 6,8.
Kolumnę heksylową 650C (TosoHaas) o średnicy 1,6 cm i wysokości złoża 4 cm i o objętości złoża około 8 ml upakowano i zrównoważono buforem KPB, pH 6,8, zawierającym 2M AS. Próbkę załadowano przy prędkości przepływu równej 2 ml/min. Frakcję przepływającą zebrano i pobrano próbki do analizy (stężenie DNA, żel agarozowy i test endotoksynowy, patrz wyżej). Po załadowaniu próbki, przepuszczono przez kolumnę TE zawierający 2M siarczan amonu, który zebrano i próbkowano. Następnie kolumnę przepłukano KPB z 2M siarczanem amonu, który zbierano. Następnie kolumnę płukano KPB o pH 6,8, wodą oczyszczoną USP, i czyszczono 0,5N wodorotlenkiem sodu, po czym płukano >15 objętościami wody oczyszczonej USP. Endotoksyna występowała w każdej z płukanek, jak przedstawiono w Tabeli 3. Oprócz znakomitej skuteczności w usuwaniu endotoksyny, usunięta została znaczna ilość RNA, białek oraz fragmentów DNA, pozostawiając próbkę zasadniczo oczyszczoną.
T a b e l a 3
| Próbka | stęż. DNA (mg/ml) | Endotoksyna EU/ml | Całkowita liczba jednostek EU | % endotoksyny | EU na mg DNA |
| załadowana | 2,43 | 593500 | 29675000 | 100 | 244238 |
| przepływająca + płukanka | 0,037 | 0,5 | 35 | 0,0001 | 14 |
Pojemność endotoksyny na ml żywicy: 3,7 mln EU/ml
Obniżenie zawartości endotoksyny w próbce: 99,999%
PL 203 013 B1
P r z y k ł a d 4:
Usuwanie endotoksyny przy użyciu chromatografii oddziaływania hydrofobowego z grupami oktylowymi (mała skala)
Komórki E. coli niosące plazmid pE1A-K2 hodowano i poddawano lizie sposobem chemicznym, po czym klarowano przez wirowanie, jak to opisano wyżej. Do doświadczeń zastosowano nadsącz. Siarczan amonu (AS) konieczny do sporządzenia 2M roztworu dodano do 20 ml TE z dodatkiem 2M AS, bufor o pH 7,4, i rozpuszczono. Roztwór dodano do 10 ml dializowanej próbki uzyskując objętość końcową 25 ml o pH 7,4.
Kolumnę oktylową Sepharose 4 Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) o średnicy 1,0 cm i wysokości złoża 10 cm, oraz o objętości złoża około 8 ml upakowano i zrównoważono buforem TE, pH 7,4, zawierającym 2M AS. Próbkę załadowano przy prędkości przepływu równej 2 ml/min. Frakcję przepływającą zebrano i pobrano próbki do analizy (stężenie DNA, żel agarozowy i test endotoksynowy). Po załadowaniu próbki, przepuszczono przez kolumnę TE zawierający 2M siarczan amonu, który zebrano i próbkowano. Następnie kolumnę przemywano TE o pH 7,4, wodą oczyszczoną USP, i czyszczono 0,5N wodorotlenkiem sodu, po czym płukano >15 objętościami wody oczyszczonej USP. Endotoksyna występowała w każdej z płukanek, jak przedstawiono w Tabeli 4.
T a b e l a 4
| Próbka | stęż. DNA (mg/ml) | Endotoksyna EU/ml | Całkowita liczba jednostek EU | % endotoksyny | EU na mg DNA |
| załadowana | 2,43 | 593500 | 59350000 | 100 | 244238 |
| przepływająca + płukanka | 0,037 | 32 | 2240 | 0,004 | 280 |
Pojemność endotoksyny na ml żywicy: 7,41 mln EU/ml
Obniżenie zawartości endotoksyny w próbce: 99,996%
P r z y k ł a d 5:
Rozdział postaci superskręconej i rozluźnionej plazmidowego DNA przy użyciu chromatografii oddziaływania hydrofobowego z grupami butylowymi - wymywanie gradientem
Komórki E. coli niosące plazmid pE1A-K2 hodowano i poddawano lizie sposobem chemicznym, po czym klarowano przez filtrację jak opisano powyżej. Zgrubne oczyszczanie plazmidowego DNA w celu usunięcia głównych zanieczyszczeń, takich jak endotoksyna, RNA, białko, chromosomalny DNA itp., przeprowadzono przez zastosowanie chromatografii oddziaływań hydrofobowych z zastosowaniem grup butylowych, przy czym przy 2M stężeniu siarczanu amonu, plazmidowy DNA przepływa przez kolumnę podczas gdy zanieczyszczenia ulegają związaniu na kolumnie (patrz, wyżej).
Frakcję przepływającą, zawierającą DNA dializowano i poddawano obróbce na kolumnie anionowymiennej (BioSepra), co nie zapewniało dodatkowego oczyszczania. Obróbka na kolumnie anionowymiennej Q i diafiltracja nie są konieczne do uzyskania rozdziału na kolumnie butylowej. Eluat z kolumny anionowymiennej Q poddano diafiltracji na regenerowanej membranie celulozowej 30 kDa (0,1 m2, Millipore Corporation). Dializowany materiał doprowadzono do 3M zawartości siarczanu amonu przy użyciu siarczanu amonu w postaci stałej.
Kolumnę butylową (Toyopearl Butyl 650S - TosoHaas) o średnicy 2,6 cm i około 15 cm wysokości upakowano przy przepływie 15-20 ml/min. Kolumnę zrównoważono 3M siarczanem amonu w buforze Tris-EDTA o pH 7,4. Próbkę załadowano przy przepływie 5 ml/min. Plazmid związano z kolumną przy stężeniu 3M siarczanu amonu. Kolumnę płukano 2-3 objętościami kolumny 3M siarczanu amonu w buforze. Następnie, kolumnę eluowano gradientem stężenia siarczanu amonu od 3M do 1M w 6 objętościach złoża. Podczas wymywania gradientem zaobserwowano obecność dwóch pików, pierwszy zawierał postać rozluźnioną plazmidowego DNA, zaś drugi zawierał postać superskręconą, co wykazano na żelu agarozowym (Fig. 4A). Chromatogram przedstawiono na Fig. 4B. Wyniki dalej potwierdzono testem HPLC w celu określenia zawartości procentowej obu frakcji (Tabela 5).
