JPH10506920A - コクシジウム症に対する卵内予防接種 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、有効な免疫量の生きたアイメリアスポロゾイト又はメロゾイト又はその混合物を卵内投与することを含んでなる、コクシジウム症に対して家禽を予防接種する方法に関する。好ましい態様では、予防接種する家禽はニワトリ又はシチメンチョウである。

Description

【発明の詳細な説明】 コクシジウム症に対する卵内予防接種発明の背景 本発明は、コクシジウム症に対する家禽の予防接種法に関する。特に、本発明 は、コクシジウム症に対して孵化したヒナを免疫するために、家禽の発生中（de veloping）の卵に生きたアイメリア種（Eime1ia spp）のスポロゾイト又はメロ ゾイト又はその混合物を卵内（in ovo）投与することに関する。 コクシジウム症は，アイメリア属の細胞内プロトゾア寄生虫による感染によっ て引き起こされる家禽の腸内疾患である。コクシジウム症は経済的に最も悲惨な 家禽の寄生虫疾患である。抗コクシジウム薬及びコクシジウム症による損失は、 家禽業者にとって毎年数億ドルにのぼる。 コクシジウム症に対して家禽を予防接種する様々な試みが１９５０年代初期か ら報告されている。現在の予防接種法は生きたアイメリアのオーシストを餌又は 水を通して家禽に投与することを含む。しかしながら、これらの方法は全ての家 禽が意図した量のオーシストを摂取するわけでなく、また多くの家禽がワクチン で保護されず病原体による感染を受けるので、不便なものであり効率が悪い。 J．M．Sharma and B．R．Burmester，Avian Dis．26:134-149，1981の中で、 著者は、シチメンチョウヘルペスウイルスを卵内予防接種したニワトリが、その 後のマレック病ウイルスによる攻撃に対する免疫を獲得したことを報告した。ヨ ーロッパ特許公開第２９１１７３号では、非複製的免疫源を投与する免疫法を卵 内（in ovo）投与と呼んでいる。このヨーロッパ特許公開で特に言及する免疫源 は、遺伝子操作されたアイメリア抗原及びアイメリアオーシストの抽出物である 。このヨーロッパ特許公開では、本発明の予防接種法で用いるような生きた寄生 虫段階のものを特に排除している。 本発明の方法は、生きたアイメリアのスポロゾイト又はメロゾイト又はその混 合物を家禽の発生中の卵に卵内投与することを含む。現在入手可能な文献による と、このような予防接種法は卵内では効果がなく、孵化後に適用すべきであると 示唆する。T．K．Jeffers and G．E．Wagenbach，J．Parasit．56(4):656-662， 1970において、著者は抱卵（incubation）１０日目にE.テネラ（tenella）のス ポロゾイトを卵内注入したところ、その後のE.テネラオーシストによる攻撃に対 して有意な免疫保護を与えなかったと報告した。実際、処置を受けなかったニワ トリは、スポロゾイトで卵内処置したニワトリよりも、その後のE.テネラオーシ ストによる攻撃に対して生存率が高かったと、報告した。K．L．Watkins et al. ，Proc．VI th．International Coccidiosis Conf.，Abstract E1-2，Ontario， Canada，1993において著者は、生きたE.マクシマ(maxima)のスポロシストとスポ ロゾイト形成したオーシストを卵内接種したことを記載し、彼らの研究によると 、卵内暴露によっては、孵化１０日後にE.マクシマオーシストでコクシジウム攻 撃したことに対して保護されたと示す証拠は得られなかったと報告した。