JPH11505707A

JPH11505707A - プラスミド大規模精製法

Info

Publication number: JPH11505707A
Application number: JP8535061A
Authority: JP
Inventors: リー，アン・エル; サガー，サンギーサ
Original assignee: メルクエンドカンパニーインコーポレーテッド
Priority date: 1995-05-19
Filing date: 1996-05-15
Publication date: 1999-05-25
Also published as: AU709003B2; EA199700399A1; EP0827536A1; HRP960222A2; YU29796A; WO1996036706A1; CN1190435A; HUP9802557A2; AR003122A1; NO975280D0; HUP9802557A3; MX9708967A; NO975280L; SK155797A3; NZ309231A; PL323475A1; KR19990014924A; CZ366197A3; AU5921996A; EA000785B1

Abstract

(57)【要約】大規模微生物発酵からのプラスミドＤＮＡの大規模単離精製方法を開示する。開示した方法を用いて、プラスミドＤＮＡの３種の形態全部、即ち超らせん型（Ｉ型）、ニックの入った環状型又は弛緩環状型（II型）、及び線状型（III型）が、別々に単離できる。医薬組成中に含有させるために適した高精製ＤＮＡを、開示した方法によって提供する。

Description

【発明の詳細な説明】プラスミド大規模精製法発明の背景微生物発酵からのプラスミドＤＮＡ単離の従来技術は、小規模又は実験室規模のプラスミド製造に適している。このような方法の一つには、プラスミドを含有する微生物宿主細胞のアルカリ溶解、続いて酢酸による中和による宿主細胞ゲノムＤＮＡとタンパク質の沈殿、次に例えば遠心によるそれらの除去が含まれる。液層には、プラスミドＤＮＡが含まれ、それをアルコール沈殿させ、次にエチジウムブロミドの存在下ＣｓＣｌを用いる等密度遠心法にかける。全プラスミドＤＮＡを３種の異なる形態、即ち超らせん型（Ｉ型）、ニックの入った環状型（II 型）、及び線状型（III型）に分離するために、エチジウムブロミドが必要であり、所望のプラスミド型を集める。残存するエチジウムブロミドを除去するために、ブタノールによる更なる抽出、続いてアルコールを用いるＤＮＡ沈殿が必要である。宿主細胞タンパク質を除去するために、更なる精製工程を行う。宿主タンパク質の除去は、フェノール又はフェノールとクロロホルムの混合液を用いる抽出を繰返して行う。プラスミドＤＮＡをアルコール沈殿させ、イソアミル／クロロホルム抽出を繰返して、残存するフェノールを除去する。最後に得られるアルコール沈殿プラスミドＤＮＡを、水又は適切な緩衝液に溶解する。この方法には、以下の点を含む多数の欠点と限界がある：ａ）この方法では、高価で危険のある化学薬品（密度勾配遠心で用いるＣｓＣｌとＥｔＢｒ；ＥｔＢｒは公知の突然変異原であり、生成物から除去しなければならない；ＥｔＢｒはプラスミドにニックを入れることができるインターカレート剤でもある）を用いることが必要である；ｂ）密度遠心工程は容易にスケールアップできない；ｃ）残存するＥｔＢｒを除去するために有機溶媒抽出が必要である；ｄ）フェノール抽出を行い、残存するタンパク質とＤＮａｓｅを除去するが、この方法では遠心を行い、フェノール／水エマルションを壊す必要がある；ｅ）繰返しの多い工程は、手間と時間がかかる（単離には数日間かかる）；ｆ）化学溶解工程のスケールアップが障害となる、即ちリゾチーム／アルカリ／ＫＯＡｃ処理工程は小規模で細胞を溶解するのには効率的であるが、粘度の増加により大規模処理が非常に困難である；及びｇ）大量のリゾチームを用いるので、溶解前に微生物細胞壁を酵素的に弱める。次に酸を添加して混合液を中和するが、それにより高分子量の染色体ＤＮＡが沈殿する。高濃度のＫＯＡｃ塩の添加により、高分子量ＲＮＡ及びタンパク質− ＳＤＳ複合体が沈殿する。生成物であるプラスミドは、遠心により清澄上清中に残る。