W granicach czuł o ś ci testu potwierdzono, ż e drugi pik zawierał 85% postaci superskręconej, podczas gdy materiał wyjściowy zawierał tylko 50-60% postaci superskręconej. Odzyskano przynajmniej 90% początkowej ilości superskręconego, plazmidowego DNA. Rozdzielczość pików była wystarczająca do przeprowadzenia rozdziału, nawet przy wysokości kolumny 15 cm. Pokazuje to skuteczny rozdział postaci superskręconej i rozluźnionej przy użyciu chromatografii oddziaływań hydroPL 203 013 B1 fobowych z grupami butylowymi. Oprócz znakomitego rozdziału, pozostałą ilość RNA, białka i endotoksyny można usunąć z produktu, który spełnia wymagania terapii genowej.
T a b e l a 5
| Próbka | % postaci superskręconej |
| Materiał wyjściowy | 63 |
| Frakcja piku 1 | 8 |
| Frakcja piku 2 | 83 |
P r z y k ł a d 6:
Rozdział postaci superskręconej i rozluźnionej plazmidowego DNA przy użyciu chromatografii oddziaływań hydrofobowych z grupami butylowymi - wymywanie gradientem na długiej kolumnie
Komórki E. coli niosące plazmid pE1A-K2 hodowano i poddawano lizie sposobem chemicznym, po czym klarowano przez filtrowanie jak opisano powyżej. Zgrubne oczyszczanie plazmidowego DNA w celu usunięcia głównych zanieczyszczeń, takich jak endotoksyna, RNA, białko, chromosomalny DNA itp., przeprowadzono przez zastosowanie chromatografii oddziaływań hydrofobowych z grupami butylowymi, przy czym przy 2M stężeniu siarczanu amonu plazmidowy DNA przepływa przez kolumnę, podczas gdy zanieczyszczenia ulegają związaniu na kolumnie (patrz, wyżej). Frakcję przepływającą, zawierającą plazmidowy DNA dializowano i poddawano obróbce na kolumnie anionowymiennej, co nie zapewniało dodatkowego oczyszczania. Eluat z kolumny Q poddano diafiltracji na regenerowanej membranie celulozowej 30 kDa. Dializowany materiał doprowadzono do 3M zawartości siarczanu amonu przy użyciu siarczanu amonu w postaci stałej, jak opisano w przykładzie 5.
Kolumnę butylową (Toyopearl Butyl 650S - TosoHaas) o średnicy 2,6 cm i około 30 cm wysokości upakowano przy przepływie 15-20 ml/min. Kolumnę zrównoważono 3M siarczanem amonu w buforze Tris-EDTA o pH 7,4. Próbkę załadowano przy przepływie 5 ml/min. Plazmid związano z kolumną przy stężeniu 3M siarczanu amonu. Kolumnę płukano 2-3 objętościami złoża 3M siarczanu amonu w buforze. Następnie, kolumnę wymywano gradientem stężenia siarczanu amonu od 3M do 1M w 6 objętościach złoża. Podczas wymywania gradientem zaobserwowano obecność dwóch pików, pierwszy zawierał postać rozluźnioną plazmidowego DNA, zaś drugi zawierał postać superskręconą, co wykazano na żelu agarozowym (Fig. 5A). Chromatogram przedstawiono na Fig. 5B. Wyniki dalej potwierdzono testem HPLC w celu określenia zawartości procentowej obu frakcji (Tabela 6).
W granicach czułości testu potwierdzono, że drugi pik zawierał 90% postaci superskręconej, podczas gdy materiał wyjściowy zawierał tylko 50% postaci superskręconej. Przy zastosowaniu długiej kolumny otrzymano rozdział pików przy linii tła. Przykład ten pokazuje skuteczny rozdział postaci superskręconej i rozluźnionej przy użyciu chromatografii oddziaływań hydrofobowych z grupami butylowymi. Oprócz znakomitego rozdziału, pozostałą ilość RNA, białka i endotoksyny można usunąć z produktu końcowego, który spełnia wymagania terapii genowej.
T a b e l a 6
| Próbka | % postaci superskręconej |
| Materiał wyjściowy | 53 |
| Frakcja 36 piku 1 | 15 |
| Frakcja 47 piku 2 | 83 |
| Frakcja 49 piku 2 | 95 |
| Frakcja 52 piku 2 | 91 |
P r z y k ł a d 7:
Rozdział postaci superskręconej i rozluźnionej plazmidowego DNA przy użyciu chromatografii oddziaływań hydrofobowych z grupami butylowymi - wymywanie etapowe na długiej kolumnie
Komórki E. coli niosące plazmid pE1A-K2 hodowano i poddawano lizie sposobem chemicznym, po czym klarowano przez filtrację jak opisano powyżej. Zgrubne oczyszczanie plazmidowego DNA w celu usunięcia głównych zanieczyszczeń, takich jak endotoksyna, RNA, białko, chromosomalny DNA itp., przeprowadzono przez zastosowanie chromatografii oddziaływań hydrofobowych z grupami
PL 203 013 B1 butylowymi, przy czym przy 2M stężeniu siarczanu amonu plazmid DNA przepływa przez kolumnę, podczas gdy zanieczyszczenia ulegają związaniu na kolumnie (patrz Przykład 1, wyżej). Frakcję przepływającą i płukanki zbierano i zatężano z zastosowaniem 30 kDa membrany ultrafiltracyjnej w procesie filtracji z przepływem stycznym. Zatężony roztwór plazmidowego DNA doprowadzano do 3M stężenia siarczanu amonu przy użyciu siarczanu amonu w postaci stałej.
Kolumnę butylową (Toyopearl Butyl 650S - TosoHaas) o średnicy 1 cm i około 30 cm wysokości upakowano przy przepływie 6 ml/min. Kolumnę zrównoważono 3M siarczanem amonu w buforze TrisEDTA o pH 7,4. Próbkę ładowano przy przepływie 2 ml/min. Plazmid ulegał związaniu na kolumnie przy stężeniu 3M siarczanu amonu. Kolumnę płukano 2-3 objętościami złoża 3M buforowanym roztworem siarczanu amonu. Następnie, kolumnę wymywano różnymi stężeniami siarczanu amonu - 2,8M, 2,7M, 2,6M, 2,55M, 2,5M, 2,4M, 1M - stosując 2-3 objętości kolumny. Piki zaobserwowano przy wymywaniu przy stężeniu 2,4M i 1M. Elektroforezę pików na żelu agarozowym przedstawiono na Fig. 6A. Żel wykazywał wyraźny rozdział postaci superskręconej i rozluźnionej. Eluent przy 2,4M zawiera postać rozluźnioną, podczas gdy eluent przy 1M zawiera superskręcony DNA. Chromatogram przedstawiono na Fig. 6B. Wyniki dalej potwierdzono testem HPLC w celu określenia zawartości procentowych obu frakcji (Tabela 7).
