CN114127283A - 用于纯化信使rna的方法 - Google Patents

Abstract

本发明尤其提供了在不使用任何苛性或易燃溶剂的情况下用于纯化适合于临床使用的高质量信使RNA(mRNA)的方法。本发明部分基于令人惊讶的发现，即mRNA可以在不使用乙醇的情况下通过选择性沉淀和洗涤来成功地纯化，同时维持mRNA的完整性和高纯度。因此，本发明提供了在不使用任何苛性或易燃溶剂的情况下从大规模制造过程治疗应用中纯化RNA的有效、可靠和更安全的方法。

Description

用于纯化信使RNA的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年5月15日提交的美国临时专利申请序列号62/848,412和2019年8月26日提交的美国临时专利申请序列号62/891,781的优先权，该美国临时专利申请中的每一个出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。

背景技术

信使RNA(mRNA)疗法正成为治疗多种疾病的越来越重要的方法。mRNA疗法涉及将包含体外转录(IVT)和高纯度信使RNA(mRNA)的药物产品施用于需要治疗的患者以及在患者体内产生由mRNA编码的蛋白质。因此，需要高效、大规模生产适合于治疗用途的高纯度mRNA产物。

传统上，使用可商购的色谱系统(例如HPLC)和/或通过萃取到有机混合物(苯酚:氯仿:异戊醇)中并且随后进行乙醇沉淀来纯化由体外转录产生的mRNA。然而，柱系统的使用是昂贵且具有挑战性的，并且在mRNA的提取中使用苛性或易燃溶剂可能带来安全性和成本挑战，特别是在大规模应用中。

目前缺乏产生治疗用途可接受的高纯度mRNA的安全和具有成本效益的方法。

发明内容

本发明尤其提供了一种纯化信使RNA(mRNA)的高效和具有成本效益方法。本发明部分基于使用少量挥发性有机化合物或不使用挥发性有机化合物纯化mRNA的方法的令人惊讶的发现并且该方法产生高完整性和高纯度的mRNA。因此，在一个方面，本发明提供了在不使用任何苛性或易燃溶剂的情况下可用于大规模制造过程治疗应用中的纯化mRNA的有效、可靠和更安全的方法。

在一些方面，本发明提供了一种纯化信使RNA(mRNA)的方法，所述方法包括a)在包含高摩尔盐溶液和两亲性聚合物的悬浮液中沉淀所述mRNA以提供沉淀的mRNA；b)捕获所述沉淀的mRNA；c)用洗涤溶液洗涤在步骤b)中捕获的所述沉淀的mRNA以纯化所述沉淀的mRNA；和d)用增溶溶液使来自步骤c)的所述沉淀的mRNA溶解以获得纯化的mRNA组合物。

在一些实施方案中，所述纯化的mRNA组合物基本上不含包括短的异常终止RNA种类、长的异常终止RNA种类、双链RNA(dsRNA)、残留质粒DNA、残留体外转录酶、残留溶剂和/或残留盐的污染物。在一些实施方案中，纯化的mRNA组合物基本上不含包括短的异常终止RNA种类的污染物。例如，纯化的mRNA组合物具有小于约1％的短的异常终止RNA种类。在一些实施方案中，纯化的mRNA组合物基本上不含包括长的异常终止RNA种类的污染物。例如，如通过毛细管凝胶电泳(CGE)所确定，纯化的mRNA组合物具有不超过约55％长的异常终止/降解种类。在一些实施方案中，纯化的mRNA组合物基本上不含包括双链RNA(dsRNA)的污染物。例如，纯化的mRNA组合物具有小于1％的双链RNA。在一些实施方案中，纯化的mRNA组合物基本上不含包括残留质粒DNA的污染物。例如，纯化的mRNA组合物具有10pg/mg或更少的残留质粒DNA。在一些实施方案中，纯化的mRNA组合物基本上不含包括残留体外转录酶的污染物。例如，对于每15μg纯化的mRNA组合物，存在小于0.3ng的聚合酶。对于每15μg纯化的mRNA组合物，存在小于0.3ng的帽酶。对于每15μg纯化的mRNA组合物，存在小于0.3ng的尾酶。在一些实施方案中，纯化的mRNA组合物基本上不含包括残留溶剂的污染物。在一些实施方案中，纯化的mRNA组合物基本上不含包括残留盐的污染物。

在一些实施方案中，纯化的mRNA包含10pg/mg纯化的mRNA或更少的残留质粒DNA。

在一些实施方案中，悬浮液中的两亲性聚合物选自普朗尼克(pluronics)、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙二醇(PEG)、聚醚诸如聚丙二醇(PPG)或聚环氧丙烷、或其组合。在一些实施方案中，悬浮液中的两亲性聚合物是普朗尼克。在一些实施方案中，悬浮液中的两亲性聚合物是聚乙烯吡咯烷酮。在一些实施方案中，悬浮液中的两亲性聚合物是聚乙烯醇。在一些实施方案中，悬浮液中的两亲性聚合物是聚乙二醇(PEG)。在一些实施方案中，悬浮液中的两亲性聚合物是聚醚。在一些实施方案中，悬浮液中的两亲性聚合物是聚丙二醇(PPG)。在一些实施方案中，悬浮液中的两亲性聚合物是聚环氧丙烷。

在一些实施方案中，悬浮液不包含有机溶剂。在一些实施方案中，悬浮液中的两亲性聚合物是PEG。在一些实施方案中，悬浮液不包含有机溶剂，并且使用聚乙二醇(PEG)沉淀mRNA。在一些实施方案中，悬浮液包括PEG以沉淀mRNA。在一些实施方案中，悬浮液包含约10％至约100％重量/体积浓度的PEG。

在一些实施方案中，悬浮液包含约50％重量/体积浓度的PEG。

在一些实施方案中，悬浮液包含最终浓度小于25％重量/体积的PEG。在一些实施方案中，悬浮液包含最终浓度为约5％至20％重量/体积的PEG。在特定实施方案中，悬浮液包含最终浓度为约10％至15％重量/体积，例如12％重量/体积的PEG。在一些实施方案中，PEG的分子量为约2000至约10000g/mol。在一些实施方案中，PEG的分子量为约4000至约8000g/mol。在一些实施方案中，PEG的分子量为约6000g/mol(例如PEG-6000)。如实施例中所示，约12％重量/体积的悬浮液中分子量为约6000g/mol的PEG(例如PEG-6000)的最终浓度确保了有效纯化并提供高纯度mRNA样品。

在一些实施方案中，悬浮液不包含有机溶剂，并且包含三乙二醇(TEG)。在一些实施方案中，悬浮液包含TEG以沉淀mRNA。在一些实施方案中，悬浮液包含约10％至约100％重量/体积浓度的TEG。

在一些实施方案中，悬浮液包含约50％重量/体积浓度的TEG。

在一些实施方案中，悬浮液不包含有机溶剂，并且包含三乙二醇单甲醚(MTEG)。在一些实施方案中，悬浮液包含MTEG以沉淀mRNA。在一些实施方案中，悬浮液包含约10％至约100％重量/体积浓度的MTEG。

在一些实施方案中，悬浮液包含约50％重量/体积浓度的MTEG。

在一些实施方案中，悬浮液包含最终浓度为约15％至约45％重量/体积的MTEG。在一些实施方案中，悬浮液包含最终浓度为约20％至约40％重量/体积的MTEG。在一些实施方案中，悬浮液包含最终浓度为约20％重量/体积的MTEG。在一些实施方案中，悬浮液包含最终浓度为约25％重量/体积的MTEG。在一些实施方案中，悬浮液包含最终浓度为约30％重量/体积的MTEG。在一些实施方案中，悬浮液包含最终浓度为约35％重量/体积的MTEG。

在一些实施方案中，高摩尔盐溶液包含硫氰酸胍(GSCN)。在一些实施方案中，GSCN的最终浓度为约2-4M。在一些实施方案中，GSCN的最终浓度为2.5-3M。在特定实施方案中，GSCN的最终浓度为约2.7M。

在一些实施方案中，洗涤溶液中的两亲性聚合物选自普朗尼克、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙二醇(PEG)、聚醚诸如聚丙二醇(PPG)或聚环氧丙烷、或其组合。在一些实施方案中，洗涤溶液中的两亲性聚合物是普朗尼克。在一些实施方案中，洗涤溶液中的两亲性聚合物是聚乙烯吡咯烷酮。在一些实施方案中，洗涤溶液中的两亲性聚合物是聚乙烯醇。在一些实施方案中，洗涤溶液中的两亲性聚合物是聚乙二醇(PEG)。在一些实施方案中，洗涤溶液中的两亲性聚合物是聚醚。在一些实施方案中，洗涤溶液中的两亲性聚合物是聚丙二醇(PPG)。在一些实施方案中，洗涤溶液中的两亲性聚合物是聚环氧丙烷。

在一些实施方案中，洗涤溶液不包含有机溶剂。在一些实施方案中，洗涤溶液不包含有机溶剂，并且包含聚乙二醇(PEG)。在一些实施方案中，洗涤溶液中使用的PEG具有90厘沲或更小的粘度。在一些实施方案中，洗涤溶液中使用的PEG具有80厘沲或更小的粘度。在一些实施方案中，洗涤溶液中使用的PEG具有70厘沲或更小的粘度。在一些实施方案中，洗涤溶液中使用的PEG具有60厘沲或更小的粘度。在一些实施方案中，洗涤溶液中使用的PEG具有50厘沲或更小的粘度。在一些实施方案中，洗涤溶液中使用的PEG具有40厘沲或更小的粘度。在一些实施方案中，洗涤溶液中使用的PEG具有30厘沲或更小的粘度。在一些实施方案中，洗涤溶液中使用的PEG具有20厘沲或更小的粘度。在一些实施方案中，洗涤溶液中使用的PEG具有10厘沲或更小的粘度。适用于洗涤溶液中的PEG在25℃下具有约90厘沲的粘度，诸如PEG-400。因此，在特定实施方案中，洗涤溶液中使用的PEG是PEG-400。

在一些实施方案中，洗涤溶液不包含有机溶剂，并且包含三乙二醇(TEG)。在一些实施方案中，溶液包含TEG。

在一些实施方案中，洗涤溶液不包含有机溶剂，并且包含三乙二醇单甲醚(MTEG)。在一些实施方案中，洗涤溶液包含MTEG。在一些实施方案中，MTEG以约90％至约100％重量/体积的浓度存在于洗涤溶液中。在特定实施方案中，MTEG以约95％重量/体积的浓度存在于洗涤溶液中。

如实施例中所示，MTEG适用于洗涤溶液，有效地洗涤沉淀的mRNA，同时保持其呈沉淀形式。MTEG在室温下具有约7厘沲的粘度。因此，无论所使用的纯化方法(例如，流过滤、深层过滤或离心)如何，MTEG都允许mRNA的高效纯化和回收。

在一些实施方案中，洗涤溶液中的两亲性聚合物是PEG。在特定实施方案中，洗涤溶液中的PEG的分子量为约200g/mol至约600g/mol。在特定实施方案中，洗涤溶液中的PEG具有约400g/mol的分子量(例如PEG-400)。

在一些实施方案中，PEG以约10％至约100％重量/体积浓度存在于洗涤溶液中。

在一些实施方案中，PEG以约50％至约90％重量/体积浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，PEG以约90％至约100％重量/体积浓度存在于洗涤溶液中。

在一些实施方案中，PEG以约90％重量/体积浓度存在于洗涤溶液中。在特定实施方案中，洗涤溶液中的PEG具有约400g/mol的分子量(例如PEG-400)。在一些实施方案中，洗涤溶液中的PEG具有约400g/mol的分子量(例如PEG-400)，并且为约90％至约100％的重量/体积浓度。在特定实施方案中，洗涤溶液中的PEG具有约400g/mol的分子量(例如PEG-400)，并且以约90％重量/体积浓度存在于洗涤溶液中。

在一些实施方案中，悬浮液中的PEG的分子量为约200至约40,000g/mol。在一些实施方案中，洗涤溶液中的PEG的分子量为约200至约40,000g/mol。在一些实施方案中，悬浮液和洗涤溶液中的PEG的分子量均为约200至约40,000g/mol。在特定实施方案中，悬浮液中的PEG的分子量为约2,000g/mol至约10,000g/mol，并且洗涤溶液中的PEG的分子量为约200g/mol至约600g/mol。在具体实施方案中，悬浮液中的PEG是PEG-6000，并且洗涤溶液中的PEG是PEG-400。

在一些实施方案中，悬浮液中的PEG是直链的。在一些实施方案中，悬浮液中的PEG是支链的。在一些实施方案中，悬浮液中的PEG是Y形的。在一些实施方案中，悬浮液中的PEG具有多臂构型。

在一些实施方案中，洗涤溶液中的PEG是直链的。在一些实施方案中，洗涤溶液中的PEG是支链的。在一些实施方案中，洗涤溶液中的PEG是Y形的。在一些实施方案中，洗涤溶液中的PEG具有多臂构型。

在一些实施方案中，悬浮液和洗涤溶液中的PEG均是直链的。在一些实施方案中，悬浮液和洗涤溶液中的PEG均是支链的。在一些实施方案中，悬浮液和洗涤溶液中的PEG均是Y形的。在一些实施方案中，悬浮液和洗涤溶液中的PEG均是多臂构型。

在一些实施方案中，悬浮液包含选自以下的PEG：三乙二醇、四乙二醇、PEG 200、PEG 300、PEG 400、PEG 600、PEG 1,000、PEG 1,500、PEG 2,000、PEG 3,000、PEG 3,350、PEG4,000、PEG 6,000、PEG 8,000、PEG 10,000、PEG 20,000、PEG 35,000和PEG 40,000。在一些实施方案中，悬浮液包含三乙二醇。在一些实施方案中，悬浮液包含四乙二醇。在一些实施方案中，悬浮液包含PEG 200。在一些实施方案中，悬浮液包含PEG 300。在一些实施方案中，悬浮液包含PEG 400。在一些实施方案中，悬浮液包含PEG 600。在一些实施方案中，悬浮液包含PEG 1,000。在一些实施方案中，悬浮液包含PEG 1,500。在一些实施方案中，悬浮液包含PEG 2,000。在一些实施方案中，悬浮液包含PEG 3,000。在一些实施方案中，悬浮液包含PEG 3,350。在一些实施方案中，悬浮液包含PEG 4,000。在一些实施方案中，悬浮液包含PEG6,000。在一些实施方案中，悬浮液包含PEG 8,000。在一些实施方案中，悬浮液包含PEG 10,000。在一些实施方案中，悬浮液包含PEG 20,000。在一些实施方案中，悬浮液包含PEG 35,000。在一些实施方案中，悬浮液包含PEG 40,000。

在一些实施方案中，悬浮液包含PEG 6,000。

在一些实施方案中，悬浮液不包含PEG 6,000。

在一些实施方案中，悬浮液是PEG 400。

在一些实施方案中，悬浮液是PEG 150。

在一些实施方案中，悬浮液包含一种或多种PEG聚合物的混合物。

在一些实施方案中，悬浮液中的PEG聚合物的混合物包含具有不同分子量的聚合物。

在一些实施方案中，悬浮液中的PEG聚合物的混合物包含具有不同几何构型的聚合物。

在一些实施方案中，悬浮液是水性的。

在一些实施方案中，悬浮液具有占悬浮液总体积的小于约50％的挥发性有机化合物。例如，在一些实施方案中，悬浮液具有占悬浮液总体积的小于约50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、2％、1％、0.5％、0.01％的挥发性有机化合物。因此，在一些实施方案中，悬浮液具有占悬浮液总体积的小于约50％的挥发性有机化合物。在一些实施方案中，悬浮液具有占悬浮液总体积的小于45％的挥发性有机化合物。在一些实施方案中，悬浮液具有占悬浮液总体积的小于40％的挥发性有机化合物。在一些实施方案中，悬浮液具有占悬浮液总体积的小于35％的挥发性有机化合物。在一些实施方案中，悬浮液具有占悬浮液总体积的小于30％的挥发性有机化合物。在一些实施方案中，悬浮液具有占悬浮液总体积的小于25％的挥发性有机化合物。在一些实施方案中，悬浮液具有占悬浮液总体积的小于20％的挥发性有机化合物。在一些实施方案中，悬浮液具有占悬浮液总体积的小于15％的挥发性有机化合物。在一些实施方案中，悬浮液具有占悬浮液总体积的小于10％的挥发性有机化合物。在一些实施方案中，悬浮液具有占悬浮液总体积的小于5％的挥发性有机化合物。在一些实施方案中，悬浮液具有占悬浮液总体积的小于2％的挥发性有机化合物。在一些实施方案中，悬浮液具有占悬浮液总体积的小于1％的挥发性有机化合物。在一些实施方案中，悬浮液具有占悬浮液总体积的小于0.5％的挥发性有机化合物。在一些实施方案中，悬浮液具有占悬浮液总体积的小于0.1％的挥发性有机化合物。许多挥发性有机化合物是本领域已知的，并且包括例如乙醇、异丙醇和苄醇。

在一些实施方案中，悬浮液不含挥发性有机化合物。

在一些实施方案中，悬浮液不含醇。

在一些实施方案中，悬浮液不含乙醇。在一些实施方案中，悬浮液不含异丙醇。在一些实施方案中，悬浮液不含苄醇。

在一些实施方案中，悬浮液包含非水性组分。在一些实施方案中，悬浮液的非水性组分是乙醇。在一些实施方案中，悬浮液的非水性组分是异丙醇。在一些实施方案中，悬浮液的非水性组分是苄醇。

在一些实施方案中，洗涤溶液包含选自以下的PEG：三乙二醇、四乙二醇、PEG 200、PEG 300、PEG 400、PEG 600、PEG 1,000、PEG 1,500、PEG 2,000、PEG 3,000、PEG 3,350、PEG4,000、PEG 6,000、PEG 8,000、PEG 10,000、PEG 20,000、PEG 35,000和PEG 40,000。在一些实施方案中，洗涤溶液包含三乙二醇。在一些实施方案中，洗涤溶液包含四乙二醇。在一些实施方案中，洗涤溶液包含PEG 200。在一些实施方案中，洗涤溶液包含PEG 300。在一些实施方案中，洗涤溶液包含PEG 400。在一些实施方案中，洗涤溶液包含PEG 600。在一些实施方案中，洗涤溶液包含PEG 1,000。在一些实施方案中，洗涤溶液包含PEG 1,500。在一些实施方案中，洗涤溶液包含PEG 2,000。在一些实施方案中，洗涤溶液包含PEG 3,000。在一些实施方案中，洗涤溶液包含PEG 3,350。在一些实施方案中，洗涤溶液包含PEG 4,000。在一些实施方案中，洗涤溶液包含PEG6,000。在一些实施方案中，洗涤溶液包含PEG 8,000。在一些实施方案中，洗涤溶液包含PEG 10,000。在一些实施方案中，洗涤溶液包含PEG20,000。在一些实施方案中，洗涤溶液包含PEG 35,000。在一些实施方案中，洗涤溶液包含PEG 40,000。

