JP3811767B2 - 均質な混合物から核酸を純化する方法 - Google Patents
均質な混合物から核酸を純化する方法 Download PDFInfo
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Description
発明の背景
発明の分野
本発明は、一般的には、DNAおよび他の物質を含む不均質または異種の混合物からDNAを単離しまた純化することに関する。具体的には、本発明は、容易に利用可能である緩衝液、溶媒および材料を用いて高純度のDNAを得るための方法および試薬に関する。本発明は自動化された研究室計装への適用に好適であり、また、自動化された蛍光サイクルDNAシークエンサーを含むほとんどの適用要求に対する使用に十分な高純度のDNAを提供する。
関連技術の説明
分子生物学の急速な発展により、様々な異なる出所すなわちソースからDNAを単離し、純化する能力について数多くの強調がなされてきた。DNAは、そのソースによって、タンパク質、脂質およびその他の分子成分を含む様々な成分と共に混合物中に存在する。これらの混合物からDNAを単離し、単離されたDNAを引き続き純化する能力は、組換えDNAの研究および方法、遺伝研究、および分子診断学を含む多くの方法論において重要である。特に、自動蛍光サイクル・シークエンサーの使用が増えるにしたがって、高度に純化されたDNAについての効率の高い方法が望まれるようになってきた。DNAのソースは、プラスミドDNA、コスミドDNAもしくは他のベクターを含む処理された細菌または酵母菌の溶菌液、ゲノムDNAを含む血液もしくは尿、組換えファージ溶菌液、DNA増幅反応、および分子生物学的方法で使用される他のシステムを含む。
近年、数多くの単離および純化の方法が報告されまた商業化されてきた。初期の方法は、広範囲の遠心分離過程、または、水性フェノールまたはクロロフォルムにエタノールを加えて使用する２相抽出の沈殿および洗浄過程に依存していた。これらの方法は時間を浪費し、また、高価な計装と、高価でありまた有害な試薬とを必要とする。さらに、１層を他の相から除去すべくこれをピペットで移し替える必要があるため、抽出および沈殿方法は自動化することが難しい。クロマトグラフィ、特に高圧液体クロマトグラフィおよびカラムクロマトグラフィは、短鎖核酸にはうまく利用されてきた。しかし、長鎖核酸には過度の機械的撹拌から鎖切断がしばしば生じる。
最近、商業化された純化システムは、けい藻土の調整またはガラス玉（ビーズ）のようなガラスおよび/またはケイ酸塩の表面に結合させるDNAの能力に信■をおいている。これらのシステムは、引き続く固定化DNAおよびシリカの洗浄と次の前記ガラスまたはケイ酸塩の表面からのDNAの溶離とのために低イオン強度の緩衝液および有機溶媒のような不均質な混合物および溶液からDNAを単離するためのガラスまたはケイ酸塩を提供する。これらのシステムに付随する共通の不利点は、単離されたDNAが、自動化された蛍光サイクルDNAの配列決定および次の増幅反応のような多くの特別な要求手順のためには十分に純粋ではないことである。したがって、溶離され、回収されたDNAのさらなる純化が求められ、次に、純化プロセスに要するさらなる時間と費用とが加わる。さらに、それは、クロマトグラフィのカラムの使用と、沈殿および再懸濁の過程とを必要とすることがあるため、さらなる純化は、ふつうの研究室の自動計装についての使用には適合しない。
近年、混合物からDNAを単離するための他の方法論が示唆されている。例えば、米国特許第5,057,426号明細書は、DNAを含む混合物から該DNAを分離するのに、前記DNAを陰イオン交換樹脂に固定し、濾過により前記混合物から前記樹脂を除去することを示唆する。前記樹脂から前記固定DNAを回収するため、前記DNAは、前記陰イオン交換樹脂上のサイトを得るために張り合う塩または他のイオンシステムを用いて別個に溶離される。
異なったやり方につき、米国特許第4,923,978号明細書は、ガラス玉またはシリカのような固形の物質をその表面が親水性の物質で被覆されるように処理することを示唆する。これらの表面は、タンパク質性の物質および非DNAを選択的に結合するといわれている。したがって、混合物を含むDNAおよびタンパク質が前記処理された固形物質と接触することを可能とし、続いて前記処理済みの物質を除去し、懸濁されまたは溶液中にある単離DNAを後方に離すことにより、DNAを単離することができる。
ヨーロッパ特許出願第0 512 767 A1号は、結合剤としてのエチルアルコールを100％まで使用して、シリカのような固形粒子の表面にDNAを結合することを容易にするために代表的に使用されるカオトロープ（chaotrope）と置き換えることを示唆する。このプロセスは、自動蛍光サイクル配列決定に使用するための固形粒子の表面からDNAを除去することに引き続くさらなる純化を求めるものとして特徴づけられる。ほとんどの細菌プラスミド純化方法論の特徴は、アルカリ溶解手順であり、次に、カオトロープの存在下でのシリカによる処理および次の洗浄過程および溶離過程が引き続く。自動蛍光サイクルDNA配列決定の適用に適するDNAを得るため、これらの方法は、カラム濾過、または他の洗浄および純化DNAの再懸濁により引き継がれる再沈殿を含むさらなる純化を必要とする。一般に、これらの多段階の純化プロセスは労働集約的であると考えられる。
さらに、最近の研究室自動化の強調と共に、ロボット化が容易に適合可能であるDNA純化方法に対する興味が増大している。シリカの洗浄後におけるさらなる純化を必要とする、現在使用中の一般的な、シリカを基本とする単離および純化システムは、ロボットシステムには適しない。
したがって、本発明の目的は、後の洗浄沈殿および洗浄を必要とすることなしに自動蛍光サイクル配列決定の適用のために十分に純粋であるプラスミドDNAを単離しかつ回収するための方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、自動研究室システムに容易に適合可能であるプラスミドDNA純化方法を提供することにある。
さらに、本発明の他の目的は、高価な装置および試薬を必要としないDNA純化方法を提供することにある。
発明の概要
本発明は、新規な洗浄の過程（ステップ）を含むDNAの単離および純化方法を提供することにより前記した目的を達成する。より詳細には、本発明の方法は、カオトロープ塩溶液（chaotropic salt solution）の存在下でDNAを含む均質な混合物でシリカを処理することにより前記均質な混合物からDNAを単離しかつ純化し、次いで、水性アルコール洗浄溶液で、連続する洗浄ステップにおいて、処理されたシリカを洗浄することを提供する。第１の洗浄ステップは、少なくとも９５重量％のアルコール水溶液からなる第１の洗浄溶液で前記被処理シリカを洗浄することを含む。第２のステップは、９５重量％未満のアルコール水溶液からなる第２の溶液で、前記の処理されかつ洗浄されたシリカを洗浄することを含む。各洗浄ステップに引き続き、洗浄システムから不要の物質と不純物とを除去するため、使用後の洗浄溶液が前記洗浄されたシリカから分離される。
本発明に従って、DNAを含む混合物にさらされたシリカを洗浄するとき、前記処理されかつ洗浄されたシリカは、自動蛍光サイクル配列決定方法論で使用するに十分な純度のDNAを含む。引き続く使用のために前記シリカの表面から単離されかつ純化されたDNAを回収するため、前記シリカが水または低イオン強度の緩衝液と組み合わされた水で単に洗浄される。これが、前記シリカから洗浄水に前記DNAを溶離させる。前記シリカから、溶離されたDNAを含む溶液を分離した後、純化または精製されたDNAはいつでも使用することができる。
