PT831897E

PT831897E - Vacinacao in ovo contra a coccidiose

Info

Publication number: PT831897E
Application number: PT95918720T
Authority: PT
Inventors: Nigel A Evans; R Craig Findly; Frederick H Weber
Original assignee: Pfizer
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1995-06-07
Publication date: 2001-07-31
Also published as: SK282004B6; FI974439A0; IL118490A0; IL118490A; MY121973A; EP0831897B1; AR002157A1; RO113716B1; JPH10506920A; GR3035938T3; HUP9601554A2; US20020031530A1; AR044235A2; US7018640B2; NZ286754A; JP3120860B2; PE2998A1; DK0831897T3; DZ2048A1; HU223707B1

Description

DESCRIÇÃO "VACINAÇÃO INOVO CONTRA A COCCIDIOSE " A presente invenção relaciona-se com um método de vacinação de aves domésticas contra a coccidiose. Em particular, a invenção relaciona-se com a administração in ovo de esporozoitos ou merozoitos Eimeria spp vivos, ou de misturas destes, no desenvolvimento de ovos de aves domésticas de forma a imunizar os filhotes de aves saídas do ovo contra a coccidiose. A coccidiose é uma doença entérica de aves domésticas causada por uma infecção com parasitas protozoários intracelulares do género Eimeria. A coccidiose é a doença parasítica economicamente mais devastadora de aves domésticas. Está estimado que medicações anticoccidiais e perdas devidas à coccidiose custam à indústria de aves domésticas centenas de milhões de dólares em cada ano. Várias tentativas de vacinação de aves domésticas contra a cocciodiose têm sido relatadas desde o início dos anos 50. Os métodos de vacinação correntes incluem a administração de oocistos Eimeria vivos a aves através dos alimentos ou da água. Estes métodos, no entanto, são inconvenientes e ineficientes devido a que nem todas as aves obtêm a dose pretendida de oocistos e muitas estão desprotegidas pela vacina ou acolhem uma infecção patogénica.

No J. M. Sharma e B. R. Burmester, Avian Dis. 26: 134-139, 1981, os autores relatam que galinhas vacinadas in ovo com herpesvírus da Turquia desenvolveram imunidade contra a indução de uma resposta imunológica subsequente com víms da doença de Marek. Na publicação de patente Europeia n° 291 173, é referido um processo de imunização em que é administrado in ovo um imunogéne não replicante. Os imunogénes especificamente referidos na patente Europeia são um antigéne Eimeria geneticamente planeado e um extracto de oocisto Eimeria. A patente Europeia exclui especificamente estádios de parasitas vivos tais como aqueles usados no método de vacinação desvendado de aqui por diante. O método de vacinação presente envolve a administração in ovo de esporozoitos ou merozoitos Eimeria vivos, ou de uma mistura subsequente, nos ovos de aves domésticas em desenvolvimento. A literatura disponível sugere que um tal método de vacinação seria inefectivo in ovo e que deveria ser aplicado pós-eclosão. No T. K. Jeffers e G. E. Wagenbach, J. Parasit. 56(4): 656-662, 1970, os autores relatam que a injecção in ovo de esporozoitos E. tenella no dia 10 da incubação não forneceram protecção imunológica significativa contra a indução de uma resposta imunológica subsequente com oocistos E. tenella. De facto, eles relatam que galinhas que não receberam tratamento tiveram uma taxa de sobrevivência superior contra a indução de uma resposta imunológica subsequente com oocistos E. tenella do que galinhas que foram tratadas in ovo com esporozoitos. No K. L. Watkins et al., Proc. VIa International Coccodiosis Conf., Abstract El-2, Ontário, Canadá, 1993, os autores descrevem a inoculação in ovo com esporocistos E. maxima vivos e oocistos esporulados e concluíram que o seu estudo não forneceu evidência de que a exposição in ovo protege contra a indução de uma resposta imunológica subsequente coccidial com oocistos E. maxima 10 dias pós-eclosão. Watkins et al. concluíram adicionalmente que a protecção imunológica significativa é fornecida se a inoculação for feita logo após a eclosão em vez de in ovo. Contrariamente a esta instrução o método de vacinação in ovo da presente invenção fornece inesperadamente imunidade que protege as aves saídas do ovo contra a indução de uma resposta imunológica coccidial subsequente.