在一些实施方案中，洗涤溶液包含PEG 6,000。

在一些实施方案中，洗涤溶液不包含PEG 6,000。

在一些实施方案中，洗涤溶液是PEG 400。

在一些实施方案中，洗涤溶液包含一种或多种PEG聚合物的混合物。

在一些实施方案中，洗涤溶液中的PEG聚合物的混合物包含具有不同分子量的聚合物。

在一些实施方案中，洗涤溶液中的PEG聚合物的混合物包含具有不同几何构型的聚合物。

在一些实施方案中，洗涤溶液是水性的。

在一些实施方案中，洗涤溶液不含挥发性有机化合物。

在一些实施方案中，洗涤溶液不含醇。

在一些实施方案中，洗涤溶液具有占洗涤溶液总体积的小于约50％的挥发性有机化合物。例如，在一些实施方案中，洗涤溶液具有占洗涤溶液总体积的小于约50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、2％、1％、0.5％、0.01％的挥发性有机化合物。因此，在一些实施方案中，洗涤溶液具有占洗涤溶液总体积的小于约50％的挥发性有机化合物。在一些实施方案中，洗涤溶液具有占洗涤溶液总体积的小于45％的挥发性有机化合物。在一些实施方案中，洗涤溶液具有占洗涤溶液总体积的小于40％的挥发性有机化合物。在一些实施方案中，洗涤溶液具有占洗涤溶液总体积的小于35％的挥发性有机化合物。在一些实施方案中，洗涤溶液具有占洗涤溶液总体积的小于30％的挥发性有机化合物。在一些实施方案中，洗涤溶液具有占洗涤溶液总体积的小于25％的挥发性有机化合物。在一些实施方案中，洗涤溶液具有占洗涤溶液总体积的小于20％的挥发性有机化合物。在一些实施方案中，洗涤溶液具有占洗涤溶液总体积的小于15％的挥发性有机化合物。在一些实施方案中，洗涤溶液具有占洗涤溶液总体积的小于10％的挥发性有机化合物。在一些实施方案中，洗涤溶液具有占洗涤溶液总体积的小于5％的挥发性有机化合物。在一些实施方案中，洗涤溶液具有占洗涤溶液总体积的小于2％的挥发性有机化合物。在一些实施方案中，洗涤溶液具有占洗涤溶液总体积的小于1％的挥发性有机化合物。在一些实施方案中，洗涤溶液具有占洗涤溶液总体积的小于0.5％的挥发性有机化合物。在一些实施方案中，洗涤溶液具有占洗涤溶液总体积的小于0.1％的挥发性有机化合物。许多挥发性有机化合物是本领域已知的，并且包括例如乙醇、异丙醇和苄醇。

在一些实施方案中，洗涤溶液不含乙醇。在一些实施方案中，洗涤溶液不含异丙醇。在一些实施方案中，洗涤溶液不含苄醇。

在一些实施方案中，洗涤溶液包含非水性组分。在一些实施方案中，洗涤溶液的非水性组分是乙醇。在一些实施方案中，洗涤溶液的非水性组分是异丙醇。在一些实施方案中，洗涤溶液的非水性组分是苄醇。

在一些实施方案中，悬浮液和洗涤缓冲液均是水性的。在一些实施方案中，悬浮液和洗涤缓冲液均包含PEG。在一些实施方案中，悬浮液和洗涤缓冲液均是水性的并且包含相同的PEG。在一些实施方案中，悬浮液和洗涤缓冲液均是水性的，并且悬浮液包含第一PEG，并且洗涤缓冲液包含不同于第一PEG的第二PEG。在一些实施方案中，悬浮液中的PEG的分子量为约2000至约10000g/mol，并且洗涤缓冲液中的PEG的分子量为约200-600g/mol。在一些实施方案中，悬浮液中的PEG的分子量为约4000至约8000g/mol，并且洗涤缓冲液中的PEG的分子量为约300-500g/mol。在一些实施方案中，悬浮液中的PEG的分子量为约6000g/mol(例如PEG-6000)，并且洗涤缓冲液中的PEG的分子量为约400g/mol(例如PEG-400)。

在一些实施方案中，捕获沉淀的mRNA在过滤器上进行。在一些实施方案中，过滤器选自微滤过滤器或超滤过滤器。在一些实施方案中，微滤过滤器具有0.05μm与1.0μm之间的孔径。例如，在一些实施方案中，微滤过滤器具有0.05μm、0.10μm、0.20μm、0.3μm、0.4μm、0.5μm、0.6μm、0.7μm、0.8μm、0.9μm或1.0μm的孔径。因此，在一些实施方案中，微滤过滤器具有0.05μm的孔径。在一些实施方案中，微滤过滤器具有0.10μm的孔径。在一些实施方案中，微滤过滤器具有0.20μm的孔径。在一些实施方案中，微滤过滤器具有0.30μm的孔径。在一些实施方案中，微滤过滤器具有0.40μm的孔径。在一些实施方案中，微滤过滤器具有0.50μm的孔径。在一些实施方案中，微滤过滤器具有0.60μm的孔径。在一些实施方案中，微滤过滤器具有0.70μm的孔径。在一些实施方案中，微滤过滤器具有0.80μm的孔径。在一些实施方案中，微滤过滤器具有0.90μm的孔径。在一些实施方案中，微滤过滤器具有1.0μm的孔径。

在一些实施方案中，过滤器将具有100kDa与1,000kDa之间的标称分子量限值(NMWL)。在一些实施方案中，过滤器将具有200kDa与700kDa之间的NMWL。在一些实施方案中，过滤器将具有200kDa与500kDa之间的NMWL。在一些实施方案中，过滤器具有300kDa的NMWL。在一些实施方案中，过滤器具有500kDa的NMWL。

在一些实施方案中，微滤过滤器具有大于1,000千道尔顿(kDa)的标称分子量限值(NMWL)。在一些实施方案中，超滤过滤器具有小于0.05μm的孔径。在一些实施方案中，超滤过滤器具有约1kDa与1,000kDA之间的NMWL。例如，在一些实施方案中，超滤过滤器具有1kDA、5kDA、10kDA、15kDA、20kDA、25kDA、50kDA、100kDA、150kDA、200kDA、250kDA、300kDA、350kDA、400kDA、450kDA、500kDA、550kDA、600kDA、650kDA、700kDA、750kDA、800kDA、850kDA、900kDA、950kDA或1,000kDA的NMWL。因此，在一些实施方案中，超滤过滤器具有1kDA的NMWL。在一些实施方案中，超滤过滤器具有5kDA的NMWL。在一些实施方案中，超滤过滤器具有10kDA的NMWL。在一些实施方案中，超滤过滤器具有15kDA的NMWL。在一些实施方案中，超滤过滤器具有20kDA的NMWL。在一些实施方案中，超滤过滤器具有25kDA的NMWL。在一些实施方案中，超滤过滤器具有50kDA的NMWL。在一些实施方案中，超滤过滤器具有100kDA的NMWL。在一些实施方案中，超滤过滤器具有150kDA的NMWL。在一些实施方案中，超滤过滤器具有200kDA的NMWL。在一些实施方案中，超滤过滤器具有250kDA的NMWL。在一些实施方案中，超滤过滤器具有300kDA的NMWL。在一些实施方案中，超滤过滤器具有350kDA的NMWL。在一些实施方案中，超滤过滤器具有400kDA的NMWL。在一些实施方案中，超滤过滤器具有450kDA的NMWL。在一些实施方案中，超滤过滤器具有500kDA的NMWL。在一些实施方案中，超滤过滤器具有550kDA的NMWL。在一些实施方案中，超滤过滤器具有600kDA的NMWL。在一些实施方案中，超滤过滤器具有650kDA的NMWL。在一些实施方案中，超滤过滤器具有700kDA的NMWL。在一些实施方案中，超滤过滤器具有750kDA的NMWL。在一些实施方案中，超滤过滤器具有800kDA的NMWL。在一些实施方案中，超滤过滤器具有850kDA的NMWL。在一些实施方案中，超滤过滤器具有900kDA的NMWL。在一些实施方案中，超滤过滤器具有950kDA的NMWL。在一些实施方案中，超滤过滤器具有1,000kDA的NMWL。

在一些实施方案中，切向流过滤(TFF)或渗滤用于在步骤c)中纯化沉淀的mRNA。因此，在一些实施方案中，TFF用于在步骤c)中纯化沉淀的mRNA。在一些实施方案中，渗滤用于在步骤c)中纯化沉淀的mRNA。

在一些实施方案中，使用助滤剂。

在一些实施方案中，助滤剂是基于纤维素的。在特定实施方案中，以1:10的沉淀mRNA与助滤剂的质量比将基于纤维素的助滤剂添加到悬浮液中。在一些实施方案中，基于纤维素的助滤剂包含长度为约5至约500μm的纯化的纤维素纤维。在一些实施方案中，纤维素纤维的长度为约10至约100μm。在一些实施方案中，纤维素纤维的长度为约20μm、30μm、40μm或50μm。在特定实施方案中，基于纤维素的助滤剂包含长度约20μm的纯化的纤维素纤维(例如，

或Sigmacell Cellulose 20)。

在一些实施方案中，助滤剂包含硅藻土和/或火山灰。在一些实施方案中，助滤剂包含硅藻土。在一些实施方案中，助滤剂包含火山灰。在一些实施方案中，助滤剂包含硅藻土和火山灰。

在一些实施方案中，增溶溶液选自水、Tris-EDTA(TE)、柠檬酸钠或其组合。在一些实施方案中，增溶溶液是水。在一些实施方案中，增溶溶液是TE。在一些实施方案中，增溶溶液是柠檬酸钠。

在一些实施方案中，纯化的mRNA的产率为约50％至约100％。

在一些实施方案中，纯化的mRNA的产率为约70％至约99％。

在一些实施方案中，纯化的mRNA的产率在约90％与约99％之间。在特定实施方案中，纯化的mRNA的产率大于约93％，例如大于约94％，特别是大于约95％。

在一些实施方案中，纯化的mRNA的纯度在约60％与约100％之间。

在一些实施方案中，纯化的mRNA的纯度在约80％与99％之间。

在一些实施方案中，纯化的mRNA的纯度在约90％与约99％之间。

在一些实施方案中，所述方法不包括色谱法步骤。

在一些实施方案中，将沉淀的mRNA离心以获得mRNA沉淀。

在一些实施方案中，将mRNA沉淀重新悬浮于缓冲溶液中。

在一些实施方案中，缓冲溶液选自水、TE、柠檬酸钠或其组合。在一些实施方案中，缓冲溶液是水。在一些实施方案中，缓冲溶液是TE。在一些实施方案中，缓冲溶液是柠檬酸。

在一些实施方案中，沉淀的mRNA包含至少100mg、1g、10g、100g、1kg、10kg、100kg、一公吨或十公吨的mRNA，或其间的任何量。因此，在一些实施方案中，沉淀的mRNA包含至少100mg。在一些实施方案中，沉淀的mRNA包含至少1g。在一些实施方案中，沉淀的mRNA包含至少10g。在一些实施方案中，沉淀的mRNA包含至少100g。在一些实施方案中，沉淀的mRNA包含至少1kg。在一些实施方案中，沉淀的mRNA包含至少10kg。在一些实施方案中，沉淀的mRNA包含至少100kg。在一些实施方案中，沉淀的mRNA包含至少一公吨。在一些实施方案中，沉淀的mRNA包含至少十公吨。

在一些实施方案中，沉淀的mRNA包含大于1kg的mRNA。

在一些实施方案中，所述方法不含乙醇。

在一些方面，本发明提供了一种纯化信使RNA(mRNA)的方法，所述方法包括：a)在包含PEG的硫氰酸胍(GSCN)溶液中沉淀所述mRNA；b)将所述溶液离心以产生mRNA沉淀；c)将所述mRNA沉淀重新悬浮于缓冲液中；d)在过滤器上捕获所述mRNA；e)用PEG溶液洗涤步骤d)的所述mRNA；以及f)使洗涤的mRNA溶解以获得基本上不含污染物的mRNA组合物。

在一些方面，本发明提供了一种制造mRNA的方法，所述方法包括以下步骤：(a)通过混合(i)包含启动子的DNA模板和(ii)RNA聚合酶来进行体外转录(IVT)，以产生包含全长mRNA的不纯制剂；(b)向所述悬浮液提供高摩尔盐和两亲性聚合物以沉淀全长mRNA并在所述悬浮液中提供沉淀的全长mRNA；(c)通过将所述悬浮液施加到过滤器来捕获所述沉淀的全长mRNA；以及(d)用水性溶剂洗涤步骤(c)的所述沉淀的全长mRNA以在水溶液中获得纯化的全长mRNA，以及(e)使来自步骤(d)的所述沉淀的mRNA溶解以获得纯化的mRNA组合物，其中由步骤(d)提供的所述水溶液中的所述纯化的全长mRNA基本上不含(i)所述包含启动子的DNA模板和(ii)所述RNA聚合酶。

在一些实施方案中，在步骤(a)中，所述RNA聚合酶是SP6聚合酶。

在一些实施方案中，由步骤(e)提供的所述水溶液中的所述纯化的全长mRNA也基本上不含(v)双链RNA(dsRNA)。

在一些实施方案中，悬浮液包含最终浓度在约5％与20％重量/体积浓度之间的分子量为约6000g/mol的PEG(例如PEG-6000)和最终浓度为约2-4M的GSCN。在特定实施方案中，悬浮液包含最终浓度为约10％、11％、12％、13％、14％或15％重量/体积浓度的分子量为约6000g/mol的PEG(例如PEG-6000)和最终浓度为约2.5-3M的GSCN。如下文实施例中所示，悬浮液中PEG的最终浓度小于20％的聚合物诱导的沉淀在纯化后产生高纯度mRNA样品。此外，悬浮液中PEG的最终浓度为约12％(例如，50％PEG-6000的比率为1)和2.7M的最终GSCN浓度实现了mRNA的高效纯化。

在一些实施方案中，可以使用MTEG代替PEG以提供沉淀的mRNA的悬浮液。在特定实施方案中，MTEG用于此目的的最终浓度为约15％至约45％重量/体积。在一些实施方案中，悬浮液包含最终浓度为约20％至约40％重量/体积的MTEG。在一些实施方案中，悬浮液包含最终浓度为约20％重量/体积的MTEG。在一些实施方案中，悬浮液包含最终浓度为约25％重量/体积的MTEG。在一些实施方案中，悬浮液包含最终浓度为约30％重量/体积的MTEG。在一些实施方案中，悬浮液包含最终浓度为约35％重量/体积的MTEG。在一些实施方案中，悬浮液包含最终浓度小于约35％重量/体积的MTEG。MTEG诱导的沉淀中使用的其余条件与PEG诱导的沉淀中使用的条件相同。如实施例中所示，包含mRNA、GSCN和MTEG的悬浮液(其中MTEG的最终浓度小于35％重量/体积)在没有不期望的过程酶沉淀的情况下确保了mRNA的有效回收。特别适合于在没有不期望的过程酶沉淀的情况下有效回收mRNA的是包含mRNA、GSCN和MTEG的悬浮液(其中MTEG的最终浓度为约25％)，除了与沉淀的mRNA的质量比为约10:1的助滤剂(例如基于纤维素的助滤剂)以外。

附图说明

下图仅用于说明的目的，而非限制。

图1示出了用不同沉淀条件由5mg IVT反应纯化的mRNA的产率。

图2示出了用不同沉淀条件纯化的mRNA的银染凝胶。银染凝胶用于示出污染过程酶的存在。凝胶左侧的箭头指示的凝胶带表示SP6 RNA聚合酶的迁移。

图3示出了通过用各种PEG-6000比率的聚合物诱导的沉淀纯化的mRNA的产率。

图4示出了通过用各种PEG-6000比率的聚合物诱导的沉淀纯化的mRNA的银染凝胶。

图5示出了对于所使用的不同聚合物洗涤缓冲液和浓度，通过聚合物诱导的沉淀和聚合物洗涤的无乙醇mRNA纯化的产率。

图6示出了对于90％和100％PEG-400洗涤缓冲液(分别为泳道3和泳道4)，无乙醇mRNA纯化聚合物诱导的沉淀和聚合物洗涤的银染凝胶。

图7示出了对于5mg、1g和10g规模的不同mRNA构建体(OTC和CFTR)，通过聚合物诱导的沉淀和聚合物洗涤的无乙醇mRNA纯化的回收百分比。

图8示出了毛细管电泳(CE)图谱，表明对于5mg、1g和10g规模的不同mRNA构建体(OTC和CFTR)，通过聚合物诱导的沉淀和聚合物洗涤纯化的mRNA的完整性。

图9示出了对于5mg、1g和10g规模的不同mRNA构建体(OTC和CFTR)，通过聚合物诱导的沉淀和聚合物洗涤的无乙醇mRNA纯化的银染凝胶。

图10是示出了以10克、5mg或1g规模纯化鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)mRNA之后dsRNA的存在或不存在的一系列点图。纯化条件在凝胶上方所示，并且包括：阳性对照泳道(2ngdsRNA对照、25ng dsRNA对照、阳性对照)、10g OTC mRNA的基于乙醇的纯化以及10g、5g或1gOTC mRNA的无乙醇纯化。

图11示出了通过聚合物诱导的沉淀和用各种重量/体积浓度的MTEG洗涤纯化的mRNA的回收。

图12示出了通过在悬浮液中使用各种比率的mRNA:盐:MTEG的MTEG诱导的沉淀和用95％重量/体积浓度的MTEG洗涤纯化的mRNA的银染凝胶。

图13示出了使用MTEG作为用于沉淀和洗涤步骤的聚合物的7.5gOTC mRNA样品深层过滤后的CE涂片分析。

图14示出了使用MTEG作为用于沉淀和洗涤步骤的聚合物的7.5gOTC mRNA样品深层过滤后的银染凝胶。

图15示出了使用MTEG作为用于沉淀和洗涤步骤的聚合物的15gCFTR mRNA样品深层过滤后的CE涂片分析。

图16示出了使用MTEG作为用于沉淀和洗涤步骤的聚合物的15gCFTR mRNA样品深层过滤后的银染凝胶。

图17示出了使用MTEG作为用于沉淀和洗涤步骤的聚合物的15gCFTR mRNA样品离心过滤后的CE涂片分析。

图18示出了使用MTEG作为用于沉淀和洗涤步骤的聚合物的15gCFTR mRNA样品离心过滤后的银染凝胶。

定义

为了使本发明更容易理解，首先在下文定义了某些术语。下述术语和其他术语的另外定义阐述在整个本说明书中。

术语“或更多个”、“至少”、“超过”等，例如，“至少一个”应理解为包括但不限于至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000个或超过所陈述值。还包括其间的任何较大数目或分数。

相反，术语“不超过”包括小于所陈述值的每个值。例如，“不超过100个核苷酸”包括100、99、98、97、96、95、94、93、92、91、90、89、88、87、86、85、84、83、82、81、80、79、78、77、76、75、74、73、72、71、70、69、68、67、66、65、64、63、62、61、60、59、58、57、56、55、54、53、52、51、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1和0个核苷酸。还包括其间的任何较小数目或分数。

术语“多个”、“至少两个”、“两个或更多个”、“至少第二”等应理解为包括但不限于至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149或150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000个或更多个。还包括其间的任何较大数目或分数。

大约或约：如本文所用，当应用于一个或多个目的值时，术语“大约”或“约”指与所述参考值相似的值。在某些实施方案中，术语“大约”或“约”是指在所陈述值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％或0.001％内。除非根据上下原本清楚，否则本文提供的所有数值均由术语“大约”或“约”修饰。

批次：如本文所用，术语“批次”是指一次纯化的(例如，在同一制造周期期间根据单个制造订单所纯化的)mRNA的数量或量。批次可以指在一个反应中纯化的mRNA的量。

生物活性的：如本文所用，短语“生物活性的”是指在生物系统中并且特别是在生物体中具有活性的任何药剂的特征。例如，当施用于生物时对所述生物体具有生物作用的药剂视为生物活性的。

包括：如本文所用，术语“包括”或者诸如“包含”或“含有”的变化形式将被理解为意味着包括所陈述的要素、整体或步骤、或者要素、整体或步骤的组，但不排除任何其他要素、整体或步骤、或者要素、整体或步骤的组。

dsRNA：如本文所用，术语“dsRNA”是指在体外转录(IVT)反应期间产生互补RNA序列。可出于多种原因产生互补RNA序列，该原因包括例如可与新生RNA链中的互补序列杂交的短的异常终止转录物、充当RNA依赖性DNA非依赖性RNA转录的引物的短的异常终止转录物，以及可能的RNA聚合酶模板逆转。

表达：如本文所用，核酸序列的“表达”是指将mRNA翻译成多肽(例如抗体的重链和轻链)，将多个多肽(例如抗体的重链或轻链)组装成完整蛋白质(例如抗体)和/或多肽或完全组装的蛋白质(例如抗体)的翻译后修饰。在本申请中，术语“表达”和“产生”以及语法上的等同术语可互换使用。

功能性：如本文所用，“功能性”生物分子是其表现出表征其的特性和/或活性的形式的生物分子。

改进、增加或减少：如本文所用，术语“改善”、“增加”或“减少”或语法等同项表示相对于基线测量值，诸如在本文所述治疗开始之前同一个体的测量值，或在没有本文所述治疗的情况下对照受试者(或多个对照受试者)的测量值的值。“对照受试者”是患有与所治受试者相同形式的疾病，其年龄与所治受试者大约相同的受试者。