Watkin sらはさらに、卵内よりもむしろ孵化直後に接種すると有意な免疫保護が得られ ると結論した。この教示に反して、本発明の卵内予防接種法は、孵化したトリを その後のコクシジウム攻撃に対して保護する予期せぬ免疫を与える。発明の概略 本発明は、”本予防接種法”と呼ぶこともあり、有効な免疫量の生きたアイメ リアスポロゾイト又はメロゾイト又はその混合物を抱卵の最後の４分の１の期間 内に卵内投与することを含んでなる、コクシジウム症に対して家禽を予防接種す る方法に関する。 本明細書で用いる”家禽”という用語は、特記しない限り、ニワトリ、シチメ ンチョウ、アヒル、狩猟鳥（ウズラ、キジ及びガチョウを含むが、これに限定さ れない）及び走鳥類（ダチョウを含むが、これに限定されない）を含む。 本明細書で用いる”卵内（in ovo）”という用語は、特記しない限り、生きた 発生中の胚を含む家禽の卵内へ、ということを意味する。 本明細書で用いる”卵内へ投与する”又は”卵内投与”という用語は、特記し ない限り、ここに記載するワクチンを生きた発生中の胚を含む家禽の卵に、卵の 殼を貫通してワクチンを導入するあらゆる手段によって投与することを意味する 。このような投与手段にはワクチン注入を含むが、これに限定されない。 本明細書で用いる”抱卵の最後の４分の１の期間”という用語は、特記しない 限り、家禽の発生中の卵の抱卵の最後の４分の１の期間を意味する。 本明細書で用いる”アイメリア”という用語は、特記しない限り、家禽に感染 するアイメリア属の１以上の種を意味する。このようなアイメリア種には、E.テ ネラ、E.アセルブリナ（acervulina）、E.マクシマ、E.ネカトリックス（necatr ix）、E.ミティス（mitis）、E.プレコックス（praecox）及びE.ブルネッティ（ brunetti）を含むニワトリに見られるもの、及びE.マレアグリミティス（maleag rimitis）、E.アデノエイデス（adenoeides）、E.ガロパボニス（gallopavonis ）、E.ディスペルサ（dispersa）、E.メレアグリディス（meleagridis）、E.イ ノキュア（innocua）及びE.スブロツンダ（subrotunda）を含むシチメンチョウ に見られるもの、並びに上述したその他の家禽を感染するアイメリア種も含む。 ”アイメリア”という用語はまた、アイメリアの上述した種の全ての株を含み、 放射線照射されたりその他の処理を施されて完全に発達しないような株を含む早 熟株及び弱毒株を含むが、これに限定されない。アイメリアという用語は、上述 した家禽に感染するアイメリアの新しく発見された株又は種も含む。 本明細書で用いる”スポロゾイト”、”スポロシスト”、”オーシスト”及び ”メロゾイト”という用語は、特記しない限り、生きたアイメリアのスポロゾイ ト、スポロシスト、オーシスト及びメロゾイトを意味する。 本明細書で用いる”有効免疫量”という用語は、特記しない限り、免疫されて いないトリの固有の免疫力よりも大きな免疫保護を孵化したトリに与えるのに十 分なスポロゾイト又はメロゾイトの数、又は混合する場合にはスポロゾイトとメ ロゾイトの合計数を意味する。本明細書で用いる”免疫する”及び”予防接種す る”という用語は同義語であり、互換的に用いられる。 本発明の方法により投与する好ましい投与量は、１０−１０⁶スポロゾイト又 はメロゾイト又はその混合物であり、この場合スポロゾイトとメロゾイトの合計 数が１０−１０⁶である。 より好ましい投与量は、１０³−１０⁶スポロゾイト又はメロゾイト又はその混 合物であり、この場合スポロゾイトとメロゾイトの合計数が１０³−１０⁶である 。 