Sumário da Invenção A presente invenção, também referida de aqui por diante como o "método de vacinação presente", relaciona-se com um método (não reivindicado) de vacinação de uma ave doméstica contra a coccidiose compreendendo a administração in ovo, durante o quarto final da incubação, de uma dose de imunização efectiva de esporozoitos ou merozoitos Eimeria vivos, ou de uma mistura subsequente.

Assim, de acordo com a presente invenção, é fornecida a utilização de esporozoitos ou merozoitos Eimeria vivos, ou de uma mistura subsequente, no fabrico de uma vacina para protecção de uma ave doméstica contra a coccidiose, em que uma dose imunizante efectiva da vacina é administrada in ovo durante o quarto final da incubação. O termo "ave(s) doméstica(s)", como usado de aqui por adiante, a menos que seja indicado algo em contrário, inclui galinhas, perus, patos, aves de caça (incluindo, mas não limitado a, codornízes, faisões, e gansos) e ratites (incluindo, mas não limitado a, avestruz). O termo "in ovo" como usado de aqui por diante, a menos que seja indicado algo em contrário, significa um ovo de ave doméstica contendo um embrião vivo, em desenvolvimento. -4- O termo "administrar in ovo" ou "administração in ovo", como usado de aqui por adiante, a menos que seja indicado algo em contrário, significa administração da vacina descrita de aqui para a frente a um ovo de ave doméstica contendo um embrião vivo, em desenvolvimento por qualquer meio de penetração da casca do ovo e introdução da vacina. Tais meios de administração incluem, mas não estão limitados a, injecção da vacina. O termo, "quarto final da incubação" como usado de aqui por diante, a menos que seja indicado algo em contrário, significa o quarto final da incubação de um ovo de uma ave doméstica em desenvolvimento. O termo "Eimeria", como usado de aqui por diante, a menos que seja indicado algo em contrário, significa uma ou mais espécies do género Eimeria que infectam aves domésticas. Tais espécies Eimeria incluem aquelas que são encontradas em galinhas, incluindo E. tenella, E. acervulina, E. maxima, E. necatrix, E. mitis, E. praecox, e E. brunetti, e também aquelas que são encontradas em perus, incluindo E. meleagrimitis, E. adenoeides, E. gallopavonis, E. dispersa, E. meleagridis, E. innocua, e E. subrotunda, e também espécies"Eimeria" que infectam outras aves domésticas como definido acima. O termo "Eimeria" também inclui todas as estirpes das seguintes espécies Eimeria, incluindo, mas não limitada a estirpes precoces, e estirpes atenuadas, que incluem estirpes que foram irradiadas, ou tratadas de outro modo, de tal modo que falharam o desenvolvimento completo. O termo Eimeria também inclui quaisquer estirpes recentemente descobertas ou espécies Eimeria que infectam aves domésticas como definido acima.

Os termos "esperozoitos", "esporocistos", 'oocistos", e "merozoitos", como usados de aqui por diante, a menos que seja indicado algo em contrário, significam esporozitos, esporocistos, oocistos e merozoitos Eimeria vivos. O termo "dose imunizante efectiva", como usado de aqui por diante, a menos que seja indicado algo em contrário, significa um número de esporozoitos ou merozoitos, ou, quando misturados, um número de esporozoitos e merozoitos, suficiente para prover protecção imunológica nas aves saídas do ovo que é maior do que a imunidade inerente de aves não imunizadas. Como usado de aqui por diante, os termos "imuniza" e "vacina" são sinónimos e são usados permutavelmente.

Uma dose preferida para ser administrada de acordo com a invenção compreende 10 a 106 esporozoitos ou merozoitos, ou uma mistura destes em que o número total dos referidos esporozoitos e merozoitos varia desde 10 até 106.

Uma dose mais preferida compreende 103 a 106 esperozoitos ou merozoitos, ou uma mistura destes em que o número total dos referidos esporozoitos e merozoitos varia desde 103 a 106.

Outra dose preferida compreende 102 a 105 esporozoitos ou merozoitos, ou uma mistura destes em que o número total dos referidos esporozoitos e merozoitos varia desde 102 até 103.

Uma ave doméstica preferida para ser vacinada de acordo com o método da invenção é uma galinha.