杂质:如本文所用，术语“杂质”是指在限定量的液体、气体或固体内，与目标材料或化合物的化学组成不同的物质。杂质也被称为“污染物”。

体外：如本文所用，术语“体外”是指在人工环境中，例如在试管或反应容器中，在细胞培养物中等，而不是在多细胞生物体内发生的事件。

体内：如本文所用，术语“体内”是指在多细胞生物体诸如人和非人动物内发生的事件。在基于细胞的系统的上下文中，该术语可用于指在活细胞内发生的事件(与例如体外系统相反)。

分离的：如本文所用，术语“分离的”是指(1)与最初生产时(无论是天然的和/或在实验环境中)与之相关联的至少一些组分分离，和/或(2)由人工生产、制备和/或制造的物质和/或实体。分离的物质和/或实体可以与最初与它们相关联的其他组分的约10％、约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或大于约99％分离。在一些实施方案中，分离的试剂的纯度为约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或超过99％。如本文所用，如果一种物质基本上不含其他组分，则该物质是“纯的”。如本文所用，分离的物质和/或实体的纯度百分比的计算不应包括赋形剂(例如，缓冲剂、溶剂、水等)。

信使RNA(mRNA)：如本文所用，术语“信使RNA(mRNA)”是指编码至少一种多肽的多核苷酸。如本文所用，mRNA涵盖修饰的RNA和未修饰的RNA。mRNA可以含有一个或多个编码区和非编码区。

mRNA完整性：如本文所用，术语“mRNA完整性”一般是指mRNA的质量。在一些实施方案中，mRNA完整性是指在纯化过程之后未降解的mRNA的百分比。可以使用本领域熟知的方法(例如通过RNA琼脂糖凝胶电泳)来确定mRNA完整性(例如Ausubel等人,John Weley&Sons,Inc.,1997,Current Protocols in Molecular Biology)。

核酸：如本文所用，术语“核酸”在其最广泛的意义上是指可以掺入多核苷酸链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，核酸是由磷酸二酯键掺入或可以由磷酸二酯键掺入多核苷酸链的化合物和/或物质。在一些实施方案中，“核酸”是指单独的核酸残基(例如，核苷酸和/或核苷)。在一些实施方案中，“核酸”是指包含单个核酸残基的多核苷酸链。在一些实施方案中，“核酸”涵盖RNA以及单链和/或双链DNA和/或cDNA。此外，术语“核酸”、“DNA”、“RNA”和/或类似术语包括核酸类似物，即具有除磷酸二酯骨架以外的类似物。例如，所谓的“肽核酸”被认为在本发明的范围内，该术语是本领域已知的，并且在主链中具有肽键而不是磷酸二酯键。术语“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此互为简并形式和/或编码相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质的核苷酸序列和/或RNA可包括内含子。核酸可从天然来源纯化，使用重组表达系统产生且任选地纯化，化学合成等。适当时，例如在化学合成的分子的情况下，核酸可包含核苷类似物，诸如具有化学修饰的碱基或糖、主链修饰等的类似物。除非另外指明，否则核酸序列以5'至3'方向呈现。在一些实施方案中，核酸是或包含天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)；核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、O(6)-甲基鸟苷和2-硫代胞苷)；经化学修饰的碱基；经生物修饰的碱基(例如，甲基化碱基)；插入的碱基；经修饰的糖(例如，2’-氟核糖、核糖、2’-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)；和/或经修饰的磷酸酯基团(例如，硫代磷酸酯和5’-N-亚磷酰胺键)。在一些实施方案中，本发明特别涉及“未修饰的核酸”，它意指未经化学修饰以促进或实现递送的核酸(例如，多核苷酸和残基，包括核苷酸和/或核苷)。

沉淀：如本文所用，术语“沉淀”(或其任何语法等同物)是指溶液中固体的形成。当与mRNA结合使用时，术语“沉淀”是指在液体中mRNA的不溶或固体形式的形成。

过早终止的RNA序列：如本文所用，术语“过早终止的RNA序列”、“短的异常终止RNA种类”、“短聚体”和“长的异常终止RNA种类”是指mRNA合成反应(例如，体外合成反应)的不完全产物。由于多种原因，RNA聚合酶并不总是完成DNA模板的转录；例如，RNA合成过早终止。RNA合成过早终止的可能原因包括DNA模板的质量、模板中存在的特定聚合酶的聚合酶终止子序列、降解的缓冲液、温度、核糖核苷酸的耗竭和mRNA二级结构。过早终止的RNA序列可以是小于所需转录产物的预期长度的任何长度。例如，过早终止的mRNA序列可以小于1000个碱基、小于500个碱基、小于100个碱基、小于50个碱基、小于40个碱基、小于30个碱基、小于20个碱基、小于15个碱基、小于10个碱基或更少。

盐：如本文所用，术语“盐”是指确实由或可能由酸与碱之间的中和反应产生的离子化合物。

基本上：如本文所用，术语“基本上”是指表现出全部或接近全部范围或程度的目标特征或特性的定性条件。生物学领域的普通技术人员将理解，生物学和化学现象很少(如果曾经有)完成和/或继续完成或达到或避免绝对结果。因此，在本文中使用术语“基本上”来捕获许多生物学和化学现象中固有的潜在完整性缺失。

基本上不含：如本文所用，术语“基本上不含”是指其中存在相对少量或不存在待去除的物质(例如，过早终止的RNA序列)的状态。例如，“基本上不含过早终止的RNA序列”意指过早终止的RNA序列以小于杂质的大约5％、4％、3％、2％、1.0％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％或更小(w/w)的水平存在。或者，“基本上不含过早终止的RNA序列”意指过早终止的RNA序列以小于约100ng、90ng、80ng、70ng、60ng、50ng、40ng、30ng、20ng、10ng、1ng、500pg、100pg、50pg、10pg或更小的水平存在。

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本申请所属领域的普通技术人员通常所理解的以及在本申请所属领域中常用的含义相同的含义；此类技术以引用的方式以其整体并入。如果发生冲突，将以本说明书(包括定义)为准。

具体实施方式

本发明尤其提供了在纯化过程中不使用醇的情况下用于纯化mRNA的改进方法。

在以下部分中详细描述了本发明的各个方面。部分的使用并不意在限制本发明。每个部分可以适用于本发明的任何方面。在本申请中，除非另有说明，否则“或”的使用意指“和/或”。

纯化方法

在纯化mRNA中使用苛性或易燃溶剂可以带来安全性和成本挑战，特别是在大规模制备中。本发明涉及在不使用苛性或易燃溶剂的情况下纯化mRNA的方法。本文提供的方法允许以能够满足大多数临床和商业需求的规模制造的mRNA的有效捕获、洗涤和高产率分离。因此，本公开提供了mRNA替代治疗剂的前进路径，使其成为目前可获得的更传统的酶替代疗法和生物治疗剂的可行且成功的替代方案。

为了成为可行且成功的替代方案，用于mRNA纯化的方法需要安全、具有成本效益、稳健和可规模化以确保大规模制造能力到位以满足所有临床和商业需求。适当的mRNA纯化方法是安全的、具有成本效益的且易于规模化的，同时与目前可获得的行业标准mRNA纯化方法相比，还提供了等效或更好的产品。特别地，本文提供的方法消除了苛性或易燃溶剂的使用，并且导致高的纯化后mRNA产率、纯化后mRNA完整性的维持，以及过程相关污染物(例如，过早终止的RNA序列(短的异常终止RNA种类或“短聚体”)、长的异常终止RNA种类、双链RNA(dsRNA)、质粒DNA、残留溶剂、残留盐和体外转录酶)的去除。

本文提供的方法可在宽范围的规模下使用。例如，以及如本文进一步讨论的，所提供的方法允许以各种规模纯化，诸如等于或低于100mg至大于1kg。此外，本文提供的数据表明，本发明是依赖于使用易燃溶剂诸如醇来纯化mRNA的现有可用方法的有能力的(和较低成本)替代方案。本文提供的mRNA纯化方法适合于各种用途，包括例如实验、临床或商业用途。此外，本发明还具有与行业标准方法和试剂盒无法兼容的可扩展性的显著附加益处。最后，相对于当前工艺诸如包括醇溶剂和/或色谱法的过滤方法，本文公开的方法是极具成本效益的。参见例如WO 2011/068810；WO 2012/075040；WO 2014/152659；WO2014/152673；WO2014/152966；WO 2015/164773；WO 2016/004318；US 62/420,413；和PCT/US16/57044。

因此，本文所述的方法对于mRNA的纯化是有利的，包括大规模量的mRNA(例如，本文所述的任何批量大小或加载体积)。如所述的纯化方法可以提供具有治疗用途可接受的高水平完整性和纯度的mRNA，并且由于纯化，全长mRNA的损失最小。

本文所述的纯化mRNA的方法包括沉淀mRNA、捕获沉淀的mRNA和洗涤捕获的沉淀的mRNA以获得基本上不含污染物的纯化的mRNA组合物。以下部分详细描述了这些步骤中的每一个。

沉淀mRNA

纯化mRNA的方法包括以下步骤：在包含高摩尔盐溶液和两亲性聚合物的悬浮液中沉淀mRNA，捕获mRNA以及洗涤mRNA，从而获得基本上不含污染物的mRNA。

本文所述的方法适合于纯化所提供的包含mRNA的悬浮液(例如，体外合成反应混合物)中的mRNA。悬浮液可以具有各种污染物，例如质粒DNA和酶。

在一个实施方案中，将盐(例如，离液盐，诸如硫氰酸胍(GSCN))添加到含mRNA的悬浮液中，以使污染蛋白变性并溶解。因此，在一个实施方案中，GSCN在含高摩尔溶液的悬浮液中。随后添加两亲性聚合物以选择性地沉淀mRNA。在mRNA沉淀后，使用过滤器或膜捕获所得沉淀的mRNA，并且洗涤以得到无污染的沉淀物，例如短的异常终止RNA种类、长的异常终止RNA种类、dsRNA、质粒DNA、残留体外转录酶、残留盐和残留溶剂。随后通过水溶解沉淀的mRNA产生纯化的mRNA组合物。

在一些实施方案中，一种促进mRNA沉淀的试剂包含硫氰酸胍(例如，包含约1-5M硫氰酸胍的溶液)。例如，溶液包含约1M、1.5M、2.0M、2.5M、3.0M、3.5M、4.0M、4.5M或约5MGSCN。合适的GSCN缓冲液的实例包括例如包含4M硫氰酸胍、25mM柠檬酸钠pH 6.5、0.5％N-月桂酰肌氨酸钠盐的水溶液。GSCN缓冲液的另一个实例是在10mM二硫苏糖醇(DTT)缓冲液中包含5M GSCN的水溶液。在一些实施方案中，GSCN的最终浓度为2-4M。在一些实施方案中，GSCN(例如5M GSCN-10mM DTT缓冲液)的最终浓度为2.5-3M。在特定实施方案中，GSCN的最终浓度为约2.7M。

许多两亲性聚合物是本领域已知的。在一些实施方案中，本文方法中使用的两亲性聚合物包括普朗尼克、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙二醇(PEG)或其组合。在一些实施方案中，两亲性聚合物选自以下中的一种或多种：PEG三乙二醇、四乙二醇、PEG 200、PEG300、PEG400、PEG 600、PEG 1,000、PEG 1,500、PEG 2,000、PEG 3,000、PEG 3,350、PEG 4,000、PEG 6,000、PEG 8,000、PEG 10,000、PEG 20,000、PEG 35,000和PEG 40,000或其组合。在一些实施方案中，两亲性聚合物包含两种或更多种分子量PEG聚合物的混合物被使用。例如，在一些实施方案中，两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种或十二种分子量PEG聚合物包含两亲性聚合物。因此，在一些实施方案中，PEG溶液包含一种或多种PEG聚合物的混合物。在一些实施方案中，PEG聚合物的混合物包含具有不同分子量的聚合物。

在一些实施方案中，悬浮液中沉淀mRNA包含一种或多种两亲性聚合物。在一些实施方案中，悬浮液中沉淀mRNA包含PEG聚合物。本领域认识到各种类型的PEG聚合物，其中一些具有不同的几何构型。适用于本文方法的PEG聚合物包括例如具有直链构型、支链构型、Y形构型或多臂构型的PEG聚合物。在一些实施方案中，PEG在包含一种或多种具有不同几何构型的PEG的悬浮液中。在一些实施方案中，可以使用PEG-6000沉淀mRNA来实现沉淀mRNA。在一些实施方案中，可以使用PEG-400沉淀mRNA来实现沉淀mRNA。在一些实施方案中，可以使用三乙二醇(TEG)沉淀mRNA来实现沉淀mRNA。在一些实施方案中，可以使用三乙二醇单甲醚(MTEG)沉淀mRNA来实现沉淀mRNA。在一些实施方案中，可以使用叔丁基-TEG-O-丙酸酯沉淀mRNA来实现沉淀mRNA。在一些实施方案中，可以使用TEG-二甲基丙烯酸酯沉淀mRNA来实现沉淀mRNA。在一些实施方案中，可以使用TEG-二甲基醚沉淀mRNA来实现沉淀mRNA。在一些实施方案中，可以使用TEG-二乙烯基醚沉淀mRNA来实现沉淀mRNA。在一些实施方案中，可以使用TEG-单丁基醚沉淀mRNA来实现沉淀mRNA。在一些实施方案中，可以使用TEG-甲基醚甲基丙烯酸酯沉淀mRNA来实现沉淀mRNA。在一些实施方案中，可以使用TEG-单癸基醚沉淀mRNA来实现沉淀mRNA。在一些实施方案中，可以使用TEG-二苯甲酸酯沉淀mRNA来实现沉淀mRNA。这些基于PEG或TEG的试剂中的任何一种均可以与硫氰酸胍组合使用来沉淀mRNA。在下面表A中显示了这些试剂中的每一种试剂的结构。

表A：用于纯化mRNA(沉淀和/或洗涤mRNA)的非有机溶剂试剂

在一些实施方案中，在悬浮液中沉淀mRNA包含PEG聚合物，其中PEG聚合物包含PEG修饰的脂质。在一些实施方案中，PEG修饰的脂质是1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇(DMG-PEG-2K)。在一些实施方案中，PEG修饰的脂质是DOPA-PEG缀合物。在一些实施方案中，PEG修饰的脂质是泊洛沙姆-PEG缀合物。在一些实施方案中，PEG修饰的脂质包含DOTAP。在一些实施方案中，PEG修饰的脂质包含胆固醇。

在一些实施方案中，在包含两亲性聚合物的悬浮液中沉淀mRNA。在一些实施方案中，在包含任何前述PEG试剂的悬浮液中沉淀mRNA。在一些实施方案中，PEG在悬浮液中为约10％至约100％重量/体积浓度。例如，在一些实施方案中，PEG以约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％重量/体积浓度及其间的任何值存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约5％重量/体积浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约6％重量/体积浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约7％重量/体积浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约8％重量/体积浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约9％重量/体积浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约10％重量/体积浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约12％重量/体积浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约15％重量/体积存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约18％重量/体积存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约20％重量/体积浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约25％重量/体积浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约30％重量/体积浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约35％重量/体积浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约40％重量/体积浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约45％重量/体积浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约50％重量/体积浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约55％重量/体积浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约60％重量/体积浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约65％重量/体积浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约70％重量/体积浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约75％重量/体积浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约80％重量/体积浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约85％重量/体积浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约90％重量/体积浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约95％重量/体积浓度存在于悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约100％重量/体积浓度存在于悬浮液中。

在一些实施方案中，在悬浮液中沉淀mRNA包含约0.1至约5.0的PEG与总mRNA悬浮液体积的体积/体积比。例如，在一些实施方案中，PEG以约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.25、2.5、2.75、3.0、3.25、3.5、3.75、4.0、4.25、4.5、4.75、5.0的体积/体积比存在于mRNA悬浮液中。因此，在一些实施方案中，PEG以约0.1的体积/体积比存在于mRNA悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约0.2的体积/体积比存在于mRNA悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约0.3的体积/体积比存在于mRNA悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约0.4的体积/体积比存在于mRNA悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约0.5的体积/体积比存在于mRNA悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约0.6的体积/体积比存在于mRNA悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约0.7的体积/体积比存在于mRNA悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约0.8的体积/体积比存在于mRNA悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约0.9的体积/体积比存在于mRNA悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约1.0的体积/体积比存在于mRNA悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约1.25的体积/体积比存在于mRNA悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约1.5的体积/体积比存在于mRNA悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约1.75的体积/体积比存在于mRNA悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约2.0的体积/体积比存在于mRNA悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约2.25的体积/体积比存在于mRNA悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约2.5的体积/体积比存在于mRNA悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约2.75的体积/体积比存在于mRNA悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约3.0的体积/体积比存在于mRNA悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约3.25的体积/体积比存在于mRNA悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约3.5的体积/体积比存在于mRNA悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约3.75的体积/体积比存在于mRNA悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约4.0的体积/体积比存在于mRNA悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约4.25的体积/体积比存在于mRNA悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约4.50的体积/体积比存在于mRNA悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约4.75的体积/体积比存在于mRNA悬浮液中。在一些实施方案中，PEG以约5.0的体积/体积比存在于mRNA悬浮液中。在特定实施方案中，PEG以约1.0、约1.5或约2.0的体积/体积比存在于mRNA悬浮液中。

在一些实施方案中，用于mRNA沉淀的反应体积包括GSCN和PEG。在特定实施方案中，用于mRNA沉淀的反应体积包括分子量为约4000至约8000g/mol，例如约6000g/mol(例如PEG-6000)的GSCN和PEG。GSCN的最终浓度通常在2M与4M之间。PEG的最终浓度通常为约10％至约20％(重量/体积)。

在一些实施方案中，纯化mRNA的方法不含醇。

在一些实施方案中，添加非水性溶剂(例如，醇)以沉淀mRNA。在一些实施方案中，溶剂可以是异丙醇、丙酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮、乙醇、甲醇、地那铵(denatonium)及其组合。在实施方案中，溶剂是醇溶剂(例如，甲醇、乙醇或异丙醇)。在实施例中，溶剂是酮溶剂(例如丙酮、甲基乙基酮或甲基异丁基酮)。在一些实施方案中，将非水性溶剂与两亲性溶液混合。

在一些实施方案中，添加水溶液以沉淀mRNA。在一些实施方案中，水溶液包含聚合物。在一些实施方案中，水溶液包含PEG聚合物。

在一些实施方案中，所述方法还包括添加一种或多种使蛋白质变性的试剂(例如，RNA聚合酶和DNase I，其在转录后添加以去除DNA模板)和/或使蛋白质在水性介质中保持可溶的步骤。在一些实施方案中，一种或多种使蛋白质变性和/或使蛋白质在水性介质中保持可溶的试剂是盐，例如离液盐。

在一些实施方案中，沉淀步骤包括使用离液盐(例如，硫氰酸胍)和/或两亲性聚合物(例如，聚乙二醇或聚乙二醇的水溶液)和/或醇溶剂(例如，无水乙醇或醇的水溶液，诸如乙醇水溶液)。因此，在一些实施方案中，沉淀步骤包括分别使用离液盐和两亲性聚合物，诸如GSCN和PEG。

在一些实施方案中，促进mRNA沉淀的试剂包括变性剂或由变性条件产生。如本文所用，术语“变性条件”是指可以导致变性的任何化学或物理条件。示例性变性条件包括但不限于化学试剂的使用、高温、极端pH等。在一些实施方案中，通过向含有待纯化的mRNA的不纯制剂中添加一种或多种变性剂来实现变性条件。在一些实施方案中，适用于本发明的变性剂是蛋白质和/或DNA变性剂。在一些实施方案中，变性剂可以是：1)酶(诸如丝氨酸蛋白酶或DNase)、2)酸、3)溶剂、4)交联剂、5)离液剂、6)还原剂和/或7)经由高盐浓度的高离子强度。在一些实施方案中，特定试剂可以落入这些类别中的多于一种。

在一些实施方案中，一种或多种酶可用作变性剂以降解mRNA合成中使用的蛋白质和DNA模板。在一些实施方案中，合适的酶包括但不限于丝氨酸蛋白酶，诸如胰凝乳蛋白酶和胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶、胰蛋白酶和胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶、弹性蛋白酶和弹性蛋白酶样丝氨酸蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶及其组合；脱氧核糖核酸酶(DNase)，诸如脱氧核糖核酸酶I、II和/或IV；限制性内切酶，诸如EcoRI、EcoRII、BamHI、HindIII、SpeI、SphI、StuI、XbaI及其组合。

在一些实施方案中，酸可用作变性剂。在一些实施方案中，合适的酸可以是乙酸、甲酸、草酸、柠檬酸、苯甲酸、氯乙酸、二氯乙酸、三氯乙酸、抗坏血酸、磺基水杨酸及其组合。

在一些实施方案中，溶剂可用作变性剂。在一些实施方案中，溶剂不含苛性剂或易燃剂。在一些实施方案中，溶剂不含乙醇。在一些实施方案中，溶剂不含异丙醇、丙酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮、乙醇、甲醇、地那铵及其组合。在一些实施方案中，溶剂不含醇溶剂(例如，甲醇、乙醇或异丙醇)。在一些实施方案中，溶剂不含酮溶剂(例如，丙酮、甲基乙基酮或甲基异丁基酮)。

在一些实施方案中，溶剂可用作变性剂。在一些实施方案中，溶剂是乙醇。在一些实施方案中，溶剂是异丙醇、丙酮、甲基乙基酮、甲基异丁基酮、乙醇、甲醇、地那铵及其组合。在一些实施方案中，溶剂是醇溶剂(例如，甲醇、乙醇或异丙醇)。在一些实施方案中，溶剂是酮溶剂(例如，丙酮、甲基乙基酮或甲基异丁基酮)

在一些实施方案中，离液剂可用作变性剂。离液剂是通过干扰非共价力诸如氢键和范德华力(van der Waals forces)而破坏大分子诸如蛋白质和核酸的结构的物质。在一些实施方案中，离液剂可以是尿素、硫脲、氯化胍、硫氰酸胍、异硫氰酸胍、乙酸锂、氯化镁、十二烷基硫酸钠、高氯酸锂及其组合。

在一些实施方案中，还原剂可用作变性剂。还原剂是向另一物种提供电子，从而本身氧化的化合物。在一些实施方案中，还原剂可以是氢化铝锂、钠汞齐、乙硼烷、硼氢化钠、亚硫酸盐、二异丁基氢化铝、亚磷酸盐、一氧化碳、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇或三(2-羧乙基)膦及其组合。

在一些实施方案中，pH、热和/或重金属(诸如铅、汞或镉)中的一种或多种也可以用作变性剂以提供变性条件。已知极端pH会导致蛋白质变性。尽管蛋白质链的主链是中性的，但构成蛋白质的氨基酸残基通常含有酸性和碱性基团。这些基团通常是带电的，并且可以形成具有一组相反电荷的盐桥。因此，极端的pH可以改变这些酸性和碱性基团上的电荷，从而破坏盐桥。

在一些实施方案中，较不剧烈的pH变化还可以影响蛋白质的活性和溶解度。与单个氨基酸一样，蛋白质具有负电荷数等于正电荷数的等电点。这通常是最低水溶性的点。在等电pH下，分子上没有净电荷。单个分子具有彼此接近，凝结和从溶液中沉淀出来的倾向。在高于或低于等电pH的pH下，分子分别具有净负电荷或正电荷。因此，当蛋白质分子彼此接近时，它们具有相同的总电荷并彼此排斥。

在一些实施方案中，热可用作变性剂。热可以向蛋白质分子提供动能，使其原子振动更快。在一些实施方案中，这将破坏相对弱的力，诸如氢键和疏水相互作用。热也用于灭菌以变性并因此破坏细菌中的酶。

在一些实施方案中，金属离子诸如汞(II)、铅(II)和银的盐可以用作变性剂，因为它们能够与二硫化物基团和酸性氨基酸的羧酸根离子形成强键。因此，它们破坏二硫键和盐键两者，并且使蛋白质以不溶性金属-蛋白质盐的形式从溶液中沉淀出来。

在一些实施方案中，高浓度的盐(高盐度)还可用作变性剂。已知高浓度的盐使蛋白质和核酸两者从水溶液中沉淀。在一些实施方案中，高浓度盐可以在1M与10M之间，包括端值。在一些实施方案中，高浓度盐可以在2M与9M之间，包括端值。在一些实施方案中，高浓度盐可以在2M与8M之间，包括端值。在一些实施方案中，高浓度盐可以在2M与5M之间，包括端值。在一些实施方案中，高浓度盐可以大于1M浓度。在一些实施方案中，高浓度盐可以大于2M浓度。在一些实施方案中，高浓度盐可以大于3M浓度。在一些实施方案中，高浓度盐可以大于4M浓度。在一些实施方案中，高浓度盐可以大于5M浓度。在一些实施方案中，高浓度盐可以大于6M浓度。在一些实施方案中，高浓度盐可以大于7M浓度。在一些实施方案中，高浓度盐可以大于8M浓度。在一些实施方案中，单一盐用作变性剂。在一些实施方案中，多于一种盐用作变性剂。

在一些实施方案中，用作变性剂的盐可以是钙盐、铁盐、镁盐、钾盐、钠盐或其组合。在一些实施方案中，适合用作变性剂的示例性具体盐包括但不限于氯化钾(KCl)、氯化钠(NaCl)、氯化锂(LiCl)、氯化钙(CaCl₂)、溴化钾(KBr)、溴化钠(NaBr)、溴化锂(LiBr)。在一些实施方案中，不纯制剂经受的变性剂是氯化钾(KCl)。在一些实施方案中，添加KCl，使得所得KCl浓度为约1M或更大。在一些实施方案中，添加KCl，使得所得KCl浓度为约2M或更大、3M或更大、4M或更大、或5M或更大。

在一些实施方案中，所述方法不包括色谱法步骤。在一些实施方案中，将沉淀的mRNA离心以获得mRNA沉淀。然后将mRNA沉淀重新悬浮于缓冲溶液(诸如水、TE、柠檬酸钠或其组合)中。因此，在一些实施方案中，将mRNA沉淀重新悬浮于水中。在一些实施方案中，将mRNA沉淀重新悬浮于TE中。在一些实施方案中，将mRNA沉淀重新悬浮于柠檬酸钠中。

在一些实施方案中，mRNA以约2-4M的最终浓度沉淀在包含GSCN的悬浮液中；以约5％与约20％(重量/体积)之间的最终浓度沉淀在分子量为约4000至约8000g/mol，例如约6000g/mol的PEG(例如PEG-6000)中；以及沉淀在与沉淀的mRNA的质量比为约2:1、约5:1、约10:1或约15:1的助滤剂(例如基于纤维素的助滤剂)中。在一些实施方案中，mRNA以约2.5-3M的最终浓度沉淀在包含GSCN的悬浮液中；以约10％与约15％(重量/体积)之间的最终浓度沉淀在分子量为约6000g/mol的PEG(例如PEG-6000)中；以及沉淀在与沉淀的mRNA的质量比为约10:1的助滤剂(例如基于纤维素的助滤剂)中。在特定实施方案中，mRNA以约2.7M的最终浓度沉淀在包含GSCN的悬浮液中；以约12％(重量/体积)的最终浓度沉淀在分子量为约6000g/mol的PEG(例如PEG-6000)中；以及沉淀在与沉淀的mRNA的质量比为约10:1的助滤剂(例如基于纤维素的助滤剂，例如Solka-Floc)中。如实施例中所示，包含这些浓度的mRNA、盐和PEG的悬浮液在不沉淀过程酶的情况下实现了mRNA的高效纯化。

在一些实施方案中，可以使用MTEG代替PEG以提供沉淀的mRNA的悬浮液。在特定实施方案中，MTEG用于此目的的最终浓度为约15％至约45％重量/体积。在一些实施方案中，悬浮液包含最终浓度为约20％至约40％重量/体积的MTEG。在一些实施方案中，悬浮液包含最终浓度为约20％重量/体积的MTEG。在一些实施方案中，悬浮液包含最终浓度为约25％重量/体积的MTEG。在一些实施方案中，悬浮液包含最终浓度为约30％重量/体积的MTEG。在一些实施方案中，悬浮液包含最终浓度为约35％重量/体积的MTEG。在一些实施方案中，悬浮液包含最终浓度小于约35％重量/体积的MTEG。MTEG诱导的沉淀中使用的其余条件与PEG诱导的沉淀中使用的条件相同。如实施例中所示，包含mRNA、GSCN和MTEG的悬浮液(其中MTEG的最终浓度小于35％重量/体积)在没有不期望的过程酶沉淀的情况下确保了mRNA的有效回收。特别适合于在没有不期望的过程酶沉淀的情况下有效回收mRNA的是包含mRNA、GSCN和MTEG的悬浮液(其中MTEG的最终浓度为约25％)，除了与沉淀的mRNA的质量比为约10:1的助滤剂(例如基于纤维素的助滤剂)以外。

例如，GSCN可以作为4-8M溶液(例如，在10mM DTT缓冲液中)提供，然后将其与mRNA和MTEG组合以制备沉淀的mRNA的悬浮液。在一些实施方案中，悬浮液包含体积比为1:2-3:1-2的沉淀的mRNA、离液盐，例如GSCN和MTEG。在一些实施方案中，悬浮液包含体积比为1:2-2.5:1-2的沉淀的mRNA、离液盐，例如GSCN和MTEG。在一些实施方案中，悬浮液包含体积比为1:2.3:1-2的沉淀的mRNA、离液盐，例如GSCN和MTEG。在特定实施方案中，悬浮液包含比率为1:2.3:2的沉淀的mRNA、GSCN和MTEG。在特定实施方案中，悬浮液包含体积比为1:2.3:1.7的沉淀的mRNA、GSCN和MTEG。在特定实施方案中，悬浮液包含比率为1:2.3:1的沉淀的mRNA、GSCN和MTEG。如实施例中所示，包含体积比为1:2.3:1、1:2.3:1.7和1:2.3:2的mRNA、GSCN和MTEG的悬浮液与最终浓度为约95％的MTEG洗涤溶液组合特别适合于聚合物诱导的纯化方法中-该步骤的组合确保了在没有不期望的过程沉淀的情况下mRNA的有效回收。

捕获mRNA

如本文所述的纯化mRNA的方法的另一步骤包括捕获mRNA。捕获mRNA的各种方法是本领域已知的。在一些实施方案中，对含有沉淀的mRNA的不纯制剂进行涉及膜过滤的纯化过程，使得沉淀的mRNA被膜或过滤器捕获或保留。因此，在一些实施方案中，在没有预处理的情况下沉淀以去除不溶物之后，对不纯制剂进行膜过滤。

可以使用各种类型的膜过滤来捕获或保留沉淀的mRNA。通常，膜过滤涉及使用一个或多个插入的可渗透膜将固体与流体分离。膜过滤也可用于从气体样品过滤颗粒。一般来说，存在两种主要形式的膜过滤，即仅由于溶液扩散而进行的被动过滤，和使用正压或负压(即真空)来迫使液体或气体穿过膜的主动过滤。通常，膜过滤涉及加载、洗涤和洗脱步骤。

在过滤器上捕获mRNA包括将包含沉淀的mRNA的溶液加载到膜或过滤器上。该步骤通常称为加载步骤。加载步骤涉及将进料(例如，含有沉淀的mRNA的不纯制剂)加载到膜或过滤器上，并且通过正压或负压迫使其穿过，留下在膜上捕获或保留的渗余物。如本文所用，术语“渗余物”是指被膜保留的任何非渗透溶质和/或不溶物。根据本发明，沉淀的mRNA作为渗余物被膜捕获。如本文所用，术语“膜”或“过滤器”是指材料的任何多孔层或片材。在本申请中，术语“膜”与过滤器可互换使用。

在一些实施方案中，合适的膜具有适合于捕获或保留沉淀的mRNA的孔径，同时使杂质(包括可溶性杂质和/或尺寸小于孔径的不溶物)作为渗透物通过。在一些实施方案中，合适的膜具有为或大于约0.10μm、0.20μm、0.22μm、0.24μm、0.26μm、0.28μm、0.30μm、0.40μm、0.5μm或1.0μm的平均孔径。在特定实施方案中，合适的膜具有约0.22μm的平均孔径。在一些实施方案中，合适的膜具有约1.0μm、1.5μm、2.0μm、2.5μm、3.0μm、3.5μm、4.0μm、4.5μm、5.0μm、5.5μm、6.0μm、6.5μm、7.0μm、7.5μm、8.0μm、8.5μm、9.0μm、9.5μm和10μm的平均孔径。在一些实施方案中，例如对于与常规流过滤(NFF)或深层过滤一起使用，合适的膜具有约5μm至约8μm的平均孔径。在一些实施方案中，与NFF或深层过滤一起使用的合适的膜具有约7μm的平均孔径。在一些实施方案中，例如对于与离心过滤一起使用，合适的膜具有约0.5μm至约2.0μm的平均孔径。在一些实施方案中，与离心过滤一起使用的合适的膜为约1μm。在一些实施方案中，用于保留沉淀的mRNA的适当孔径可通过沉淀的mRNA的标称分子量限值(NMWL)，也称为分子量截止(MWCO)确定。通常，使用孔径小于沉淀的mRNA的NMWL或MWCO的膜。在一些实施方案中，使用孔径比沉淀的mRNA的NMWL或MWCO低二至六倍(例如2、3、4、5或6倍)的膜。在一些实施方案中，用于本发明的合适的膜可以具有为或大于约100千道尔顿(kDa)、300kDa、500kDa、1,000kDa、1,500kDa、2,000kDa、2,500kDa、3,000kDa、3,500kDa、4,000kDa、4,500kDa、5,000kDa、5,500kDa、6,000kDa、6,500kDa、7,000kDa、7,500kDa、8,000kDa、8,500kDa、9,000kDa、9,500kDa或10,000kDa的孔径。在一些实施方案中，膜具有大于mRNA的NMWL和MWCO但小于沉淀的mRNA的NMWL和MWCO的孔径。因此，在某些实施方案中，本发明提供了一种纯化mRNA的方法，所述方法包括在包含高摩尔盐溶液和PEG聚合物的悬浮液中沉淀mRNA，以在悬浮液中提供沉淀的mRNA，在孔径大于mRNA的NMWL和MWCO但小于沉淀的mRNA的NMWL和MWCO的过滤器上捕获沉淀的mRNA；以及洗涤所捕获和沉淀的mRNA以获得基本上不含污染物的纯化的mRNA组合物。

用于本发明的合适的膜可以由任何材料制成。示例性膜材料包括但不限于聚醚砜(mPES)(未改性)、聚醚砜(mPES)中空纤维膜、聚偏二氟乙烯(PVDF)、醋酸纤维素、硝化纤维素、MCE(混合纤维素酯)、超高分子量聚乙烯(UPE)、聚氟四乙烯(PTFE)、尼龙、聚砜、聚醚砜、聚丙烯腈、聚丙烯、聚氯乙烯及其组合。在特定实施方案中，膜是平均孔径为约1.0μm的聚丙烯过滤器。

用于本发明的合适的膜可以具有各种表面积。在一些实施方案中，合适的膜具有足够大的表面积以促进mRNA的大规模生产。例如，合适的膜可以具有为或大于约2,000cm²、2,500cm²、3,000cm²、3,500cm²、4,000cm²、4,500cm²、5,000cm²、7,500cm²、10,000cm²、5m²、10m²、12m²、15m²、20m²、24m²、25m²、30m²或50m²的表面积。

膜过滤可以各种形式进行以捕获沉淀的mRNA。在一些实施方案中，膜过滤作为切向流过滤(TFF)的一部分进行。在一些实施方案中，膜过滤包括常规流过滤(NFF)或深层过滤。在一些实施方案中，膜过滤包括离心过滤。

助滤剂(包括分散剂)

在一些实施方案中，在本文所述的方法中使用助滤剂。当使用过滤离心机纯化沉淀的mRNA时，可以使用助滤剂。助滤剂可有助于将沉淀的mRNA保留在过滤离心机的过滤器上，并且允许从过滤离心机的过滤器表面去除保留的mRNA。

在一些实施方案中，助滤剂是分散剂。在一些实施方案中，助滤剂包括灰分、粘土、硅藻土、珍珠岩、玻璃珠、塑料珠、聚合物、聚丙烯珠、聚苯乙烯珠、盐(例如，纤维素盐)、沙子、火山灰、硅藻土和/或糖中的一种或多种。在一些实施方案中，分散剂是珠粒。在一些实施方案中，沉淀的mRNA组合物不包含分散剂。

在一些实施方案中，在不存在任何分散剂的情况下进行添加一种或多种促进mRNA沉淀的试剂的步骤。

在一些实施方案中，在存在至少一种分散剂的情况下进行添加一种或多种促进mRNA沉淀的试剂的步骤。

在一些实施方案中，将分散剂添加到在添加一种或多种促进mRNA沉淀的试剂之后获得的浆液中。

因此，在一些实施方案中，纯化方法还可包括用于将分散剂与纯化的mRNA沉淀物分离的一个或多个步骤，例如洗涤和干燥滤饼。该方法还可包括在过滤分散剂的同时，使用水性介质例如水从滤饼中溶解和洗脱纯化的mRNA的步骤。在实施方案中，可同时进行沉淀步骤和干燥步骤。

在实施方案中，助滤剂是纤维素。在实施方案中，纤维素助滤剂是粉末状纤维素纤维(例如，

或Sigmacell Cellulose 20)。在实施方案中，纤维素助滤剂是粉末状纤维素纤维，诸如

200NF或Sigmacell Cellulose类型20(20μm)。在一些实施方案中，助滤剂是火山灰。在一些实施方案中，助滤剂是硅藻土。

在一些实施方案中，沉淀的mRNA和助滤剂(例如粉末状纤维素纤维，诸如SolkaFloc)的质量比为1:2；1:5；1:10或1:15。在特定实施方案中，沉淀的mRNA和助滤剂(例如粉末状纤维素纤维，诸如Solka Floc)的质量比为1:10。