別の好ましい投与量は、１０²−１０⁵スポロゾイト又はメロゾイト又はその混 合物であり、この場合スポロゾイトとメロゾイトの合計数が１０²−１０⁵である 。 本発明の方法により予防接種する好ましい家禽はニワトリである。 ニワトリ卵に卵内投与する好ましい投与量は、E.テネラ、E.アセルブリナ、E. マクシマ、E.ネカトリックス、E.ミティス、E.プレコックス及びE.ブルネッティ からなる群より選択される２以上のアイメリア種のスポロゾイト又はメロゾイト 又はその混合物を含む。投与量は好ましくは、投与量に含まれる各種について１ ０−１０⁶のスポロゾイト又はメロゾイト又はその混合物である。 本発明の方法により予防接種する別の好ましい家禽はシチメンチョウである。 シチメンチョウ卵に卵内投与する好ましい投与量は、E.マレアグリミティス、 E.アデノエイデス、E.ガロパボニス、E.ディスペルサ、E.メレアグリディス、E. イノキュア及びE.スブロツンダからなる群より選択される２以上のアイメリア種 のスポロゾイト又はメロゾイト又はその混合物を含む。投与量は好ましくは、投 与量に含まれる各種について１０−１０⁵のスポロゾイト又はメロゾイト又はそ の混合物である。 本発明の方法により予防接種する別の好ましい家禽は狩猟鳥、アヒル及び走鳥 類である。 本発明の方法はさらに、本発明の予防接種法と組み合わせて、抱卵中のいずれ かの時点において免疫刺激剤を卵中投与することを含む。 免疫刺激剤を投与する好ましい方法は、抱卵の最後の４分の１の期間内にスポ ロゾイト又はメロゾイト又はスポロゾイトとメロゾイトの混合物の一定投与量を 卵内投与するのと同時に行う。発明の詳細な説明 本発明の予防接種法は、生きたアイメリアスポロゾイト又はメロゾイト又はそ の混合物を抱卵の最後の４分の１の期間内に家禽の卵に卵内投与することを含む 。ニワトリの場合、卵内投与は好ましくは抱卵の１５−２０日目に、より好まし くは抱卵の１８日目に行う。シチメンチョウの場合、卵内投与は好ましくは抱卵 の２１−２６日目に行う。 本発明の予防接種法はいかなる適切な卵内投与方法を用いて行ってもよい。好 ましくは、本発明のワクチンは注入によって投与する。注入の１方法によると、 １８ゲージの針を用いて卵の大きい方の末端の卵殻に穴をあけて卵の気胞を露出 する。適切なサイズ（１−３ｍｌ）のシリンジをつけた１．０−１．５インチの ２２ゲージの針を穴及び気胞の膜を通して挿入する。適切な数のスポロゾイト又 はメロゾイト又は混合する場合には適切な数のスポロゾイトとメロゾイトを適切 な液体担体、例えばリン酸緩衝塩液１０−５００μｌに懸濁して卵に注入する。 適切な容量は処置する卵のサイズに依存し、ダチョウの卵ではニワトリの卵より も明らかに多くの容量を要するであろう。注入部位は卵又は胚のいかなる領域で あってもよい。好ましくは、注入は卵の大きい方の末端の中心から軸方向に羊膜 内に行う。 あるいは、本発明の予防接種法では自動卵注入システムを用いることもできる 。このようなシステムは米国特許第４，６８１，０６３号、４，０４０，３８８ 号、４，４６９，０４７号、及び４，５９３，６４６号に記載されており、これ らを参照としてここに援用する。その他の適切な注入法も当業者には公知である 。 オーシストは当業者に公知のいくつかの方法によって調製できる。このような 方法には、J．F．Ry1ey et al.，Parasitology 73:311-326，1976及びP．L．Lon g et al.，Fo1ia Veterinaria Latina VI＃3，201-217，1976に記載されており 、これらを参照としてここに援用する。１つの方法によると、約２週齢の市販の ブロイラーニワトリに、適切な投与量のスポロゾイト形成したオーシストを経口 で強制餌養させることにより興味のあるアイメリア種で感染する。例えば、E.テ ネラで用いた典型的な投与量は、トリ１羽当たり２００，０００スポロゾイト形 成したオーシストである。感染したトリからオーシストを回収及び精製する公知 の方法を次に行う。ほとんどのアイメリア種では、感染の５−７日後に感染した トリから糞を回収し、混合して濾過することによりカスを除き、残渣の糞物質を ペレットにするのに十分な速度で遠心する。E.テネラでは、感染６日目に盲腸コ アを取り出す点を除き、同様の方法を用いる。ペレットを飽和塩溶液に再懸濁す ると、オーシストは浮遊し、ほとんどの汚染カスは遠心により除去できる。次い でオーシスト懸濁液を希釈して低塩濃度にする。オーシストを繰り返し洗浄して 塩を除去し、重クロム酸カリウム溶液（２．５％ｗ／ｖ）に再懸濁する。オーシ スト懸濁液を震盪（例えば１４０ｒｐｍ）しながら約７２時間２９℃でインキュ ベートし、オーシストのスポロゾイト形成を誘導する。あるいは、オーシストを 次 亜塩素酸ナトリウムで処理した後スポロゾイト形成することもできる。血球計数 器を用いて１ｍｌ当たりのスポロゾイト形成したオーシストの数を直接計数し、 培養液を好ましくは必要時まで冷蔵で保存する。 スポロシストを調製するには、オーシストを繰り返し洗浄することにより上述 のオーシスト懸濁液から重クロム酸カリウムを除去し、これには遠心によるオー シストの回収と脱イオン水又は蒸留水への再懸濁を含む。黄橙色が消えることに よって判断して、重クロム酸カリウムが除去されたら、オーシスト懸濁液を等容 量の次亜塩素酸ナトリウム（ブリーチ）と混合して室温で１５分インキュベート する。次いで繰り返し洗浄してブリーチを除去し、オーシストを生理食塩水又は 脱イオン水に再懸濁する。種々の公知の方法を用いて、オーシストを壊してスポ ロシストを放出させる。例えば、１−４ｍｍ直径のガラスビーズとオーシストを 混合して手、ボルテックスミキサー又は震盪培養器で震盪するか、あるいは手で もつホモジェナイザーを用いてオーシストを壊してスポロシストを放出させる。 放出されたスポロシストから、壊れなかったオーシスト及びオーシスト壁を、Du lski et al.，Avian Diseases，32:235-239，1988に記載するように、５０％Per co11^TM（Pharmacia Biotechから販売）又は１Ｍスクロース中で分別遠心するこ とにより分離できる。 本発明で使用するスポロゾイト又はスポロゾイトに富む調製物を調製するには 、上述のスポロシスト調製物からスポロゾイトを脱嚢させる。１つの方法では、 上述のように調製したスポロシストを遠心によってペレットにし、脱嚢バッファ ー（リン酸緩衝塩溶液ｐＨ８．０中の０．５％タウロデオキシコリン酸及び０． ２５％トリプシン）中に再懸濁し、４１℃で１時間震盪しながらインキュベート する。得られる懸濁液サンプルを計数してスポロゾイト数を決定し、スポロゾイ トを１回洗浄して脱嚢バッファーを除去し、卵内注入に用いる所望の濃度でリン 酸緩衝塩溶液中に再懸濁する。この調製物はスポロゾイト、スポロシスト及びオ ーシストを含み、さらに精製することなく、本発明の予防接種法に用いることが できる。スポロシスト及びオーシストを除去した精製スポロゾイトは、D．M．Sc hmatz et al.，J．Protozoo1．31:181-183，1984（参照としてここに援用する） に記載するように、ＤＥ−５２アニオン交換クロマトグラフィーにより調製でき る。 本発明の予防接種法に用いるスポロゾイトの投与量は、予防接種する家禽の種類 及びワクチンに用いるアイメリア種により変更する。一般に、投与量は卵１個当 たり１０−１０⁶スポロゾイトの範囲でありうる。好ましくは投与量範囲は、卵 １個当たり１０−１０⁵スポロゾイトであり、より好ましくは投与量範囲は、卵 １個当たり１０²−１０⁵スポロゾイトである。 メロゾイトは当業者に公知の種々の方法によって調製できる。１つの方法では 、D．J．Doran，J．Parasit．57:891-900，1971（参照としてここに援用する） に記載の方法を修飾して、細胞凝集物として培養で生育させた一次ヒナ腎臓細胞 （ＰＣＫ）中にスポロゾイトを感染させる。S．D．Chung et al.，J．Cel1 Biol ．95:118-126，1982に記載するように、ウシ胎児血清、ペニシリン−ストレプト マイシン、１５ｍＭ炭酸水素ナトリウム、１０ｎｇ／ｍｌ上皮成長因子、５μｇ ／ｍｌインシュリン、５μｇ／ｍｌトランスフェリン、５ｎｇ／ｍｌ亜セレン酸 及び０．０１μＭ塩酸ヒドロコルチゾンを補充した、Ｌ−グルタミン及び１５ｍ ＭＨＥＰＥＳ含有の修飾ＲＫ２培地−ＤＭＥＭ／Ｆ１２中で、３％ＣＯ₂中、４ ０℃でＰＣＫ細胞を生育する。ＰＣＫ細胞は、２−３週齢のヒナ腎臓から、腎臓 を刻み、リン酸緩衝塩溶液中の０．２ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼ（Worthington Bi ochemical Corp.，Freeho1d，NJから販売）を数回代えながら３７℃で組織を処 理することにより調製される。懸濁液中の細胞凝集物を洗浄し、５％ウシ胎児血 清を含む修飾ＲＫ２培地に再懸濁し、１ｃｍ²当たり１０⁵凝集物の密度でフラス コ中に組織培養物を接種する。ＰＣＫ細胞を３％ＣＯ₂中、４０℃で１８時間イ ンキュベートし、次に４ｘ１０⁵スポロゾイト／ｃｍ²で感染する。感染した培養 物を２％ウシ胎児血清を含む修飾ＰＫ２培地で生育する。浸潤させるために、イ ンキュベーション２４時間後に、フラスコを撹拌して培地を除去することによっ て非浸潤スポロゾイトを除去する。細胞層を２％ウシ胎児血清を含む修飾ＲＫ２ 培地で１回洗浄し、培地を再度捨てる。新しいＲＫ２培地を加えて、メロゾイト が培地に放出されるまで、焙養物をさらに４８−５４時間インキュベートする。 宿主の細胞カスを除去するためのメロゾイト精製は、当業者に公知の種々の方 法によって行うことができる。J．A．Olson，Antimicrob．Agents Chemother．3 4:1435-1439，1990に記載の１つの方法によると、放出されたメロゾイトを含む 培 地を回収して４５０ｘｇで１０分遠心してメロゾイトを濃縮する。メロゾイトと 宿主細胞カスを含むペレットを０．１Ｍ ＮａＣｌ−０．０５Ｍ ＫＣｌ−２０ ％ウシ血清アルブミンに懸濁し、７５ｍＭ Ｔｒｉｓ−４０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄ −８６ｍＭ ＮａＣｌ−１００ｍＭグルコース、ｐＨ８．２で平衡化したＤＥ− ５２アニオン交換カラムにかける。メロゾイトはカラムを通って流出する。カラ ムから回収したメロゾイトをA．Ki1ejian，J．Bio1．Chem．249:4650-4655，197 4に記載のように、電子顕微鏡で純度を試験する。一般に、メロゾイトの投与量 は卵１個当たり１０−１０⁶メロゾイトの範囲でありうる。好ましくは投与量範 囲は、卵１個当たり１０−１０⁵メロゾイトあり、より好ましくは投与量範囲は 、卵１個当たり１０²−１０⁵メロゾイトである。スポロゾイトとメロゾイトを混 合する場合には、一般に、メロゾイトとスポロゾイトの合計数からなる投与量は 卵１個当たり１０−１０⁶の範囲でありうる。好ましくは投与量範囲は、卵１個 当たり１０−１０⁵メロゾイト及びスポロゾイトあり、より好ましくは投与量範 囲は、卵１個当たり１０²−１０⁵メロゾイト及びスポロゾイトである。 スポロゾイト又はメロゾイト又はその混合物はいかなる生理学的に適当な溶媒 中で卵内注入してもよい。好ましくは、リン酸緩衝塩溶液のような生理学的にバ ランスのとれた塩溶液中に懸濁する。選択した溶媒は、場合により生理学的に適 当なゲル、ゼラチン、ヒドロゾル、セルロース又は多糖ガムを含む１以上の懸濁 剤を含んでいてもよい。 好ましくは、本発明の予防接種法では、２以上のアイメリア種のスポロゾイト 又はメロゾイト又はその混合物を同時に卵中注入する。本発明の予防接種法では 、ニワトリのような特定の家禽を感染する全ての同定されたアイメリア種のスポ ロゾイト又はメロゾイト又はその混合物を、全ての種に対する免疫学的保護を与 えるための適当な投与量で同時に又は連続して卵中注入することができる。 本発明の予防接種法と組み合わせて免疫刺激剤を用いることができる。適当な 免疫刺激剤には、サイトカイン、成長因子、ケモカイン、リンパ球の細胞培養物 の上清、単球、又はリンパ球器官由来の細胞、細胞調製物又は細胞抽出物（例え ば、Staphy1ococcus aureus又はリポ多糖調製物）、マイトジェン、又は低分子 量医薬を含むアジュバントを含むが、これに限定されない。免疫刺激剤は抱卵中 の いかなる時点で卵内投与してもよい。好ましくは、免疫刺激剤は投与量のアイメ リアスポロゾイト又はメロゾイト又はその混合物を含む溶媒中で卵内投与する。 コクシジウム症に対する予防接種における本発明の効果を以下の実施例によっ て示す。各投与量は上述の生理学的に受容できる塩溶液で卵内注入した。特定調 製物の有効性は、ヒナの孵化率及び孵化体重をモニターし、また攻撃感染の後の オーシストの産生、体重増加及び病原性（病変スコア）によって決定した。病変 スコアはJ．K．Johnson and W．M．Reid，Exp．Parasjto1．28:30-36，1970に記 載のプロトコルに従って割り振り、ここでは０は疾患なしを表し、４は最大病変 を表す。実施例１ 抱卵１８日目にニワトリ卵に、卵１個当たり１０⁵のE.テネラスポロゾイトを 含む調製物を注入した。この調製物はスポロシスト及びオーシストを除去するた めの精製を行わなかった。各投与量には、約１０⁴のE.テネラスポロシストと約 １０⁴のE.テネラオーシストも含んでいた。対照として、リン酸緩衝塩溶液のみ を卵に注入した。スポロゾイト処理したトリ集団では、孵化７日目に落屑した平 均オーシストはトリ１羽当たり１．１ｘ１０⁶オーシストであった。免疫しない トリ及びスポロゾイト処理したトリを種々の投与量のE.テネラのスポロゾイト形 成したオーシストで、卿化７、１４又は２１日目に経口強制餌養により投与して 攻撃した。 データを表１に示す。 表１のデータは、免疫したトリにおける病変スコアの減少と体重増加の改善に よって示されるように、免疫したトリは免疫しないヒナよりも感染に対する感受 性が低かったことを明瞭に示す。このデータはまた、本発明の方法が比較的早期 年齢（孵化後７日以内）にヒナに免疫を付与することを示す。さらに、このデー タは、ヒナが成長、発達しても免疫が続くことを示す。普通ブロイラーは６週齢 で市場にでるので、早期年齢でヒナに免疫を付与できることは、ブロイラーニワ トリ業界に顕著な利点を提供する。実施例２ ニワトリ卵に抱卵１８日目に、食塩水（対照）又は種々の投与量のE.テネラの スポロゾイトを含む調製物を注入し、表２に示すように攻撃前の結果を与えた。 各投与量で用いたスポロゾイト調製物は６２％スポロゾイト、９％スポロシスト 、及び２９％オーシストを含んでいた。１０⁵のスポロゾイトを含む各投与量は 合計で１．６ｘ１０⁵の寄生虫段階（スポロゾイト、スポロシスト及びオーシス ト）を含んでいた。 孵化率及び体重に及ぼす卵内予防接種の効果 表２に示すデータは、生きたスポロゾイトを注入した卵から孵化したヒナは、 孵昨化率及び孵化体重の点では免疫しない孵化ヒナと実質的に同じであったこと を示す。次に孵化１４日目にヒナにトリ１羽当たり１．２５ｘ１０⁴のスポロゾ イト形成したオーシストを経口強制餌養投与により攻撃した。攻撃後の結果を表 ３に示す。 免疫しないトリと種々の投与量のスポロゾイトで卵内処置したトリの 攻撃感染に対する応答 表３に示すデータは、全てのパラメーター（体重増加、病変スコア、オーシス ト落屑）で、種々の投与量のスポロゾイト調製物を注入した卵から孵化したヒナ が免疫された証拠を示す。食塩水のみで処置されて攻撃感染を付与された対照の トリと比較して、スポロゾイト調製物で卵内免疫されたトリはより大きな体重増 加と減少した病変スコアを示した。さらに、スポロゾイト調製物で卵内免疫した トリは攻撃感染後に対照のトリよりも少ないオーシストを落屑し、これは免疫し たトリにおける感染がより重症でないことを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ウェーバー，フレデリック・エイチ アメリカ合衆国インディアナ州47803，テ レ・ホート，フェニックス・コート 159

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．有効な免疫量の生きたアイメリアスポロゾイト又はメロゾイト又はその混 合物を抱卵の最後の４分の１の期間内に卵内投与することを含んでなる、コクシ ジウム症に対して家禽を予防接種する方法。 ２．投与量が１０−１０⁶のスポロゾイト又はメロゾイト又はその混合物を含 み、ここでスポロゾイト及びメロゾイトの合計数が１０−１０⁶の範囲である請 求項１記載の方法。 ３．投与量が１０³−１０⁶のスポロゾイト又はメロゾイト又はその混合物を含 み、ここでスポロゾイト及びメロゾイトの合計数が１０³−１０⁶の範囲である請 求項１記載の方法。 ４．投与量が１０²−１０⁵のスポロゾイト又はメロゾイト又はその混合物を含 み、ここでスポロゾイト及びメロゾイトの合計数が１０²−１０⁵の範囲である請 求項１記載の方法。 ５．家禽がニワトリである請求項２記載の方法。 ６．投与量がE.テネラ、E.アセルブリナ、E.マクシマ、E.ネカトリックス、E. ミティス、E.プレコックス及びE.ブルネッティからなる群より選択される２以上 のアイメリア種のスポロゾイト又はメロゾイト又はその混合物を含む請求項５記 載の方法。 ７．投与量を卵内注入によって投与する請求項６記載の方法。 ８．抱卵のいずれかの時点において免疫刺激剤を卵内投与することをさらに含 んでなる請求項２記載の方法。 ９．免疫刺激剤を投与量のスポロゾイト又はメロゾイト又はスポロゾイト及び メロゾイトの混合物と同時に卵内投与する請求項８記載の方法。 １０．投与量がメロゾイトを含んでなる請求項２記載の方法。 １１．投与量がスポロゾイトを含んでなる請求項２記載の方法。 １２．スポロゾイトがスポロシスト及びオーシストを除去するように予め精製さ れている精製１１記載の方法。 １３．家禽がシチメンチョウである請求項２記載の方法。 １４．投与量がE.マレアグリミティス、E.アデノエイデス、E.ガロパボニス、E. ディスペルサ、E.メレアグリディス、E.イノキュア及びE.スブロツンダからなる 群より選択される２以上のアイメリア種のスポロゾイト又はメロゾイト又はその 混合物を含む請求項１３記載の方法。 １５．投与量を卵内注入により投与する請求項１４記載の方法。 １６．家禽が狩猟鳥、アヒル又は走鳥類である請求項２記載の方法。