フェノール抽出まで除去されないヌクレアーゼ活性を阻害するために、素早く氷上で処理する必要があるということがここでの限界である。上清中に生成物と一緒に残存する主要夾雑物はＲＮＡである。細菌からのプラスミドＤＮＡの単離精製法のもう一つのよく用いられる方法は、非常な小規模製造にのみ適した素早い方法である。 Holmes 及び Quigley（1981，Analytical Biochem.，114，pp193-197）は、プラスミド製造の簡単で素早い方法を報告したが、その方法では、細菌をリゾチーム処理し、次に適切な緩衝液（ＳＴＥＴ）中で２０〜４０秒間約１００℃で煮沸し、ゲノムＤＮＡ、タンパク質及び残渣の不溶性凝固物を生成させ、溶液中にプラスミドが残るが、ＲＮＡが主要夾雑物である。リゾチームは明らかにこの技術が働くのに必要であり、それだけで、ヒト又は動物に用いるためのＤＮＡの大規模製造に好ましくない処理工程が必要となる。しかし、リゾチームの添加により、溶解中にプラスミドの放出が大きくなる可能性がある。この方法の利点は、細胞の熱処理により、ＤＮａｓｅも変性させるだろうという点である。しかし、この技術は、大容量の微生物発酵へのスケールアップに適さず、５Ｌ未満の発酵に限定される。プラスミド精製にＣｓＣｌを用いる等密度遠心に対する代替法が報告された。これらの代替法は実験室規模のプラスミド単離にのみ適し、以下の工程を含む：ａ）サイズ排除クロマトグラフィー、これは固有の性質として生産高において限界を有する；ｂ）ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、これには効率のために高濃度の尿素を必要とする欠点がある；ｃ）逆相クロマトグラフィー；及びｄ）イオン交換クロマトグラフィー。それ故に、大容量の微生物発酵からのプラスミドＤＮＡの大規模単離精製のために、プラスミド製造法を改良する方法の開発が必要となる。プラスミドＤＮＡの大規模生産の単離精製法は、分子生物学の多くの分野の最近の発展により必要とされる。特に、ヒトでの使用のためのポリヌクレオチドをベースとしたワクチンの分野の最近の進歩、及びヒト遺伝子治療の可能性により、高精製形態でのポリヌクレオチドワクチンを大量生産できることが必要とされる。生物薬剤としてのＤＮＡの発酵、単離、精製、及びキャラクタリゼーションのための大規模で、商業的に実施可能な方法の開発／実施のために、先例のない技術が必要である。発明の概要プラスミドＤＮＡを単離精製するために使用する現在の実験室用方法は、大規模製造方法には適さない一連の従来の実験室用技術からなる。例えば、密度勾配遠心はスケールアップできない；精製方法は、公知の突然変異原であるエチジウムブロミドなどの危険があり高価な化学薬品／溶媒の使用が必要であり、労働集約的で時間がかかる。それ故、スケールアップできる代替方法を開発したが、それを本明細書で開示する。更に、本方法の工程を通しプラスミド生成物を追跡し、プラスミド形態を区別するために、ＨＰＬＣアッセイを確立した。プラスミドを有する微生物細胞を懸濁し、次に必要に応じて、界面活性剤を含有する緩衝液中でリゾチームとインキュベートし、通過型熱交換器を用い加熱し、細胞を溶解させ、次に遠心にかける。遠心後、主にＲＮＡとプラスミド生成物を含む清澄溶解液を０．４５ミクロンフィルターで濾過し、次にダイアフィルトレーションを行い、次にアニオン交換カラムにかける。濾過前もしくは後に、又はもっと前に、もしくはもっと後で、必要に応じてプラスミド生成物をＲＮａｓｅで処理してもよい。プラスミド含有アニオン交換生成物分画を逆相カラムにかけ、適切な緩衝液で溶出し、ヒトでの使用に適した高純度プラスミドＤＮＡを得る。図面の簡単な説明図１：適切な熱交換装置の図面を示す。図２：出口の温度と流速の関係をグラフで示す。図３：５０ｍＭＥＤＴＡと１００ｍＭＥＤＴＡによる清澄化上清中の全プラスミドの比較クロマトグラムを示す。図４：出口温度の関数としての超らせん型プラスミドの収率を示す。図５：ＲＮａｓｅ処理（太線）及び非処理（細線）清澄化溶解液を用いるアニオン交換カラムランの溶出プロフィールを示す。図６：カラムの前にダイアフィルトレーションを行った、又は行わなかった清澄化溶解液を用いるアニオン交換クロマトグラフィーの溶出プロフィールを示す。