Uma dose preferida para ser administrada in ovo a ovos de galinlia compreende esporozoitos e merozoitos, ou uma mistura destes, ou duas ou mais espécies Eimeria seleccionadas do grupo consistindo em E. tenella, E. acervulina, E. maxima, E. necatrix, E. mitis, E. praecox, e E. brunetti. A dose inclui preferivelmente desde 10 até 106 esporozoitos ou merozoitos, ou uma mistura destes, para cada espécie que é incluída na dose.

Outra ave doméstica preferida para ser vacinada de acordo com a invenção é um peru.

Uma dose preferida para ser administrada in ovo a ovos de peru compreende esporozoitos ou merozoitos, ou uma mistura destes, ou duas ou mais espécies Eimeria seleccionadas do grupo consistindo em E. meleagrimitis, E. adenoeides, E. gallopavonis, E. dispersa, E. meleagridis, E. innocua, e E. subrotunda. A dose inclui preferivelmente desde 10 até 106 esporozoitos ou merozoitos, ou uma mistura destes, para cada espécie que é incluída na dose.

Outras aves domésticas preferidas para serem vacinadas de acordo com a invenção são ave de caça, patos e ratites. A invenção compreende adicionalmente a utilização como definida acima, mas na qual é administrado in ovo um estimulante imune em qualquer altura durante a incubação.

Preferivelmente, o estimulante imune é administrado simultaneamente com a administração in ovo de uma dose de esporozoitos ou merozoitos, ou de uma mistura dos referidos esporozoitos e merozoitos, durante o quarto final da incubação.

Descrição Detalhada da Invenção O presente método de vacinação envolve a administração in ovo, durante o quarto final da incubação, de esporozoitos ou merozoitos Eimeria vivos, ou de uma mistura destes, a ovos de aves domésticas. No caso das galinhas, a administração in ovo é realizada preferivelmente nos dias 15-20 da incubação, e mais preferivelmente no dia 18 da incubação. No caso dos perus, a administração in ovo é feita preferivelmente nos dias 21-26 da incubação. O presente método de vacinação pode ser realizado usando qualquer método de administração in ovo adequado. Preferivelmente, a presente vacina é administrada via injecção. De acordo com um método de injecção, é feito um orifício na casca do ovo na extremidade grande do ovo usando uma agulha de calibre 18 para expor o alvéolo de ar do ovo. Uma agulha de 2,54 -3,81 cm de calibre 22 ligada a uma seringa de tamanho apropriado (1-3 ml) pode ser inserida através do orifício e através da membrana do alvéolo de ar. Um número apropriado de esporozoitos ou merozoitos, ou, quando misturados, um número apropriado de esporozoitos e merozoitos, são suspensos num veículo líquido apropriado, por exemplo 10 - 500 μΐ de solução salina tamponizada com fosfato, e em seguida injectados para o interior do ovo. O volume apropriado irá depender do tamanho do ovo a ser tratado, com ovos de avestruz sendo obviamente capazes de tomar um volume maior do que ovos de galinha. O local da injecção pode estar dentro de qualquer região do ovo ou embrião. Preferivelmente, a injecção é feita axialmente através do centro da extremidade grande do ovo dentro do âmnio.

Altemativamente, pode ser usado um sistema de injecção de ovo automatizado no método de vacinação presente. Tais sistemas são descritos na Patente dos Estados Unidos da América nos. 4 681 063, 4 040 388, 4 469 047 e 4 593 646. Outros métodos de injecção apropriados são conhecidos para aqueles peritos na técnica.

Oocistos podem ser preparados por qualquer um dos vários métodos conhecidos para aqueles peritos na técnica. Tais métodos incluem aqueles descritos em J. F. Ryley et al., Parasitology 73: 311 - 326, 1976 e P. L. Long et al., Folia Veterinária Latina VI#3, 201 - 217, 1976. De acordo com um método, frangos para assar comerciais, de aproximadamente 2 semanas de idade, são injectados com a espécie Eimeria de interesse por alimentação oral por sonda esofágica de uma dose apropriada de oocistos esporulados. Por exemplo, uma dose típica usada para E. tenella é 200 000 oocistos esporulados/ave. Procedimentos bem conhecidos para recolha e purificação de oocistos de aves infectadas são então seguidos. Para a maioria das espécies Eimeria, são recolhidos excrementos de aves infectadas 5-7 dias pós-infecção, misturados e filtrados para remover entulhos, em seguida centrifugados a uma velocidade suficiente para transformar o restante material fecal em pastilhas. Para E. tenella, é usado um procedimento semelhante excepto que os núcleos cecais são tomados a 6 dias pós-infecção. A pastilha é re-suspensa numa solução de sal saturada, na qual os oocistos flutuam e a maioria do entulho contaminante pode ser removido por centrifugação. A suspensão de oocisto é então diluída para baixar a concentração de sal. Os oocistos são lavados repetidamente para remover o sal e re-suspensos numa solução de dicromato de potássio (2,5 % p/v). A suspensão de oocistos é incubada a 29 °C com agitação (e. g., 140 rpm) durante aproximadamente 72 horas para induzir a esporulação dos oocistos. Altemativamente, os oocistos podem ser tratados com hipoclorito de sódio e em -9- seguida esporulados. O número de oocistos esporulados/ml é determinado por contagem directa usando um hemocitomedidor, e a cultura é guardada, preferivelmente sob refrigeração até ser necessário.