W granicach czułości testu potwierdzono, że drugi pik zawiera 93% postaci superskręconej, podczas gdy materiał wyjściowy zawierał tylko 62% postaci superskręconej. Wyniki te potwierdzono kolejnymi doświadczeniami, w których elucja przy 2,3M i 2,2M nie zapewniła rozdziału, zaś elucja przy 2,4M powtórnie potwierdziła istotne usuwanie postaci rozluźnionej, wzbogacając w ten sposób postać superskręconą podczas wymywania przy 1M. Rozdział uzyskany przez wymywanie skokowe jest istotny podczas rozdziału na dużą skalę, który może być wykonany bardziej niezawodnie z zastosowaniem wymywania skokowego. Przykład ten pokazuje skuteczny rozdział postaci superskręconej i rozluźnionej przy użyciu wymywania skokowego w chromatografii oddziaływań hydrofobowych z grupami butylowymi. Oprócz znakomitego rozdziału, pozostałą ilość RNA, białka i endotoksyny można usunąć z produktu końcowego, który spełnia wymagania terapii genowej.
T a b e l a 7
| Próbka | % postaci superskręconej |
| Materiał wyjściowy | 62 |
| Wymywanie przy 2,4M | 8 |
| Wymywania przy 1M | 93 |
P r z y k ł a d 8:
Rozdział postaci superskręconej i rozluźnionej plazmidowego DNA przy użyciu chromatografii oddziaływań hydrofobowych z grupami heksylowymi - wymywanie gradientem stężeń na długiej kolumnie
Komórki E. coli niosące plazmid pE1A-K2 hodowano i poddawano lizie sposobem chemicznym, po czym klarowano przez filtrowanie, jak opisano powyżej. Zgrubne oczyszczanie plazmidowego DNA w celu usunięcia głównych zanieczyszczeń, takich jak endotoksyna, RNA, białko, chromosomalny DNA itp., przeprowadzono przez zastosowanie chromatografii oddziaływań hydrofobowych z grupami butylowymi, przy czym przy 2M stężeniu siarczanu amonu plazmid DNA przepływa przez kolumnę, podczas gdy zanieczyszczenia ulegają związaniu na kolumnie (patrz np. Przykład 1, wyżej). Frakcję przepływającą, zawierającą DNA dializowano i poddawano obróbce na kolumnie anionowymiennej, co nie zapewniało dodatkowego oczyszczania. Eluent z kolumny Q poddawano diafiltracji z zastosowaniem regenerowanej membrany celulozowej 30 kDa. Dializowany materiał doprowadzono do stężenia 3M siarczanu amonu przy użyciu siarczanu amonu w postaci stałej (patrz powyżej).
Kolumnę heksylową (Toyopearl Butyl 650C - TosoHaas) o średnicy 1 cm i około 30 cm wysokości upakowano przy przepływie 5 ml/min. Kolumnę zrównoważono 3M siarczanem amonu w buforze Tris-EDTA o pH 7,4. Próbkę ładowano przy przepływie 2 ml/min. Plazmid ulegał związaniu na kolumnie przy stężeniu 3M siarczanu amonu. Kolumnę płukano 2-3 objętościami złoża 3M siarczanu amonu w buforze. Następnie, kolumnę eluowano gradientem stężenia siarczanu amonu od 3M do 1M w 6 objętościach kolumny. Podczas wymywania gradientem stwierdzono obecność dwóch pików, pierwszy zawierał głównie postać rozluźnioną plazmidowego DNA, zaś drugi zawierał głównie postać superskręconą, co wykazano dla frakcji na żelu agarozowym (Fig. 7A).
PL 203 013 B1
Chromatogram przedstawiono na Fig. 7B. Na podstawie elekroforezy na żelu agarozowym stwierdzono, że jakościowo drugi pik zawierał znacznie większą proporcję superskręconego plazmidu w porównaniu z materiałem wyjściowym. Uzyskano doskonałą zdolność rozdzielczą mimo faktu, że zastosowano perełki 100 um dla grup heksylowych w porównaniu z perełkami 35 um dla grup butylowych.
P r z y k ł a d 9:
Usuwanie endotoksyny przy użyciu chromatografii oddziaływania hydrofobowego z grupami butylowymi (z zastosowaniem chlorku sodu)
Komórki E. coli niosące plazmid pE1A-K2 hodowano i poddawano lizie sposobem chemicznym, po czym klarowano przez odwirowanie. W doświadczeniu zastosowano nadsącz. Próbkę oczyszczono na kolumnie anionowymiennej (Q Hyper D - Biosepra Inc.). W doświadczeniu do wymywania stosowano 2M chlorek sodu. Próbka znajdowała się w 50 mM buforze Tris, 10 mM EDTA, pH 7,4 z 2M NaCl. Kolumnę butylową 650S (żywica Butyl 650S, TosoHaas) o średnicy 1 cm i wysokości 20 cm, oraz o objętości około 10 ml upakowano i zrównoważono buforem TE, pH 7,4, zawierającym 2M chlorek sodu. Próbkę załadowano przy prędkości przepływu równej 2 ml/min. Frakcję przepływającą zebrano i próbki pobrano do analizy (stężenie DNA, żel agarozowy i test endotoksynowy). Po załadowaniu próbki, przepuszczono przez kolumnę TE zawierający 2M siarczan amonu i zebrano próbki. Następnie kolumnę przemywano TE o pH 7,4.
T a b e l a 8
| Próbka | stęż. DNA (mg/ml) | Endotoksyna EU/ml | Całkowita liczba jednostek EU | % endotoksyny | EU na mg DNA |
| załadowana | 0,27 | 642 | 16050 | 100 | 2377 |
| płukanka | 0,13 | 5 | 350 | 2 | 38 |
Pojemność endotoksyny na ml żywicy: 1570 EU/ml
Obniżenie zawartości endotoksyny w próbce: 98%
P r z y k ł a d 10:
Oczyszczanie plazmidu na małą skalę przez chromatografię oddziaływań hydrofobowych z grupami butylowymi
Oczyszczanie plazmidowego DNA na małą skalę przeprowadzono przy użyciu zestawów dostępnych na rynku, z których najbardziej znany jest Miniprep z Qiagen. Opisane tu sposoby można zastosować do oczyszczania plazmidowego DNA wykazując zalety wobec zestawów dostępnych komercyjnie. Poniższy przykład pokazuje zastosowanie chromatografii oddziaływań hydrofobowych według wynalazku do oczyszczania plazmidowego DNA na małą skalę.