本発明の好ましい実施例では、第１および第２の洗浄溶液は、それぞれ、水中に約95-99重量％のエチルアルコールが存在するものおよび水中に約70-85重量％のエチルアルコールが存在するものからなる。最も好ましい第１および第２の洗浄溶液は、それぞれ、約99重量％のエチルアルコール水溶液および約75重量％のエチルアルコール水溶液からなる。しかし、DNAのソースにより、この技術分野の専門家は、第１の洗浄のための95-99重量％間および第２の洗浄のための70-85重量％間のアルコール量を最適にすると考えられる。加えて、これらの専門家には、洗浄後のシリカから洗浄後の溶液を分離することが各洗浄ステップに引き続いて適当なサイズのフィルタを介して前記シリカを濾過することを優先的に含むことは理解されよう。これは、各洗浄ステップに引き続いて前記シリカから除去された不要の不純物を除去することを提供する。
本発明の新規な洗浄ステップは、実質的に全てのタンパク質性物質、脂質、不要な細胞片と、DNA混合物をシリカに最初に露出させるに際して使用された前記カオトロープ塩とを除去する一方、前記シリカに対する制限を維持するためのDNAに関する環境を提供するという効果を有する。続く前記シリカからの単離DNAの溶離は、溶媒沈殿および引き続く洗浄またはスピンカラム純化のようなさらなる純化ステップを要しない十分な純度のＤＮＡを提供する。したがって、本発明は、従来の材料および廉価な装置を用いるシンプルで時間を節約する方法を提供する。選択的に、本発明の単純性は、例えばロボット化研究室装置を用いるDNAの単離および純化プロセスまたは過程の完全な自動化を可能にする。
本発明の方法に付随するさらなる利点は、以下の詳細な説明に記載された本発明の理解によりこの技術分野の専門家により理解されよう。
発明の詳細な説明
本発明は、シリカに基礎をおくDNA純化方法が非常に低濃度の水性アルコール溶液により引き継がれる非常に高濃度の水性アルコール溶液の連続的な洗浄ステップを利用するとき、DNAが前記シリカから溶離しまた非常に高い純度を有するという発見に基づいている。本発明は、従来の方法すなわち一つの洗浄ステップを組み入れ、重要な塩の集合物を有する洗浄溶液を利用し、過剰な塩を除去するために後の洗浄再沈殿を要するものとは異なる。有利なことに、本発明は、溶媒の再沈殿およびスピンカラム溶離のような後の溶離純化を必要としない。
概して、本発明は、DNAおよび他の物質の均質な混合物からDNAを単離する方法を含み、また、前記均質な混合物およびカオトロープ（chaotrope）でのシリカの第１の処理と、引き続く第１および第２の洗浄溶液のそれぞれによる前記処理されたシリカの洗浄とを含む。前記第１の洗浄溶液は水中に少なくとも９５重量％のアルコールを有し、また、前記第２の洗浄溶液は水中に９５重量％未満のアルコールを有する。本発明は、さらに、前記第１および第２の洗浄ステップに引き続く、前記洗浄されたシリカからの洗浄溶液の分離を提供する。これは、過剰なカオトロープおよび非結合の細胞物質が前記シリカの処理後に除去されることを保証する。連続的な洗浄ステップおよび分離ステップは、カオトロープ溶液の存在下で前記DNA混合物でのシリカの第１の処理に関連して行われるとき、前記シリカの表面に単離された純粋なDNAを提供する。
好ましい実施例では、各洗浄ステップは２度繰り返され、また、さらに、適当な洗浄溶液で前記処理されたシリカを混合することを含み、前記処理されたシリカおよび洗浄溶液の混合物を培養し、次に、適当なサイズのフィルタを通して前記培養された混合物を濾過する。本発明によれば、また、純化されたDNAを回収するため、単離されたDNAを含む洗浄され、濾過されおよび乾燥されたシリカは水または低イオン強度緩衝液で溶離される。
いかなるソース（出所）からのDNAも、本発明の方法に従って純化される。この技術分野の専門家には、DNAの純化の手順に日常的に適用される多くの物質と過程との混合は馴染みの深いものであろう。典型的なソースは、a)血液、尿、精液等の臨床用試料、b)ゲノムライブラリー、c)PCRまたは他の増幅反応システム、d)細菌の溶菌液、およびe)ウイルスを含む。分子生物学者は、DNAのクローニングおよび/または配列決定のために細菌からプラスミドを回収することに関して精通している。この理由から、本発明は、細菌のソースから純化されたプラスミドを単離しかつ回収することに関して記載されている。これらの専門家には、しかし、本発明がDNAのいかなるソースにも適用可能であることは理解されよう。
以下に説明するように、本発明の好ましい実施例は、水中に約９９重量％のエチルアルコールを有する第１の洗浄溶液と、水中に約７５重量％のエチルアルコールを有する第２の洗浄溶液との使用を含む。しかし、９５重量％を越えるアルコールを有する水性を基本とする第１の洗浄溶液は、外見上、対抗する不純物を除去する間に前記シリカへの結合を維持するように前記DNAのための環境を付与する。水性を基本とする第２の洗浄溶液は、非常に多量の水（９５重量％未満のアルコール）を提供し、また、前記単離されたDNAが前記シリカの表面に結合されたままである間に前記不純物の残りを効果的に除去する。一般に、前記第１の洗浄ステップにおける水の量が９５重量％のアルコールより少ない場合、DNAの収量は減少して純度が向上することが決定されている。同様に、前記第１の洗浄溶液に１００重量％のアルコールが用いられる場合、前記収量は向上するが、結果として生じるDNAは相当量の不純物を含む。
既に述べたように、本発明の典型的な方法は、細菌の溶菌液からの純化されたプラスミドの回収を含む。したがって、典型的な純化過程は、まず、細菌培養からの細菌の溶菌液の準備が必要である。この技術分野の専門家は、細菌を溶解させるための方法には精通している。本発明は、公知のアルカリ溶解のBirnboimの処理または手順（Birnboim & Doly，1979,and Birnboim,1982）に基づいて記載されているが、細菌の細胞を効果的に溶解しまたDNAを開放する任意の手順が適用可能である。典型的には、これらの手順は、細菌のペレットを溶液に加えることを含み、前記溶液は、溶液中で前記プラスミドDNAを引き離す間に細菌を破壊して開き、前記細菌の染色体、細胞膜および他の要素を沈殿させる。
したがって、関心のあるDNA配列を含むプラスミドで形を変えられた細菌を用いる小スケールのプラスミド純化手順のため、細菌培養の１−２mL試料がプレート・ウェルフォーマット（plate-well format）において遠心分離され、その結果、前記細菌が前記ウェルの底にペレット状に集まる。次に、前記液体を排出するために前記プレートがひっくり返される。５０mMのグルコース、２５mMトリスpH８の緩衝液、１０mMおよびpH８のエチレンジニトロロ四酢酸（EDTA）、および、100-1000μg/mLのRNAse A（RNAse Aの活性または活量に依存する濃度）の溶液が前記ペレットに加えられる。続いて、これに、細菌を溶解しかつ細菌タンパク質と染色体およびプラスミドDNAとを変性させる。0.2NのNaOHおよび１重量％のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の溶液が加えられる。最後に、pH5，３Ｍの酢酸カリウムの第３の溶液の添加が前記混合物を中和し、共有結合閉プラスミドをリアーニングさせる。前記染色体DNA、タンパク質および高分子量RNAが固形の塊に凝集する。前記した手順から得られた前記細胞溶菌液は、次に、沈殿の汚染を保ちまた前記プラスミドDNAを含む溶菌液が通過することを許すフィルタに前記溶菌液を通すことにより前記沈殿から分離される。
前記沈殿から前記溶菌液を分離するのに適当なフィルタは、十分に小さい孔サイズ、典型的には３μｍ以下と結合する低タンパク質である。９６ウェル方法（96 well technologies）を利用する高効率の手順をおいて、好ましいフィルタは９６ウェル・フィルタプレートの形態のものであり、このフィルタはニューヨーク州イーストヒルのPALL Corp.から入手可能であり、Loprodvne/Loprosprbの商標で販売されている。これは２相フィルタ膜システムからなり、その上層が目の詰んだ繊維状のメッシュからなり、また、その下層が３μｍの孔サイズのナイロン製膜からなる。この分野の専門家は、前記沈殿物から前記溶菌液を分離する他の方法が遠心分離ステップであることを理解するであろう。典型的な遠心分離方法では、約2500rpmで約５分間を必要とする。