Para preparar esporocistos, o dicromato de potássio é removido da suspensão de oocisto descrita acima por lavagem repetida dos oocistos, que envolvem colecta dos oocistos por centrifugação e re-suspensão em água desionizada ou destilada. Quando o dicromato foi removido como julgado pela falta de coloração laranja-amarelado, a suspensão de oocisto é misturada com volume igual de hipoclorito de sódio (branqueador) e incubado à temperatura ambiente durante 15 minutos. O branqueador é removido em seguida por lavagens repetidas, e os oocistos são re-suspensos em solução salina fisiológica ou em água desionizada. Os oocistos podem ser partidos para libertar esporocistos por mistura dos oocistos com camadas de vidro de 1 - 4 mm de diâmetro e agitação manual, misturador de vórtex, ou incubador de agitação, ou usando um homogenizador portátil. Oocistos inteiros e paredes de oocistos podem ser separados dos esporocistos libertados por centrifugação diferencial em Percoll™ 50 % (vendido pela Pharmacia Biotech) ou em sacarose 1 M como descrito em Dulski et. al., Avian Diseases, 32: 235 - 239, 1988.

Para preparar esporozoitos ou uma preparação rica em esporozoitos para ser usada de acordo com a presente invenção os esporzoitos são excistados a partir da preparação de esporocistos descrita acima. Num procedimento, os esporocistos preparados como descritos acima são prensados por centrifugação, re-suspensos num tampão de excistação (ácido taurodexicólico 0,5 % e tripsina 0,25 % em solução salina de fosfato tamponizada, pH 8,0) e incubada com agitação durante uma hora a 41 °C. Uma amostra da suspensão resultante é contada para determinar o número de esporozoitos, os esporozoitos são lavados uma vez para remover o tampão de excistação, e re-suspensos em solução salina de fosfato tamponizado à concentração desejada para injecção in ovo. Esta preparação contém esporozoitos, esporocistos e oocistos, e, sem purificação adicional, pode ser usada de acordo com o presente método de vacinação. Esporozoitos purificados, removidos a partir de esporocistos e oocistos, podem ser preparados por cromatografia de permuta aniónica DE-52 como descrito em D. M. Schmatz et al., J. Protozool. 31: 181 - 183, 1984. A dose de esporozoitos para ser usada no presente método de vacinação irá variar de acordo com o tipo de ave doméstica a ser vacinada e as espécies Eimeria a serem usadas na vacina. Em geral, a dose pode variar desde 10 a 106 esporozoitos por ovo. Preferivelmente, a dose varia desde 10 a 105 esporozoitos por ovo, e, mais preferivelmente, a dose varia desde 102 até 105 esporozoitos por ovo.