図７：細胞溶解液からのプラスミドＤＮＡの溶出プロフィールを示す。図８：精製の種々の中間工程で得られたＤＮＡ生成物のアガロースゲル電気泳動分析を示す。図９：生成物の純度を示すＤＮＡ生成物のアニオン交換ＨＰＬＣ分析の追跡を示す。発明の詳細な説明本発明者らは、細胞溶解を誘起し、ゲノムＤＮＡ、タンパク質及び他の残渣を沈殿させるが、プラスミドを溶液に保つ急速加熱方法を用いるプラスミド大規模単離精製のための新規で、スケールアップできる、代替の溶解／残渣除去方法を発明した。この方法の有用性は、プラスミドＤＮＡの大規模単離精製である。本発明者らは、改変ＳＴＥＴ緩衝液（下記）中に微生物細胞を懸濁し、次に通過型熱交換器中で約７０〜１００℃に懸濁液を加熱すると、良好な溶解が起ることを知見した。溶解液の連続流動遠心又はバッチ方式遠心により、細胞残渣、タンパク質及びゲノムＤＮＡの大部分を含むペレットが生じるが、プラスミドは上清に残る。本発明は、化学的溶解よりも高い生成物回収、ＤＮａｓｅの不活化、操作の単純さ、及びスケールアップができることを含む幾つかの利点を提供する。本発明は、微生物発酵からのプラスミドＤＮＡの大規模単離精製方法に関する。本明細書で使用する大規模微生物細胞発酵は、約５Ｌ以上の全細胞発酵容量、又は約５Ｌ以上の発酵容量から取得される細胞と定義する。本発明は、ヒトへの使用に適する高精製形態のプラスミドＤＮＡの提供にも関する。ヒト使用用のＤＮＡには、ポリヌクレオチドワクチンとヒト遺伝子治療用ＤＮＡが含まれるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドワクチンは、ヒトに直接注射するように意図される（Montgomery，D.L.ら、1993，Cell Biol.， 169，pp.244-247；Ulmer，J.B.ら、1993，Science，259，pp．1745-1749）。本発明は、単離精製工程を通し種々の形態のプラスミドＤＮＡを追跡するためのインラインモニター方法にも関する。本発明の方法により別々に単離できる、上記の種々の形態のプラスミドＤＮＡは、Ｉ型（超らせん型プラスミド）、II型（ニックの入ったプラスミド又は弛緩型プラスミド）、及びIII型（線状型プラスミド）である。本発明の方法は一般的に、微生物発酵における使用に適する。酵母を含む菌類細胞、及び細菌細胞を含む（これらに限定されない）種々の微生物細胞が、本発明の方法での使用に適することは当業者に自明である。好適微生物発酵は、単離精製するプラスミドを含有する細胞の細菌発酵である。好適細菌発酵は、単離精製するプラスミドを含有するE．coliの発酵である。E．coli発酵以外の細菌発酵が本発明での使用に適することは当業者に自明である。微生物発酵は、使用する細菌の生育に適する任意の液体培地で行ってもよい。本発明の方法によって単離精製されるプラスミドは染色体外ＤＮＡ分子でありうる。プラスミドは、細胞当り高コピー数又は低コピー数でありうる。プラスミドは事実上如何なる大きさであってもよい。事実上、微生物細胞中の如何なるプラスミドも、本発明の方法によって単離できることは当業者に自明である。プラスミド含有微生物細胞は、発酵培地から取得され、細胞ペースト又はスラリーを与える。液体培地から細胞を取得する任意の通常手段（遠心又はミクロ濾過を含むが、これらに限定されない）が適する。現在の実験室規模方法を用いる、取得微生物細胞からのプラスミドＤＮＡの単離は主に、細胞壁を弱め、細胞溶解を起こすための微生物細胞の酵素的処理からなる。精製工程には、反復的なＣｓＣｌ／ＥｔＢｒ遠心、続いて有機溶媒抽出、及びｔＲＮＡ、残っているタンパク質、ＥｔＢｒ及び他の宿主夾雑物を除去するための沈殿が含まれる。これらの工程はスケールアップができず、そのため大規模処理での使用に適さない。これとは対照的に、分取スケールクロマトグラフィーは強力な精製の道具であり、ＤＮＡプラスミド生成物の精製のために、高分解能、操作の容易さ、及び生産性の増加を提供する。逆相及びアニオン交換という２種の別個の形式のクロマトグラフィーは、ヒトへの使用に必要な厳格なレベルまでＤＮＡプラスミドを精製するのに適切である。逆相に基づく分離は疎水性相互作用に支配され、アニオン交換による分離は静電的相互作用に基づく。