本発明によれば、適当量のシリカが、高濃度のカオトロープ塩を含む溶液の存在下で前記溶解手順における濾過液として得られた細菌の溶菌液で処理される。様々なソースからのシリカが本発明の実施において適当であり、また、ガラス玉（ガラスビーズ）およびけい藻土を含むことができる。前記シリカの粒度は決定的なものではなく、ミクロン以下の直径から100μｍの直径の範囲とすることができる。好ましい実施例では、前記シリカは５μｍおよび１０μｍ間の平均粒度を有する。
好ましくは、前記シリカはヒドロキシル化（水酸化）され、豊富化された表面ヒドロキシル官能基を有する。このようなヒドロキシル化されたシリカは、カリフォルニア州フラートンのBeckman Instrumentsから入手可能であり、商標Ultrasphereで販売されている。
カオトロープ剤はこの分野では既知のものであり、また、DNA純化システムにおいて近頃使用されている。高濃度のカオトロープ剤の存在下において、DNAが選択的にシリカに結合される。明らかに、前記カオトロープ剤は水分子とDNAとの相互作用を低減し、その結果、DNAは、前記水性溶液中の残りより前記シリカの表面に優先的に水素結合する。カオトロープ剤は、チオシアン酸グアニジン、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウムおよび塩酸グアニジンを含むがこれらに限定されない本発明の実施に有用である。本発明の好ましい実施例は、6Mの塩酸グアニジンの水溶液を使用する。前記カオトロープざ剤が5Mから7Mの範囲の比較的高濃度で存在するとき、最良の結果が得られる。
本発明によれば、前記DNAが前記カオトロープ剤の存在下で前記シリカとの相互作用が可能とされた後、前記処理されたシリカが前記水性の混合物から分離される。種々の方法が、前記シリカが漏斗形の装置に詰め込まれその一方で前記シリカから前記水性の混合物が排出可能とすることを含む、前記水性の混合物を除去するために利用可能である。好ましい実施例では、処理されたシリカと水性の混合物との組合せがフィルタ膜を通される。前記膜は、堆積したDNAを有する処理されたシリカを捕え、前記カオトロープ剤と前記溶菌液からの不純物とを濾過液中に通すことを許す。この時点で、前記処理されたシリカは、また、少量のタンパク質性の物質と、他の細菌細胞成分であって十分に純粋なDNAを得るために除去されなければならないものとを含む。
このDNA純化方法における次の過程またはステップは、好ましくは水の９５重量％を超え、最も好ましくは水の約９９重量％である水性アルコールの第１の洗浄溶液で前記処理されたシリカを洗浄することを含む。この洗浄の過程は、前記処理されたシリカと前記洗浄溶液とを混合すること、結果として生じた混合物を培養すること、次に前記処理されかつ洗浄されたシリカから濾過液を分離することを含む。好ましくはこの分離は洗浄されたシリカを濾過することにより行われるが、しかし、遠心分離も代わりの分離方法である。この洗浄、培養および分離過程は、好ましくは、少なくとも一回、最も好ましくは２度繰り返される。
最後の洗浄過程は、前記第２の洗浄溶液が９５重量％未満であることを除き、前記第１の洗浄ステップで使用されたと同様の方法で処理され、洗浄されかつ濾過されたシリカを洗浄することを含む。最も好ましくは、前記第２の洗浄溶液は、約７５重量％のエチルアルコールである。この第２の洗浄ステップは一緒にされ、また、残りのカオトロープ剤とタンパク質性物質のような他の不純物または汚染物質とが溶液になるように数分間培養される。最後に、洗浄されたシリカは、適当なフィルタを介しての濾過によりまたは遠心分離により、濾過液から分離される。最適な結果を得るため、前記第２の洗浄ステップが少なくとも一回、最も好ましくは２度繰り返され、最後の濾過は前記シリカが乾燥するまで行われる。
本発明の実施に適当なアルコールは、メチルアルコール、エチルアルコールおよびイソプロピルアルコールであってこれらに限定されない低分子量で水溶性のものである。好ましい実施例では、前記アルコールはエチルアルコールであるが、本発明に従って処理されるDNAの純度および収量は任意の低アルキルアルコールを用いる場合も良好である。
処理されかつ洗浄されたシリカからアルコール洗浄溶液を分離するために適当なフィルタは、前記シリカを残すのに適当な孔寸法を有するほとんどのフィルタを含む。前記したように、本発明の利点は、９６ウェル・プレートの形態および自動化の適合性にある。この形態を採用する実施例では、特に好ましいフィルタは、PALL Corp.から入手可能でありまた商標Loprodyneで販売されている９６ウェル・フィルタプレート（96 well filter plate）である。このプレートのフィルタ部分は、３μｍの孔寸法を有する低タンパク質結合ナイロンである。
前記した２つの洗浄ステップの結果生じるものは、前記シリカの表面に堆積または沈殿した単離されたDNAであり、不要な細胞の不純物と過剰なカオトロープ剤とは前記洗浄濾過液中に除去される。次の使用のために純化されたDNAを回収するため、前記DNAは、DNAが溶離溶液中に存在することを除き、前記洗浄ステップに似た過程において前記シリカから溶離される。水は好ましい溶離媒体であり、DNAの配列決定において使用されるDNAには最も有利な点を提供する。有利なことに、水は特に適する溶離媒体であるため、結果として得られるDNAは塩から遊離している。特に洗浄溶液中に塩を含む従来の純化過程と異なり、本発明に従って純化されたDNAは実質的に塩から遊離している。引き続いて複数の例に示すように、このような塩遊離のDNAの配列を決定するとき、非常に限定された数の配列決定誤差が生じる。しかし、この分野の専門家には、DNAを扱う分野で知られた緩衝液の代表的な低塩濃度緩衝液が溶離媒体として利用可能であることが認識されている。
次の諸例は、本発明の実施例を示すために提供され、本発明を限定するものではない。
例 １
次の実験は、９６ウェルフォーマット、細菌培養、細胞溶解、洗浄、および適当な９６ウェルプレートで生じた溶離を用いて行われた。この実験は、代表的な細胞溶解および本発明に従うDNA純化過程を示す。
細菌培養準備
溶菌または溶解のための細菌を得るため、50μ g/mLまでのアンピシリンを含む２mLsの培養媒体を複数の小さい試験管に入れた。各試験管は、無菌の爪楊枝で、関心のあるコロニーを接触させて接種された。使用したＥコリ菌株は、プラスミドに基づくpBluescriptまたはpUCで形質転換されたαDH5およびXL1である。培養は、好気的に成長し、成長後に処理しまたはさらなる処理のために冷凍した。前記培養は矩形のウェルプレート（カリフォルニア州フラートンのBeckman Instrumentsからの）に移し、約2500回転で５分間遠心分離して細菌をペレット化し、液体を排出するために逆様にした。前記プレートは、次いで、Biomek自動研究室ワークステーション（カリフォルニア州フラートンのBeckman Instruments）におかれた。前記Biomekは、装置に設けられた一般的な指示に従って自動処理を行うようにプログラムを組まれている。
細菌溶菌液の準備
次の成分を有する、水性緩衝液および安定化溶液を準備した。50mMのグルコース、pH8，25mMのTris HCL、10mMのEDTA、850μ g/mlのRNAseA。これらの成分の全ては、Biodyneから購入したRNAseAを除いて、ミズーリ州セントルイスのSigma Chamicalsから購入した。次の成分を有する水性の溶菌溶液を準備した。0.2NのNaOHおよび１重量％のSDS。両成分はJT Bakerから購入した。最後に、pH5,3Mの酢酸カリウム（JT Bakerより）の第３の水溶液を準備した。