Os merozoitos podem ser preparados por vários métodos conhecidos para aqueles peritos na técnica. Num método, os esporozoitos são infectados em células de rins primárias de filhotes de aves (PCK) que cresceram em cultura como agregados celulares, usando uma modificação do método descrito em D. J. Doran, J. Parasit. 57: 891 - 900, 1971, as células PCK cresceram a 40 °C em C02 a 3% no meio modificado RK2-DMEM/F12 com L-glutamina e HEPES 15 raM, suplementado com soro bovino fetal, penicilina -estreptomicina, bicarbonato de sódio 15 mM, factor de crescimento epidermal 10 ng/ml, insulina 5 pg/ml, transferrina 5 pg/ml, ácido selenioso 5 ng/ml e hidrocortisona HC1 0,01 μΜ como descrito em S. D. Chung et .al, J. Cell Biol. 95: 118 - 126, 1982. As células PCK são preparadas a partir de rins de filhotes de aves com 2 ou 3 semanas por trituração do rim, e em seguida tratamento do tecido a 37 °C com várias mudanças de colagenese 0,2 mg/ml (vendida por Worthington Biochemical corp. Freehold, NJ) em solução salina tampomzada com fosfato. Os agregados celulares no sobrenadanle são lavados, re-suspensos em meio RK2 modificado contendo 5 % de soro bovino fetal e usados para semear balões de vidro com culturas de tecido a uma densidade de 105 agregados por cm2. As células PCK são incubadas durante 18 horas a 40 °C em 3% de CO2 e em seguida infectadas com 4 x 105 esprozoitos/cm2. As culturas infectadas são deixadas crescer em meio RK2 modificado contendo 2% de soro bovino fetal. Após 24 horas de incubação, para permitir invasão, os esporozoitos não invadidos são removidos por agitação do balão de vidro e remoção do meio de cultura. A camada celular é lavada uma vez com meio RK2 modificado contendo 2% de soro bovino fetal e o meio de cultura é novamente rejeitado. É adicionado meio RK2 fresco, e as culturas são incubadas durante outras 48 a 54 horas até que os merozoitos sejam libertados no meio de cultura. A purificação dos merozoitos para remover as células hospedeiras do entulho pode ser feita por vários métodos conhecidos para aqueles peritos na técnica. De acordo com um método, como descrito em J. A. Olson, Antimicrob. Agents Chemother. 34: 1435 - 1439, 1990, o meio de cultura contendo os merozoitos libertados é recolhido e torcido a 450 X g durante 10 minutos para concentrar os merozoitos. A pastilha contendo os merozoitos e as células hospedeiras do entulho é suspensa em albumina de soro bovino 0,1 M NaCl -0,05 M KC1 - 20% e aplicada a uma coluna de permuta aniónica DE-52 equilibrada em glucose 75 mM Tris - 40 mM NaH2PC>4 - 86 mM NaCl - 100 mM a pH 8,2. Os merozoitos fluem através da coluna. Os merozoitos recolhidos a partir da coluna podem ser testados para a sua pureza por microscopia electrónica como descrito em A. Kilejian, J. Biol. Chem. 249: 4650 - 4655, 1974. Em geral, a dose de merozoitos pode variar desde 10 até 106 merozoitos por ovo. Preferivelmente, a dose varia desde 10 até 105 merozoitos por ovo, e, mais preferivelmente, a dose varia desde 102 até 105 merozoitos por ovo. Quando são misturados esporozoitos e merozoitos, em geral, a dose compreendendo o número -12- total dc mcrozoitos c csporozoitos pode variar desde 10 até 106 por ovo. Preferivelmente, a dose varia desde 10 até 105 merozoitos e esporozoitos por ovo, e, mais preferivelmente, a dose varia desde 102 até 105 merozoitos e esporozoitos por ovo.

Os esporozoitos ou merozoitos, ou uma mistura destes, pode ser injectada in ovo em qualquer meio fisiológico adequado. Preferivelmente, são suspensos em solução salina balanceada fisiologicamente tal como solução salina tamponizada com fosfato. O meio seleccionado pode incluir opcionalmente um ou mais agentes de suspensão incluindo geis fisiologicamente adequados, gelatinas, hidrosois, celulose, ou gomas de polisacarídeos.

Preferivelmente, no presente método de vacinação, esporozoitos ou merozoitos, ou uma mistura destes, de duas ou mais espécies Eimeria são injectados in ovo ao mesmo tempo. De acordo com o presente método de vacinação, esporzoitos ou merozoitos, ou uma mistura destes, de todas as espécies identificadas de Eimeria que infectam uma ave doméstica específica, tal como uma galinha, podem ser injectadas in ovo ao mesmo tempo, ou em séries, em doses apropriadas para fornecer protecção imunológica contra todas as espécies.