洗涤捕获的mRNA

纯化mRNA的方法还包括在洗脱之前洗涤所捕获的不溶性mRNA，以除去保留在膜上的杂质。

在一些实施方案中，在洗涤步骤中使用两亲性聚合物。在一些实施方案中，两亲性聚合物是聚乙二醇(PEG)。因此，在一些实施方案中，PEG溶液(“PEG洗涤溶液”)用于洗涤捕获的mRNA。PEG洗涤溶液包含三乙二醇、四乙二醇、PEG 200、PEG 300、PEG 400、PEG 600、PEG1,000、PEG 1,500、PEG 2,000、PEG 3,000、PEG 3,350、PEG 4,000、PEG6,000、PEG 8,000、PEG 10,000、PEG 20,000、PEG 35,000和PEG 40,000或其组合。在一些实施方案中，PEG洗涤溶液包含三乙二醇。在一些实施方案中，PEG洗涤溶液包含四乙二醇。在一些实施方案中，PEG洗涤溶液包含PEG 200。在一些实施方案中，PEG溶液包含PEG 300。在一些实施方案中，洗涤PEG洗涤溶液包含PEG 400。在一些实施方案中，PEG洗涤溶液包含PEG 600。在一些实施方案中，PEG洗涤溶液包含PEG1,000。在一些实施方案中，PEG洗涤溶液包含PEG 1,500。在一些实施方案中，PEG洗涤溶液包含PEG 2,000。在一些实施方案中，PEG洗涤溶液包含PEG3,000。在一些实施方案中，PEG洗涤溶液包含PEG 3,350。在一些实施方案中，PEG洗涤溶液包含PEG 4,000。在一些实施方案中，PEG洗涤溶液包含PEG 6,000。在一些实施方案中，PEG洗涤溶液包含PEG 8,000。在一些实施方案中，PEG洗涤溶液包含PEG 10,000。在一些实施方案中，PEG洗涤溶液包含PEG 20,000。在一些实施方案中，PEG洗涤溶液包含PEG 35,000。在一些实施方案中，PEG洗涤溶液包含PEG40,000。在一些实施方案中，洗涤沉淀的mRNA包括一次或多次包含粘度为90厘沲或更小的PEG的洗涤。在一些实施方案中，用于洗涤沉淀的mRNA的PEG具有80厘沲或更小的粘度。在一些实施方案中，用于洗涤沉淀的mRNA的PEG具有70厘沲或更小的粘度。在一些实施方案中，用于洗涤沉淀的mRNA的PEG具有60厘沲或更小的粘度。在一些实施方案中，用于洗涤沉淀的mRNA的PEG具有50厘沲或更小的粘度。在一些实施方案中，用于洗涤沉淀的mRNA的PEG具有40厘沲或更小的粘度。在一些实施方案中，用于洗涤沉淀的mRNA的PEG具有30厘沲或更小的粘度。在一些实施方案中，用于洗涤沉淀的mRNA的PEG具有20厘沲或更小的粘度。在一些实施方案中，用于洗涤沉淀的mRNA的PEG具有10厘沲或更小的粘度。在一些实施方案中，可以使用三乙二醇(TEG)来实现洗涤沉淀的mRNA。在一些实施方案中，可以使用三乙二醇单甲醚(MTEG)来实现洗涤沉淀的mRNA。在一些实施方案中，可以使用叔丁基-TEG-O-丙酸酯来实现洗涤沉淀的mRNA。在一些实施方案中，可以使用TEG-二甲基丙烯酸酯来实现洗涤沉淀的mRNA。在一些实施方案中，可以使用TEG-二甲基醚来实现洗涤沉淀的mRNA。在一些实施方案中，可以使用TEG-二乙烯基醚来实现洗涤沉淀的mRNA。在一些实施方案中，可以使用TEG-单丁基来实现洗涤沉淀的mRNA。在一些实施方案中，可以使用TEG-甲基醚甲基丙烯酸酯来实现洗涤沉淀的mRNA。在一些实施方案中，可以使用TEG-单癸基醚来实现洗涤沉淀的mRNA。在一些实施方案中，可以使用TEG-二苯甲酸酯来实现洗涤沉淀的mRNA。在上面表A中显示了这些试剂中的每一种试剂的结构。

液体溶液的粘度可以使用本领域熟知的方法测量，例如在室温(例如约18至25℃)下使用粘度计。

在一些实施方案中，PEG洗涤溶液中的PEG包含PEG修饰的脂质。在一些实施方案中，PEG洗涤溶液中的PEG是PEG修饰的脂质1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇(DMG-PEG-2K)。在一些实施方案中，PEG修饰的脂质是DOPA-PEG缀合物。在一些实施方案中，PEG修饰的脂质是泊洛沙姆-PEG缀合物。在一些实施方案中，PEG修饰的脂质包含DOTAP。在一些实施方案中，PEG修饰的脂质包含胆固醇。

在一些实施方案中，PEG洗涤溶液包含两种或更多种分子量PEG聚合物的混合物。例如，在一些实施方案中，两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种、十一种或十二种分子量PEG聚合物包含PEG洗涤溶液。因此，在一些实施方案中，PEG洗涤溶液包含一种或多种PEG聚合物的混合物。在一些实施方案中，PEG聚合物的混合物包含具有不同分子量的聚合物。

PEG洗涤溶液中使用的PEG可以具有各种几何构型。例如，合适的PEG聚合物包括具有直链构型、支链构型、Y形构型或多臂构型的PEG聚合物。在一些实施方案中，PEG在包含一种或多种具有不同几何构型的PEG的悬浮液中。

在一些实施方案中，洗涤溶液中的PEG以约10％至约100％重量/体积浓度存在。例如，在一些实施方案中，PEG以约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％重量/体积浓度及其间的任何值存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，PEG以约10％重量/体积浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，PEG以约15％重量/体积存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，PEG以约20％重量/体积浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，PEG以约25％重量/体积浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，PEG以约30％重量/体积浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，PEG以约35％重量/体积浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，PEG以约40％重量/体积浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，PEG以约45％重量/体积浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，PEG以约50％重量/体积浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，PEG以约55％重量/体积浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，PEG以约60％重量/体积浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，PEG以约65％重量/体积浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，PEG以约70％重量/体积浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，PEG以约75％重量/体积浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，PEG以约80％重量/体积浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，PEG以约85％重量/体积浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，PEG以约90％重量/体积浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，PEG以约95％重量/体积浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，PEG以约100％重量/体积浓度存在于洗涤溶液中。

在一些实施方案中，洗涤缓冲液包含浓度为约80至100％的PEG-400。因此，在一些实施方案中，洗涤缓冲液包含浓度为约80％的PEG-400。在一些实施方案中，洗涤缓冲液包含浓度为约85％的PEG-400。在一些实施方案中，洗涤缓冲液包含浓度为约90％的PEG-400。在一些实施方案中，洗涤缓冲液包含浓度为约95％的PEG-400。在一些实施方案中，洗涤缓冲液包含浓度为约100％的PEG-400。

在一些实施方案中，在包含两亲性聚合物的溶液中洗涤沉淀的mRNA。在一些实施方案中，两亲性聚合物是PEG。沉淀的mRNA可以洗涤1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或超过10次。因此，在一些实施方案中，用包含PEG聚合物的溶液洗涤沉淀的mRNA一次。在一些实施方案中，用包含PEG聚合物的溶液洗涤沉淀的mRNA两次。在一些实施方案中，用包含PEG聚合物的溶液洗涤沉淀的mRNA三次。在一些实施方案中，用包含PEG聚合物的溶液洗涤沉淀的mRNA四次。在一些实施方案中，用包含PEG聚合物的溶液洗涤沉淀的mRNA五次。在一些实施方案中，用包含PEG聚合物的溶液洗涤沉淀的mRNA六次。在一些实施方案中，用包含PEG聚合物的溶液洗涤沉淀的mRNA七次。在一些实施方案中，用包含PEG聚合物的溶液洗涤沉淀的mRNA八次。在一些实施方案中，用包含PEG聚合物的溶液洗涤沉淀的mRNA九次。在一些实施方案中，用包含PEG聚合物的溶液洗涤沉淀的mRNA十次。在一些实施方案中，用包含PEG聚合物的溶液洗涤沉淀的mRNA超过十次。

在一些实施方案中，用于洗涤捕获的mRNA的洗涤溶液是水性的。因此，在一些实施方案中，洗涤溶液不含醇，诸如乙醇、异丙醇或苄醇。

在一些实施方案中，PEG洗涤溶液包含非水性组分，诸如，例如乙醇、异丙醇或苄醇。

在一些实施方案中，洗涤步骤包括使用包含两亲性聚合物(例如，聚乙二醇)的溶液的多次漂洗循环。在一些实施方案中，洗涤步骤包括使用包含一种或多种不同两亲性聚合物的溶液的多次漂洗。在一些实施方案中，洗涤步骤可以通过使用包含约10％至约100％两亲性聚合物的溶液的多次漂洗循环进行。在某些实施方案中，多次漂洗循环包括2次循环、3次循环、4次循环、5次循环、6次循环、7次循环、8次循环、9次循环、10次循环或多于10次循环。

在一些实施方案中，PEG以约90％至约100％重量/体积浓度存在于洗涤溶液中。在特定实施方案中，PEG(例如PEG-400)以约90％重量/体积浓度存在于洗涤溶液中。如实施例中所示，约90％至约100％重量/体积的分子量为约400g/mol的PEG(例如PEG-400)的最终浓度特别适合于洗涤步骤，因为这种洗涤溶液产生高产率和高纯度的mRNA样品。

在一些实施方案中，MTEG以约75％至约95％重量/体积浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，MTEG以约75％、约80％、约85％、约90％或约95％重量/体积浓度存在于洗涤溶液中。在一些实施方案中，MTEG以约90％至约100％重量/体积的浓度存在于洗涤溶液中。在特定实施方案中，MTEG以约95％重量/体积的浓度存在于洗涤溶液中。如实施例中所示，约90％或约95％重量/体积的MTEG的最终浓度特别适合于洗涤步骤，因为这些最终浓度在没有沉淀过程酶的情况下实现了mRNA的高效回收。

洗脱或收集

通常，可以通过将沉淀的mRNA重新溶解到溶液中来洗脱或收集所捕获或保留的mRNA。例如，可以用无RNAse的水来洗脱捕获的mRNA。在某些实施方案中，洗脱捕获的mRNA涉及再循环无RNAse的水。例如，可以将无RNAse的水循环约5-30分钟(例如，约5-25分钟、约5-20分钟或约5-15分钟)。在特定实施方案中，将无RNAse的水再循环约5-10分钟(例如，约5、6、7、8、9或10分钟)。其他缓冲液，诸如TE和/或柠檬酸钠可用于使mRNA再溶解。术语“洗脱”可用于涉及例如深层过滤的纯化方法的上下文中，而术语“收集”可用于涉及离心的纯化方法的上下文中。

在一些实施方案中，可以将重新溶解的mRNA以期望的浓度透析到期望的配制品中。可以将各种配制品用于透析。在一些实施方案中，将纯化的mRNA溶液用1mM柠檬酸钠透析。在一些实施方案中，将纯化的mRNA溶液用乙酸钠、碳酸铵、碳酸氢铵、乙酸吡啶鎓、甲酸吡啶鎓、乙酸铵、尿素、氯化钾等透析。根据感兴趣的mRNA的大小，可以使用具有适当分子量截止(MWCO)的透析膜。例如，合适的透析膜可以具有约50kDa、60kDa、70kDa、80kDa、90kDa、100kDa、150kDa、200kDa、250kDa、300kDa、350kDa、400kDa、450kDa或500kDa的MWCO。

规模和回收量

本发明提供的特定优点是能够以大规模或商业规模纯化mRNA，特别是体外合成的mRNA。例如，在一些实施方案中，体外合成的mRNA以每批次为或大于约100毫克、1克、10克、50克、100克、200克、300克、400克、500克、600克、700克、800克、900克、1kg、5kg、10kg、50kg、100kg、一公吨、十公吨或更大的规模纯化。在实施方案中，体外合成的mRNA以为或大于约1kg的规模纯化。

在一个特定实施方案中，体外合成的mRNA以每批次10克的规模纯化。在一个特定实施方案中，体外合成的mRNA以每批次20克的规模纯化。在一个特定实施方案中，体外合成的mRNA以每批次25克的规模纯化。在一个特定实施方案中，体外合成的mRNA以每批次50克的规模纯化。在另一个特定实施方案中，体外合成的mRNA以每批次100克的规模纯化。在又一个特定实施方案中，体外合成的mRNA以每批次1kg的规模纯化。在又一个特定实施方案中，体外合成的mRNA以每批次10kg的规模纯化。在又一个特定实施方案中，体外合成的mRNA以每批次100kg的规模纯化。在又一个特定实施方案中，体外合成的mRNA以每批次1,000kg的规模纯化。在又一个特定实施方案中，体外合成的mRNA以每批次10,000kg的规模纯化。

在一些实施方案中，mRNA以每批次为或大于1克、5克、10克、15克、20克、25克、30克、35克、40克、45克、50克、75克、100克、150克、200克、250克、300克、350克、400克、450克、500克、550克、600克、650克、700克、750克、800克、850克、900克、950克、1kg、2.5kg、5kg、7.5kg、10kg、25kg、50kg、75kg、100kg的规模纯化。

在一些实施方案中，包含mRNA的溶液包括至少一克、十克、一百克、一千克、十千克、一百千克、一公吨、十公吨或更多的mRNA，或其间的任何量。在一些实施方案中，本文所述的方法用于纯化的mRNA的量为至少约250mg mRNA。在一个实施方案中，本文所述的方法用于纯化的mRNA的量为至少约250mg mRNA、约500mg mRNA、约750mg mRNA、约1000mg mRNA、约1500mg mRNA、约2000mg mRNA或约2500mg mRNA。在实施方案中，本文所述的方法用于纯化的mRNA的量为至少约250mg mRNA至约500g mRNA。在实施方案中，本文所述的方法用于纯化的mRNA量为至少约500mg mRNA至约250g mRNA、约500mg mRNA至约100g mRNA、约500mgmRNA至约50g mRNA、约500mg mRNA至约25g mRNA、约500mg mRNA至约10g mRNA或约500mgmRNA至约5g mRNA。在实施方案中，本文所述的方法用于纯化的mRNA的量为至少约100mgmRNA至约10g mRNA、约100mg mRNA至约5g mRNA或约100mg mRNA至约1g mRNA。

在一些实施方案中，本文所述的方法提供的纯化的mRNA的回收量(或“产率”)为至少约40％、45％、50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约97％、约98％、约99％或约100％。因此，在一些实施方案中，纯化的mRNA的回收量为约40％。在一些实施方案中，纯化的mRNA的回收量为约45％。在一些实施方案中，纯化的mRNA的回收量为约50％。在一些实施方案中，纯化的mRNA的回收量为约55％。在一些实施方案中，纯化的mRNA的回收量为约60％。在一些实施方案中，纯化的mRNA的回收量为约65％。在一些实施方案中，纯化的mRNA的回收量为约70％。在一些实施方案中，纯化的mRNA的回收量为约75％。在一些实施方案中，纯化的mRNA的回收量为约75％。在一些实施方案中，纯化的mRNA的回收量为约80％。在一些实施方案中，纯化的mRNA的回收量为约85％。在一些实施方案中，纯化的mRNA的回收量为约90％。在一些实施方案中，纯化的mRNA的回收量为约91％。在一些实施方案中，纯化的mRNA的回收量为约92％。在一些实施方案中，纯化的mRNA的回收量为约93％。在一些实施方案中，纯化的mRNA的回收量为约94％。在一些实施方案中，纯化的mRNA的回收量为约95％。在一些实施方案中，纯化的mRNA的回收量为约96％。在一些实施方案中，纯化的mRNA的回收量为约97％。在一些实施方案中，纯化的mRNA的回收量为约98％。在一些实施方案中，纯化的mRNA的回收量为约99％。在一些实施方案中，纯化的mRNA的回收量为约100％。

在特定实施方案中，纯化的mRNA的回收量大于约80％或大于约90％，例如在约90％与100％之间。

对纯化的mRNA的表征

本文提供的mRNA纯化方法产生基本上不含污染物的纯化的mRNA组合物，该污染物包括短的异常终止RNA种类、长的异常终止RNA种类、双链RNA(dsRNA)、残留质粒DNA、残留体外转录酶、残留溶剂和/或残留盐。

本文所述的方法产生纯度介于约60％与约100％之间的纯化的mRNA。因此，在一些实施方案中，纯化的mRNA具有约60％的纯度。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有约65％的纯度。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有约70％的纯度。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有约75％的纯度。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有约80％的纯度。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有约85％的纯度。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有约90％的纯度。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有约91％的纯度。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有约92％的纯度。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有约93％的纯度。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有约94％的纯度。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有约95％的纯度。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有约96％的纯度。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有约97％的纯度。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有约98％的纯度。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有约99％的纯度。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有约100％的纯度。

在一些实施方案中，除了全长mRNA以外，通过本文公开的方法产生的mRNA具有小于10％、小于9％、小于8％、小于7％、小于6％、小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％、小于0.5％和/或小于0.1％的杂质。杂质包括IVT污染物，例如蛋白质、酶、DNA模板、游离核苷酸、残留溶剂、残留盐、双链RNA(dsRNA)、过早终止的RNA序列(“短聚体”或“短的异常终止RNA种类”)和/或长的异常终止RNA种类。在一些实施方案中，纯化的mRNA基本上不含过程酶。

在一些实施方案中，使用本文所述的纯化方法的纯化的mRNA中的残留质粒DNA小于约1pg/mg、小于约2pg/mg、小于约3pg/mg、小于约4pg/mg、小于约5pg/mg、小于约6pg/mg、小于约7pg/mg、小于约8pg/mg、小于约9pg/mg、小于约10pg/mg、小于约11pg/mg或小于约12pg/mg。因此，使用本文所述的纯化方法的纯化的mRNA中的残留质粒DNA小于约1pg/mg。在一些实施方案中，使用本文所述的纯化方法的纯化的mRNA中的残留质粒DNA小于约2pg/mg。在一些实施方案中，使用本文所述的纯化方法的纯化的mRNA中的残留质粒DNA小于约3pg/mg。在一些实施方案中，使用本文所述的纯化方法的纯化的mRNA中的残留质粒DNA小于约4pg/mg。在一些实施方案中，使用本文所述的纯化方法的纯化的mRNA中的残留质粒DNA小于约5pg/mg。在一些实施方案中，使用本文所述的纯化方法的纯化的mRNA中的残留质粒DNA小于约6pg/mg。在一些实施方案中，使用本文所述的纯化方法的纯化的mRNA中的残留质粒DNA小于约7pg/mg。在一些实施方案中，使用本文所述的纯化方法的纯化的mRNA中的残留质粒DNA小于约8pg/mg。在一些实施方案中，使用本文所述的纯化方法的纯化的mRNA中的残留质粒DNA小于约9pg/mg。在一些实施方案中，使用本文所述的纯化方法的纯化的mRNA中的残留质粒DNA小于约10pg/mg。在一些实施方案中，使用本文所述的纯化方法的纯化的mRNA中的残留质粒DNA小于约11pg/mg。在一些实施方案中，使用本文所述的纯化方法的纯化的mRNA中的残留质粒DNA小于约12pg/mg。

在一些实施方案中，本发明去除或消除高度过早终止的RNA序列(也称为“短聚体”)。在一些实施方案中，根据本发明的方法去除超过约90％、95％、96％、97％、98％、99％或基本上全部过早终止的RNA序列。在一些实施方案中，根据本发明纯化的mRNA基本上不含过早终止的RNA序列。在一些实施方案中，根据本发明纯化的mRNA含有小于约5％(例如小于约4％、3％、2％或1％)的过早终止的RNA序列。在一些实施方案中，根据本发明纯化的mRNA含有小于约1％(例如小于约0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％)的过早终止的RNA序列。在一些实施方案中，根据本发明纯化的mRNA含有不可检测的过早终止的RNA序列，如通过例如高效液相色谱法(HPLC)(例如，肩峰或单独的峰)、溴化乙锭、考马斯染色、毛细管电泳或Glyoxal凝胶电泳(例如，存在单独的较低条带)所确定。如本文所用，术语“短聚体”、“短的异常终止RNA种类”、“过早终止的RNA序列”或“长的异常终止RNA种类”是指小于全长的任何转录物。在一些实施方案中，“短聚体”、“短的异常终止RNA种类”或“过早终止的RNA序列”的长度小于100个核苷酸，长度小于90个、小于80个、小于70个、小于60个、小于50个、小于40个、小于30个、小于20个或小于10个核苷酸。在一些实施方案中，在添加5'-帽和/或3'-聚A尾巴之后，检测或定量短聚体。在一些实施方案中，过早终止的RNA转录物包含少于15个碱基(例如，少于14个、13个、12个、11个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个或3个碱基)。在一些实施方案中，过早终止的RNA转录物含有约8-15、8-14、8-13、8-12、8-11或8-10个碱基。

在一些实施方案中，根据本发明的方法去除或消除体外合成中使用的高度酶试剂，包括但不限于T7 RNA聚合酶、DNAse I、焦磷酸酶和/或RNAse抑制剂。在一些实施方案中，本发明对于去除T7 RNA聚合酶特别有效。在一些实施方案中，根据本发明的方法去除超过约90％、95％、96％、97％、98％、99％或基本上全部体外合成中包括使用的酶试剂。在一些实施方案中，根据本发明纯化的mRNA基本上不含体外合成中包括使用的酶试剂。在一些实施方案中，根据本发明纯化的mRNA含有少于约5％(例如，少于约4％、3％、2％或1％)的体外合成中包括使用的酶试剂。在一些实施方案中，根据本发明纯化的mRNA含有少于约1％(例如，少于约0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％或0.1％)的体外合成中包括使用的酶试剂。在一些实施方案中，根据本发明纯化的mRNA含有体外合成中使用的不可检测的酶试剂，包括如通过例如银染、凝胶电泳、高效液相色谱法(HPLC)、超高效液相色谱法(UPLC)、和/或毛细管电泳、溴化乙锭和/或考马斯染色所确定。