次のステップは、前記Biomekにより行われた個々の操作に基づいて記載されているが、手動によるピペット操作および移送操作によっても行うことができる。細菌細胞を溶解するため、100μＬの安定緩衝溶液と200μＬの溶解溶液とを細菌ペレットを含む各ウェルに加えた。前記ウェルは、５分間、室温で培養した。最後に、前記第３の溶液の150μＬが各ウェルに加えられ前記混合物を中和し、染色体DNAおよびタンパク質SDSの複合体を粘着性の塊に集める間に前記プラスミドDNAを優先的にリアニーリングし、溶液中に残した。
各ウェル中の混合物は、Loprodyne/Loprosorbフィルタプレートを通して濾過し、この間、９６ウェルプレートにおける他の対応する一組のウェルを通して透明な溶菌液を引張る真空を用いた。前記粘着性の塊は前記フィルタプレートに残った。
細菌溶菌液DNA純化
透明な細菌溶菌液の各ウェルに、175μＬのヒドロキシル化されたシリカのスラリ（１７重量％のシリカ）を加えた。前記ヒドロキシル化されたシリカはUltrashpereとして知られ、また、10μｍの粒度を有する。また、各ウェルに水性の6M塩酸グアニジン（JT Bakerから購入）溶液を加えた。溶菌液混合物、シリカおよび塩酸ブアニジン溶液の混合物は混合され、５分間置いた。９６ウェルのそれぞれにおける液体は、次いで、シリカの通過を許さない９６ウェルフィルタプレート（Loprodyne）に通した。
本発明の新規な洗浄ステップを次のようにして行った。各ウェルのシリカに、200μＬの水性の９９重量％のエチルアルコールを加えた。前記ウェルの内容を混合し、約５分間培養し、次いで、真空濾過方法を用いて前記洗浄溶液を濾過した。使用したフィルタは、Loprodyneプレートフィルタである。この洗浄過程は繰り返し行った。次に、200μＬの水性７５重量％のエチルアルコール溶液を、前記シリカを含む各ウェルに加えた。各ウェルの内容を混合し、５分間培養し、前記第１の洗浄ステップに関して説明したように濾過した。この第２の洗浄過程は２度繰り返した。最後に、前記シリカを露出して、乾燥するまで真空濾過を行った。
純粋な形態の単離されたDNAを回収するため、前記洗浄されたシリカを含む前記ウェルのそれぞれに７０μＬの水を加えた。前記９６ウェルプレートは約５分間培養した。収集プレートを前記フィルタプレート下に置き、前記シリカを濾過し、純粋なプラスミドを含む水を集めた。純粋なDNAの収量は、培養開始の少なくとも１μg/mLである。
例 ２
DNAの純度はDNA配列決定方法の成功のファクタであるため、自動化された蛍光サイクルDNA配列決定実験は、本発明に従って純化されたDNAの高い純度を示すために行った。以下に記載した議論および実験は、本発明に従って純化されたDNAがさらなる純化なしに自動配列決定に使用することができ、また、商業的に入手可能のシステムと比べて非常に優れた結果を提供することを示す。
前記したようにして準備された細菌の溶菌液は、本発明に従って、２つの商業的に利用可能であるDNAの純化手続およびDNAの純化過程の対象となる。より詳細には、Promega and Qiagenから購入したDNA純化キットは、製造業者の指示に従ってABI装置の自動蛍光サイクル配列決定のためのプラスミドを準備するために使用した。これらの実験のための細菌溶菌液は、上記例１で説明したように準備し、また、前記純化キット製造業者により推薦された手続に従って行った。加えて、例１で説明したように準備した、純化したプラスミドDNAを同じ装置の自動配列決定に用いた。配列決定されたプラスミドは、それぞれ、αDH5およびXL1において形質転換されたpBluescript（pBlue）である。表１は、３５０塩基配列、４００塩基配列、４５０塩基配列および５００塩基配列のそれぞれのための配列決定の実行における配列決定誤差数の形態で配列決定データを提供する。絶対誤差以外の配列決定アンビギュイティーは、表１において（±）で示されている。
Qiagenにより供給された純化プロセスは、陰イオン交換方法、これに引き続くシリカ結合ステップ、その後の約８０％のエタノールを含む洗浄である。Promegaにより供給された純化プロセスは、８３mMのNaClおよび８mMのTris HCL pH7.5の水性緩衝水における５５％エチルアルコールにより引き継がれるシリカ結合ステップである。上に示した配列決定結果から分かるように、Promegaのシリカを基本とするプロセスは、自動DNA配列決定分析に適する純度であるように再沈殿および洗浄のような追加の純化手続を必要とする。対照的に、本発明に従って準備されたDNAは、第１の高アルコール濃度および第２の低アルコール濃度の２つの洗浄後、使用のためには十分な純度である。
例 ３
回収したDNAの純度上のアルコールの可変濃度の効果を示すため、例１に記載したように準備した細菌溶菌液を用いて実験を行った。例１に示した純化プロセスも、また、洗浄に用いられた水中のアルコールの可変の量を除いて、これらの実験に組み入れた。純化されたプラスミドは、DNAの収量を決定するために紫外線分光光度計260nmにおける吸光度について分析した。表IIに示された結果は、各純化または精製についての同じ培養バッチを用いる培養のμg/mL中の全収量を示す。
表IIは、９９重量％エチルアルコールの第１の洗浄溶液が７５重量％エチルアルコールの洗浄溶液と組み合わされるとき、収量が一般に高くなることを示す。さらに、２６０における吸光度の測定から得られた収量データに加えて、280nmにおけるタンパク質のピークを観察することにより不純レベルに関する情報を得ることができる。第１の洗浄で１００％のエチルアルコールを用いると、前記不純レベルは最大となり、相対的に受け入れ不能であった。
例 ４
自動蛍光サイクルシークエンサーを用いて配列決定されるように異なる濃度のエチルアルコールを用いて純化されたDNAの能力を分析するために他の実験を行った。これらの試料は、例１および例２で記載したようにして得、また、分析した。第１の洗浄溶液は表IIIに示すように変わり、また、第２の洗浄溶液は７５重量％のエチルアルコール水溶液であった。２つの菌株（strain）を成長させ、純化し、配列決定した−プラスミドpUC18＋1.5KB挿入断片を有するαDH5およびプラスミドpB1＋1.5KB挿入断片を有するXL1。表IIIは、次の自動配列決定の間に観察された配列決定誤差の数に基づいて３５０塩基配列、４００塩基配列、４５０塩基配列および５００塩基配列の配列決定の結果を示す。
上記のデータにより、９８重量％または９９重量％のエチルアルコールを用いる第１の洗浄が、さらなる純化過程なしに良好な配列決定データを提供することがわかる。
例 ５
以下は、本発明に従って洗浄溶液として他の低アルキルアルコールを使用する適用可能性を示す。例１に記載したように、培養を準備し、また、透明にされた溶菌液でシリカを処理した。シリカは、次に、種々の洗浄過程で露出させた。表IVは結果を示す。
上記の例は本発明のいくつかの実施例について記載したものであって、本発明を限定するものではない。この分野の専門家には、上記の発明の範囲内において多くの変更が可能であることが理解されよう、例えば、粒子結合担体がシリカとして記載されている。しかし、ガラス玉、けい藻土および他の類似の固形粒子も適することは、この分野の専門家に明らかであろう。
発明の分野
本発明は、一般的には、DNAおよび他の物質を含む不均質または異種の混合物からDNAを単離しまた純化することに関する。具体的には、本発明は、容易に利用可能である緩衝液、溶媒および材料を用いて高純度のDNAを得るための方法および試薬に関する。本発明は自動化された研究室計装への適用に好適であり、また、自動化された蛍光サイクルDNAシークエンサーを含むほとんどの適用要求に対する使用に十分な高純度のDNAを提供する。
関連技術の説明
分子生物学の急速な発展により、様々な異なる出所すなわちソースからDNAを単離し、純化する能力について数多くの強調がなされてきた。DNAは、そのソースによって、タンパク質、脂質およびその他の分子成分を含む様々な成分と共に混合物中に存在する。これらの混合物からDNAを単離し、単離されたDNAを引き続き純化する能力は、組換えDNAの研究および方法、遺伝研究、および分子診断学を含む多くの方法論において重要である。特に、自動蛍光サイクル・シークエンサーの使用が増えるにしたがって、高度に純化されたDNAについての効率の高い方法が望まれるようになってきた。DNAのソースは、プラスミドDNA、コスミドDNAもしくは他のベクターを含む処理された細菌または酵母菌の溶菌液、ゲノムDNAを含む血液もしくは尿、組換えファージ溶菌液、DNA増幅反応、および分子生物学的方法で使用される他のシステムを含む。
近年、数多くの単離および純化の方法が報告されまた商業化されてきた。初期の方法は、広範囲の遠心分離過程、または、水性フェノールまたはクロロフォルムにエタノールを加えて使用する２相抽出の沈殿および洗浄過程に依存していた。これらの方法は時間を浪費し、また、高価な計装と、高価でありまた有害な試薬とを必要とする。さらに、１層を他の相から除去すべくこれをピペットで移し替える必要があるため、抽出および沈殿方法は自動化することが難しい。クロマトグラフィ、特に高圧液体クロマトグラフィおよびカラムクロマトグラフィは、短鎖核酸にはうまく利用されてきた。しかし、長鎖核酸には過度の機械的撹拌から鎖切断がしばしば生じる。
最近、商業化された純化システムは、けい藻土の調整またはガラス玉（ビーズ）のようなガラスおよび/またはケイ酸塩の表面に結合させるDNAの能力に信■をおいている。これらのシステムは、引き続く固定化DNAおよびシリカの洗浄と次の前記ガラスまたはケイ酸塩の表面からのDNAの溶離とのために低イオン強度の緩衝液および有機溶媒のような不均質な混合物および溶液からDNAを単離するためのガラスまたはケイ酸塩を提供する。これらのシステムに付随する共通の不利点は、単離されたDNAが、自動化された蛍光サイクルDNAの配列決定および次の増幅反応のような多くの特別な要求手順のためには十分に純粋ではないことである。したがって、溶離され、回収されたDNAのさらなる純化が求められ、次に、純化プロセスに要するさらなる時間と費用とが加わる。さらに、それは、クロマトグラフィのカラムの使用と、沈殿および再懸濁の過程とを必要とすることがあるため、さらなる純化は、ふつうの研究室の自動計装についての使用には適合しない。
近年、混合物からDNAを単離するための他の方法論が示唆されている。例えば、米国特許第5,057,426号明細書は、DNAを含む混合物から該DNAを分離するのに、前記DNAを陰イオン交換樹脂に固定し、濾過により前記混合物から前記樹脂を除去することを示唆する。前記樹脂から前記固定DNAを回収するため、前記DNAは、前記陰イオン交換樹脂上のサイトを得るために張り合う塩または他のイオンシステムを用いて別個に溶離される。
異なったやり方につき、米国特許第4,923,978号明細書は、ガラス玉またはシリカのような固形の物質をその表面が親水性の物質で被覆されるように処理することを示唆する。これらの表面は、タンパク質性の物質および非DNAを選択的に結合するといわれている。したがって、混合物を含むDNAおよびタンパク質が前記処理された固形物質と接触することを可能とし、続いて前記処理済みの物質を除去し、懸濁されまたは溶液中にある単離DNAを後方に離すことにより、DNAを単離することができる。
ヨーロッパ特許出願第0 512 767 A1号は、結合剤としてのエチルアルコールを100％まで使用して、シリカのような固形粒子の表面にDNAを結合することを容易にするために代表的に使用されるカオトロープ（chaotrope）と置き換えることを示唆する。このプロセスは、自動蛍光サイクル配列決定に使用するための固形粒子の表面からDNAを除去することに引き続くさらなる純化を求めるものとして特徴づけられる。ほとんどの細菌プラスミド純化方法論の特徴は、アルカリ溶解手順であり、次に、カオトロープの存在下でのシリカによる処理および次の洗浄過程および溶離過程が引き続く。自動蛍光サイクルDNA配列決定の適用に適するDNAを得るため、これらの方法は、カラム濾過、または他の洗浄および純化DNAの再懸濁により引き継がれる再沈殿を含むさらなる純化を必要とする。一般に、これらの多段階の純化プロセスは労働集約的であると考えられる。
さらに、最近の研究室自動化の強調と共に、ロボット化が容易に適合可能であるDNA純化方法に対する興味が増大している。シリカの洗浄後におけるさらなる純化を必要とする、現在使用中の一般的な、シリカを基本とする単離および純化システムは、ロボットシステムには適しない。
したがって、本発明の目的は、後の洗浄沈殿および洗浄を必要とすることなしに自動蛍光サイクル配列決定の適用のために十分に純粋であるプラスミドDNAを単離しかつ回収するための方法を提供することにある。
本発明の他の目的は、自動研究室システムに容易に適合可能であるプラスミドDNA純化方法を提供することにある。
さらに、本発明の他の目的は、高価な装置および試薬を必要としないDNA純化方法を提供することにある。
発明の概要
本発明は、新規な洗浄の過程（ステップ）を含むDNAの単離および純化方法を提供することにより前記した目的を達成する。より詳細には、本発明の方法は、カオトロープ塩溶液（chaotropic salt solution）の存在下でDNAを含む均質な混合物でシリカを処理することにより前記均質な混合物からDNAを単離しかつ純化し、次いで、水性アルコール洗浄溶液で、連続する洗浄ステップにおいて、処理されたシリカを洗浄することを提供する。第１の洗浄ステップは、少なくとも９５重量％のアルコール水溶液からなる第１の洗浄溶液で前記被処理シリカを洗浄することを含む。第２のステップは、９５重量％未満のアルコール水溶液からなる第２の溶液で、前記の処理されかつ洗浄されたシリカを洗浄することを含む。各洗浄ステップに引き続き、洗浄システムから不要の物質と不純物とを除去するため、使用後の洗浄溶液が前記洗浄されたシリカから分離される。
本発明に従って、DNAを含む混合物にさらされたシリカを洗浄するとき、前記処理されかつ洗浄されたシリカは、自動蛍光サイクル配列決定方法論で使用するに十分な純度のDNAを含む。引き続く使用のために前記シリカの表面から単離されかつ純化されたDNAを回収するため、前記シリカが水または低イオン強度の緩衝液と組み合わされた水で単に洗浄される。これが、前記シリカから洗浄水に前記DNAを溶離させる。前記シリカから、溶離されたDNAを含む溶液を分離した後、純化または精製されたDNAはいつでも使用することができる。
本発明の好ましい実施例では、第１および第２の洗浄溶液は、それぞれ、水中に約95-99重量％のエチルアルコールが存在するものおよび水中に約70-85重量％のエチルアルコールが存在するものからなる。最も好ましい第１および第２の洗浄溶液は、それぞれ、約99重量％のエチルアルコール水溶液および約75重量％のエチルアルコール水溶液からなる。しかし、DNAのソースにより、この技術分野の専門家は、第１の洗浄のための95-99重量％間および第２の洗浄のための70-85重量％間のアルコール量を最適にすると考えられる。加えて、これらの専門家には、洗浄後のシリカから洗浄後の溶液を分離することが各洗浄ステップに引き続いて適当なサイズのフィルタを介して前記シリカを濾過することを優先的に含むことは理解されよう。これは、各洗浄ステップに引き続いて前記シリカから除去された不要の不純物を除去することを提供する。
本発明の新規な洗浄ステップは、実質的に全てのタンパク質性物質、脂質、不要な細胞片と、DNA混合物をシリカに最初に露出させるに際して使用された前記カオトロープ塩とを除去する一方、前記シリカに対する制限を維持するためのDNAに関する環境を提供するという効果を有する。続く前記シリカからの単離DNAの溶離は、溶媒沈殿および引き続く洗浄またはスピンカラム純化のようなさらなる純化ステップを要しない十分な純度のＤＮＡを提供する。したがって、本発明は、従来の材料および廉価な装置を用いるシンプルで時間を節約する方法を提供する。選択的に、本発明の単純性は、例えばロボット化研究室装置を用いるDNAの単離および純化プロセスまたは過程の完全な自動化を可能にする。
本発明の方法に付随するさらなる利点は、以下の詳細な説明に記載された本発明の理解によりこの技術分野の専門家により理解されよう。
発明の詳細な説明
本発明は、シリカに基礎をおくDNA純化方法が非常に低濃度の水性アルコール溶液により引き継がれる非常に高濃度の水性アルコール溶液の連続的な洗浄ステップを利用するとき、DNAが前記シリカから溶離しまた非常に高い純度を有するという発見に基づいている。本発明は、従来の方法すなわち一つの洗浄ステップを組み入れ、重要な塩の集合物を有する洗浄溶液を利用し、過剰な塩を除去するために後の洗浄再沈殿を要するものとは異なる。有利なことに、本発明は、溶媒の再沈殿およびスピンカラム溶離のような後の溶離純化を必要としない。
概して、本発明は、DNAおよび他の物質の均質な混合物からDNAを単離する方法を含み、また、前記均質な混合物およびカオトロープ（chaotrope）でのシリカの第１の処理と、引き続く第１および第２の洗浄溶液のそれぞれによる前記処理されたシリカの洗浄とを含む。前記第１の洗浄溶液は水中に少なくとも９５重量％のアルコールを有し、また、前記第２の洗浄溶液は水中に９５重量％未満のアルコールを有する。本発明は、さらに、前記第１および第２の洗浄ステップに引き続く、前記洗浄されたシリカからの洗浄溶液の分離を提供する。これは、過剰なカオトロープおよび非結合の細胞物質が前記シリカの処理後に除去されることを保証する。連続的な洗浄ステップおよび分離ステップは、カオトロープ溶液の存在下で前記DNA混合物でのシリカの第１の処理に関連して行われるとき、前記シリカの表面に単離された純粋なDNAを提供する。
好ましい実施例では、各洗浄ステップは２度繰り返され、また、さらに、適当な洗浄溶液で前記処理されたシリカを混合することを含み、前記処理されたシリカおよび洗浄溶液の混合物を培養し、次に、適当なサイズのフィルタを通して前記培養された混合物を濾過する。本発明によれば、また、純化されたDNAを回収するため、単離されたDNAを含む洗浄され、濾過されおよび乾燥されたシリカは水または低イオン強度緩衝液で溶離される。
いかなるソース（出所）からのDNAも、本発明の方法に従って純化される。この技術分野の専門家には、DNAの純化の手順に日常的に適用される多くの物質と過程との混合は馴染みの深いものであろう。典型的なソースは、a)血液、尿、精液等の臨床用試料、b)ゲノムライブラリー、c)PCRまたは他の増幅反応システム、d)細菌の溶菌液、およびe)ウイルスを含む。分子生物学者は、DNAのクローニングおよび/または配列決定のために細菌からプラスミドを回収することに関して精通している。この理由から、本発明は、細菌のソースから純化されたプラスミドを単離しかつ回収することに関して記載されている。これらの専門家には、しかし、本発明がDNAのいかなるソースにも適用可能であることは理解されよう。
以下に説明するように、本発明の好ましい実施例は、水中に約９９重量％のエチルアルコールを有する第１の洗浄溶液と、水中に約７５重量％のエチルアルコールを有する第２の洗浄溶液との使用を含む。しかし、９５重量％を越えるアルコールを有する水性を基本とする第１の洗浄溶液は、外見上、対抗する不純物を除去する間に前記シリカへの結合を維持するように前記DNAのための環境を付与する。水性を基本とする第２の洗浄溶液は、非常に多量の水（９５重量％未満のアルコール）を提供し、また、前記単離されたDNAが前記シリカの表面に結合されたままである間に前記不純物の残りを効果的に除去する。一般に、前記第１の洗浄ステップにおける水の量が９５重量％のアルコールより少ない場合、DNAの収量は減少して純度が向上することが決定されている。同様に、前記第１の洗浄溶液に１００重量％のアルコールが用いられる場合、前記収量は向上するが、結果として生じるDNAは相当量の不純物を含む。
既に述べたように、本発明の典型的な方法は、細菌の溶菌液からの純化されたプラスミドの回収を含む。したがって、典型的な純化過程は、まず、細菌培養からの細菌の溶菌液の準備が必要である。この技術分野の専門家は、細菌を溶解させるための方法には精通している。本発明は、公知のアルカリ溶解のBirnboimの処理または手順（Birnboim & Doly，1979,and Birnboim,1982）に基づいて記載されているが、細菌の細胞を効果的に溶解しまたDNAを開放する任意の手順が適用可能である。典型的には、これらの手順は、細菌のペレットを溶液に加えることを含み、前記溶液は、溶液中で前記プラスミドDNAを引き離す間に細菌を破壊して開き、前記細菌の染色体、細胞膜および他の要素を沈殿させる。
したがって、関心のあるDNA配列を含むプラスミドで形を変えられた細菌を用いる小スケールのプラスミド純化手順のため、細菌培養の１−２mL試料がプレート・ウェルフォーマット（plate-well format）において遠心分離され、その結果、前記細菌が前記ウェルの底にペレット状に集まる。次に、前記液体を排出するために前記プレートがひっくり返される。５０mMのグルコース、２５mMトリスpH８の緩衝液、１０mMおよびpH８のエチレンジニトロロ四酢酸（EDTA）、および、100-1000μg/mLのRNAse A（RNAse Aの活性または活量に依存する濃度）の溶液が前記ペレットに加えられる。続いて、これに、細菌を溶解しかつ細菌タンパク質と染色体およびプラスミドDNAとを変性させる。0.2NのNaOHおよび１重量％のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の溶液が加えられる。最後に、pH5，３Ｍの酢酸カリウムの第３の溶液の添加が前記混合物を中和し、共有結合閉プラスミドをリアーニングさせる。前記染色体DNA、タンパク質および高分子量RNAが固形の塊に凝集する。前記した手順から得られた前記細胞溶菌液は、次に、沈殿の汚染を保ちまた前記プラスミドDNAを含む溶菌液が通過することを許すフィルタに前記溶菌液を通すことにより前記沈殿から分離される。
前記沈殿から前記溶菌液を分離するのに適当なフィルタは、十分に小さい孔サイズ、典型的には３μｍ以下と結合する低タンパク質である。９６ウェル方法（96 well technologies）を利用する高効率の手順をおいて、好ましいフィルタは９６ウェル・フィルタプレートの形態のものであり、このフィルタはニューヨーク州イーストヒルのPALL Corp.から入手可能であり、Loprodvne/Loprosprbの商標で販売されている。これは２相フィルタ膜システムからなり、その上層が目の詰んだ繊維状のメッシュからなり、また、その下層が３μｍの孔サイズのナイロン製膜からなる。この分野の専門家は、前記沈殿物から前記溶菌液を分離する他の方法が遠心分離ステップであることを理解するであろう。典型的な遠心分離方法では、約2500rpmで約５分間を必要とする。
本発明によれば、適当量のシリカが、高濃度のカオトロープ塩を含む溶液の存在下で前記溶解手順における濾過液として得られた細菌の溶菌液で処理される。様々なソースからのシリカが本発明の実施において適当であり、また、ガラス玉（ガラスビーズ）およびけい藻土を含むことができる。前記シリカの粒度は決定的なものではなく、ミクロン以下の直径から100μｍの直径の範囲とすることができる。好ましい実施例では、前記シリカは５μｍおよび１０μｍ間の平均粒度を有する。
好ましくは、前記シリカはヒドロキシル化（水酸化）され、豊富化された表面ヒドロキシル官能基を有する。このようなヒドロキシル化されたシリカは、カリフォルニア州フラートンのBeckman Instrumentsから入手可能であり、商標Ultrasphereで販売されている。
カオトロープ剤はこの分野では既知のものであり、また、DNA純化システムにおいて近頃使用されている。高濃度のカオトロープ剤の存在下において、DNAが選択的にシリカに結合される。明らかに、前記カオトロープ剤は水分子とDNAとの相互作用を低減し、その結果、DNAは、前記水性溶液中の残りより前記シリカの表面に優先的に水素結合する。カオトロープ剤は、チオシアン酸グアニジン、ヨウ化ナトリウム、過塩素酸ナトリウムおよび塩酸グアニジンを含むがこれらに限定されない本発明の実施に有用である。本発明の好ましい実施例は、6Mの塩酸グアニジンの水溶液を使用する。前記カオトロープざ剤が5Mから7Mの範囲の比較的高濃度で存在するとき、最良の結果が得られる。
本発明によれば、前記DNAが前記カオトロープ剤の存在下で前記シリカとの相互作用が可能とされた後、前記処理されたシリカが前記水性の混合物から分離される。種々の方法が、前記シリカが漏斗形の装置に詰め込まれその一方で前記シリカから前記水性の混合物が排出可能とすることを含む、前記水性の混合物を除去するために利用可能である。好ましい実施例では、処理されたシリカと水性の混合物との組合せがフィルタ膜を通される。前記膜は、堆積したDNAを有する処理されたシリカを捕え、前記カオトロープ剤と前記溶菌液からの不純物とを濾過液中に通すことを許す。この時点で、前記処理されたシリカは、また、少量のタンパク質性の物質と、他の細菌細胞成分であって十分に純粋なDNAを得るために除去されなければならないものとを含む。
このDNA純化方法における次の過程またはステップは、好ましくは水の９５重量％を超え、最も好ましくは水の約９９重量％である水性アルコールの第１の洗浄溶液で前記処理されたシリカを洗浄することを含む。この洗浄の過程は、前記処理されたシリカと前記洗浄溶液とを混合すること、結果として生じた混合物を培養すること、次に前記処理されかつ洗浄されたシリカから濾過液を分離することを含む。好ましくはこの分離は洗浄されたシリカを濾過することにより行われるが、しかし、遠心分離も代わりの分離方法である。この洗浄、培養および分離過程は、好ましくは、少なくとも一回、最も好ましくは２度繰り返される。
最後の洗浄過程は、前記第２の洗浄溶液が９５重量％未満であることを除き、前記第１の洗浄ステップで使用されたと同様の方法で処理され、洗浄されかつ濾過されたシリカを洗浄することを含む。最も好ましくは、前記第２の洗浄溶液は、約７５重量％のエチルアルコールである。この第２の洗浄ステップは一緒にされ、また、残りのカオトロープ剤とタンパク質性物質のような他の不純物または汚染物質とが溶液になるように数分間培養される。最後に、洗浄されたシリカは、適当なフィルタを介しての濾過によりまたは遠心分離により、濾過液から分離される。最適な結果を得るため、前記第２の洗浄ステップが少なくとも一回、最も好ましくは２度繰り返され、最後の濾過は前記シリカが乾燥するまで行われる。
本発明の実施に適当なアルコールは、メチルアルコール、エチルアルコールおよびイソプロピルアルコールであってこれらに限定されない低分子量で水溶性のものである。好ましい実施例では、前記アルコールはエチルアルコールであるが、本発明に従って処理されるDNAの純度および収量は任意の低アルキルアルコールを用いる場合も良好である。
処理されかつ洗浄されたシリカからアルコール洗浄溶液を分離するために適当なフィルタは、前記シリカを残すのに適当な孔寸法を有するほとんどのフィルタを含む。前記したように、本発明の利点は、９６ウェル・プレートの形態および自動化の適合性にある。この形態を採用する実施例では、特に好ましいフィルタは、PALL Corp.から入手可能でありまた商標Loprodyneで販売されている９６ウェル・フィルタプレート（96 well filter plate）である。このプレートのフィルタ部分は、３μｍの孔寸法を有する低タンパク質結合ナイロンである。
前記した２つの洗浄ステップの結果生じるものは、前記シリカの表面に堆積または沈殿した単離されたDNAであり、不要な細胞の不純物と過剰なカオトロープ剤とは前記洗浄濾過液中に除去される。次の使用のために純化されたDNAを回収するため、前記DNAは、DNAが溶離溶液中に存在することを除き、前記洗浄ステップに似た過程において前記シリカから溶離される。水は好ましい溶離媒体であり、DNAの配列決定において使用されるDNAには最も有利な点を提供する。有利なことに、水は特に適する溶離媒体であるため、結果として得られるDNAは塩から遊離している。特に洗浄溶液中に塩を含む従来の純化過程と異なり、本発明に従って純化されたDNAは実質的に塩から遊離している。引き続いて複数の例に示すように、このような塩遊離のDNAの配列を決定するとき、非常に限定された数の配列決定誤差が生じる。しかし、この分野の専門家には、DNAを扱う分野で知られた緩衝液の代表的な低塩濃度緩衝液が溶離媒体として利用可能であることが認識されている。
次の諸例は、本発明の実施例を示すために提供され、本発明を限定するものではない。
例 １
次の実験は、９６ウェルフォーマット、細菌培養、細胞溶解、洗浄、および適当な９６ウェルプレートで生じた溶離を用いて行われた。この実験は、代表的な細胞溶解および本発明に従うDNA純化過程を示す。
細菌培養準備
溶菌または溶解のための細菌を得るため、50μ g/mLまでのアンピシリンを含む２mLsの培養媒体を複数の小さい試験管に入れた。各試験管は、無菌の爪楊枝で、関心のあるコロニーを接触させて接種された。使用したＥコリ菌株は、プラスミドに基づくpBluescriptまたはpUCで形質転換されたαDH5およびXL1である。培養は、好気的に成長し、成長後に処理しまたはさらなる処理のために冷凍した。前記培養は矩形のウェルプレート（カリフォルニア州フラートンのBeckman Instrumentsからの）に移し、約2500回転で５分間遠心分離して細菌をペレット化し、液体を排出するために逆様にした。前記プレートは、次いで、Biomek自動研究室ワークステーション（カリフォルニア州フラートンのBeckman Instruments）におかれた。前記Biomekは、装置に設けられた一般的な指示に従って自動処理を行うようにプログラムを組まれている。
細菌溶菌液の準備
次の成分を有する、水性緩衝液および安定化溶液を準備した。50mMのグルコース、pH8，25mMのTris HCL、10mMのEDTA、850μ g/mlのRNAseA。これらの成分の全ては、Biodyneから購入したRNAseAを除いて、ミズーリ州セントルイスのSigma Chamicalsから購入した。次の成分を有する水性の溶菌溶液を準備した。0.2NのNaOHおよび１重量％のSDS。両成分はJT Bakerから購入した。最後に、pH5,3Mの酢酸カリウム（JT Bakerより）の第３の水溶液を準備した。
次のステップは、前記Biomekにより行われた個々の操作に基づいて記載されているが、手動によるピペット操作および移送操作によっても行うことができる。細菌細胞を溶解するため、100μＬの安定緩衝溶液と200μＬの溶解溶液とを細菌ペレットを含む各ウェルに加えた。前記ウェルは、５分間、室温で培養した。最後に、前記第３の溶液の150μＬが各ウェルに加えられ前記混合物を中和し、染色体DNAおよびタンパク質SDSの複合体を粘着性の塊に集める間に前記プラスミドDNAを優先的にリアニーリングし、溶液中に残した。
各ウェル中の混合物は、Loprodyne/Loprosorbフィルタプレートを通して濾過し、この間、９６ウェルプレートにおける他の対応する一組のウェルを通して透明な溶菌液を引張る真空を用いた。前記粘着性の塊は前記フィルタプレートに残った。
細菌溶菌液DNA純化
透明な細菌溶菌液の各ウェルに、175μＬのヒドロキシル化されたシリカのスラリ（１７重量％のシリカ）を加えた。前記ヒドロキシル化されたシリカはUltrashpereとして知られ、また、10μｍの粒度を有する。また、各ウェルに水性の6M塩酸グアニジン（JT Bakerから購入）溶液を加えた。溶菌液混合物、シリカおよび塩酸ブアニジン溶液の混合物は混合され、５分間置いた。９６ウェルのそれぞれにおける液体は、次いで、シリカの通過を許さない９６ウェルフィルタプレート（Loprodyne）に通した。
本発明の新規な洗浄ステップを次のようにして行った。各ウェルのシリカに、200μＬの水性の９９重量％のエチルアルコールを加えた。前記ウェルの内容を混合し、約５分間培養し、次いで、真空濾過方法を用いて前記洗浄溶液を濾過した。使用したフィルタは、Loprodyneプレートフィルタである。この洗浄過程は繰り返し行った。次に、200μＬの水性７５重量％のエチルアルコール溶液を、前記シリカを含む各ウェルに加えた。各ウェルの内容を混合し、５分間培養し、前記第１の洗浄ステップに関して説明したように濾過した。この第２の洗浄過程は２度繰り返した。最後に、前記シリカを露出して、乾燥するまで真空濾過を行った。
純粋な形態の単離されたDNAを回収するため、前記洗浄されたシリカを含む前記ウェルのそれぞれに７０μＬの水を加えた。前記９６ウェルプレートは約５分間培養した。収集プレートを前記フィルタプレート下に置き、前記シリカを濾過し、純粋なプラスミドを含む水を集めた。純粋なDNAの収量は、培養開始の少なくとも１μg/mLである。
例 ２
DNAの純度はDNA配列決定方法の成功のファクタであるため、自動化された蛍光サイクルDNA配列決定実験は、本発明に従って純化されたDNAの高い純度を示すために行った。以下に記載した議論および実験は、本発明に従って純化されたDNAがさらなる純化なしに自動配列決定に使用することができ、また、商業的に入手可能のシステムと比べて非常に優れた結果を提供することを示す。
前記したようにして準備された細菌の溶菌液は、本発明に従って、２つの商業的に利用可能であるDNAの純化手続およびDNAの純化過程の対象となる。より詳細には、Promega and Qiagenから購入したDNA純化キットは、製造業者の指示に従ってABI装置の自動蛍光サイクル配列決定のためのプラスミドを準備するために使用した。これらの実験のための細菌溶菌液は、上記例１で説明したように準備し、また、前記純化キット製造業者により推薦された手続に従って行った。加えて、例１で説明したように準備した、純化したプラスミドDNAを同じ装置の自動配列決定に用いた。配列決定されたプラスミドは、それぞれ、αDH5およびXL1において形質転換されたpBluescript（pBlue）である。表１は、３５０塩基配列、４００塩基配列、４５０塩基配列および５００塩基配列のそれぞれのための配列決定の実行における配列決定誤差数の形態で配列決定データを提供する。絶対誤差以外の配列決定アンビギュイティーは、表１において（±）で示されている。
例 ３
回収したDNAの純度上のアルコールの可変濃度の効果を示すため、例１に記載したように準備した細菌溶菌液を用いて実験を行った。例１に示した純化プロセスも、また、洗浄に用いられた水中のアルコールの可変の量を除いて、これらの実験に組み入れた。純化されたプラスミドは、DNAの収量を決定するために紫外線分光光度計260nmにおける吸光度について分析した。表IIに示された結果は、各純化または精製についての同じ培養バッチを用いる培養のμg/mL中の全収量を示す。
例 ４
自動蛍光サイクルシークエンサーを用いて配列決定されるように異なる濃度のエチルアルコールを用いて純化されたDNAの能力を分析するために他の実験を行った。これらの試料は、例１および例２で記載したようにして得、また、分析した。第１の洗浄溶液は表IIIに示すように変わり、また、第２の洗浄溶液は７５重量％のエチルアルコール水溶液であった。２つの菌株（strain）を成長させ、純化し、配列決定した−プラスミドpUC18＋1.5KB挿入断片を有するαDH5およびプラスミドpB1＋1.5KB挿入断片を有するXL1。表IIIは、次の自動配列決定の間に観察された配列決定誤差の数に基づいて３５０塩基配列、４００塩基配列、４５０塩基配列および５００塩基配列の配列決定の結果を示す。
例 ５
以下は、本発明に従って洗浄溶液として他の低アルキルアルコールを使用する適用可能性を示す。例１に記載したように、培養を準備し、また、透明にされた溶菌液でシリカを処理した。シリカは、次に、種々の洗浄過程で露出させた。表IVは結果を示す。
Claims (16)
- ＤＮＡと他の物質との均質な混合物からＤＮＡを単離する方法であって、
ａ）カオトロープの存在下でシリカを前記均質な混合物で処理すること、
ｂ）前記処理されたシリカを少なくとも９５重量％のアルコールからなる第１の洗浄溶液で洗浄すること、
ｃ）前記処理されかつ洗浄されたシリカを９５重量％未満のアルコール水溶液からなる第２の洗浄溶液で洗浄し、単離された前記ＤＮＡを前記シリカの表面に据えることを含む、DNAの単離方法。 - さらに、前記ステップ（ｃ）の後に前記洗浄されたシリカを水性溶液で処理することにより前記シリカの表面から純化された前記ＤＮＡを溶離することを含む、請求項１に記載の方法。
- 前記ステップ（ｂ）および（ｃ）を繰り返して行う、請求項１に記載の方法。
- 前記アルコールはエチルアルコールである、請求項１に記載の方法。
- 前記第１の洗浄溶液は９５−９９重量％のアルコール水溶液である、請求項１に記載の方法。
- 前記第２の洗浄溶液は７０−８５重量％のアルコール水溶液である、請求項１に記載の方法。
- 前記第１の洗浄溶液は９９重量％のエチルアルコール水溶液であり、前記第２の洗浄溶液は７５重量％のエチルアルコール水溶液である、請求項１に記載の方法。
- さらに、前記ステップ（ａ）の後に前記処理されたシリカを濾過によって分離することを含む、請求項７に記載の方法。
- 均質な混合物からＤＮＡを単離する方法において、該方法は、シリカを前記均質な混合物で処理することおよび前記処理されたシリカをエタノールを含む溶液で洗浄することを含み、さらに、
ａ）カオトロープの存在下で前記シリカを前記均質な混合物中で処理すること、
ｂ）前記処理されたシリカを９５重量％以上のアルコール水溶液からなる第１の洗浄溶液で洗浄すること、および
ｃ）前記洗浄されたシリカを９５重量％未満のアルコール水溶液からなる第２の洗浄溶液で洗浄することを含む、DNAの単離方法。 - 前記アルコールはエチルアルコールである、請求項９に記載の方法。
- 前記第１の洗浄溶液は９５−９９重量％のエチルアルコール水溶液である、請求項９に記載の方法。
- 前記第２の洗浄溶液は７０−８５重量％のエチルアルコール水溶液である、請求項９に記載の方法。
- ＤＮＡと他の物質との均質な混合物からＤＮＡを単離および純化する方法であって、
ａ）カオトロープ塩溶液の存在下でシリカを前記均質な混合物で処理すること、
ｂ）前記処理されたシリカを前記カオトロープ塩溶液および前記均質な混合物から分離すること、
ｃ）前記処理されかつ分離されたシリカを少なくとも９５重量％のエチルアルコールを含む第１の洗浄溶液で洗浄すること、
ｄ）前記洗浄されたシリカを前記第１の洗浄溶液から分離すること、
ｅ）前記ステップ（ｄ）で濾過された前記シリカを９５重量％未満のエチルアルコール水溶液からなる第２の洗浄溶液で洗浄し、単離された前記ＤＮＡを前記シリカの表面に据えること、
ｆ）前記洗浄されたシリカを前記第２の洗浄溶液から分離すること、および
ｇ）前記ステップ（ｆ）で洗浄された前記シリカを水性溶液で洗浄すること
により前記ＤＮＡを前記シリカから溶離することを含む、DNAの単離および純化方法。 - 前記第１の洗浄溶液は９５−９９重量％のエチルアルコール水溶液である、請求項１３に記載の方法。
- 前記第２の洗浄溶液は７０−８５重量％のエチルアルコール水溶液である、請求項１３に記載の方法。
- 前記カオトロープ塩溶液は濃縮された塩酸グアニジンである、請求項１３に記載の方法。
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