Os estimulantes imunes podem ser usados em conjugação com o presente método de vacinação. Os estimulantes imunes adequados incluem, mas não estão limitados a, citoquinas, factores de crescimento, quimioquinas, sobrenadantes de culturas celulares de linfócitos, monócitos, ou células de orgãos linfóides, preparações celulares ou extractos celulares (e.g. Staphylococcus aureus) ou preparações de lipopolissacarídeos), mitogenes, ou adjuvantes incluindo farmacêuticos de baixo peso molecular. Um estimulante imune pode ser administrado in ovo em qualquer altura durante a incubação. Preferivelmente, um estimulante imune é administrado in ovo no meio contendo a dose de esporozoitos ou merozoitos Eimeria, ou de uma mistura destes. A eficácia da presente invenção na vacinação contra a coccidiose é ilustrada nos exemplos seguintes. Cada dose é injectada in ovo em solução salina fisiologicamente aceitável como descrito acima. A efectividade de uma preparação particular foi determinada através da monitorização do seu efeito na taxa de eclosão de filhotes de aves, e, seguindo a infecção indutora de uma resposta imunológica, produção de oocisto, ganho de peso, e patogenicidade (classificação de lesão). As classificações de lesão são atribuídas de acordo com o protocolo descrito em J. K. Johnson e W. M. Reid, Exp. Parasitol. 28: 30 - 36, 1970, de acordo com o qual um valor de 0 representa que não existe doença e um valor de 4 representa a patologia máxima. EXEMPLO 1

Foram injectados ovos de galinha no dia 18 de incubação com uma preparação contendo 105 esproozoitos E. tenella por ovo. A preparação não foi purificada para remover esporocistos e oocistos. Cada dose continha também aproximadamente 104 esporocistos E. tenella e aproximadamente 104 oocistos E. tenella. Como um controlo, foram injectados ovos apenas com uma solução salina tamponizada com fosfato. Na população de aves tratada com esporozoitos a cala de oocisto média a 7 dias pós-oclosão foi de 1,1 x 106 oocistos/ave. As aves não imunizadas e as aves tratadas com esporozoitos foram induzidas a uma resposta imunológica com várias doses de oocistos esporulados E. tenella, administrados por alimentação oral por sonda esofágica, nos dias 7, 4, ou 21 pós-eclosão. Os dados aparecem na Tabela 1. .**·ν

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Aves Imunizadas Versus Aves Não-Imunizadas: Respostas a Doses Indutoras de uma Resposta Imunológica Diferentes A Tempos de Pós-Eclosão Diferentes. < -w CQ <

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Os dados da Tabela 1 mostram claramcntc que aves imunizadas foram menos susceptiveis à infecção do que os seus colegas de eclosão não imunizados como indicado pelas classificações de lesão reduzidas e ganhos de peso melhorados nas aves imunizadas. Os dados demostram também que o método da invenção confere imunidade a filhotes de aves de uma relativamente tenra idade (dentro de sete dias pós-eclosão). Além disso, os dados mostram que a imunidade continua à medida que os filhotes de aves crescem e se desenvolvem. A conferição de imunidade a filhotes de aves de tenra idade fornece uma vantagem significativa na indústria de frangos assados porque os frangos para assar chegam rotineiramente ao mercado com 6 semanas de idade. EXEMPLO 2

Foram injectados ovos de galinha no dia 18 de incubação com solução salina (controlo) ou com preparações contendo doses diferentes de esporozoitos E. tenella, como indicado na Tabela 2 que fornece os resultados de pré-indução de uma resposta imunológica. A preparação de esporozoitos usada para cada dose continha 62% de esporozoitos, 9% de esporocistos, e 29% de oocistos. Cada dose contendo 105 esporozoitos inclua um total de 1,6 x 105 estádios parasitas (esporozoitos, esporocistos, e oocistos).

Efeito da Vacinação In Ovo na Taxa de Eclosão e no Peso TABELA 2

Esporozoitos injectados por ovo no dia 18 da incubação Taxa de Eclosão (%) Peso de Eclosão (gramas) 0 94 48,2 0 94 48,0 103 100 49,4 104 97 47,0 105 94 49,1 - 16-

Os dados da Tabela 2 mostram que os filhotes de aves eclodidos de ovos injectados com esporozoitos vivos eram substancialmente idênticos aos seus colegas de eclosão não imunizados em termos da taxa de eclosão e da taxa de peso. Os filhotes de aves foram em seguida sujeitos a indução de uma resposta imunológica no dia 14 pós-eclosão com 1,25 x 104 oocistos esporulados E. tenella por ave, administrados por alimentação oral por sonda esofágica. Os resultados de pós-indução de uma resposta imunológica são fornecidos na Tabela 3.