在各种实施方案中，使用本文所述的方法纯化的mRNA保持高度完整性。如本文所用，术语“mRNA完整性”一般是指纯化后mRNA的质量。mRNA完整性可以使用本领域熟知的方法，例如通过RNA琼脂糖凝胶电泳来确定。在一些实施方案中，mRNA完整性可以通过RNA琼脂糖凝胶电泳的带型来确定。在一些实施方案中，与RNA琼脂糖凝胶电泳的参考条带相比，根据本发明纯化的mRNA显示很少或无条带。在一些实施方案中，根据本发明纯化的mRNA具有大于约95％(例如大于约96％、97％、98％或99％或更高)的完整性。在一些实施方案中，根据本发明纯化的mRNA具有大于98％的完整性。在一些实施方案中，根据本发明纯化的mRNA具有大于99％的完整性。在一些实施方案中，根据本发明纯化的mRNA具有大约100％的完整性。在一些实施方案中，本文所述的方法提供了相对于具有较低百分比的全长mRNA分子的组合物具有增加的活性(例如至少两倍、三倍、四倍、五倍或更多)的翻译多肽的组合物。

在一些实施方案中，评估纯化的mRNA的以下特征中的一个或多个：外观、同一性、数量、浓度、杂质的存在、微生物学评估、pH水平和活性。在一些实施方案中，可接受的外观包括基本上不含可见颗粒的澄清无色溶液。在一些实施方案中，通过测序方法评估mRNA的同一性。在一些实施方案中，通过合适的方法，诸如UV分光光度法来评估浓度。在一些实施方案中，合适的浓度在约90％与110％标称(0.9-1.1mg/mL)之间。

在一些实施方案中，评估mRNA的纯度包括评估mRNA完整性、评估残留质粒DNA和评估残留溶剂。在一些实施方案中，通过琼脂糖凝胶电泳评估可接受的mRNA完整性水平。分析凝胶以确定带型和表观核苷酸长度是否与分析参比标准品一致。评估RNA完整性的其他方法包括例如使用毛细管凝胶电泳(CGE)评估纯化的mRNA。在一些实施方案中，如通过CGE确定的纯化的mRNA的可接受纯度是纯化的mRNA组合物具有不超过约55％的长的异常终止/降解种类。在一些实施方案中，通过本领域的方法，例如通过使用qPCR来评估残留质粒DNA。在一些实施方案中，小于10pg/mg(例如，小于10pg/mg、小于9pg/mg、小于8pg/mg、小于7pg/mg、小于6pg/mg、小于5pg/mg、小于4pg/mg、小于3pg/mg、小于2pg/mg或小于1pg/mg)是可接受的残留质粒DNA水平。在一些实施方案中，可接受的残留溶剂水平不超过10,000ppm、9,000ppm、8,000ppm、7,000ppm、6,000ppm、5,000ppm、4,000ppm、3,000ppm、2,000ppm、1,000ppm。因此，在一些实施方案中，可接受的残留溶剂水平不超过10,000ppm。在一些实施方案中，可接受的残留溶剂水平不超过9,000ppm。在一些实施方案中，可接受的残留溶剂水平不超过8,000ppm。在一些实施方案中，可接受的残留溶剂水平不超过7,000ppm。在一些实施方案中，可接受的残留溶剂水平不超过6,000ppm。在一些实施方案中，可接受的残留溶剂水平不超过5,000ppm。在一些实施方案中，可接受的残留溶剂水平不超过4,000ppm。在一些实施方案中，可接受的残留溶剂水平不超过3,000ppm。在一些实施方案中，可接受的残留溶剂水平不超过2,000ppm。在一些实施方案中，可接受的残留溶剂水平不超过1,000ppm。

在一些实施方案中，对纯化的mRNA进行微生物学测试，其包括例如细菌内毒素的评估。在一些实施方案中，细菌内毒素<0.5EU/mL、<0.4EU/mL、<0.3EU/mL、<0.2EU/mL或<0.1EU/mL。因此，在一些实施方案中，纯化的mRNA中的细菌内毒素<0.5EU/mL。在一些实施方案中，纯化的mRNA中的细菌内毒素<0.4EU/mL。在一些实施方案中，纯化的mRNA中的细菌内毒素<0.3EU/mL。在一些实施方案中，纯化的mRNA中的细菌内毒素<0.2EU/mL。在一些实施方案中，纯化的mRNA中的细菌内毒素<0.2EU/mL。在一些实施方案中，纯化的mRNA中的细菌内毒素<0.1EU/mL。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有不超过1CFU/10mL、1CFU/25mL、1CFU/50mL、1CFU/75mL或不超过1CFU/100mL。因此，在一些实施方案中，纯化的mRNA具有不超过1CFU/10mL。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有不超过1CFU/25mL。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有不超过1CFU/50mL。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有不超过1CFR/75mL。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有1CFU/100mL。

在一些实施方案中，评估纯化的mRNA的pH。在一些实施方案中，纯化的mRNA的可接受pH在5与8之间。因此，在一些实施方案中，纯化的mRNA具有约5的pH。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有约6的pH。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有约7的pH。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有约7的pH。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有约8的pH。

在一些实施方案中，评估纯化的mRNA的翻译保真度。翻译保真度可以通过各种方法评估，并且包括例如转染和蛋白质印迹分析。纯化的mRNA的可接受的特征包括蛋白质印迹上的带型，该蛋白质印迹以与参照标准品相似的分子量迁移。

在一些实施方案中，评估纯化的mRNA的传导。在一些实施方案中，纯化的mRNA的可接受的特征包括参考标准品的约50％与150％之间的传导。

还针对Cap百分比和聚A尾长度评估纯化的mRNA。在一些实施方案中，可接受的Cap百分比包括Cap1，面积％：NLT90。在一些实施方案中，可接受的聚A尾长度为约100-1500个核苷酸(例如，100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950和1000、1100、1200、1300、1400或1500个核苷酸)。因此，在一些实施方案中，可接受的聚A尾长度为约100个核苷酸。在一些实施方案中，可接受的聚A尾长度为约200个核苷酸。在一些实施方案中，可接受的聚A尾长度为约250个核苷酸。在一些实施方案中，可接受的聚A尾长度为约300个核苷酸。在一些实施方案中，可接受的聚A尾长度为约350个核苷酸。在一些实施方案中，可接受的聚A尾长度为约400个核苷酸。在一些实施方案中，可接受的聚A尾长度为约450个核苷酸。在一些实施方案中，可接受的聚A尾长度为约500个核苷酸。在一些实施方案中，可接受的聚A尾长度为约550个核苷酸。在一些实施方案中，可接受的聚A尾长度为约600个核苷酸。在一些实施方案中，可接受的聚A尾长度为约650个核苷酸。在一些实施方案中，可接受的聚A尾长度为约700个核苷酸。在一些实施方案中，可接受的聚A尾长度为约750个核苷酸。在一些实施方案中，可接受的聚A尾长度为约800个核苷酸。在一些实施方案中，可接受的聚A尾长度为约850个核苷酸。在一些实施方案中，可接受的聚A尾长度为约900个核苷酸。在一些实施方案中，可接受的聚A尾长度为约950个核苷酸。在一些实施方案中，可接受的聚A尾长度为约1000个核苷酸。在一些实施方案中，可接受的聚A尾长度为约1100个核苷酸。在一些实施方案中，可接受的聚A尾长度为约1200个核苷酸。在一些实施方案中，可接受的聚A尾长度为约1300个核苷酸。在一些实施方案中，可接受的聚A尾长度为约1400个核苷酸。在一些实施方案中，可接受的聚A尾长度为约1500个核苷酸。

在一些实施方案中，还评估纯化的mRNA的任何残留PEG。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有小于10ng PEG/mg的纯化的mRNA和1000ng PEG/mg的mRNA。因此，在一些实施方案中，纯化的mRNA具有小于约10ng PEG/mg的纯化的mRNA。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有小于约100ng PEG/mg的纯化的mRNA。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有小于约250ngPEG/mg的纯化的mRNA。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有小于约500ng PEG/mg的纯化的mRNA。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有小于约750ng PEG/mg的纯化的mRNA。在一些实施方案中，纯化的mRNA具有小于约1000ng PEG/mg的纯化的mRNA。

检测和定量mRNA纯度的各种方法是本领域已知的。例如，这类方法包括印迹、毛细管电泳、色谱法、荧光、凝胶电泳、HPLC、银染、光谱、紫外线(UV)或UPLC或其组合。在一些实施方案中，在凝胶电泳(“乙二醛凝胶电泳”)之前，首先通过乙二醛染料使mRNA变性。在一些实施方案中，在加帽或加尾之前表征合成的mRNA。在一些实施方案中，在加帽和加尾之后表征合成的mRNA。

用于所述方法的合适的核酸

可以使用本文所述的方法纯化任何种类的核酸。在一些实施方案中，核酸是体外转录(IVT)mRNA。简而言之，IVT通常使用线性或环状DNA模板进行，该模板包含启动子，三磷酸核糖核苷酸库，可能包括DTT和镁离子的缓冲系统以及适当的RNA聚合酶(例如，T3、T7或SP6RNA聚合酶)，DNAse I，焦磷酸酶和/或RNAse抑制剂。在一些实施方案中，IVT反应包括两步过程，第一步包括mRNA的体外转录，随后为纯化步骤，并且第二步包括体外转录mRNA的加帽和加尾，随后为第二纯化步骤。在一些实施方案中，IVT反应是导致加帽和加尾的mRNA的体外转录的一步过程。例如，在一些实施方案中，体外转录导致产生加帽和加尾的mRNA，所述mRNA随后被纯化。这例如通过使用包含聚T区和/或

的质粒来实现。确切条件将根据特定应用而变化。根据若干实施方案，这些试剂的存在于最终产品中是不希望的，因此可以被称为杂质，并且含有一种或多种这些杂质的制剂可以被称为不纯的制剂。因此，在一方面，本发明提供了一种制造mRNA的方法，所述方法包括以下步骤：(a)通过混合(i)包含启动子的DNA模板和(ii)RNA聚合酶来进行体外转录(IVT)，以产生包含全长mRNA的不纯制剂；(b)向所述悬浮液提供高摩尔盐和两亲性聚合物以沉淀全长mRNA并在所述悬浮液中提供沉淀的全长mRNA；(c)通过将所述悬浮液施加到过滤器来捕获所述沉淀的全长mRNA；以及(d)用水性溶剂洗涤步骤(c)的所述沉淀的全长mRNA以在水溶液中获得纯化的全长mRNA，以及(e)使来自步骤(d)的所述沉淀的mRNA溶解以获得纯化的mRNA组合物，其中由步骤(d)提供的所述水溶液中的所述纯化的全长mRNA基本上不含(i)所述包含启动子的DNA模板和(ii)所述RNA聚合酶。

在一些实施方案中，在步骤(a)中，DNA模板是线性DNA模板。在一些实施方案中，在步骤(a)中，聚合酶是SP6聚合酶。在一些实施方案中，在步骤(a)中，混合还包括混合三磷酸核糖核苷酸库。在一些实施方案中，在步骤(a)中，混合还包括RNase抑制剂(例如RNase I抑制剂)、RNase A、RNase B和RNase C。

在一些实施方案中，在步骤(b)中，高摩尔盐是GSCN。在一些实施方案中，在步骤(b)中，高摩尔盐包含GSCN。在一些实施方案中，在步骤(b)中，两亲性聚合物包含PEG聚合物。在一些实施方案中，在步骤(b)中，两亲聚合物包含MTEG。在特定实施方案中，在步骤(b)中，高摩尔盐包含GSCN，并且两亲性聚合物包含分子量为约6000g/mol(例如PEG-6000)或MTEG的PEG。

在一些实施方案中，在步骤(c)中，过滤器具有的MWCO小于沉淀的全长mRNA但大于全长mRNA。在一些实施方案中，在步骤(c)中，过滤器是深层过滤器。在一些实施方案中，在步骤(c)中，过滤器与离心一起使用。

在一些实施方案中，在步骤(d)中，水性溶剂包含两亲性聚合物。在一些实施方案中，在步骤(d)中，水性溶剂中的两亲性聚合物与步骤(b)中使用的两亲性聚合物相同。在一些实施方案中，在步骤(d)中，水性溶剂中的两亲性聚合物与步骤(b)中使用的两亲性聚合物不同。在一些实施方案中，在步骤(d)中，两亲性聚合物包含PEG聚合物。在一些实施方案中，在步骤(d)中，水性溶剂中的PEG聚合物与步骤(b)中使用的PEG聚合物相同。在一些实施方案中，在步骤(d)中，水性溶剂中的PEG聚合物与步骤(b)中使用的PEG聚合物不同。

在一些实施方案中，由步骤(e)提供的所述水溶液中的所述纯化的全长mRNA也基本上不含(iv)预终止RNA序列。在一些实施方案中，预终止的RNA序列包含短聚体。在一些实施方案中，由步骤(e)提供的所述水溶液中的所述纯化的全长mRNA也基本上不含(v)双链RNA(dsRNA)。在一些实施方案中，由步骤(e)提供的所述水溶液中的所述纯化的全长mRNA也基本上不含(iv)预终止RNA序列和(v)双链RNA(dsRNA)。

在一些实施方案中，在步骤(a)中，RNA聚合酶是SP6聚合酶，并且由步骤(e)提供的所述水溶液中的所述纯化的全长mRNA也基本上不含(v)双链RNA(dsRNA)。

在一些实施方案中，这种制造方法不使用色谱法来产生高纯度mRNA。在一些实施方案中，这种制造方法不使用基于醇的溶剂来产生高纯度mRNA。在一些实施方案中，这种制造方法不使用色谱法并且不使用基于醇的溶剂来产生高纯度mRNA。

根据各种实施方案，本发明用于纯化各种长度的体外合成的mRNA。在一些实施方案中，本发明用于纯化长度大于约1kb、1.5kb、2kb、2.5kb、3kb、3.5kb、4kb、4.5kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、11kb、12kb、13kb、14kb或15kb的体外合成的mRNA。在一些实施方案中，本发明用于纯化含有一个或多个通常增强稳定性的修饰的mRNA。在一些实施方案中，一个或多个修饰选自经修饰的核苷酸、经修饰的糖磷酸主链、5’和/或3’非翻译区。在一些实施方案中，本发明用于纯化未经修饰的体外合成的mRNA。

通常，修饰mRNA以增强稳定性。mRNA的修饰可包括例如RNA的核苷酸的修饰。因此，根据本发明的经修饰的mRNA可包括例如主链修饰、糖修饰或碱基修饰。在一些实施方案中，编码抗体的mRNA(例如，编码重链和轻链的mRNA)可以由以下天然存在的核苷酸和/或核苷酸类似物(经修饰的核苷酸)合成：包括但不限于嘌呤(腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G))或嘧啶(胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U))，以及嘌呤和嘧啶的经修饰的核苷酸类似物或衍生物，如例如1-甲基腺嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲硫基-N-6-异戊烯基腺嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、N6-异戊烯基腺嘌呤、2-硫胞嘧啶、3-甲基胞嘧啶、4-乙酰基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、2,6-二氨基嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、2,2-二甲基鸟嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、肌苷、1-甲基肌苷、假尿嘧啶(5-尿嘧啶)、二氢尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-(羧羟甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5'-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸(v)、1-甲基假尿嘧啶、辫苷、β-D-甘露糖基辫苷、怀丁氧苷和焦磷酰胺、硫代磷酸酯、肽核苷酸、甲基膦酸酯、7-脱氮鸟苷、5-甲基胞嘧啶和肌苷。此类类似物的制备是本领域的技术人员已知的，例如来自美国专利No.4,373,071、美国专利No.4,401,796、美国专利No.4,415,732、美国专利No.4,458,066、美国专利No.4,500,707、美国专利No.4,668,777、美国专利No.4,973,679、美国专利No.5,047,524、美国专利No.5,132,418、美国专利No.5,153,319、美国专利No.5,262,530和5,700,642，这些专利的全部公开内容以引用的方式包括于本文中。

通常，mRNA合成包括在N端(5')末端添加一个“帽”，以及在C端(3')末端添加一个“尾巴”。帽的存在对于提供对存在于大多数真核细胞中的核酸酶的抗性很重要。“尾巴”的存在用于保护mRNA免受核酸外切酶降解。

因此，在一些实施方案中，使用本文所述的方法纯化的mRNA包括5’帽结构。通常按如下方式添加5’帽：首先，RNA末端磷酸酶从5’核苷酸除去一个末端磷酸基团，剩下两个末端磷酸酯；然后通过鸟苷酰转移酶将三磷酸鸟苷(GTP)添加到末端磷酸酯中，产生5’5’5三磷酸酯键；并且然后用甲基转移酶将鸟嘌呤的7-氮甲基化。帽结构的实例包括但不限于m7G(5')ppp(5'(A,G(5')ppp(5')A和G(5')ppp(5')G。

虽然在一些实施方案中体外转录反应所提供的mRNA可以是所期望的，但是在本发明的范围内设想了mRNA的其他来源，包括从细菌、真菌、植物和/或动物产生的野生型mRNA。

在一些实施方案中，本文所述的方法中用于纯化的mRNA包括5’和/或3’非翻译区。在一些实施方案中，5’非翻译区包括一个或多个影响mRNA的稳定性或翻译的元件，例如铁应答元件。在一些实施方案中，5’非翻译区的长度可以在约50和500个核苷酸之间。

在一些实施方案中，3’非翻译区包括一个或多个聚腺苷酸化信号，影响mRNA在细胞中定位稳定性的蛋白质结合位点，或一个或多个miRNA结合位点。在一些实施方案中，3’非翻译区的长度可以在50和500个核苷酸之间或更长。

本发明可用于纯化编码任何蛋白质的mRNA。使用本文所述的方法纯化的mRNA的非限制性实施例在以下部分中呈现。

实施例

实施例1.mRNA的合成

IVT反应条件

在以下实施例中，除非另有描述，否则使用T7聚合酶或SP6聚合酶经由体外转录(IVT)合成mRNA。简而言之，在SP6聚合酶IVT反应中，对于每克转录的mRNA，用无RNase的水制备反应，所述反应含有20mg线性化的双链DNA质粒和RNA聚合酶特异性启动子、SP6 RNA聚合酶、RNase抑制剂、焦磷酸酶、5mM NTP、10mM DTT和反应缓冲液(10x-250mM Tris-HCl，pH7.5，20mM亚精胺，50mM NaCl)，然后在37℃下温育60min。然后通过添加DNase I和DNase I缓冲液(10x-100mM Tris-HCl，5mM MgCl₂和25mM CaCl2，pH 7.6)以促进用于纯化的制剂中双链DNA模板的消化来淬灭反应。最终反应体积为204mL。

5’帽

除非另有描述，否则IVT转录的mRNA通过包括帽结构作为IVT反应的一部分或在随后的酶促步骤中在其5’末端上进行加帽。为了作为IVT反应的一部分加帽，帽类似物可以作为第一个“碱基”掺入新生RNA链中。帽类似物可以是Cap 0、Cap1、Cap 2、^m6A_m或非天然帽。或者，如Fechter,P.；Brownlee,G.G.“Recognition of mRNA cap structures by viral andcellular proteins”J.Gen.Virology 2005,86,1239-1249所描述，可以例如通过使用鸟苷酸转移酶添加5'N⁷-甲基鸟苷酸Cap 0结构并使用2'O-甲基转移酶在倒数第二个核苷酸的2'O位置处添加甲基产生Cap 1结构而在IVT后酶促修饰未加帽和纯化的体外转录(IVT)mRNA以包括帽。

3’尾

除非另有描述，否则IVT转录的mRNA通过在线性化质粒中包括尾巴模板(其作为IVT反应的一部分使mRNA加尾)或在随后的酶促步骤中在其3’末端上进行加尾。为了作为IVT反应的一部分加尾，进行将聚T或类似的加尾特征掺入pDNA模板中，使得聚A尾部或类似的适当尾作为IVT过程的一部分在mRNA上形成。或者，可以在IVT反应之后，例如使用聚A聚合酶，将聚A尾以酶促方式添加到IVT产生的mRNA的3’末端中。