Materiał wyjściowy do oczyszczania uzyskano standardowym sposobem. W szczególności, E. coli niosące plazmid wielkości około 4,65 Kb hodowano w bulionie Luria zawierającym 100 ug/ml ampicyliny w 37°C. Komórki zebrano przy OD równej 2,7. Komórki odzyskano z pożywki przez odwirowanie. Następnie, osad komórkowy zawieszono w 50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, pH 8,0. Dodano równą objętość roztworu 200 mM NaOH, 1% SDS, zmieszano dokładnie i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Etap ten prowadzi do lizy komórek i uwolnienia zawartości komórek, w tym plazmidowego DNA. Roztwór do neutralizacji zawierający 3,1M octanu potasu (pH 5,5) dodano w równej (wyjściowej) objętości i dobrze zmieszano. Zneutralizowany lizat filtrowano przez tkaninę serowarską i filtry w celu usunięcia osadu. Sklarowany lizat wytrącono 70% izopropanolem (dodając
2,1 ml izopropanolu na 3 ml sklarowanego lizatu). Osad oddzielono przez odwirowanie i płukano 70% etanolem, suszono i rozpuszczono w 10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0. Preparat zamrożono w -20°C i stosowano jako materiał wyjściowy do doświadczeń nad oczyszczaniem.
Kolumnę Butyl 650S o objętości złoża 20 ml i wysokości złoża 10 cm i średnicy 1,6 cm (Pharmacia XK16/20) upakowano i zrównoważono 2,2M siarczanem amonu (AS) w 50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA (TE) pH 7,4. Próbkę do załadowania wytworzono przez dodanie siarczanu amonu w postaci stałej do stężenia końcowego 2,2M. Próbkę rozcieńczono 2,2M AS w Tris-EDTA, pH 7,4 do 10 ml.
Warunki oczyszczania były dopasowane, aby było możliwe zebranie plazmidowego DNA we frakcji przepływającej i związanie zanieczyszczeń z żywicą.
Próbkę załadowano przy prędkości 2 ml/min i zbierano frakcję przepływającą. Kolumnę płukano 35 ml 2,2M AS w buforze TE i zbierano frakcje z 1 płukania (10 ml), 2 płukania (14,5 ml) i 3 płukania
PL 203 013 B1 (10 ml). W trakcie płukania stwierdzono obecność piku. Kolumnę eluowano 55 ml 1M AS w buforze TE, pH 7,4 i zbierano jako 1 płukanie 1M (10 ml) i 2 płukanie 1M (45 ml). W trakcie wymywania 1M AS stwierdzono obecność piku. Kolumnę eluowano 50 ml wody oczyszczonej USP. Powstał pik. Poniższa
Tabela przestawia całkowity kwas nukleinowy występujący w powyższych frakcjach. Stężenia obliczono na podstawie absorbancji przy 260 nm (Stęż. (pg /ml) = A260*50).
T a b e l a 9
| Frakcja z kolumny | Stęż. (pg /ml) | Ciężar (pg) |
| próbka wprowadzona | 550,0 | 5503 |
| 1 płukanie | 7,6 | 76 |
| 2 płukanie | 40,4 | 607 |
| 3 płukanie | 5,0 | 50 |
| pula płukań (DNA) | 20,9 | 733 |
| elucja 1M | 35,8 | 1611 |
| elucja wodą | 30,5 | 1523 |
Przeprowadzono elektroforezę próbek na żelu agarozowym. Fig. 8 przedstawia fotokopię żelu. Plazmidowy DNA występuje we frakcjach płukania (ścieżka 3, 4, 5). W porównaniu z próbką wprowadzaną (ścieżka 2), nie widać RNA we frakcjach płukania. Elucja frakcji zawierających RNA widoczna jest na ścieżce 6 i 7. Pomiar endotoksyny w puli płukań wykonano stosując test endotoksynowy Kinetic QCL. Nie stwierdzono obecności endotoksyny w próbce w granicach czułości testu wynoszącej 0,005 EU/ml. Wydajność plazmidu wynosi 733 μg ze 100 ml hodowli, co stanowi wartość podobną do uzyskiwanej z zastosowaniem zestawów dostępnych na rynku.
Zawartość cytowanych tu odnośników włączona jest w całości na drodze odniesienia: Wytwarzanie plazmidowego DNA jakości farmaceutycznej, Magda Marquet, Nancy Horn, Jeimifer Meek, Gregg Budahazi, patent US m 5561064; Zatężanie i frakcjonowanie ze względu na wielkość kwasów nukleinowych i wirusów w podłożu porowatym. Cole Kenneth D., patent US nr 5707850; Oczyszczanie plazmidowego DNA podczas chromatografii kolumnowej, Nancy Horn, Greg Budahazi, Magda Marqeut, patent US m 5707812.
Claims (3)
1. Sposób oczyszczania plazmidowego DNA z mieszaniny zawierającej przynajmniej jedno zanieczyszczenie z komórki gospodarza, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:
a) wytworzenia roztworu przez dodanie odpowiedniej soli do mieszaniny w celu umożliwienia wybiórczego wiązania przynajmniej jednego zanieczyszczenia z komórki gospodarza z podłożem oddziaływań hydrofobowych;
b) doprowadzenia do kontaktu tego roztworu zawierającego plazmidowy DNA z podłożem oddziaływań hydrofobowych w warunkach umożliwiających związanie się przynajmniej jednego zanieczyszczenia z komórki gospodarza z podłożem oddziaływań hydrofobowych z wytworzeniem kompleksu; oraz
c) zebrania niezwiązanego w kompleksie plazmidowego DNA;
przy czym sposób przeprowadza się pod nieobecność rozpuszczalników organicznych, detergentów, glikoli, heksaaminakobaltu, spermidyny i poliwinylopirolidonu.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przynajmniej jedno zanieczyszczenie z komórki gospodarza jest wybrane z grupy obejmującej RNA, endotoksynę, chromosomalny DNA i białko.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przynajmniej jedno zanieczyszczenie z komórki gospodarza jest endotoksyną.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że sól obejmuje anion albo kation wybrany z grupy obejmującej octan, fosforan, węglan, SO4 2-, Cl-, Br-, NO3-, Mg2+, Li+, Na+, K+ i NH4+.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że solą jest siarczan amonu w stężeniu od 2M do 4M.
PL 203 013 B1
6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że siarczan amonu występuje w stężeniu 2M.
7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że roztwór zawiera sole sodowe w stężeniu od 2M do 4M.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że solą sodową jest chlorek sodu.