これらの２種の直交クロマトグラフィー工程で、種々の形態のプラスミド（超らせん型、開環状弛緩型、線状型及びコンカテマー）が分離され、ＬＰＳ（エンドトキシン）、ＲＮＡ、ＤＮＡ及び残っているタンパク質などの宿主夾雑物が除去される。本発明の方法では、取得微生物細胞を改変ＳＴＥＴ緩衝液に再懸濁する。改変ＳＴＥＴ緩衝液は、約５０ｍＭＴＲＩＳ、約５０−１００ｍＭＥＤＴＡ、約８％スクロース、約２％ＴＲＩＴＯＮＸ−１００、及び必要に応じてマイクログラム近傍の濃度のリゾチームからなり、ｐＨ範囲は６．０−１０．０である。本発明の方法で必要に応じて用いるリゾチーム濃度は、当業界公知の方法で用いるリゾチーム濃度よりかなり小さい。この基本緩衝液組成の改変を行うことができ、それが本発明での使用に適することは当業者に自明である。本発明の結果に実質的に影響を与えない、又は変更しない、この基本緩衝液組成の改変は、本発明の方法の範囲内とする。用いる細菌の特定の株で得られる最良の結果に従ってｐＨ範囲を調整しうる。好適ｐＨ範囲は約８．０−８．５である。次に、懸濁液を、通過型熱交換器中で約７０−１００℃に加熱するが、約７０−７７℃ が好ましい。溶解液を遠心し、ペレット状の、多量細胞残渣、タンパク質及び大部分のゲノムＤＮＡを得る。原型の熱交換器を作製し、プラスミド含有微生物細胞の通過型熱溶解の容易さを実証した。特別の熱交換器は、コイル状形態の１０フィート×０．２５インチＯ．Ｄ．ステンレス鋼鉄チューブからなった。コイルを、一定の高温の水浴に完全に浸した。コイルのホールドアップ容量は約５０ｍＬであった。熱電対及び温度計を用い、入口と出口の温度、及び水浴温度をそれぞれ測定した。Masterflex 蠕動性ポンプとシリコーンチューブを用い、生成物を加熱コイルに流し入れた。細胞溶解液がコイルから流出し、次にそれをBeckman Ｊ−２１バッチ遠心機で遠心し、清澄化した。図１はこの特定の装置の図を示すが、好適な外殻とチューブを有する装置（これに限定されない）を含む他の型の熱交換装置も本発明での使用に適する。遠心後、清澄化溶解液を必要に応じてＲＮａｓｅで処理でき、プラスミド生成物を濾過し、更に小残渣を除去できる。小穴サイズの膜を通す濾過を含む（これに限定されない）種々の濾過方法はこの工程での使用に適する。好適な濾過方法は、０．４５ミクロンフィルターを通す濾過である。ＤＮＡ生成物から更に夾雑物を除去するために、生成物のダイアフィルトレーションを行うことができる。標準的で市販のダイアフィルトレーション装置は、当業者公知の標準的技術に基づき、本工程での使用に適する。好適なダイアフィルトレーション方法は、プラスミドの大きさにより、分子量カットオフの範囲３０，０００から５００，０００を有する限外濾過膜を用いるダイアフィルトレーションである。上記ＤＮＡ調製物をアニオン交換カラムにかける前に、カラム緩衝液に対し、限外濾過膜（約１００，０００分子量カットオフ）を用いてダイアフィルトレーションにかける。アニオン交換カラム前のダイアフィルトレーションが好適である。ダイアフィルトレーションによって、カラムに負荷できる溶解液の量が大きく増加する。種々の市販のアニオン交換マトリックスが本発明での使用に適する。該アニオン交換マトリックスには、ＰＯＲＯＳアニオン交換樹脂、Ｑｉａｇｅｎ、ＴｏｓｏＨａａｓ、Ｓｔｅｒｏｇｅｎｅ、Ｓｐｈｅｒｏｄｅｘ、Ｎｕｃｌｅｏｐａｃ、及びＰｈａｍａｃｉａから入手できるものが含まれるが、それらに限定されない。カラム（Ｐｏｒｏｓ II ＰＩ／Ｍ、４．５ｍｍ×１００）を最初に２０ｍＭＢｉｓ／ＴＲＩＳＰｒｏｐａｎｅ（ｐＨ７．５）及び０．７ＭＮａＣｌで平衡化する。サンプルを負荷し、最初と同一の緩衝液で洗浄する。次に、約２５カラム容量の、０．５Ｍから０．８５ＭＮａＣｌのグラジエント溶出を行い、溶出分画を集める。アニオン交換クロマトグラフィーは、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ及びタンパク質を良好に除去できるので、理想的な第１の精製工程である。図５（太線）は、濾過清澄化された細胞溶解液のアニオン交換カラムからのサンプル溶出プロフィールを示す。アガロースゲル分析により、通過液後に出現する第２ピークはプラスミド生成物からなる。