实施例2.经由无VOC的聚合物诱导的mRNA沉淀纯化mRNA

本实施例说明，在mRNA纯化的mRNA沉淀步骤期间，可以使用聚合物代替挥发性有机化合物(VOC)，诸如乙醇。此类聚合物诱导的沉淀方法提供了适合于治疗用途的最终产率和纯度水平。

如实施例1中所述，经由IVT合成来合成三个5mg批次的CFTR mRNA，每个批次在下述三种不同条件下沉淀。

条件1：乙醇和GSCN(实验对照)

将1体积的mRNA与2.3体积的5M GSCN-10mM DTT缓冲液混合，最终浓度为2M GSCN。然后向悬浮液中添加1.7体积的100％乙醇，乙醇的最终浓度为34％。

条件2：PEG-6000和GSCN(无乙醇的聚合物诱导的沉淀)

将1体积的mRNA与2.3体积的5M GSCN-10mM DTT缓冲液混合，最终浓度为2M GSCN。然后向悬浮液中添加1.7体积的50％PEG-6000，PEG-6000的最终浓度为17％。

条件3：PEG-6000和NaCl(无乙醇的聚合物诱导的沉淀)

沉淀步骤在Schmitz等人，Notes&Tips,AnalBiochem.(2006)311-313中描述的条件下进行。将1体积的mRNA与NaCl混合至NaCl的最终浓度为500mM。然后向悬浮液中添加50％PEG-6000，PEG-6000的最终浓度为19％。

在每个条件下沉淀的mRNA样品在Qiagen RNeasy maxi柱上捕获，用10ml的80％乙醇洗涤两次，并溶解在5ml无RNase的水中。使用260nm处的吸光度，通过NanoDrop2000分光光度计对溶解的mRNA样品的浓度进行定量。每种沉淀条件的产率在图1中示出。另外，经由下文所述的银染检测到残留过程酶的存在，并且结果在图2中示出。

数据表明，三种沉淀条件在纯化后产生相似的mRNA产率。如图2所示，沉淀条件1和2产生高纯度mRNA样品，没有通过银染可观察到的过程酶。然而，经由PEG-6000和NaCl(条件3)的聚合物诱导的沉淀导致样品显示出与过程酶的存在一致的条带化，这将需要另外的纯化步骤才能被接受用于治疗用途。此处的数据支持通过条件2的mRNA沉淀可用于纯化mRNA以实现用于治疗用途的足够产率和纯度水平。

mRNA纯度-残留过程酶检测(银染)

通过银染评估相对于残留IVT酶和任选的帽和/或尾酶的mRNA纯度。特别地，可以使用该方法检测以下残留过程酶中的每一个：RNA聚合酶、RNA抑制剂、焦磷酸酶、鸟苷酰转移酶(GuaT)、2’OM和聚A聚合酶，以及用作银染凝胶制剂的一部分的酶RNase I。特别地，根据Invitrogen试剂盒使用以下预染色样品制剂来运行银染凝胶。在37℃下用4μlRNaseI(100U/mL，Invitrogen)处理15.5μl 1mg/ml RNA持续30分钟。在含有还原剂的InvitrogenLDS上样缓冲液中制备样品，并最终上样到10％Bis-Tris凝胶上。在200V下进行电泳35分钟。使用Silver Quest染色试剂盒对凝胶染色并显影8分钟。如果特定过程酶的条带不可见，则认为包含纯化的mRNA的样品基本上不含特定过程酶。

实施例3.测试聚合物诱导的mRNA沉淀中的聚合物比率范围

本实施例说明，根据各种实施方案，不同比率的聚合物可用于聚合物诱导的mRNA沉淀以纯化适合于治疗用途的mRNA。

如上所述，经由IVT合成来合成七个5mg批次的CFTR mRNA，每个批次在下表1中示出的不同条件下沉淀。

表1.用于mRNA纯化的沉淀条件

在每个条件下沉淀的mRNA样品在Qiagen RNeasy maxi柱上捕获，用10ml的80％乙醇洗涤两次，并溶解在5ml无RNase的水中。使用260nm处的吸光度，通过NanoDrop2000分光光度计对溶解的mRNA样品的浓度进行定量。每种沉淀条件的产率在图3中示出。另外，经由实施例2中所述的银染检测到残留过程酶的存在，并且结果在图4中示出。

数据表明，使用聚合物诱导的mRNA沉淀的纯化的mRNA的所有六个条件在纯化后产生高mRNA产率，这类似于传统的乙醇沉淀方法(图3)。另外，最终PEG浓度小于20％PEG浓度(或50％PEG-6000的比率小于2.0)的经由聚合物诱导的沉淀纯化的mRNA样品产生高纯度mRNA样品，而没有通过图4(泳道5-泳道8)中所示的银染可观察到的过程酶。然而，最终PEG-6000浓度大于20％的含有经由聚合物诱导的沉淀纯化的mRNA的样品显示出残留过程酶(泳道9)。有趣的是，与含有22％PEG-6000聚合物诱导的沉淀的样品相比，含有24％PEG-6000的聚合物诱导的沉淀在纯化的样品中产生更多的残留过程酶。不希望受任何特定理论的束缚，预期更高的PEG-6000％促进核酸和过程酶两者的沉淀。

总之，此处的数据还支持经由聚合物诱导的沉淀的mRNA纯化是用于纯化mRNA以实现用于治疗用途的足够产率和纯度水平的可行方法。PEG-6000的最终浓度在7-24％之间的聚合物诱导的沉淀导致有效的mRNA沉淀和回收。对于其余实施例，在聚合物诱导的沉淀中使用最终PEG-6000浓度12％。

实施例4.mRNA的无乙醇纯化和洗涤步骤中不同聚合物的作用。

本实施例说明可以在没有任何VOC诸如乙醇的情况下在mRNA沉淀和洗涤步骤两者期间使用聚合物，以用适合于治疗用途的产率和纯度水平来纯化mRNA。

经由IVT合成来合成十二个5mg批次的CFTR mRNA，并且如实施例1中所述添加5'帽和3'聚A尾。经由聚合物诱导的沉淀使所得的十二个5mg IVT mRNA批次各自沉淀。对于每个5mg批次，添加5M GSCN-10mM DTT缓冲液至GSCN的最终浓度为2.7M。然后向悬浮液中添加50％PEG-6000至PEG-6000的最终浓度为12％。在Qiagen RNeasy maxi柱上捕获沉淀的mRNA样品，并用10ml下表2中列出的以下聚合物洗涤缓冲液中的一种，而不是80％乙醇洗涤两次。在IVT合成的mRNA的纯化中完全不使用VOC或醇。特别地，在沉淀步骤或洗涤步骤中不使用VOC或醇。

表2.聚合物洗涤缓冲液

样品	聚合物	洗涤中聚合物的最终％
			1	三乙二醇(TEG)	70
2	三乙二醇(TEG)	80
			3	三乙二醇(TEG)	90
4	三乙二醇(TEG)	100
			5	100％PEG-400	70
6	100％PEG-400	80
			7	100％PEG-400	90
8	100％PEG-400	100
			9	50％PEG-6000	35
10	50％PEG-6000	40
			11	50％PEG-6000	45
12	50％PEG-6000	50

将十二个样品溶解于5ml无RNase的水中，并且使用260nm处的吸光度，通过NanoDrop2000分光光度计对浓度进行定量。每种沉淀条件的产率在图5中示出。另外，经由实施例2中所述的银染检测到残留过程酶的存在，并且结果在图6中示出。

如图5中所示，发现洗涤缓冲液中聚合物的百分比与观察到的回收的mRNA的量之间存在强相关性。不希望受任何特定理论的束缚，预期向这些洗涤缓冲液中添加水导致在这些洗涤步骤期间mRNA的溶解。

总的来说，数据表明，令人惊讶的是，mRNA可以经由聚合物诱导的沉淀，随后通过聚合物洗涤而完全不含乙醇地纯化，以获得适合于治疗用途的令人惊讶的产率和纯度水平。含有最终浓度在90-100％之间的PEG-400的洗涤缓冲液产生如图5所示的高产率和高纯度mRNA样品，而没有通过图6(泳道3-泳道4)中所示的银染可观察到的过程酶。PEG-400具有所测试的缓冲液的最低粘度，使得其可修改以在不同规模下在不同系统中使用。这些数据一起证明，经由本文所述的聚合物诱导的沉淀和聚合物洗涤的无乙醇mRNA纯化可用于有效地纯化高质量mRNA，所得的产率回收率、完整性概况、纯度和功能性等效于或优于采用VOC(诸如醇，包括乙醇)的行业标准mRNA纯化方法。此外，本发明具有可扩展性和安全性的显著附加益处，这对于采用VOC(诸如醇，包括乙醇)的现有行业标准方法是不可用的。

实施例5.OTC和CFTR mRNA的无乙醇纯化和分析

本实施例说明，上文所述的无乙醇mRNA纯化方法可用于纯化mRNA，无论其构建体大小或核苷酸组成如何。另外，根据本文所述的方法的纯化的mRNA导致高产率、纯度和完整性。

如实施例1中所述，经由IVT合成来合成5mg批次的OTC mRNA(～1400nt)和5mg的CFTR mRNA(～4600nt)。经由聚合物诱导的沉淀使所得的IVT mRNA样品沉淀。对于每个5mg批次，添加5M GSCN-10mM DTT缓冲液至GSCN的最终浓度为2.7M。然后向悬浮液中添加50％PEG-6000至PEG-6000的最终浓度为12％。在Qiagen RNeasy maxi柱上捕获沉淀的mRNA样品，并用10ml的90％PEG-400洗涤缓冲液洗涤两次。将洗涤的样品溶解于5ml无RNase的水中，使用100kD Amicon旋转柱将缓冲液交换到超纯水中，并浓缩至2mg/ml。

然后经由如实施例1中所述的酶促步骤将纯化和浓缩的IVT mRNA加帽和加尾。经由不含乙醇的聚合物诱导的沉淀和聚合物洗涤来纯化具有5'帽和3'尾的mRNA。特别地，对于每个批次的沉淀步骤，添加5MGSCN-10mM DTT缓冲液至GSCN的最终浓度为2.7M。然后向悬浮液中添加50％PEG-6000至PEG-6000的最终浓度为12％。在Qiagen RNeasy maxi柱上捕获沉淀的mRNA样品，并用10ml的90％PEG-400洗涤缓冲液洗涤两次。将洗涤的样品溶解于5ml无RNase的水中，使用100kD Amicon旋转柱将缓冲液交换到超纯水中，并浓缩至1mg/ml。

如图7所示，测定每种最终mRNA产物的产率。数据证实，5mg规模的OTC和CFTR mRNA的mRNA产率分别为80％和78％。这些值在行业标准mRNA纯化方法的产率之内或之上。

如下所述分析最终mRNA产物的纯度和完整性。如图8所示，使用毛细管电泳评估完整性和聚A尾长度。结果表明，来自5mg规模纯化的OTC和CFTR mRNA两者的最终产物具有与对照(当前乙醇10克OTC)的峰相似的明确定义峰。另外，两种构建体的尾巴长度在500nt的目标范围内(OTC＝468nt和CFTR＝649nt)。在5mg规模纯化的任一mRNA构建体中未检测到如经由银染评估的残留过程酶的存在。如下文所述，经由dsRNA J2斑点印迹进一步确认纯度。如图10中所示，结果证实在任一构建体的最终产物中未检测到dsRNA。最后，使用ELISA证实PEG在透析步骤期间被完全去除，如表3所示。

表3.使用ELISA定量最终mRNA样品中的PEG

BQL＝低于可检测限值

总之，数据表明，本文所述的经由聚合物诱导的沉淀和聚合物洗涤对mRNA的无乙醇纯化可以应用于对不同长度和构建体的mRNA的纯化。通过本文所述的方法纯化的mRNA符合或超过关于上述临界释放特征的历史大规模mRNA批次。因此，本文所述的方法的高产率、完整性和纯度水平适合于治疗用途。

纯化的mRNA完整性分析

RNA完整性分析(片段分析仪–毛细管电泳)

使用CE片段分析仪和可商购的RNA检测试剂盒评估RNA完整性和尾巴长度。对原始数据和归一化数据集进行完整性峰曲线和尾巴长度尺寸变化的分析。

mRNA帽种类分析(HPLC/MS)

使用美国专利No.9,970,047中描述的色谱方法定量最终纯化的mRNA产物中存在的帽种类。该方法能够以总mRNA的百分比来准确地定量未加帽的mRNA。该方法还可以定量特定帽结构的量，诸如CapG、Cap0和Cap1量，其可以报告为总mRNA的百分比。

dsRNA检测(J2斑点印迹)

使用先前由Kariko等人，Nucleic Acids Research，2011.39，No.21描述的J2抗dsRNA斑点印迹测量个别mRNA样品中dsRNA的存在。简言之，将200ng RNA或25ng dsRNA对照印迹到带超电荷的Nytran上。将印迹干燥，用5％脱脂奶粉封闭，然后每个印迹用1μg的J2抗体探测。洗涤印迹，用HRP缀合的驴抗小鼠探测，然后再次洗涤。用ECL加蛋白质印迹检测试剂检测印迹并在膜上捕获图像。如果与缺乏任何dsDNA的对照相比，相应的印迹未显示明显较深的颜色，则认为包含纯化的mRNA的样品基本上不含dsRNA。

PEG定量/检测ELISA(Abcam试剂盒)

使用来自Abcam的PEG-ELISA试剂盒确定mRNA样品中各种分子量PEG种类的存在。简而言之，使用竞争性抑制ELISA，其检测样品中低至10ng/mL的PEG，并且可以在该水平下精确地定量大分子量PEG。使用标准的基于乙醇的沉淀方法以及下文提及的无乙醇方法以纯的、1/10和1/100稀释度纯化mRNA样品。在纯浓度、1/10稀释度和1/100稀释度下，检测限分别为10ng/mg的RNA、100ng/mg的RNA和1ug/mg的RNA。

实施例6.1克和10克规模的mRNA的无乙醇纯化

本实施例说明，上文所述的无乙醇mRNA纯化方法可用于以治疗用途所需的必要规模和质量纯化mRNA。根据本文所述的方法以1克和10克规模纯化的mRNA产生高产率、纯度和完整性，证明了方法的可扩展性。

OTC mRNA以1克和10克规模合成，并且CFTR mRNA经由如实施例1中所述的IVT合成以10克规模来合成。经由聚合物诱导的沉淀使所得的IVT mRNA样品沉淀。对于每个mRNA样品，添加5M GSCN-10mM DTT缓冲液至GSCN的最终浓度为2.7M。然后向悬浮液中添加50％PEG-6000至PEG-6000的最终浓度为12％。将基于Solka-Floc纤维素的助滤剂以助滤剂与RNA的比率(wt/wt)10比1的比率添加到沉淀的mRNA中并充分混合。用助滤剂在0.22μm聚醚砜(PES)真空过滤烧瓶上捕获1克规模的沉淀的mRNA样品。用助滤剂在具有1μm聚丙烯过滤袋的H300P过滤离心机上捕获10克规模的沉淀的mRNA样品。然后将1克和10克mRNA样品用1L或10L的90％PEG-400洗涤缓冲液洗涤两次。将洗涤和沉淀的mRNA手动地或通过具有1μm聚丙烯过滤袋的H300P过滤离心机过滤而从过滤器中去除。然后将洗涤和沉淀的mRNA溶解于1L或10L无RNase的水中，使用100kD光谱TFF柱(mPES)将缓冲液交换到超纯水中，并浓缩至2mg/ml。

然后通过如实施例1中所述的酶促反应将纯化和浓缩的IVT mRNA加帽和加尾。经由不含乙醇的聚合物诱导的沉淀和聚合物洗涤来纯化具有5'帽和3'尾的mRNA。对于每一个，添加5M GSCN-10mM DTT缓冲液至GSCN的最终浓度为2.7M。然后向悬浮液中添加50％PEG-6000至PEG-6000的最终浓度为12％。将基于Solka-Floc纤维素的助滤剂以助滤剂与RNA的比率(wt/wt)10比1的比率添加到沉淀的mRNA中，并充分混合。将沉淀的mRNA用1L或10L的90％PEG-400洗涤缓冲液洗涤两次。将洗涤的mRNA样品手动地或通过具有1μm聚丙烯过滤袋的H300P过滤离心机过滤而从过滤器中去除。将mRNA样品溶解于1L或10L无RNase的水中，使用100kD光谱TFF柱(mPES)将缓冲液交换到超纯水中并浓缩至1mg/ml。

如图7所示，测定每种最终mRNA产物的产率。数据证实，1克和10克规模的OTC mRNA和10克规模的CFTR mRNA的mRNA产率都高于80％，并且高达93％。这些值在行业标准mRNA纯化方法的产率之内或之上。

如上所述分析最终mRNA产物的纯度和完整性。如图8所示，使用毛细管电泳评估完整性和聚A尾长度。结果表明，来自1克和10克规模纯化的OTC和CFTR mRNA的最终产物具有与对照(当前乙醇10克OTC)的峰相似的明确定义峰。对于10克规模纯化的mRNA，使用如实施例2中所述的HPLC-MS测定来定量帽种类。另外，两种构建体的尾巴长度在目标范围内(1克的OTC＝306nt；10克的OCT＝158nt；10克的CFTR＝712nt)。在1克和10克规模纯化的两种mRNA构建体中未检测到如经由银染评估的残留过程酶的存在，如图9所示。如实施例5中所述，经由dsRNA J2斑点印迹进一步确认纯度。如图10中所示，结果证实在1克和10克规模的最终产物中均未检测到dsRNA。最后，使用ELISA证实PEG在透析步骤期间被完全去除。

总之，数据证明了经由聚合物诱导的沉淀和聚合物洗涤mRNA的无乙醇纯化的可扩展性，从而以临床治疗用途所需的必要规模和质量纯化mRNA。通过本文所述的方法以1克和10克规模纯化的mRNA符合或超过关于上述临界释放特征的历史大规模mRNA批次，证明了该方法用于mRNA制造和治疗的适用性。

本发明可用于纯化编码任何蛋白质的mRNA。描述了使用该方法纯化的mRNA的非限制性实施例。

实施例7.mRNA的无乙醇纯化和洗涤步骤中MTEG的作用

本实施例说明可以在没有任何VOC诸如乙醇的情况下在洗涤步骤期间使用两亲性聚合物MTEG，以用适合于治疗用途的产率和纯度水平来纯化mRNA。

表4示出了MTEG相对于前述实施例中测试的聚合物的特性。尽管具有类似于TEG的分子量，但MTEG由于甲基的存在而具有低得多的粘度。这意味着，MTEG具有更接近水的粘度，意味着更容易泵送。此外，美国食品和药物管理局(FDA)将其分类为“安全”，而TEG、PEG-400和PEG-6000(50％)被分类为“通常认为安全”(GRAS)。

表4.聚合物特性

经由IVT合成来合成五个5mg批次的CFTR mRNA，并且如实施例1中所述添加5'帽和3'聚A尾。经由聚合物诱导的沉淀使所得的五个5mg IVT mRNA批次各自沉淀。沉淀反应中mRNA、GSCN(5M GSCN-10mM DTT缓冲液)和MTEG(100％重量/体积)的体积比为1:2.3:1。在Qiagen RNeasy maxi柱上捕获沉淀的mRNA样品，并用2.5ml下表5中列出的以下MTEG洗涤缓冲液中的一种，而不是80％乙醇洗涤两次。在IVT合成的mRNA的纯化中不使用VOC或醇。特别地，在沉淀步骤或洗涤步骤中不使用VOC或醇。

表5.聚合物洗涤缓冲液

样品	聚合物	洗涤中聚合物的最终％
			1	MTEG	75
2	MTEG	80
			3	MTEG	85
4	MTEG	90
			5	MTEG	95

将五个样品溶解于5ml无RNase的水中，并且使用260nm处的吸光度，通过NanoDrop2000分光光度计对浓度进行定量。回收的RNA的浓度显示于图11中。

如图11中所示，发现洗涤缓冲液中MTEG的百分比与回收的mRNA的量之间存在强相关性。如上所述，不希望受任何特定理论的束缚，预期向这些洗涤缓冲液中添加水导致在这些洗涤步骤期间mRNA的溶解。如图11中所示，最终浓度在90-95％之间的MTEG的洗涤缓冲液产生接近于仅理论上可达到的100％回收率水平的极高产率。纯度和回收率与采用80％乙醇的洗涤条件相当。选择95％的MTEG浓度用作其余实施例中的洗涤缓冲液。

这些数据进一步证明，可以使用完全不含乙醇的方法纯化mRNA。

实施例8.mRNA的无乙醇纯化和洗涤步骤中MTEG的作用。

本实施例说明可以在没有任何VOC诸如乙醇的情况下在mRNA沉淀和洗涤步骤两者期间使用两亲性聚合物MTEG，以用适合于治疗用途的产率和纯度水平来纯化mRNA。

经由IVT合成来合成五个5mg批次的CFTR mRNA，并且如实施例1中所述添加5'帽和3'聚A尾。经由聚合物诱导的沉淀使所得的五个5mg IVT mRNA批次中的四个各自沉淀。对于每个5mg批次，以下表6中提供的体积组合mRNA、5M GSCN-10mM DTT缓冲液和MTEG，以形成沉淀的mRNA的悬浮液。在Qiagen RNeasy maxi柱上捕获沉淀的mRNA样品，并用2.5ml的95％MTEG洗涤两次。在IVT合成的mRNA的纯化中完全不使用VOC或醇。特别地，在沉淀步骤或洗涤步骤中不使用VOC或醇。作为实验对照，如实施例2中所述用乙醇沉淀一批mRNA，其中mRNA、GSCN和乙醇(100％重量/体积)的体积比为1:2.3:1.7，并使用2ml的80％乙醇洗涤两次。

表6聚合物洗涤缓冲液

将五个样品溶解于5ml无RNase的水中，并且使用260nm处的吸光度，通过NanoDrop2000分光光度计对浓度进行定量。如使用银染观察到的由沉淀和洗涤步骤产生的mRNA样品的纯度在图12(泳道6-泳道10)中示出。使用MTEG的沉淀和洗涤实现了mRNA的高效mRNA回收和纯化。将1-2体积的MTEG添加到1体积mRNA和2.3体积GSCN中显示出相当的纯度和产率水平。将2.5体积的MTEG添加到1体积mRNA和2.3体积GSCN中导致凝胶上的微弱附加条带，如图12所示。这可以表明较高MTEG浓度导致蛋白质从IVT反应中沉淀。

总之，这些数据支持在沉淀期间和在洗涤缓冲液中使用MTEG的mRNA纯化是用于纯化mRNA以实现用于治疗用途的足够产率和纯度水平的可行方法。

这些数据一起证明，MTEG mRNA纯化可用于有效地纯化高质量mRNA，所得的产率回收率、完整性概况和纯度等效于或优于采用VOC(诸如醇，包括乙醇)的行业标准mRNA纯化方法。MTEG可以在沉淀期间替代乙醇和高分子量聚合物，诸如PEG-6000。此外，MTEG还可以在洗涤步骤中替代乙醇或低分子量聚合物，诸如PEG-400，使其成为用于无乙醇纯化的最通用聚合物。此外，如上所述，基于MTEG的纯化，如本文所述的其他基于聚合物的无乙醇方法具有可扩展性和安全性的显著附加益处，这对于采用VOC(诸如醇，包括乙醇)的现有行业标准方法是不可用的。

实施例9.适用于使用深层过滤和离心的纯化的MTEG聚合物诱导的沉淀和MTEG洗涤缓冲液。

本实施例证实，由于其较低的粘度和相关的优异的处理特性，MTEG令人惊讶地是通用的，并且可以各种规模用于各种无乙醇mRNA纯化方法中，从而产生超过90％的回收率。

按照上述实施例制备样品，并使用深层过滤(DF)或离心纯化。

深层过滤纯化

对于较小的批次，经由IVT合成来合成7.5g的OTC mRNA，并且如实施例1和结垢反应条件中所述添加5'帽和3'聚A尾。使用实施例7中所示的相同MTEG聚合物诱导的沉淀来沉淀mRNA。因此，沉淀反应中mRNA、GSCN(5M GSCN-10mM DTT缓冲液)和MTEG(100％重量/体积)的体积比为1:2.3:1。将悬浮液在具有底部安装叶轮的60L Lee容器中以60Hz混合，然后以60L/min/m²的流速加载到负载容量为68g/m²的0.11m²深层过滤器上。使用90％MTEG以60L/min/m²的流速洗涤沉淀的保留的mRNA。

对于较大的批次，经由IVT合成来合成15g的CFTR mRNA，并且如实施例1和结垢反应条件中所述添加5'帽和3'聚A尾。使用实施例7中所示的相同MTEG聚合物诱导的沉淀来沉淀mRNA。因此，沉淀反应中mRNA、GSCN(5M GSCN-10mM DTT缓冲液)和MTEG(100％重量/体积)的体积比为1:2.3:1。将悬浮液在具有底部安装叶轮的60L Lee容器中以60Hz混合，然后以60L/min/m²的流速加载到负载容量为68g/m²的0.11m²深层过滤器上。使用95％MTEG以60L/min/m²的流速洗涤沉淀的保留的mRNA。在洗涤期间压力增加时，流速降低到30L/min/m²。在相同的0.11m²深层过滤器上重复过滤过程。

离心纯化

经由IVT合成来合成15g的CFTR mRNA，并且如实施例1和结垢反应条件中所述添加5'帽和3'聚A尾。使用实施例7中所示的相同MTEG聚合物诱导的沉淀来沉淀mRNA。因此，沉淀反应中mRNA、GSCN(5MGSCN-10mM DTT缓冲液)和MTEG(100％重量/体积)的体积比为1:2.3:1。将悬浮液在具有底部安装叶轮的60L Lee容器中以60Hz混合，并且以1:10的mRNA:助滤剂质量比添加纤维素助滤剂。将悬浮液加载到过滤离心机中并用95％MTEG洗涤。

对于两种纯化策略，使用280nm处的吸光度，通过NanoDrop2000分光光度计对最终mRNA产率进行定量。RNA的回收率％显示于下表7中。此外，使用CE涂片分析评估mRNA的完整性，并且使用银染分析评估mRNA纯度以检测残留过程酶。

结果

在7.5g或更大的批量大小下，使用MTEG作为沉淀聚合物和洗涤缓冲液组分确保了非常高的mRNA的回收率％。如表7中所示，使用相同的沉淀方案，MTEG可以既用于基于离心的纯化方法，也用于基于过滤器膜或基于过滤器滤芯的纯化方法，诸如深层过滤(DF)，作为沉淀和洗涤缓冲液两者。使用离心产生接近100％的mRNA回收率(参见下表7)。

表7在不同纯化方法中使用MTEG的有效mRNA回收

纯化平台	规模(g)	助滤剂(g)	回收率％
				DF	7.5	n/a	～93％
DF	15	n/a	～82％
				H300P	15	150	～100％

此外，在沉淀和洗涤步骤中使用MTEG保持了mRNA完整性和纯度。最终OTC完整性(CE)为约92％，如图13所示。此外，在银染剂上未检测到残留过程酶(参见图14)。对于深层过滤后的15g CFTR样品，完整性为约73％(参见图15)，并且在银染剂上不存在过程酶的情况下纯度非常高(图16)。最后，对于离心后的15g CFTR样品，不仅产率为100％，而且完整性为约82％(图17)，并且银染未显示残留过程酶(图18)。因此，MTEG是用于在不使用乙醇的情况下使用聚合物诱导的沉淀纯化mRNA的非常合适的聚合物。

等效物和范围

本领域的技术人员将认识到或能够使用不超过常规实验来确定本文所描述的本发明的具体实施方案的许多等效物。本发明的范围并非旨在限于以上说明书，而是如权利要求书中所述。

Claims (93)

1.一种纯化信使RNA(mRNA)的方法，所述方法包括：

a)在包含高摩尔盐溶液和两亲性聚合物的悬浮液中沉淀所述mRNA以提供沉淀的mRNA；

b)捕获所述沉淀的mRNA；

c)用洗涤溶液洗涤步骤b)中捕获的所述沉淀的mRNA以纯化所述沉淀的mRNA；以及

d)溶解来自步骤c)的所述沉淀的mRNA以获得纯化的mRNA组合物。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述纯化的mRNA组合物基本上不含包括短的异常终止RNA种类、长的异常终止RNA种类、双链RNA(dsRNA)、残留质粒DNA、残留体外转录酶、残留溶剂和/或残留盐的污染物。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述残留质粒DNA为10pg/mg或更少。

4.如权利要求1所述的方法，其中所述两亲性聚合物选自普朗尼克、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙二醇(PEG)或其组合。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述两亲性聚合物是PEG。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述悬浮液包含约10％至约100％重量/体积浓度的PEG。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述悬浮液包含约50％重量/体积浓度的PEG。

8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述高摩尔盐溶液包含硫氰酸胍(GSCN)。

9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中包含两亲性聚合物的洗涤溶液用于在步骤c)中洗涤所述mRNA。

10.如权利要求9所述的方法，其中所述两亲性聚合物包含PEG。

11.如权利要求10所述的方法，其中PEG以约10％至约100％重量/体积浓度存在于所述洗涤溶液中。

12.如权利要求10所述的方法，其中PEG以约50％至约90％重量/体积浓度存在于所述洗涤溶液中。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述PEG以约90％重量/体积浓度存在于所述洗涤溶液中。

14.如权利要求5至13中任一项所述的方法，其中PEG的分子量为约200至约40,000g/mol。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述PEG是直链构型、支链构型、Y形构型或多臂构型。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述PEG是直链的。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述PEG溶液包含选自以下的PEG：三乙二醇、四乙二醇、PEG 200、PEG 300、PEG 400、PEG 600、PEG 1,000、PEG 1,500、PEG 2,000、PEG 3,000、PEG 3,350、PEG 4,000、PEG 6,000、PEG 8,000、PEG 10,000、PEG 20,000、PEG 35,000和PEG40,000。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述PEG溶液包含PEG 6,000。

19.如权利要求5至17中任一项所述的方法，其中所述PEG溶液不包含PEG 6,000。

20.如权利要求17所述的方法，其中所述PEG是PEG 400。

21.如权利要求5至20中任一项所述的方法，其中所述PEG溶液包含一种或多种PEG聚合物的混合物。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述PEG聚合物的混合物包含具有不同分子量的聚合物。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述PEG聚合物的混合物包含具有不同几何构型的聚合物。

24.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述洗涤溶液是水性的。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述洗涤溶液不含醇。

26.如权利要求25所述的方法，其中所述洗涤溶液不含乙醇、异丙醇或苄醇。

27.如权利要求5至23中任一项所述的方法，其中所述PEG溶液包含非水性组分。

28.如权利要求27所述的方法，其中所述非水性组分是乙醇、异丙醇或苄醇。

29.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中捕获所述沉淀的mRNA在过滤器上进行。

30.如权利要求29所述的方法，其中所述过滤器选自微滤过滤器或超滤过滤器。

31.如权利要求30所述的方法，其中所述微滤过滤器具有0.05μm与1.0μm之间的孔径。

32.如权利要求31所述的方法，其中所述微滤过滤器具有大于1,000千道尔顿(kDa)的标称分子量限值(NMWL)。

33.如权利要求30所述的方法，其中所述超滤过滤器具有小于0.05μm的孔径。

34.如权利要求33所述的方法，其中所述超滤过滤器具有约1kDa与1,000kDA之间的NMWL。

35.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中切向流过滤(TFF)或渗滤用于在步骤c)中纯化所述沉淀的mRNA。

36.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中使用助滤剂。

37.如权利要求36所述的方法，其中所述助滤剂是基于纤维素的。

38.如权利要求37所述的方法，其中所述助滤剂包含硅藻土和/或火山灰。

39.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法不包括色谱法步骤。

40.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中将所述沉淀的mRNA离心以获得mRNA沉淀。

41.如权利要求40所述的方法，其中将所述mRNA沉淀重新悬浮于缓冲溶液中。

42.如权利要求41所述的方法，其中所述缓冲溶液选自水、Tris-EDTA(TE)、柠檬酸钠或其组合。

43.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述纯化的mRNA的产率为约50％至约100％。

44.如权利要求43所述的方法，其中所述纯化的mRNA的产率为约70％至约99％。

45.如权利要求44所述的方法，其中所述纯化的mRNA的产率在约90％与约99％之间。

46.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述纯化的mRNA的纯度在约60％与约100％之间。

47.如权利要求46所述的方法，其中所述纯化的mRNA的纯度在约80％与99％之间。

48.如权利要求47所述的方法，其中所述纯化的mRNA的纯度在约90％与约99％之间。

49.一种纯化信使RNA(mRNA)的方法，所述方法包括：

a)在包含高摩尔盐溶液和两亲性聚合物的悬浮液中沉淀所述mRNA；

b)在过滤器上捕获所述mRNA；以及

c)用PEG溶液洗涤步骤b)的所述mRNA以获得基本上不含污染物的纯化的mRNA组合物。

50.如权利要求49所述的方法，其中所述纯化的mRNA的产率为约50％至约100％。

51.如权利要求50所述的方法，其中所述纯化的mRNA的产率为约70％至约99％。

52.如权利要求51所述的方法，其中所述纯化的mRNA的产率约在约90％与约99％之间。

53.如权利要求49至52中任一项所述的方法，其中所述纯化的mRNA的纯度在约60％与约100％之间。

54.如权利要求53所述的方法，其中所述纯化的mRNA的纯度在约80％与99％之间。

55.如权利要求54所述的方法，其中所述纯化的mRNA的纯度在约90％与约99％之间。

56.如权利要求49至55中任一项所述的方法，其中所述沉淀的mRNA包含至少100mg、1g、10g、100g、1kg、10kg、100kg、一公吨或十公吨的mRNA，或其间的任何量。

57.如权利要求55所述的方法，其中所述沉淀的mRNA包含大于1kg的mRNA。

58.如权利要求49至57中任一项所述的方法，其中所述两亲性聚合物选自普朗尼克、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚乙二醇(PEG)或其组合。

59.如权利要求58所述的方法，其中所述两亲性聚合物是PEG。

60.如权利要求49至59中任一项所述的方法，其中所述高摩尔盐溶液包含硫氰酸胍(GSCN)。

61.如权利要求49至60中任一项所述的方法，其中所述方法不含乙醇。

62.如权利要求49至61中任一项所述的方法，其中所述纯化的mRNA组合物基本上不含包括短的异常终止RNA种类、长的异常终止RNA种类、双链RNA(dsRNA)、残留质粒DNA、残留体外转录酶、残留溶剂和/或残留盐的污染物。

63.一种纯化信使RNA(mRNA)的方法，所述方法包括：

a)在包含PEG的硫氰酸胍(GSCN)溶液中沉淀所述mRNA；

b)将步骤a)的所述溶液离心以产生mRNA沉淀；

c)将所述mRNA沉淀重新悬浮于缓冲液中；

d)在过滤器上捕获所述mRNA；

e)用PEG溶液洗涤步骤d)的所述mRNA；以及

f)溶解步骤e)的所述经过洗涤的mRNA以获得基本上不含污染物的mRNA组合物。

64.如权利要求63所述的方法，其中所述纯化的mRNA组合物基本上不含包括短的异常终止RNA种类、长的异常终止RNA种类、双链RNA(dsRNA)、残留质粒DNA、残留体外转录酶、残留溶剂和/或残留盐的污染物。

65.一种制造mRNA的方法，所述方法包括以下步骤：

a)通过混合(i)包含启动子的DNA模板和(ii)RNA聚合酶来进行体外转录(IVT)以产生包含全长mRNA的不纯制剂

b)向所述悬浮液提供高摩尔盐和两亲性聚合物以沉淀全长mRNA并在所述悬浮液中提供沉淀的全长mRNA；

c)通过将所述悬浮液施加到过滤器来捕获所述沉淀的全长mRNA；

d)用水性溶剂洗涤步骤(c)的所述沉淀的全长mRNA以在水溶液中获得纯化的全长mRNA；以及

e)使来自步骤(d)的所述沉淀的mRNA溶解以获得纯化的mRNA组合物，其中由步骤(d)提供的所述水溶液中的所述纯化的全长mRNA基本上不含(i)所述包含启动子的DNA模板和(ii)所述RNA聚合酶。

66.如权利要求65所述的方法，其中在步骤(a)中，所述RNA聚合酶是SP6聚合酶。

67.如权利要求65或66所述的方法，其中由步骤(e)提供的所述水溶液中的所述纯化的全长mRNA也基本上不含(v)双链RNA(dsRNA)。

68.如权利要求1、49和65中任一项所述的方法，其中所述两亲性聚合物包含MTEG。

69.如权利要求68所述的方法，其中所述悬浮液包含沉淀的mRNA、所述高摩尔盐溶液和MTEG，其中所述MTEG的最终浓度为约15％至约45％重量/体积。

70.如权利要求69所述的方法，其中所述悬浮液包含沉淀的mRNA、所述高摩尔盐溶液和MTEG，其中所述MTEG的最终浓度为约20％至约40％重量/体积。

71.如权利要求70所述的方法，其中所述悬浮液包含沉淀的mRNA、所述高摩尔盐溶液和MTEG，其中所述MTEG的最终浓度为约20％、约25％、约30％或约35％重量/体积。

72.如权利要求1、49和65中任一项所述的方法，其中所述悬浮液包含沉淀的mRNA、高摩尔盐溶液和PEG或MTEG。

73.如权利要求5、59或65所述的方法，其中所述高摩尔盐的最终浓度在约2-4M之间，并且PEG的最终浓度在约5％与约20％重量/体积之间。

74.如权利要求73所述的方法，其中所述高摩尔盐的最终浓度为约2.5-3M，并且所述PEG的最终浓度在约10％与约15％重量/体积之间。

75.如权利要求74所述的方法，其中所述高摩尔盐的最终浓度为约2.7M，并且所述PEG的最终浓度为约12％重量/体积。

76.如权利要求69至75中任一项所述的方法，其中所述高摩尔盐溶液包含GCSN。

77.如权利要求72至76中任一项所述的方法，其中所述PEG具有约6000g/mol的分子量(例如PEG-6000)。

78.如权利要求69至77中任一项所述的方法，其中所述悬浮液还包含与所述沉淀的mRNA的质量比为2:1；5:1；10:1或15:1的助滤剂。

79.如权利要求78所述的方法，其中所述助滤剂与所述沉淀的mRNA的质量比为10:1。

80.如权利要求78或79所述的方法，其中所述助滤剂是基于纤维素的。

81.如权利要求9所述的方法，其中所述两亲性聚合物包含MTEG。

82.如权利要求81所述的方法，其中MTEG以约75％、约80％、约85％、约90％或约95％重量/体积浓度存在于所述洗涤溶液中。

83.如权利要求82所述的方法，其中所述MTEG以约90％至100％的重量/体积浓度存在于所述洗涤溶液中。

84.如权利要求83所述的方法，其中所述MTEG以约95％重量/体积浓度存在于所述洗涤溶液中。

85.如权利要求63步骤a)所述的方法，其中所述GSCN的最终浓度在约2-4M之间，并且PEG的最终浓度在约5％与约20％重量/体积之间。

86.如权利要求85所述的方法，其中所述GSCN的最终浓度为约2.7M，并且所述PEG的最终浓度为约12％重量/体积。

87.如权利要求85或86所述的方法，其中所述PEG具有约6000g/mol的分子量(例如PEG-6000)。

88.如权利要求85至87中任一项所述的方法，其中所述溶液还包含与所述沉淀的mRNA的质量比为2:1；5:1；10:1或15:1的助滤剂。

89.如权利要求88所述的方法，其中所述助滤剂与所述沉淀的mRNA的质量比为10:1。

90.如权利要求88或89所述的方法，其中所述助滤剂是基于纤维素的。

91.如权利要求63步骤e)所述的方法，其中所述PEG溶液中的所述PEG为约50％至约95％重量/体积浓度。

92.如权利要求63步骤e)所述的方法，其中所述PEG溶液中的所述PEG为约90％至约100％重量/体积浓度。

93.如权利要求90所述的方法，其中所述PEG溶液中的所述PEG为约90％重量/体积浓度。

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