JP2010517569A - 制御された剪断力を使用してスポロシストをオーシストから放出させる方法 - Google Patents
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Abstract
Description
、ネコ、ヒツジ、イヌ、ネズミ(例えば、マウス、ラット)及びウサギ目動物の対象が挙げられるが、これらに限定されない。
の国際公開第00/50072号;Embrex, Inc.の国際公開第03/020917号;及びNovus International, Inc.の国際公開第02/37961号;Hammond et al., (1944) Amer. J. Vet. Res. 5:70;Hill et al., (1961) J. Parasit. 47:357;Jackson, (1964) Parasitology 54:87;Lotze et al., (1961) J. Parasit. 47:588;Schmatz et al., (1984) J. Protozool. 31:181;Whitlock, (1959) Aust. Vet. J. 35:310;Kowalik et al., (1999) Parasitol. Res. 85:496-499 を参照)。
広範囲のパラメータ値にわたって、スポロシスト回収及びオーシスト破壊を描くために一連の実験を行った。各実験は、500mLのHBSS中合計約2×108個の胞子形成オーシスト(mL当たり4×105胞子形成オーシスト)を使用した。サブサンプルを、Microfluidizer(登録商標)プロセッサ処理前に、計数のために取った。試験しようとするチャンバーの直径は、種によって、1)アイメリアマキシマ:200、300、400μm直径のチャンバー;2)アイメリアテネラ:200、300μm直径のチャンバー;3)アイメリアアセルブリナ:125μm直径のチャンバー、に変えた。単回通過様式を使用した。圧力は、試験によって、2000psigから6000psigの範囲の圧力を使用した。Microfluidizer(登録商標)プロセッサを通過させた後、全量をHBSSで1Lに調整し、サンプルを混合し、そして計数用のサブサンプルを取った。典型的には、3つの複製の操作を各設定条件を使用して作った。
1) アイメリアアセルブリナのオーシストが破壊される割合は、125μmチャンバーを使って、圧力が高まるに従って増加することが観察された。
2)スポロシスト回収の最も良い結果は、125μmチャンバーを使って5000psigで得られた(54%回収)。
1)スポロシスト放出方法は、チャンバー直径及び試験圧力の試験したほぼ全ての組み合わせにおいて、かなり良く稼動した。
2)300μmチャンバーと3000psigの圧力の組み合わせは、Microfluidizer(登録商標)プロセッサを使用したアイメリアマキシマ1スポロシスト生産にとって適切な初期標準条件を与えた。
1)スポロシストの放出方法は、チャンバー直径及び試験圧力のほぼ全ての組み合わせにおいて、かなり良く稼動した。
2)300μmチャンバーと3000psigの圧力の組み合わせが、最適であると考えられた。
1)アイメリアテネラスポロシストの回収及びオーシストの破壊の割合は、予想通り、試験した両チャンバー共に、圧力の上昇に従って増加することが観察された。
2)最良の結果は、125μmチャンバーを用いた4000psigで得られた。
スポロシストを放出させるために細胞破壊装置を使用する場合、放出されたスポロシストの生存率を確保するため、放出条件の最適化が必要である。生存能力は、スポロシストの用量をトリに投与し、感染から生じる関連のオーシストの排出量を計数することによって評価することができる。細胞破砕装置のチャンバー形状及び圧力が変わる条件下では、生存可能でない条件でスポロシストをオーシストから効率的に放出させ得る。即ち、そのスポロシストの投与でトリに起こさせる感染は、ガラスビーズのような従来の方法によって放出されたスポロシストを使用して行った場合と比較して、減少する可能性がある。生存能力のあるスポロシストの生産を確実にするためには、チャンバーの形状及び圧力の条件は、慎重に評価されなければならない。
アイメリアアセルブリナ(長さ:約12μm)及びアイメリアテネラ(長さ約20μm)を含む、より小さいアイメリア属は、より大きいアイメリアマキシマ種(長さ:約40μm)より、剪断を受けにくいことが観察される。Microfluidizer(登録商標)システムにおいて圧力を高めることによってより高いレベルの剪断を生じさせると、どの種についてもオーシストからのスポロシストの顕微鏡的収率の改善が可能であるが、特により小さい種の効率的な放出に必要である;しかし、圧力の上昇は、また、生存率を低下させる可能性がある。生存率を改善するために圧力を下げることは、本質的に収率を犠牲にする。顕微鏡的収率と生存率の両者の改善を提供するために、オーシストの壁のコンディションを調整する前処理が開発されている。
Claims (34)
- オーシストからスポロシストを放出させる方法であって、その方法が:
懸濁したオーシストを含有する溶液を調製すること;
その溶液に、オーシスト壁を破壊してそこから生存可能なスポロシストを放出させるのに十分な制御された剪断力を加えること;そして
放出された生存可能なスポロシストを溶液から回収すること;
を含む方法。 - オーシスト壁を破壊しそこからスポロシストを放出させるのに十分な制御された剪断力を溶液に加えることが、溶液を加圧下でMicrofluidizer(登録商標)プロセッサチャンバーを1回又はそれ以上通過させることを含む、請求項1に記載の方法。
- 溶液が水溶液を含む、請求項1に記載の方法。
- 水溶液が、ハンクス(Hank's)の平衡塩類溶液(HBSS)、リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)、RPMI培地及びDMEM培地から成るグループから選択される溶液を含む、請求項3に記載の方法。
- アイメリアマキシマオーシストからスポロシストを放出させるために使用される剪断力の量が、1分当り約3.00×105sec-1から1分当り約1.50×106sec-1の範囲である、請求項1に記載の方法。
- アイメリアテネラ又はアイメリアアセルブリナスポロシストをオーシストから放出させるために使用される剪断力の量が1分当り約1.00×106sec-1から1分当り約3.00×106sec-1の範囲である、請求項1に記載の方法。
- Microfluidizer(登録商標)プロセッサチャンバーを通過する溶液が約1,000psi〜約6,000psiの間に加圧される、請求項2に記載の方法。
- Microfluidizer(登録商標)プロセッサチャンバーが約75μmから約400μmの間の直径を有し、そしてここで溶液が約100mLから約2,000mLの間の流量を有する、請求項7に記載の方法。
- Microfluidizer(登録商標)プロセッサチャンバーがZ形構造を有する、請求項1に記載の方法。
- Microfluidizer(登録商標)プロセッサチャンバーがY形構造を有する、請求項1に記載の方法。
- Microfluidizer(登録商標)プロセッサが複数のチャンバーを含み、そしてオーシストの直径に実質的に等しいか又はそれよりも大きい直径を有するチャンバーを選択し、そして選択されたチャンバーに加圧下で溶液を通過させることを更に含む、請求項1に記載の方法。
- Microfluidizer(登録商標)プロセッサが直列に複数のチャンバーを含み、各チャンバーはそれぞれ異なる直径を有し、そしてオーシストの直径に実質的に等しいか又はそれよりも大きい直径を有するチャンバーを選択し、そして選択されたチャンバーに加圧下で溶液を通過させることを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 溶液に制御された剪断力を加える前に、オーシストの壁を脆弱化するため、オーシストを熱的に処理することを含む、請求項1に記載の方法。
- 溶液に制御された剪断力を加える前に、オーシストの壁を脆弱化するため、オーシストを化学的に処理することを含む、請求項1に記載の方法。
- 溶液に制御された剪断力を加える前に、オーシストの壁を脆弱化するため、オーシストを酵素的に処理することを含む、請求項1に記載の方法。
- 溶液に制御された剪断力を加える前に、オーシストの壁を脆弱化するため、オーシストを熱的、化学的、又は酵素的な処理を組み合わせて使用することを含む、請求項1に記載の方法。
- 回収されたスポロシストを凍結保存することを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 回収されたスポロシストを使ってワクチン及び/又は診断アッセイを製造することを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 回収されたスポロシストからスポロゾイトを脱嚢させることを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 脱嚢したスポロゾイトを用いてワクチンを製造することを更に含む、請求項19に記載の方法。
- オーシストから放出されるスポロシストの割合を測定することを更に含む、請求項1に記載の方法。
- 放出された生存能力のあるスポロシストの割合を測定することを更に含む、請求項1に記載の方法。
- オーシストがアイメリア属オーシストである、請求項1に記載の方法。
- アイメリア属オーシストが、アイメリアマキシマオーシスト、アイメリアミティスオーシスト、アイメリアテネラオーシスト、アイメリアアセルブリナオーシスト、アイメリアブルネッティオーシスト、アイメリアネカトリックスオーシスト、アイメリアプレコックスオーシスト、アイメリアミバティオーシスト、及びその任意の組み合わせから成るグループから選択される、請求項23に記載の方法。
- アイメリア属オーシストが、アイメリアメレアグリミティスオーシスト、アイメリアアデノイデスオーシスト、アイメリアガロパボニスオーシスト、アイメリアディスパーサオーシスト、アイメリアイノキュアオーシスト、アイメリアスブロツンダオーシスト、及びその任意の組み合わせから成るグループから選択される、請求項23に記載の方法。
- アイメリア属オーシストが、アイメリアツェルニィオーシスト、アイメリアボビスオーシスト、及びその任意の組み合わせから成るグループから選択される、請求項23に記載の方法。
- アイメリア属オーシストが、アイメリアアーサーターオーシスト、アイメリアバクエンシスオーシスト、アイメリアクランダリスオーシスト、アイメリアファウレイオーシスト、アイメリアグラヌロサオーシスト、アイメリアイントリカタオーシスト、アイメリアマルシカオーシスト、アイメリアオビノイダリスオーシスト、アイメリアパリダオーシスト、アイメリアパルバオーシスト、アイメリアウェイブリッジエンジスオーシスト、及びその任意の組み合わせから成るグループから選択される、請求項23に記載の方法。
- アイメリア属オーシストが、アイメリアインテスティナリスオーシスト、アイメリアベイドフスキイオーシスト、アイメリアピリフォルミスオーシスト、アイメリアコエキコラオーシスト、アイメリアイレシデュアオーシスト、アイメリアフラベセンスオーシスト、アイメリアエキシグアオーシスト、アイメリアマグナオーシスト、アイメリアパーフォランスオーシスト、アイメリアメディアオーシスト、アイメリアスティダイオーシスト、及びその任意の組み合わせから成るグループから選択される、請求項23に記載の方法。
- オーシストからスポロゾイトを放出させる方法であって、その方法が:
懸濁したオーシストを含む溶液を調製すること;
その溶液に、オーシスト壁を破壊してそこから生存可能なスポロゾイトを放出させるのに十分な制御された剪断力を加えること;そして
放出された生存可能なスポロゾイトを溶液から回収すること;
を含む方法。 - オーシスト壁を破壊しそこからスポロゾイトを放出させるのに十分な制御された剪断力を溶液に加えることが、Microfluidizer(登録商標)プロセッサチャンバーに加圧下で溶液を1回又はそれ以上通過させることを含む、請求項29に記載の方法。
- 溶液が水溶液を含む、請求項29に記載の方法。
- 溶液に制御された剪断力を加える前に、オーシストの壁を脆弱化するため、オーシストを処理することを含む、請求項29に記載の方法。
- 回収されたスポロゾイトを凍結保存することを更に含む、請求項29に記載の方法。
- 回収されたスポロゾイトを使ってワクチン及び/又は診断アッセイを製造することを更に含む、請求項29に記載の方法。
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