9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że solą sodową jest chlorek sodu w stężeniu 2M.
10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że pH roztworu jest w zakresie od 6,8 do 7,4.
11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że pH roztworu wynosi 7,4.
12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że podłoże oddziaływań hydrofobowych obejmuje podłoże chromatograficzne z dołączonymi grupami hydrofobowymi.
13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że dołączone grupy wybrane są z grupy obejmującej grupy alkilowe C3 do C10 i ich mieszaniny.
14. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że podłoże oddziaływań hydrofobowych jest wybrane z grupy obejmującej szkielet polimeru metakrylanowego lub kopolimeru związany z przynajmniej jedną propylową, butylową, heksylową, oktylową, nonylową albo decylową grupą hydrofobową.
15. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że podłoże zawiera przynajmniej jeden szkielet kopolimeru metakrylanu i glikolu etylenowego lub szkielet sieciowanej agarozy.
16. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że podłoże jest w postaci perełek o wielkości w zakresie od 15 do 100 μm.
17. Sposób oddzielania superskręconego plazmidowego DNA z mieszaniny superskręconego i rozluźnionego plazmidowego DNA i ewentualnie, przynajmniej jednego zanieczyszczenia z komórki gospodarza, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:
a) wytworzenia roztworu przez dodanie soli do mieszaniny superskręconego i rozluźnionego plazmidowego DNA i ewentualnie, przynajmniej jednego zanieczyszczenia z komórki gospodarza;
b) doprowadzenia do kontaktu tego roztworu z podłożem oddziaływań hydrofobowych w początkowych warunkach, w których superskręcony i rozluźniony plazmidowy DNA wiążą się z podłożem oddziaływań hydrofobowych z wytworzeniem pierwszej związanej mieszaniny;
c) zmiany początkowych warunków wokół pierwszej związanej mieszaniny na drugie warunki, w celu uwolnienia rozluźnionego plazmidowego DNA z pierwszej związanej mieszaniny, z wytworzeniem oddzielnych składników zawierających drugą związaną mieszaninę i uwolniony rozluźniony plazmidowy DNA; oraz
d) modyfikowania drugich warunków wokół drugiej związanej mieszaniny na trzecie warunki, w celu usunięcia superskręconego plazmidowego DNA z drugiej związanej mieszaniny z wytworzeniem oddzielnych składników zawierających podłoże oddziaływań hydrofobowych i uwolniony superskręcony plazmidowy DNA.
18. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że przynajmniej jedno zanieczyszczenie z komórki gospodarza jest wybrane z grupy obejmującej RNA, endotoksynę, chromosomalny DNA i białko.
19. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że przynajmniej jedno zanieczyszczenie z komórki gospodarza jest endotoksyną.
20. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że podłoże oddziaływań hydrofobowych obejmuje podłoże chromatograficzne z dołączonymi grupami hydrofobowymi.
21. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że dołączone grupy wybrane są z grupy obejmującej grupy alkilowe C3 do C10 i ich mieszaniny.
22. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że podłoże oddziaływań hydrofobowych jest wybrane z grupy obejmującej szkielet polimeru metakrylanowego lub kopolimeru związany z przynajmniej jedną grupą propylową, butylową, heksylową, oktylową, nonylową lub ich mieszaniną jako dołączonymi grupami hydrofobowymi.
23. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że podłoże zawiera przynajmniej jeden szkielet kopolimeru metakrylanu i glikolu etylenowego lub sieciowaną agarozę.
24. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że podłoże jest w postaci perełek o wielkości w zakresie od 15 do 100 μm.
25. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że sól obejmuje anion albo kation wybrany z grupy obejmującej octan, fosforan, węglan, SO4 2-, Cl-, Br-, NO3-, Mg2+, Li+, Na+, K+ i NH4+.
26. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że solą jest siarczan amonu w stężeniu od 2,5M do 4M.
27. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że początkowe warunki obejmują równoważenie podłoża w etapie (b) roztworem soli zawierającym siarczan amonu w stężeniu od 2,5M do 4M.
PL 203 013 B1
28. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że drugie warunki obejmują przemywanie podłoża roztworem soli zawierającym siarczan amonu w stężeniu od 2,35M do 2,45M.
29. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że trzecie warunki obejmują przemywanie drugiej związanej mieszaniny roztworem soli zawierającym siarczan amonu w stężeniu od 1M do 2,3M.
30. Sposób według zastrz. 17, znamienny tym, że zmiana i modyfikacja są połączone w ciągły proces obejmujący elucję rozluźnionego plazmidowego DNA i superskręconego plazmidowego DNA w gradiencie przez zmieszanie pierwszej związanej mieszaniny z roztworem zawierającym siarczan amonu o ciągle zmieniającym się stężeniu siarczanu amonu, przy czym stężenie zmienia się od 3M do 1M siarczanu amonu, zaś rozluźniony plazmidowy DNA zbiera się w pierwszej eluowanej objętości, a superskręcony DNA zbiera się w drugiej eluowanej objętoś ci.
31. Sposób oddzielania endotoksyny od plazmidowego DNA, znamienny tym, że obejmuje doprowadzenie do kontaktu mieszaniny endotoksyny i plazmidowego DNA z podłożem oddziaływań hydrofobowych w warunkach, w których endotoksyna wiąże się z podłożem oddziaływań hydrofobowych z wytworzeniem kompleksu, oraz oddzielenie plazmidowego DNA od kompleksu.
32. Sposób według zastrz. 31, znamienny tym, że warunki obejmują zawartość soli, której anion albo kation wybrany z grupy obejmującej octan, fosforan, węglan, SO42-, Cl-, Br-, NO3-, Mg2+, Li+, Na+, K+ i NH4 +.
33. Sposób według zastrz. 31, znamienny tym, że mieszanina ponadto zawiera sól amonową w stężeniu od 1,5M do 4M.
34. Sposób według zastrz. 33, znamienny tym, że solą amonową jest siarczan amonu, który występuje w stężeniu 2M.
35. Sposób według zastrz. 31, znamienny tym, że podłoże oddziaływań hydrofobowych obejmuje podłoże chromatograficzne z dołączonymi grupami hydrofobowymi.
36. Sposób według zastrz. 35, znamienny tym, że dołączone grupy wybrane są z grupy obejmującej grupy alkilowe C3 do C10 i ich mieszaniny.
37. Sposób według zastrz. 35, znamienny tym, że podłoże oddziaływań hydrofobowych jest wybrane z grupy obejmującej szkielet polimeru metakrylanowego albo kopolimeru związany z przynajmniej jedną grupą propylową, butylową, heksylową, oktylową, nonylową lub ich mieszaniną jako dołączonymi grupami hydrofobowymi.
38. Sposób według zastrz. 35, znamienny tym, że podłoże zawiera przynajmniej jeden szkielet kopolimeru metakrylanu i glikolu etylenowego lub sieciowaną agarozę.
39. Sposób według zastrz. 35, znamienny tym, że podłoże jest w postaci perełek o wielkości w zakresie od 15 do 100 μ m.
40. Sposób według zastrz. 31, znamienny tym, że pH roztworu jest w zakresie od 6,8 do 7,4.
41. Sposób według zastrz. 40, znamienny tym, że pH roztworu wynosi 7,4.
42. Sposób oddzielania superskręconego plazmidowego DNA od rozluźnionego plazmidowego DNA, znamienny tym, że obejmuje doprowadzenie do kontaktu mieszaniny superskręconego plazmidowego DNA i rozluźnionego plazmidowego DNA z podłożem oddziaływań hydrofobowych w początkowych warunkach, w których zarówno superskręcony jak i rozluźniony plazmidowy DNA wiążą się z podł o ż em oddział ywań hydrofobowych z wytworzeniem pierwszej zwi ą zanej mieszaniny, zmianę początkowych warunków wokół pierwszej związanej mieszaniny na warunki drugie, w celu usunięcia rozluźnionego plazmidowego DNA z pierwszej związanej mieszaniny z wytworzeniem oddzielnych składników zawierających drugą związaną mieszaninę i uwolniony rozluźniony plazmidowy DNA, oraz modyfikowanie drugich warunków wokół drugiej związanej mieszaniny na trzecie warunki, w celu usunięcia superskręconego plazmidowego DNA z drugiej związanej mieszaniny z wytworzeniem oddzielnych składników obejmujących podłoże oddziaływań hydrofobowych i uwolniony superskręcony plazmidowy DNA;
przy czym sposób przeprowadza się pod nieobecność rozpuszczalników organicznych, detergentów, glikoli, heksaaminakobaltu, spermidyny i poliwinylopirolidonu.
43. Sposób według zastrz. 42, znamienny tym, że podłoże oddziaływań hydrofobowych obejmuje podłoże chromatograficzne z dołączonymi grupami hydrofobowymi.
44. Sposób według zastrz. 43, znamienny tym, że dołączone grupy wybrane są z grupy obejmującej grupy alkilowe C3 do C10 i ich mieszaniny.
45. Sposób według zastrz. 42, znamienny tym, że podłoże oddziaływań hydrofobowych stanowi szkielet polimeru metakrylanowego lub kopolimeru związany z przynajmniej jedną propylową, butylową, pentylową, heksylową, heptylową, oktylową, nonylową albo decylową grupą hydrofobową.
PL 203 013 B1
46. Sposób według zastrz. 42, znamienny tym, że podłoże oddziaływań hydrofobowych stanowi przynajmniej jeden szkielet kopolimeru metakrylanu i glikolu etylenowego lub sieciowana agaroza.
47. Sposób według zastrz. 42, znamienny tym, że podłoże oddziaływań hydrofobowych jest w postaci perełek o wielkości w zakresie od 15 do 100 um.
48. Sposób według zastrz. 42, znamienny tym, że początkowe warunki obejmują równoważenie podłoża roztworem soli zawierającym siarczan amonu o stężeniu w zakresie od 2,5M do 4M.
49. Sposób według zastrz. 48, znamienny tym, że drugie warunki obejmują przemywanie pierwszej związanej mieszaniny roztworem soli zawierającym siarczan amonu w stężeniu od 2,35M do 2,45M.
50. Sposób według zastrz. 49, znamienny tym, że trzecie warunki obejmują przemywanie drugiej związanej mieszaniny roztworem soli zawierającym siarczan amonu w stężeniu od 1M do 2,3M.
51. Sposób według zastrz. 42, znamienny tym, że zmiana i modyfikacja są połączone w ciągły proces obejmujący elucję rozluźnionego plazmidowego DNA i superskręconego plazmidowego DNA w gradiencie przez zmieszanie pierwszej związanej mieszaniny z roztworem zawierającym siarczan amonu o ciągle zmieniającym się stężeniu siarczanu amonu, przy czym stężenie zmienia się od 3M do 1M siarczanu amonu, zaś rozluźniony plazmidowy DNA zbiera się w pierwszej eluowanej objętości, a superskręcony DNA zbiera się w drugiej eluowanej objętości.
52. Sposób według zastrz. 42, znamienny tym, że oddzielny składnik zawierający uwolniony rozluźniony plazmidowy DNA lub superskręcony DNA zbiera się i izoluje.
53. Sposób wzbogacania ilości superskręconego DNA względem rozluźnionego DNA, znamienny tym, że obejmuje:
1) poddanie mieszaniny zawierającej superskręcony DNA i rozluźniony DNA oddziaływaniu z podłożem oddziaływań hydrofobowych, obejmującym ugrupowanie alkilowe w warunkach, w których superskręcony DNA w sposób uprzywilejowany wiąże się z podłożem oddziaływań hydrofobowych;
2) traktowanie podłoża oddziaływań hydrofobowych, zawierającego superskręcony i rozluźniony DNA w warunkach, które umożliwiają wybiórcze usuwanie rozluźnionego DNA; oraz
3) eluowanie superskręconego DNA z podłoża oddziaływań hydrofobowych;
przy czym sposób przeprowadza się pod nieobecność rozpuszczalników organicznych, detergentów, glikoli, heksaaminakobaltu, spermidyny i poliwinylopirolidonu.
54. Sposób usuwania lipopolisacharydu (LPS) z kompozycji zawierającej DNA, znamienny tym, że obejmuje:
1) poddanie mieszaniny zawierającej DNA i LPS oddziaływaniu z podłożem oddziaływań hydrofobowych, obejmującym ugrupowanie alkilowe, w warunkach, w których LPS w sposób uprzywilejowany wiąże się z podłożem oddziaływań hydrofobowych; oraz
2) traktowanie podłoża oddziaływań hydrofobowych, zawierającego DNA i LPS w warunkach, które umożliwiają wybiórcze usuwanie DNA.
55. Sposób wzbogacania ilości superskręconego DNA względem rozluźnionego DNA, znamienny tym, że obejmuje:
a) wytworzenie roztworu przez dodanie soli do mieszaniny superskręconego DNA i rozluźnionego DNA;
b) doprowadzenie do kontaktu tego roztworu z podłożem oddziaływań hydrofobowych w początkowych warunkach, w których superskręcony i rozluźniony plazmidowy DNA wiążą się z podłożem oddziaływań hydrofobowych z wytworzeniem pierwszej związanej mieszaniny;
c) zmianę początkowych warunków wokół pierwszej związanej mieszaniny na drugie warunki, w celu uwolnienia rozluźnionego plazmidowego DNA z pierwszej mieszaniny związanej, z wytworzeniem oddzielnych składników zawierających drugą związaną mieszaninę i uwolniony rozluźniony plazmidowy DNA; oraz
d) modyfikowanie drugich warunków wokół drugiej związanej mieszaniny na trzecie warunki w celu usunięcia superskręconego plazmidowego DNA z drugiej związanej mieszaniny z wytworzeniem oddzielnych składników zawierających podłoże oddziaływań hydrofobowych i uwolniony superskręcony plazmidowy DNA.
56. Sposób według zastrz. 55, znamienny tym, że podłoże oddziaływań hydrofobowych obejmuje podłoże chromatograficzne z dołączonymi grupami hydrofobowymi.
57. Sposób według zastrz. 56, znamienny tym, że dołączone grupy wybrane są z grupy obejmującej grupy alkilowe C3 do C10.
PL 203 013 B1
58. Sposób według zastrz. 56, znamienny tym, że podłoże oddziaływań hydrofobowych jest wybrane z grupy obejmującej szkielet polimeru metakrylanowego lub kopolimeru związany z przynajmniej jedną grupą propylową, butylową, heksylową, oktylową, nonylową lub ich mieszaniną ako dołączonymi grupami hydrofobowymi.
59. Sposób według zastrz. 56, znamienny tym, że podłoże zawiera przynajmniej jeden szkielet kopolimeru metakrylanu i glikolu etylenowego lub sieciowaną agarozę.
60. Sposób według zastrz. 56, znamienny tym, że podłoże jest w postaci perełek o wielkości w zakresie od 15 do 100 μ m.
61. Sposób według zastrz. 55, znamienny tym, że sól obejmuje anion albo kation wybrany z grupy obejmującej octan, fosforan, węglan, SO4 2-, Cl-, Br-, NO3-, Mg2+, Li+, Na+, K+ i NH4+.
62. Sposób według zastrz. 61, znamienny tym, że solą jest siarczan amonu w stężeniu od 2,5M do 4M.
63. Sposób według zastrz. 55, znamienny tym, że początkowe warunki obejmują równoważenie podłoża roztworem soli zawierającym siarczan amonu w stężeniu od 2,5M do 4M.
64. Sposób według zastrz. 55, znamienny tym, że drugie warunki obejmują przemywanie podłoża roztworem soli zawierającym siarczan amonu w stężeniu od 2,35M do 2,45M.
65. Sposób według zastrz. 55, znamienny tym, że trzecie warunki obejmują przemywanie drugiej związanej mieszaniny roztworem soli zawierającym siarczan amonu w stężeniu od 1M do 2,3M.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US13677299P | 1999-05-28 | 1999-05-28 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL364051A1 PL364051A1 (pl) | 2004-12-13 |
| PL203013B1 true PL203013B1 (pl) | 2009-08-31 |
Family
ID=22474295
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL364051A PL203013B1 (pl) | 1999-05-28 | 2000-05-26 | Sposób oczyszczania plazmidowego DNA, sposób oddzielania superskręconego plazmidowego DNA, sposób oddzielania endotoksyny od plazmidowego DNA, sposób wzbogacania ilości superskręconego DNA względem rozluźnionego DNA, sposób usuwania lipopolisacharydu |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1187840B2 (pl) |
| JP (2) | JP5320528B2 (pl) |
| KR (1) | KR100688349B1 (pl) |
| CN (1) | CN1264854C (pl) |
| AT (1) | ATE433456T1 (pl) |
| AU (1) | AU782153B2 (pl) |
| BR (1) | BR0011033A (pl) |
| CA (1) | CA2375215C (pl) |
| CZ (1) | CZ20014274A3 (pl) |
| DE (1) | DE60042366D1 (pl) |
| DK (1) | DK1187840T4 (pl) |
| ES (1) | ES2328008T5 (pl) |
| HU (1) | HUP0301869A2 (pl) |
| IL (3) | IL146695A0 (pl) |
| MX (1) | MXPA01012213A (pl) |
| NO (1) | NO20015703L (pl) |
| NZ (1) | NZ515645A (pl) |
| PL (1) | PL203013B1 (pl) |
| RO (1) | RO122855B1 (pl) |
| RU (1) | RU2001135838A (pl) |
| WO (1) | WO2000073318A1 (pl) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1264854C (zh) * | 1999-05-28 | 2006-07-19 | 坎布雷科斯生物科学巴尔的摩公司 | Dna纯化方法和纯化的dna |
| GB0107634D0 (en) * | 2001-03-27 | 2001-05-16 | Fermentas Ab | Nucleic acid purification |
| GB0127803D0 (en) * | 2001-11-20 | 2002-01-09 | Glaxo Group Ltd | Processing nucleic acid |
| KR100463415B1 (ko) * | 2001-12-12 | 2004-12-23 | 씨제이 주식회사 | 세균내ｄｎａ 또는 ｒｎａ로부터 리포폴리사카라이드를제거하는 방법 |
| SE0200543D0 (sv) * | 2002-02-21 | 2002-02-21 | Amersham Biosciences Ab | Method of separation using aromatic thioether ligands |
| US20040127648A1 (en) * | 2002-12-31 | 2004-07-01 | Ciphergen Biosystems, Inc. | Sorbent and method for the separation of plasmid DNA |
| NZ545449A (en) * | 2003-09-17 | 2009-07-31 | Centelion Formerly Gencell Sas | Device and Method of preparation of pharmaceutical grade plasmid DNA |
| EA010576B1 (ru) * | 2004-04-19 | 2008-10-30 | Сентельон | Способ очистки плазмидной днк |
| KR100612869B1 (ko) * | 2004-11-08 | 2006-08-14 | 삼성전자주식회사 | 고정화된 금속-리간드 복합체에 의한 세포 용해 방법 |
| JP4811773B2 (ja) * | 2005-06-08 | 2011-11-09 | 肇 柄谷 | 核酸の精製法 |
| WO2007114762A1 (en) * | 2006-03-31 | 2007-10-11 | Ge Healthcare Bio-Sciences Ab | Method of separation of deoxyribonucleic acids |
| US20120220729A1 (en) | 2011-02-28 | 2012-08-30 | Boehringer Ingelheim International Gmbh | Liquid phase separation of plasmid dna isoforms and topoisomers |
| EP3054008A4 (en) | 2013-10-03 | 2017-04-12 | Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. | Method for purifying double-stranded ribonucleic acid |
| BR112018075667B1 (pt) * | 2016-06-14 | 2024-02-20 | Biogen Ma, Inc | Métodos para separar um oligonucleotídeo alvo de uma mistura contendo o oligonucleotídeo alvo e uma impureza relacionada com o produto |
| MX2020009579A (es) * | 2018-03-15 | 2020-11-09 | Intergalactic Therapeutics Inc | Vectores de adn sintetico y metodos de uso. |
| US11865480B2 (en) | 2019-05-07 | 2024-01-09 | Electronics and Telecommunications Research Institute Cancer Rop Co., Ltd. | Nucleic acid purification device and nucleic acid purification method |
| GB2700048B (en) | 2019-09-18 | 2026-03-04 | Aldevron Llc | synthetic dna vectors and method of use |
| CN111721871A (zh) * | 2020-06-24 | 2020-09-29 | 南京济群生物科技有限公司 | 一种质粒超螺旋dna含量的高分离度检测方法 |
| KR20220018185A (ko) | 2020-08-06 | 2022-02-15 | 주식회사 바이오솔루션 | 플라스미드 dna 추출방법 |
| KR20220018187A (ko) | 2020-08-06 | 2022-02-15 | 주식회사 바이오솔루션 | 플라스미드 dna 추출키트 |
| EP4225462A1 (en) * | 2020-10-05 | 2023-08-16 | Sartorius BIA Separations d.o.o. | Improved removal of rna and contaminants from dna plasmid preparations by hydrophobic interaction chromatography |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5622960A (en) * | 1992-04-14 | 1997-04-22 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Topoisomerase II inhibitors and therapeutic uses therefor |
| US5561064A (en) | 1994-02-01 | 1996-10-01 | Vical Incorporated | Production of pharmaceutical-grade plasmid DNA |
| DE59507433D1 (de) | 1994-02-07 | 2000-01-20 | Qiagen Gmbh | Verfahren zur herstellung endotoxinfreier oder an endotoxin abgereicherter nucleinsäuren und/oder oligonucleotide für die gentherapie |
| US5707850A (en) | 1995-11-09 | 1998-01-13 | Cole; Kenneth D. | Concentration and size-fractionation of nucleic acids and viruses in porous media |
| US5707812A (en) | 1996-08-06 | 1998-01-13 | Vical Incorporated | Purification of plasmid DNA during column chromatography |
| US6214586B1 (en) * | 1997-12-08 | 2001-04-10 | Genzyme Corporation | Method for purifying plasmid DNA and plasmid DNA substantially free of genomic DNA |
| DE69922740T2 (de) * | 1998-05-11 | 2005-12-08 | Tosoh Corp., Shinnanyo | Methode zur Trennung von Nucleinsäuren mittels Flüssigchromatographie |
| JP2000035423A (ja) * | 1998-05-11 | 2000-02-02 | Tosoh Corp | 液体クロマトグラフィ―による核酸の分離法 |
| CN1264854C (zh) * | 1999-05-28 | 2006-07-19 | 坎布雷科斯生物科学巴尔的摩公司 | Dna纯化方法和纯化的dna |
-
2000
- 2000-05-26 CN CNB008109486A patent/CN1264854C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-26 BR BR0011033-7A patent/BR0011033A/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-05-26 WO PCT/US2000/014527 patent/WO2000073318A1/en not_active Ceased
- 2000-05-26 PL PL364051A patent/PL203013B1/pl unknown
- 2000-05-26 KR KR1020017015298A patent/KR100688349B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-26 IL IL14669500A patent/IL146695A0/xx unknown
- 2000-05-26 AU AU51655/00A patent/AU782153B2/en not_active Expired
- 2000-05-26 JP JP2001500643A patent/JP5320528B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-26 EP EP00936329A patent/EP1187840B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-26 HU HU0301869A patent/HUP0301869A2/hu unknown
- 2000-05-26 AT AT00936329T patent/ATE433456T1/de active
- 2000-05-26 MX MXPA01012213A patent/MXPA01012213A/es active IP Right Grant
- 2000-05-26 NZ NZ515645A patent/NZ515645A/en not_active IP Right Cessation
- 2000-05-26 DK DK00936329.2T patent/DK1187840T4/da active
- 2000-05-26 ES ES00936329T patent/ES2328008T5/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-26 RO ROA200101276A patent/RO122855B1/ro unknown
- 2000-05-26 CA CA2375215A patent/CA2375215C/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-26 RU RU2001135838/04A patent/RU2001135838A/ru not_active Application Discontinuation
- 2000-05-26 DE DE60042366T patent/DE60042366D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-26 CZ CZ20014274A patent/CZ20014274A3/cs unknown
-
2001
- 2001-11-22 NO NO20015703A patent/NO20015703L/no not_active Application Discontinuation
- 2001-11-22 IL IL146695A patent/IL146695A/en not_active IP Right Cessation
-
2011
- 2011-12-07 JP JP2011267892A patent/JP2012050463A/ja active Pending
-
2012
- 2012-10-29 IL IL222755A patent/IL222755A/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2012050463A (ja) | Ｄｎａ精製方法および精製されたｄｎａ | |
| JP7566762B2 (ja) | 陰イオン交換クロマトグラフィーを使用した生物学的分子、例えばプラスミドｄｎａなどのための精製プロセス | |
| Urthaler et al. | Improved downstream process for the production of plasmid DNA for gene therapy. | |
| JPH11505707A (ja) | プラスミド大規模精製法 | |
| JP2024527602A (ja) | アデノ随伴ウイルスカプシドを分離するための方法、前記方法によって得られる組成物及びその使用 | |
| JPH10503086A (ja) | 大規模プラスミド精製方法 | |
| US6953686B1 (en) | Methods of DNA purification and purified DNA | |
| JP2025508416A (ja) | 超らせんプラスミドｄｎａを分離するための方法 | |
| JP2025515479A (ja) | アデノ随伴ウイルスカプシドの事前スクリーニング方法及びそれを分離するための方法 | |
| EP4490287A1 (en) | Method for reducing endotoxin levels in nucleic acid purification | |
| JP2024510907A (ja) | 関心対象のタンパク質を精製するための方法 | |
| HK40058215A (zh) | 采用阴离子交换色谱法的生物分子(如质粒dna)纯化工艺 | |
| KR20250172635A (ko) | 크로마토그래피 물질, 그의 용도, 및 아데노-연관 캡시드를 분리하는 방법 |