より早い大ピークはＲＮＡのためである。このことは、カラムにかける前に、清澄化細胞溶解液をリボヌクレアーゼとインキュベートすることにより確認される。大ピークが消失し、数個のより小さく、早く溶出するピークで置換えられる。この小ピークはリボヌクレアーゼ消化の分解産物による。アニオン交換生成物分画を逆相カラムにかける。種々の市販のマトリックスが本発明での使用に適する。これらのマトリックスには、ＰＯＲＯＳ、ＰｏｌｙｍｅｒＬａｂｓ、ＴｏｓｏＨａａｓ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ＰＱＣｏｒｐ．、Ｚｏｒｂａｘ、ＢｉｏＳｅｐｒａｒｅｓｉｎｓ、ＢｉｏＳｅｐｒａＨｙｐｅｒＤｒｅｓｉｎｓ、ＢｉｏＳｅｐｒａＱ−ＨｙｐｅｒＤｒｅｓｉｎｓ、及びＡｍｉｃｏｎから入手できるものが含まれるが、これらに限定されない。マトリックスはポリマーをベースとしたもの、又はシリカをベースとしたものでありうる。逆相カラム（ＰｏｒｏｓＲ／Ｈ）をｐＨ８．５の約１００ｍＭ重炭酸アンモニウムで平衡化する。次に、０−１１％イソプロパノールのグラジエントを用い、結合物質を溶出する。上記のプラスミドの３種の形態、即ちＩ型、II型及びIII型をこの方法で分離できる。次に、容量を減少させるために、又は緩衝液を交換するために、溶出されたプラスミドＤＮＡの濃縮及び／又はダイアフィルトレーションを行うことができる。ヒトへの使用を予定されているＤＮＡの場合、ＤＮＡ生成物の、医薬として許容できる担体又は緩衝液へのダイアフィルトレーションを行うことは有用でありうる。医薬として許容できる担体又は緩衝液は当業界公知であり、Remington′s Pharmaceutical Sciencesなどの種々の教科書に記載されているものが含まれる。ＤＮＡサンプルを濃縮するのに適する任意の方法は、本発明での使用に適する。このような方法には、ダイアフィルトレーション、アルコール沈殿、凍結乾燥などが含まれるが、ダイアフィルトレーションが好適である。ダイアフィルトレーション後、最終プラスミドＤＮＡ生成物を滅菌できる。ＤＮＡ生成物の有用性に影響を与えない任意の滅菌方法が適する。例えば、十分に小さい穴サイズ、例えば０．２ミクロン以下、を有する膜を通すことによる滅菌である。以下の実施例で本発明の方法を説明するが、本発明を実施例に限定するものではない。実施例１微生物細胞の生育、細胞溶解、及び清澄化凍結E.coli細胞スラリー１Ｌを用い、ＳＴＥＴ緩衝液（８％スクロース、０．５％ＴＲＩＴＯＮ、５０ｍＭＴＲＩＳ緩衝液ｐＨ８．５、及び５０ｍＭＥＤＴＡ）中の細胞懸濁液８Ｌを作製した。細胞懸濁液の６００ｎｍの吸光度は約Ｏ．Ｄ．３０であった。懸濁液を連続的に攪拌し均一にした。細胞懸濁液の粘度を測定したが、それは室温（２４℃）で約１．９４ｃｐであった。細胞懸濁液を８１ｍＬ／分で熱交換器にポンプを用いて流したが、それは熱交換器中での細胞溶液の滞留時間約３５秒に対応した。浴温を９２℃に維持した。細胞溶液の入口温度及び出口温度を測定したが、温度はそれぞれ約２４℃及び約８９℃（平均）であった。サンプル約１Ｌを熱交換器に通した。チューブには目で見える塊は無かったけれども、溶解液は出発物よりやや粘度が高かった。溶解液を室温に冷却し、その粘度は約４０ｃｐと測定した。細胞溶解液を、ＢｅｃｋｍａｎＪ−２１を使用する９０００ＲＰＭ、５０分間のバッチ遠心で清澄化した。上清の分析により、有効な細胞溶解と生成物回収ができたことが分った。通過型熱溶解によって得た生成物収率は、Quigley & Holmes沸騰法によるものと少なくとも同等であった。しかし、後者の方法は、バッチ形式で実験室スケールで行う必要があり、そのため大規模（５Ｌ以上）処理には適さない。熱交換器方法は通過型であるので、処理できる細胞懸濁液容量に最大限界はない。従って、この方法は細菌の非常な大規模発酵に適し、大量の高精製プラスミドＤＮＡを産生できる。次に、清澄化溶解液を、０．４５ミクロンの穴サイズを有する膜を通し濾過し、より細かい残渣を除去した。次に約１００，０００の分子量カットオフを有する膜を用いダイアフィルトレーションを行った。実施例２熱交換器を用いる細胞溶解の制御と再現性細胞スラリーをポンプを用い熱交換器に通す流速（即ち、滞留時間）の調整により、溶解の温度（即ち、出口温度）の厳格な制御が可能となる。細胞スラリー溶液を実施例１に記載のように調製し、ポンプを用い、１６０から８５０ｍＬ／分の流速で熱交換器に通した。対応する出口温度はそれぞれ９３から６５℃であった。図２は、流速と温度の関係を示す。細胞スラリーの最初の温度は２４℃であり、浴温を９６℃で一定に保った。更に、出口温度８０℃を目標とする数回の実験ランを行った。清澄化上清１Ｌ当りの環状ＤＮＡ２４ｍｇの収率が常に得られ、本方法の再現性が証明された。実施例３プラスミドＤＮＡの精製微生物細胞及び溶解液を、実施例１と実施例２に記載のように調製し、以下の分析を行った。１００ｍＭＥＤＴＡ対５０ｍＭＥＤＴＡの添加により、超らせん型ＤＮＡの割合を増加させることを示すために、及び超らせん型ＤＮＡの回収に関し出口温度（即ち、溶解温度）の許容可能な範囲を決定するために、以下の分析を行った。プラスミドＤＮＡの超らせん型は、弛緩環状型より安定であるので、超らせん型が望まれる。超らせん型ＤＮＡが開環型に転換する一つの道は、ＤＮａｓｅによってニックが入ることによる。本発明者らは、ＳＴＥＴ緩衝液中で１００ｍＭＥＤＴＡ対５０ｍＭＥＤＴＡの添加により、開環型プラスミドの形成を最少化することを見出した。図３は、５０ｍＭＥＤＴＡ対１００ｍＭＥＤＴＡによる、清澄化上清中の全プラスミドの比較クロマトグラムを示す。細胞懸濁液は実施例１に記載のように調製した。これらの実験ランでの操作流速は、約１８６ｍＬ／分であった。入口温度、出口温度、及び浴温はそれぞれ２４℃、９２℃、及び９６℃であった。溶解温度の許容範囲は、各ランで得られた超らせん型の割合を測定することにより決定した。図４は、出口温度の関数として超らせん型プラスミドの濃度を示す。溶解温度の許容範囲は７５から９２℃である。７５℃末満の温度では、より多くの弛緩環状型プラスミドが得られたが、これはＤＮａｓｅ活性の増加によるものと考えられる。９３℃以上では、超らせん型プラスミドのレベルは減少しているようであるが、これは熱変性による可能性がある。連続的熱溶解と遠心後、清澄化溶解液１ｍＬを、ＲＮａｓｅ５μｇと２時間インキュベートするか、又は非処理で使用した。次に、ＲＮａｓｅ処理及び非処理サンプルを、アニオン交換カラム（ＰｏｒｏｓＱ／Ｍ４．６×１００）にかけた。このアニオン交換カラムは前もって溶媒Ａ及びＢの５０：５０混合液で平衡化してあった（ＨＰＬＣ溶媒Ａ：２０ｍＭＴｒｉｓ／ＢｉｓＰｒｏｐａｎｅ，ｐＨ８．０；及び溶媒Ｂ：２０ｍＭＴｒｉｓ／ＢｉｓＰｒｏｐａｎｅ，ｐＨ８．０中１ＭＮａＣｌ）。１００カラム容量にわたって５０から８５％Ｂのグラジエントを用い、カラムを溶出した。開環型プラスミドは約６８％Ｂで溶出し、超らせん型は７２％Ｂで溶出する。ＲＮａｓｅ処理（細線）及び非処理（太線）の清澄化溶解液からのアニオン交換カラム溶出液の比較を図５に示す。約１０分のピークがプラスミドＤＮＡであり、非処理サンプル中の大ピークが続くが、これはＲＮＡである。ＲＮａｓｅ処理サンプルでは、大ＲＮＡピークが除去され、プラスミドピークの夾雑ピークからのより良好な分離が得られる。上記のように、アニオン交換クロマトグラフィーの前にダイアフィルトレーションを行うと、カラムにかけることができる溶解液量が大きく増加する。このことは図６で証明される。図６は、アニオン交換クロマトグラフィー前にダイアフィルトレーションを行った清澄化溶解液とダイアフィルトレーションを行わなかった清澄化溶解液の比較を示す。サンプルを、一つのサンプルはアニオン交換カラムにかける前にダイアフィルトレーションを行ったことを除き、他方のサンプルはダイアフィルトレーションを行わなかったことを除き、上記のように調製した。カラムを上記のように展開し、溶出した。図６は、カラムから溶出した夾雑物質量がダイアフィルトレーションを行わなかったサンプルにおいて非常に多いことを示す。アニオン交換カラムマトリックスに結合する大量の夾雑物質はカラムの最大吸着能力を上回り、それ以上の物質を結合できないマトリックスの故に、ＤＮＡ生成物の損失を引起す。それ故、ダイアフィルトレーションによって夾雑物が除かれ、より多くのＤＮＡ生成物がアニオン交換マトリックスに結合するようになり、カラムにかける清澄化溶解液の容量を増大させることが可能となる。アニオン交換カラムから溶出するプラスミドＤＮＡを、逆相ＨＰＬＣ分析によって、別々の形態に分離した。ニックの入った環状型プラスミド（II型）からの超らせん型プラスミド（Ｉ型）の分離を図７に示す。２種の形態は容易に分離され、プラスミドの別々の形態の単離が可能となった。実施例４クロマトグラフィーをベースとした方法による高精製プラスミドＤＮＡ発酵細胞ペーストを改変ＳＴＥＴ緩衝液に再懸濁し、次にバッチ方法で熱溶解させた。あるいは、発酵細胞ペーストを改変ＳＴＥＴ緩衝液に再懸濁し、次に上記の通過型方法で熱溶解させた。溶解液を上記のように遠心した。上清２０ｍＬを上記のように濾過し、上記の緩衝液Ａ及びＢの５０：５０混合液で前もって平衡化したアニオン交換カラム（ＰｏｒｏｓＱ／Ｍ４．６×１００）にかけた。流速１０ｍＬ／分で、５０カラム容量の５０％から８５％Ｂのグラジエントを行った。各２．５ｍＬの分画をカラムから集めた。超らせん型プラスミドＤＮＡが７２％Ｂでカラムから溶出した。次に、アニオン交換生成物を、前もってｐＨ８．０の１００ｍＭ重炭酸アンモニウムで平衡化した逆相クロマトグラフィーカラム（ＰｏｒｏｓＲ／Ｈ）にかけ、０％から８０％メタノールのグラジエントを用い、結合物質を溶出した。高精製超らせん型プラスミドＤＮＡは２２％メタノールで溶出した。精製方法の主要工程の各々からの生成物分画のアガロースゲルを図８に示す。アガロースゲルと比色アッセイと実施例３に記載のＨＰＬＣアッセイに基づくと、図９に示す最終生成物は高純度である。生成物は、９０％以上の超らせん型プラスミドと１０％未満の開環型プラスミドからなる。ＲＮＡは用いたアッセイの検出限界以下であった。ゲノムＤＮＡとタンパク質の夾雑物レベルも用いたアッセイの検出限界以下であった。本方法の最後での超らせん型プラスミドの全体での収率は、清澄化溶解液中の超らせん型プラスミドの約６０％であった。実施例５プラスミドＤＮＡの数グラム規模の精製凍結E．coli細胞スラリー４．５Ｌを用い、リゾチーム２５００単位／ｍＬを含むＳＴＥＴ緩衝液（８％スクロース、２％Ｔｒｉｔｏｎ、５０ｍＭＴｒｉｓ緩衝液、５０ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．５）中の細胞懸濁液３３．７Ｌを作製した。懸濁液の６００ｎｍでの吸光度は約Ｏ．Ｄ．３０であった。懸濁液を室温で１５分間攪拌し、適切な混合を行い、次に３７℃ で連続的攪拌を行いながら４５分間インキュベートした。インキュベーション後、混合を室温で続け、細胞懸濁液をポンプを用い、流速５００ｍＬ／分で熱交換器に通した。バッチ温度を１００℃に保ち、細胞懸濁液の入口温度と出口温度はそれぞれ約２４℃、７０−７７℃であると測定した。熱交換器から流出する細胞溶解液を、Ｂｅｃｋｍａｎ遠心管（各５００ｍＬ）に集め、物質を直ちにＢｅｃｋｍａｎＪ−２１遠心機で５０分間、９０００ＲＰＭで遠心した。遠心後、上清はリゾチームインキュベーション無しの場合より４〜５倍多いプラスミド生成物を含むことが知見された。遠心の上清生成物を直ちに、ＴＥ緩衝液（２５ｍＭＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）３容量に対しダイアフィルトレーションにかけ、次に室温で２〜４時間E．coli ＲＮａｓｅ２０×１０⁵単位とインキュベートした。インキュベーション後、ＴＥ緩衝液の更なる６容量を用い、１００ｋＤＭＷＣＯ膜を使用し、生成物溶液のダイアフィルトレーションを行い、次に０．４５ミクロンフィルターを通して濾過し、残渣を除去した。濾過した溶解液を、２０ｍＭＢｉｓ／ＴｒｉｓＰｒｏｐａｎｅ−ＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ７．５を用いて、０．７ＭＮａＣｌに希釈し、アニオン交換カラムに負荷する希釈済濾液を調製する。アニオン交換カラム（ＰＯＲＯＳＰＩ／Ｍ３．６Ｌ）を、２０ｍＭＢｉｓ／ＴｒｉｓＰｒｏｐａｎｅ及び０．７ＭＮａＣｌで前もって平衡化した。濾過した溶解液をカラム吸着容量まで負荷した。この場合、超らせん型プラスミド５ｇをアニオン交換カラムに負荷した。負荷後、カラムを、２０ｍＭＢｉｓ／ＴｒｉｓＰｒｏｐａｎｅ及び０．７ＭＮａＣｌ２〜４容量で洗浄した。２０ｍＭＢｉｓ／ＴｒｉｓＰｒｏｐａｎｅ中の０．７Ｍから２．０ＭＮａＣｌの１０カラム容量のグラジエントを行い、E．coliタンパタ質、ＲＮＡ及びエンドトキシンの大部分を除去した。超らせん型プラスミド分画はＮａＣｌ１．４から２．０Ｍで溶出した。次に、超らせん型プラスミド４ｇを含む、アニオン交換カラムからの超らせん型分画を、パイロジェンを含まない水で２〜３倍に希釈し、１．２％ＩＰＡに調整し、１ＮＮａＯＨでｐＨを８．５に調整した。次に、希釈したアニオン交換超らせん型分画を逆相カラム（ＰＯＲＯＳＲ２／Ｍ）７Ｌに負荷した。そのカラムは、１．２％ＩＰＡ含有１００ｍＭ重炭酸アンモニウムで前もって平衡化させてあった。この場合に、超らせん型プラスミド３．２ｇを逆相カラムに負荷し、続いてカラムを、１００ｍＭ重炭酸アンモニウム中１．２％ＩＰＡの６〜１０カラム容量で洗浄した。この広範な洗浄を行い、不純物を除去した。次に、５カラム容量中の１．２％から１１．２％ＩＰＡのグラジエントを行った。超らせん型プラスミド分画は約４％ＩＰＡで溶出する。次に、逆相カラムからの超らせん型プラスミド分画を濃縮し、３０ｋＤＭＷＣＯ膜を用い、正常生理食塩水へのダイアフィルトレーションを行った。最終生成物バルクを、０．２２ミクロンフィルターを通し濾過した。表１は、不純物の除去を記載する精製表を示し、主要段階の各々を示す。本方法の全体としての生成物収率は、実施例３で記載したアニオン交換ＨＰＬＣアッセイによって示されるように、清澄化細胞溶解液中の超らせん型プラスミドの５０％以上であった。生成物の純度は非常に高く、E.coli ＲＮＡ及びタンパク質を１％未満、並びにE．coliゲノムＤＮＡを２．９％未満しか含まなかった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者サガー，サンギーサアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126

Claims

【特許請求の範囲】１．大規模微生物細胞発酵からのプラスミドＤＮＡの大規模単離精製方法であって、ａ）大規模発酵から微生物細胞を取得すること；ｂ）取得微生物細胞に十分量の溶解溶液を添加すること；ｃ）通過型熱交換器中で工程ｂ）の微生物細胞を温度７０℃から１００℃に加熱し、粗溶解液を生成させること；ｄ）粗溶解液を遠心すること；ｅ）工程ｄ）の上清の濾過及びダイアフィルトレーションを行い、濾液を得ること；ｆ）工程ｅ）の濾液をアニオン交換マトリックスと接触させること；ｇ）アニオン交換マトリックスからプラスミドＤＮＡを溶出し取得すること；ｈ）工程ｇ）からのプラスミドＤＮＡを逆相高速液体クロマトグラフィーマトリックスと接触させること；ｉ）工程ｈ）の逆相高速液体クロマトグラフィーマトリックスからプラスミドを溶出し取得すること；ｊ）必要に応じて、工程ｉ）の生成物を濃縮すること、及び／又は医薬として許容できる担体中への工程ｉ）の生成物のダイアフィルトレーションを行うこと；及びｋ）必要に応じて、ＤＮＡ生成物を滅菌すること；の各工程を含むことを特徴とする上記方法。２．工程ｂ）の溶解溶液は改変ＳＴＥＴ緩衝液であることを特徴とする請求項１に記載の方法。３．工程ｃ）の加熱が温度７０℃から７７℃への加熱であることを特徴とする請求項１に記載の方法。４．工程ｂ）の溶解溶液がマイクログラム近傍の濃度のリゾチームを含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。５．必要に応じて、工程ａ）後の任意の工程でＲＮａｓｅ処理を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。６．請求項１に記載の方法で得られる単離精製されたプラスミドＤＮＡ。７．プラスミドがヒトへの投与に適することを特徴とする請求項６に記載のプラスミドＤＮＡ。８．プラスミドが非ヒト動物への投与に適することを特徴とする請求項６に記載のプラスミドＤＮＡ。９．プラスミドがポリヌクレオチドワクチンであることを特徴とする請求項６に記載のプラスミドＤＮＡ。１０．ヒトへの投与に適する単離精製されたプラスミドＤＮＡ。１１．プラスミドＤＮＡがポリヌクレオチドワクチンであることを特徴とする請求項１０に記載のプラスミドＤＮＡ。