Resposta a indução de uma resposta imunológica por Infecção de Aves Não-Imunizadas Versus Aves Tratadas In Ovo Com Doses de Esporozoitos Diferentes. TABELA 3

Esporozoitos injectados por ovo no dia 18 da incubação Ganho de Peso por ave sobre o período de seis dias após a indução de uma resposta imunológica Classificação de Lesão no dia 6 após a indução de uma resposta imunológica Cala de oocistos por ave (x 106) no dia 6 após a indução de uma resposta imunológica 0 278 3,2 12,3 0 (Não induzido -controlo) 321 0 0,003* 103 289 2,6* 11,2 104 291 2,7 12,2 105 304* 1,4* 1,4*

Significativamente diferente do grupo não imunizado (recebeu solução salina) que foi sujeito a indução de uma resposta imunológica (p<0,05, ANOVA)

Os dados da Tabela 3 mostram que para cada parâmetro (ganho de peso, classificação da lesão, cala de oocisto) os filhotes de aves eclodidos de ovos - 17- injectados com doses diferentes de preparação dc esporozoitos mostraram evidência de imunidade. Em comparação com as aves de controlo que foram tratadas apenas com solução salina e foram sujeitas a indução de uma resposta imunológica por infecção, as aves imunizadas in ovo com a preparação de esporozoitos mostraram um ganho de peso superior e classificações de lesão reduzidas. Em adição, as aves imunizadas in ovo com preparação de esporozoitos expeliram menos oocistos do que as aves de controlo após a indução de uma resposta imunológica por infecção, indicando que a infecção foi menos grave nas aves imunizadas.

Lisboa, 5 de Abril de 2001

ALBERTO CAMELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de esporozoitos ou merozoitos Eimeria vivos, ou de uma mistura destes, no fabrico de uma vacina para proteger uma ave doméstica contra a coccidiose, em que uma dose efectiva imunizante é administrada in ovo durante o quarto final da incubação.
2. A utilização da reivindicação 1, em que a dose compreende 10 a 101 esporozoitos ou merozoitos, ou uma mistura destes, em que o número total dos referidos esporozoitos e merozoitos varia desde 10 a 101.
3. A utilização da reivindicação 1, em que a dose compreende 103 a 101 esporozoitos ou merozoitos, ou uma mistura destes, em que o número total dos referidos esporozoitos e merozoitos varia desde 103 a 101.
4. A utilização da reivindicação 1, em que a dose compreende 102 a 105 esporozoitos ou merozoitos, ou uma mistura destes, em que o número total dos referidos esporozoitos e merozoitos varia desde 102 a 105.
5. A utilização da reivindicação 2, em que a ave doméstica é uma galinha. 1 A utilização da reivindicação 5, em que a dose compreende esporozoitos ou merozoitos, ou uma mistura destes, de duas ou mais espécies Eimeria seleccionadas do grupo consistindo em E. tenella, E. acervulina, E. maxima. E. necatrix, E. mitis.
E. praecox, e E. brunetti.
7. A utilização da reivindicação 6, em que a dose é administrada por injecção in ovo.
8. A utilização da reivindicação 2, em que é administrado um estimulante imune in ovo em qualquer altura durante a incubação.
9. A utilização da reivindicação 8, em que um estimulante imune é administrado in ovo simultaneamente com a dose de esporozoitos ou merozoitos, ou com uma mistura dos referidos esporozoitos ou merozoitos.
10. A utilização da reivindicação 2, em que a dose compreende merozoitos.
11. A utilização da reivindicação 2, em que a dose compreende esporozoitos.
12. A utilização da reivindicação 11, em que os esporozoitos foram purificados para remover esporocistos e oocistos.
13. A utilização da reivindicação 2, em que a ave doméstica é um peru.
14. A utilização da reivindicação 13, em que a dose compreende esporozoitos ou merozoitos, ou uma mistura destes, de duas ou mais espécies Eimeria seleccionadas do grupo consistindo em E. meleagrimitis, E. adenoeides, E. gallopavonis, E. dispersa, E. meleagridis, E. innocua, e E. subrotunda. -3-
15. A utilização da reivindicação 14, em que a dose é administrada por injecção in ovo.
16. A utilização da reivindicação 2, em que a ave doméstica é uma ave de caça, pato ou ratite. Lisboa, 5 de Abril de 2001

ALBERTO CANELAS Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA V/ICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA