JP3120860B2 - コクシジウム症に対する卵内予防接種 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、コクシジウム症に対する家禽の予防接種法
に関する。特に、本発明は、コクシジウム症に対して孵
化したヒナを免疫するために、家禽の発生中（developi
ng）の卵に生きたアイメリア種（Eimelia spp）のスポ
ロゾイト又はメロゾイト又はその混合物を卵内（in ov
o）投与することに関する。

コクシジウム症は，アイメリア属の細胞内プロトゾア
寄生虫による感染によって引き起こされる家禽の腸内疾
患である。コクシジウム症は経済的に最も悲惨な家禽の
寄生虫疾患である。抗コクシジウム薬及びコクシジウム
症による損失は、家禽業者にとって毎年数億ドルにのぼ
る。

コクシジウム症に対して家禽を予防接種する様々な試
みが1950年代初期から報告されている。現在の予防接種
法は生きたアイメリアのオーシストを餌又は水を通して
家禽に投与することを含む。しかしながら、これらの方
法は全ての家禽が意図した量のオーシストを摂取するわ
けでなく、また多くの家禽がワクチンで保護されず病原
体による感染を受けるので、不便なものであり効率が悪
い。

J.M.Sharma and B.R.Burmester,Avian Dis.26:134−1
49,1981の中で、著者は、シチメンチョウヘルペスウイ
ルスを卵内予防接種したニワトリが、その後のマレック
病ウイルスによる攻撃に対する免疫を獲得したことを報
告した。ヨーロッパ特許公開第291173号では、非複製的
免疫源を投与する免疫法を卵内（in ovo）投与と呼んで
いる。このヨーロッパ特許公開で特に言及する免疫源
は、遺伝子操作されたアイメリア抗原及びアイメリアオ
ーシストの抽出物である。このヨーロッパ特許公開で
は、本発明の予防接種法で用いるような生きた寄生虫段
階のものを特に排除している。

本発明の方法は、生きたアイメリアのスポロゾイト又
はメロゾイト又はその混合物を家禽の発生中の卵に卵内
投与することを含む。現在入手可能な文献によると、こ
のような予防接種法は卵内では効果がなく、孵化後に適
用すべきであると示唆する。T.K.Jeffers and G.E.Wage
nbach,J.Parasit.56（４）:656−662,1970において、著
者は抱卵（incubation）10日目にE.テネラ（tenella）
のスポロゾイトを卵内注入したところ、その後のE.テネ
ラオーシストによる攻撃に対して有意な免疫保護を与え
なかったと報告した。実際、処置を受けなかったニワト
リは、スポロゾイトで卵内処置したニワトリよりも、そ
の後のE.テネラオーシストによる攻撃に対して生存率が
高かったと、報告した。K.L.Watkins et al.,Proc.VI t
h.International Coccidiosis Conf.,Abstract E1−2,O
ntario,Canada,1993において著者は、生きたE.マクシマ
（maxima）のスポロシストとスポロゾイト形成したオー
シストを卵内接種したことを記載し、彼らの研究による
と、卵内暴露によっては、孵化10日後にE.マクシマオー
シストでコクシジウム攻撃したことに対して保護された
と示す証拠は得られなかったと報告した。Watkinsらは
さらに、卵内よりもむしろ孵化直後に接種すると有意な
免疫保護が得られると結論した。この教示に反して、本
発明の卵内予防接種法は、孵化したトリをその後のコク
シジウム攻撃に対して保護する予期せぬ免疫を与える。

発明の概略 本発明は、“本予防接種法”と呼ぶこともあり、有効
な免疫量の生きたアイメリアスポロゾイト又はメロゾイ
ト又はその混合物を抱卵の最後の４分の１の期間内に卵
内投与することを含んでなる、コクシジウム症に対して
家禽を予防接種する方法に関する。

本明細書で用いる“家禽”という用語は、特記しない
限り、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、狩猟鳥（ウ
ズラ、キジ及びガチョウを含むが、これに限定されな
い）及び走鳥類（ダチョウを含むが、これに限定されな
い）を含む。

本明細書で用いる“卵内（in ovo）”という用語は、
特記しない限り、生きた発生中の胚を含む家禽の卵内
へ、ということを意味する。

本明細書で用いる“卵内へ投与する”又は“卵内投
与”という用語は、特記しない限り、ここに記載するワ
クチンを生きた発生中の胚を含む家禽の卵に、卵の殻を
貫通してワクチンを導入するあらゆる手段によって投与
することを意味する。このような投与手段にはワクチン
注入を含むが、これに限定されない。

本明細書で用いる“抱卵の最後の４分の１の期間”と
いう用語は、特記しない限り、家禽の発生中の卵の抱卵
の最後の４分の１の期間を意味する。

本明細書で用いる“アイメリア”という用語は、特記
しない限り、家禽に感染するアイメリア属の１以上の種
を意味する。このようなアイメリア種には、E.テネラ、
E.アセルブリナ（acervulina）、E.マクシマ、E.ネカト
リックス（necatrix）、E.ミティス（mitis）、E.プレ
コックス（praecox）及びE.ブルネッティ（brunetti）
を含むニワトリに見られるもの、及びE.マレアグリミテ
ィス（maleagrimitis）、E.アデノエイデス（adenoeide
s）、E.ガロパボニス（gallopavonis）、E.ディスペル
サ（dispersa）、E.メレアグリディス（meleagridi
s）、E.イノキュア（innocua）及びE.スブロツンダ（su
brotunda）を含むシチメンチョウに見られるもの、並び
に上述したその他の家禽を感染するアイメリア種も含
む。“アイメリア”という用語はまた、アイメリアの上
述した種の全ての株を含み、放射線照射されたりその他
の処理を施されて完全に発達しないような株を含む早熟
株及び弱毒株を含むが、これに限定されない。アイメリ
アという用語は、上述した家禽に感染するアイメリアの
新しく発見された株又は種も含む。

本明細書で用いる“スポロゾイト”、“スポロシス
ト”、“オーシスト”及び“メロゾイト”という用語
は、特記しない限り、生きたアイメリアのスポロゾイ
ト、スポロシスト、オーシスト及びメロゾイトを意味す
る。

本明細書で用いる“有効免疫量”という用語は、特記
しない限り、免疫されていないトリの固有の免疫力より
も大きな免疫保護を孵化したトリに与えるのに十分なス
ポロゾイト又はメロゾイトの数、又は混合する場合には
スポロゾイトとメロゾイトの合計数を意味する。本明細
書で用いる“免疫する”及び“予防接種する”という用
語は同義語であり、互換的に用いられる。

本発明の方法により投与する好ましい投与量は、10−
10⁶スポロゾイト又はメロゾイト又はその混合物であ
り、この場合スポロゾイトとメロゾイトの合計数が10−
10⁶である。

より好ましい投与量は、10³−10⁶スポロゾイト又はメ
ロゾイト又はその混合物であり、この倍スポロゾイトと
メロゾイトの合計数が10³−10⁶である。

別の好ましい投与量は、10²−10⁵スポロゾイト又はメ
ロゾイト又はその混合物であり、この場合スポロゾイト
とメロゾイトの合計数が10²−10⁵である。

本発明の方法により予防接種する好ましい家禽はニワ
トリである。

ニワトリ卵に卵内投与する好ましい投与量は、E.テネ
ラ、E.アセルブリナ、E.マクシマ、E.ネカトリックス、
E.ミティス、E.プレコックス及びE.ブルネッティからな
る群より選択される２以上のアイメリア種のスポロゾイ
ト又はメロゾイト又はその混合物を含む。投与量は好ま
しくは、投与量に含まれる各種について10−10⁶のスポ
ロゾイト又はメロゾイト又はその混合物である。

本発明の方法により予防接種する別の好ましい家禽は
シチメンチョウである。

シチメンチョウ卵に卵内投与する好ましい投与量は、
E.マレアグリミティス、E.アデノエイデス、E.ガロパボ
ニス、E.ディスペルサ、E.メレアグリディス、E.イノキ
ュア及びE.スブロツンダからなる群より選択される２以
上のアイメリア種のスポロゾイト又はメロゾイト又はそ
の混合物を含む。投与量は好ましくは、投与量に含まれ
る各種について10−10⁶のスポロゾイト又はメロゾイト
又はその混合物である。

本発明の方法により予防接種する別の好ましい家禽は
狩猟鳥、アヒル及び走鳥類である。

本発明の方法はさらに、本発明の予防接種法と組み合
わせて、抱卵中のいずれかの時点において免疫刺激剤を
卵中投与することを含む。

免疫刺激剤を投与する好ましい方法は、抱卵の最後の
４分の１の期間内にスポロゾイト又はメロゾイト又はス
ポロゾイトとメロゾイトの混合物の一定投与量を卵内投
与するのと同時に行う。

発明の詳細な説明 本発明の予防接種法は、生きたアイメリアスポロゾイ
ト又はメロゾイト又はその混合物を抱卵の最後の４分の
１の期間内に家禽の卵に卵内投与することを含む。ニワ
トリの場合、卵内投与は好ましくは抱卵の15−20日目
に、より好ましくは抱卵の18日目に行う。シチメンチョ
ウの場合、卵内投与は好ましくは抱卵の21−26日目に行
う。

本発明の予防接種法はいかなる適切な卵内投与方法を
用いて行ってもよい。好ましくは、本発明のワクチンは
注入によって投与する。注入の１方法によると、18ゲー
ジの針を用いて卵の大きい方の末端の卵殻に穴をあけて
卵の気胞を露出する。適切なサイズ（１−3ml）のシリ
ンジをつけた1.0−1.5インチの22ゲージの針を穴及び気
胞の膜を通して挿入する。適切な数のスポロゾイト又は
メロゾイト又は混合する場合には適切な数のスポロゾイ
トとメロゾイトを適切な液体担体、例えばリン酸緩衝塩
液10−500μｌに懸濁して卵に注入する。適切な容量は
処置する卵のサイズに依存し、ダチョウの卵ではニワト
リの卵よりも明らかに多くの容量を要するであろう。注
入部位は卵又は胚のいかなる領域であってもよい。好ま
しくは、注入は卵の大きい方の末端の中心から軸方向に
羊膜内に行う。

あるいは、本発明の予防接種法では自動卵注入システ
ムを用いることもできる。このようなシステムは米国特
許第4,681,063号、4,040,388号、4,469,047号、及び4,5
93,646号に記載されており、これらを参照としてここに
援用する。その他の適切な注入法も当業者には公知であ
る。

オーシストは当業者に公知のいくつかの方法によって
調製できる。このような方法には、J.F.Ryley et al.,P
arasitology 73:311−326,1976及びP.L.Long et al.,Fo
lia Veterinaria Latina VI＃3,201−217,1976に記載さ
れており、これらを参照としてここに援用する。１つの
方法によると、薬２週齢の市販のブロイラーニワトリ
に、適切な投与量のスポロゾイト形成したオーシストを
経口で強制餌養させることにより興味のあるアイメリア
種で感染する。例えば、E.テネラで用いた典型的な投与
量は、トリ１羽当たり200,000スポロゾイト形成したオ
ーシストである。感染したトリからオーシストを回収及
び精製する公知の方法を次に行う。ほとんどのアイメリ
ア種では、感染の５−７日後に感染したトリから糞を回
収し、混合して濾過することによりカスを除き、残渣の
糞物質をペレットにするのに十分な速度で遠心する。E.
テネラでは、感染６日目に盲腸コアを取り出す点を除
き、同様の方法を用いる。ペレットを飽和塩溶液に再懸
濁すると、オーシストは浮遊し、ほとんどの汚染カスは
遠心により除去できる。次いでオーシスト懸濁液を希釈
して低塩濃度にする。オーシストを繰り返し洗浄して塩
を除去し、重クロム酸カリウム溶液（2.5％w/v）に再懸
濁する。オーシスト懸濁液を震盪（例えば140rpm）しな
がら約72時間29℃でインキュベートし、オーシストのス
ポロゾイト形成を誘導する。あるいは、オーシストを次
亜塩素酸ナトリウムで処理した後スポロゾイト形成する
こともできる。血球計数器を用いて1ml当たりのスポロ
ゾイト形成したオーシストの数を直接計数し、培養液を
好ましくは必要時まで冷蔵で保存する。

スポロシストを調製するには、オーシストを繰り返し
洗浄することにより上述のオーシスト懸濁液から重クロ
ム酸カリウムを除去し、これには遠心によるオーシスト
の回収と脱イオン水又は蒸留水への再懸濁を含む。黄橙
色が消えることによって判断して、重クロム酸カリウム
が除去されたら、オーシスト懸濁液を等容量の次亜塩素
酸ナトリウム（ブリーチ）と混合して室温で15分インキ
ュベートする。次いで繰り返し洗浄してブリーチを除去
し、オーシストを生理食塩水又は脱イオン水に再懸濁す
る。種々の公知の方法を用いて、オーシストを壊してス
ポロシストを放出させる。例えば、１−4mm直径のガラ
スビーズとオーシストを混合して手、ボルテックスミキ
サー又は震盪培養器で震盪するか、あるいは手でもつホ
モジェナイザーを用いてオーシストを壊してスポロシス
トを放出させる。放出されたスポロシストから、壊れな
かったオーシスト及びオーシスト壁を、Dulski et al.,
Avian Diseases,32:235−239,1988に記載するように、5
0％Percoll^TM（Pharmacia Biotechから販売）又は1Mス
クロース中で分別遠心することにより分離できる。

本発明で使用するスポロゾイト又はスポロゾイトに富
む調製物を調製するには、上述のスポロシスト調製物か
らスポロゾイトを脱嚢させる。１つの方法では、上述の
ように調製したスポロシストを遠心によってペレットに
し、脱嚢バッファー（リン酸緩衝塩溶液pH8.0中の0.5％
タウロデオキシリコン酸及び0.25％トリプシン）中に再
懸濁し、41℃で１時間震盪しながらインキュベートす
る。得られる懸濁液サンプルを計数してスポロゾイト数
を決定し、スポロゾイトを１回洗浄して脱嚢バッファー
を除去し、卵内注入に用いる所望の濃度でリン酸緩衝塩
溶液中に再懸濁する。この調製物はスポロゾイト、スポ
ロシスト及びオーシストを含み、さらに精製することな
く、本発明の予防接種法に用いることができる。スポロ
シスト及びオーシストを除去した精製スポロゾイトは、
D.M.Schmatz et al.,J.Protozool.31:181−183,1984
（参照としてここに援用する）に記載するように、DE−
52アニオン交換クロマトグラフィーにより調製できる。
本発明の予防接種法に用いるスポロゾイトの投与量は、
予防接種する家禽の種類及びワクチンに用いるアイメリ
ア種により変更する。一般に、投与量は卵１個当たり10
−10⁶スポロゾイトの範囲でありうる。好ましくは投与
量範囲は、卵１個当たり10−10⁵スポロゾイトであり、
より好ましくは投与量範囲は、卵１個当たり10²−10⁵ス
ポロゾイトである。

メロゾイトは当業者に公知の種々の方法によって調製
できる。１つの方法では、D.J.Doran,J.Parasit.57:891
−900,1971（参照としてここに援用する）に記載の方法
を修飾して、細胞凝集物として培養で生育させた一次ヒ
ナ腎臓細胞（PCK）中にスポロゾイトを感染させる。S.
D.Chung et al.,J.Cell Biol.95:118−126,1982に記載
するように、ウシ胎児血清、ペニシリン−ストレプトマ
イシン、15mM炭酸水素ナトリウム、10ng/ml上皮成長因
子、５μg/mlインシュリン、５μg/mlトランスフェリ
ン、5ng/ml亜セレン酸及び0.01μＭ塩酸ヒドロコルチゾ
ンを補充した、Ｌ−グルタミン及び15mM HEPES含有の
修飾RK2培地−DMEM/F12中で、３％CO₂中、40℃でPCK細
胞を生育する。PCK細胞は、２−３週齢のヒナ腎臓か
ら、腎臓を刻み、リン酸緩衝塩溶液中の0.2mg/mlコラゲ
ナーゼ（Worthington Biochemical Corp.,Freehold,NJ
から販売）を数回代えながら37℃で組織を処理すること
により調製される。懸濁液中の細胞凝集物を洗浄し、５
％ウシ胎児血清を含む修飾RK2培地に再懸濁し、1cm²当
たり10⁵凝集物の密度でフラスコ中に組織培養物を接種
する。PCK細胞を３％CO₂中、40℃で18時間インキュベー
トし、次に4x10⁵スポロゾイト/cm²で感染する。感染し
た培養物を２％ウシ胎児血清を含む修飾PK2培地で生育
する。浸潤させるために、インキュベーション24時間後
に、フラスコを撹拌して培地を除去することによって非
浸潤スポロゾイトを除去する。細胞層を２％ウシ胎児血
清を含む修飾RK2培地で１回洗浄し、培地を再度捨て
る。新しいRK2培地を加えて、メロゾイトが培地に放出
されるまで、培養物をさらに48−54時間インキュベート
する。

宿主の細胞カスを除去するためのメロゾイト精製は、
当業者に公知の種々の方法によって行うことができる。
J.A.Olson,Antimicrob.Agents Chemother.34:1435−143
9,1990に記載の１つの方法によると、放出されたメロゾ
イトを含む培地を回収して450xgで10分遠心してメロゾ
イトを濃縮する。メロゾイトと宿主細胞カスを含むペレ
ットを0.1M NaCl−0.05M KCl−20％ウシ血清アルブミ
ンに懸濁し、75mM Tris−40mM NaH₂PO₄−86mM NaCl
−100mMグルコース、pH8.2で平衡化したDE−52アニオン
交換カラムにかける。メロゾイトはカラムを通って流出
する。カラムから回収したメロゾイトをA.Kilejian,J.B
iol.Chem.249:4650−4655,1974に記載のように、電子顕
微鏡で純度を試験する。一般に、メロゾイトの投与量は
卵１個当たり10−10⁶メロゾイトの範囲でありうる。好
ましくは投与量範囲は、卵１個当たり10−10⁵メロゾイ
トであり、より好ましくは投与量範囲は、卵１個当たり
10²−10⁵メロゾイトである。スポロゾイトとメロゾイト
を混合する場合には、一般に、メロゾイトとスポロゾイ
トの合計数からなる投与量は卵１個当たり10−10⁶の範
囲でありうる。好ましくは投与量範囲は、卵１個当たり
10−10⁵メロゾイト及びスポロゾイトであり、より好ま
しくは投与量範囲は、卵１個当たり10²−10⁵メロゾイト
及びスポロゾイトである。

スポロゾイト又はメロゾイト又はその混合物はいかな
る生理学的に適当な溶媒中で卵内注入してもよい。好ま
しくは、リン酸緩衝塩溶液のような生理学的にバランス
のとれた塩溶液中に懸濁する。選択した溶媒は、場合に
より生理学的に適当なゲル、ゼラチン、ヒドロゾル、セ
ルロース又は多糖ガムを含む１以上の懸濁剤を含んでい
てもよい。

好ましくは、本発明の予防接種法では、２以上のアイ
メリア種のスポロゾイト又はメロゾイト又はその混合物
を同時に卵中注入する。本発明の予防接種法では、ニワ
トリのような特定の家禽を感染する全ての同定されたア
イメリア種のスポロゾイト又はメロゾイト又はその混合
物を、全ての種に対する免疫学的保護を与えるための適
当な投与量で同時に又は連続して卵中注入することがで
きる。

本発明の予防接種法と組み合わせて免疫刺激剤を用い
ることができる。適当な免疫刺激剤には、サイトカイ
ン、成長因子、ケモカイン、リンパ球の細胞培養物の上
清、単球、又はリンパ球器官由来の細胞、細胞調製物又
は細胞抽出物（例えば、Staphylococcus aureus又はリ
ボ多糖調製物）、マイトジェン、又は低分子量医薬を含
むアジュバントを含むが、これに限定されない。免疫刺
激剤は抱卵中のいかなる時点で卵内投与してもよい。好
ましくは、免疫刺激剤は投与量のアイメリアスポロゾイ
ト又はメロゾイト又はその混合物を含む溶媒中で卵内投
与する。

コクシジウム症に対する予防接種における本発明の効
果を以下の実施例によって示す。各投与量は上述の生理
学的に受容できる塩溶液で卵内注入した。特定調製物の
有効性は、ヒナの孵化率及び孵化体重をモニターし、ま
た攻撃感染の後のオーシストの産生、体重増加及び病原
性（病変スコア）によって決定した。病変スコアは、J.
K.Johnson and W.M.Reid,Exp.Parasitol.28:30−36,197
0に記載のプロトコルに従って割り振り、ここでは０は
疾患なしを表し、４は最大病変を表す。

実施例１ 抱卵18日目にニワトリ卵に、卵１個当たり10⁵のE.テ
ネラススポロゾイトを含む調製物を注入した。この調製
物はスポロシスト及びオーシストを除去するための精製
を行わなかった。各投与量には、約10⁴のE.テネラスポ
ロシストと約10⁴のE.テネラオーシストも含んでいた。
対照として、リン酸緩衝塩溶液のみを卵に注入した。ス
ポロゾイト処理したトリ集団では、孵化７日目に落屑し
た平均オーシストはトリ１羽当たり1.1x10⁶オーシスト
であった。免疫しないトリ及びスポロゾイト処理したト
リを種々の投与量のE.テネラのスポロゾイト形成したオ
ーシストで、孵化７、14又は21日目に経口強制餌養によ
り投与して攻撃した。

データを表１に示す。

表１のデータは、免疫したトリにおける病変スコアの
減少と体重増加の改善によって示されるように、免疫し
たトリは免疫しないヒナよりも感染に対する感受性が低
かったことを明瞭に示す。このデータはまた、本発明の
方法が比較的早期年齢（孵化後７日以内）にヒナに免疫
を付与することを示す。さらに、このデータは、ヒナが
成長、発達しても免疫が続くことを示す。普通ブロイラ
ーは６週齢で市場にでるので、早期年齢がヒナに免疫を
付与できることは、ブロイラーニワトリ業界に顕著な利
点を提供する。

実施例２ ニワトリ卵に抱卵18日目に、食塩水（対照）又は種々
の投与量のE.テネラのスポロゾイトを含む調製物を注入
し、表２に示すように攻撃前の結果を与えた。各投与量
で用いたスポロゾイト調製物は62％スポロゾイト、９％
スポロシスト、及び29％オーシストを含んでいた。10⁵
のスポロゾイトを含む各投与量は合計で1.6x10⁵の寄生
虫段階（スポロゾイト、スポロシスト及びオーシスト）
を含んでいた。

表２に示すデータは、生きたスポロゾイトを注入した
卵から孵化したヒナは、孵化率及び孵化体重の点では免
疫しない孵化ヒナと実質的に同じであったことを示す。
次に孵化14日目にヒナにトリ１羽当たり1.25x10⁴のスポ
ロゾイト形成したオーシストを経口強制餌養投与により
攻撃した。攻撃後の結果を表３に示す。

表３に示すデータは、全てのパラメーター（体重増
加、病変スコア、オーシスト落屑）で、種々の投与量の
スポロゾイト調製物を注入した卵から孵化したヒナが免
疫された証拠を示す。食塩水のみで処置されて攻撃感染
を付与された対照のトリと比較して、スポロゾイト調製
物で卵内免疫されたトリはより大きな体重増加と減少し
た病変スコアを示した。さらに、スポロゾイト調製物で
卵内免疫したトリは攻撃感染後に対照のトリよりも少な
いオーシストを落屑し、これは免疫したトリにおける感
染がより重症でないことを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ウェーバー，フレデリック・エイチ アメリカ合衆国インディアナ州47803, テレ・ホート，フェニックス・コート 159 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61K 39/012 A61P 33/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ) ＣＡＰＬＵＳ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ)

Claims (16)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】有効な免疫量の生きたアイメリアスポロゾ
   イト又はメロゾイト又はその混合物を抱卵の最後の４分
   の１の期間内に卵内投与することを含んでなる、コクシ
   ジウム症に対して家禽を予防接種する方法。
2. 【請求項２】投与量が10−10⁶のスポロゾイト又はメロ
   ゾイト又はその混合物を含み、ここでスポロゾイト及び
   メロゾイトの合計数が10−10⁶の範囲である請求項１記
   載の方法。
3. 【請求項３】投与量が10³−10⁶のスポロゾイト又はメロ
   ゾイト又はその混合物を含み、ここでスポロゾイト及び
   メロゾイトの合計数が10³−10⁶の範囲である請求項１記
   載の方法。
4. 【請求項４】投与量が10²−10⁵のスポロゾイト又はメロ
   ゾイト又はその混合物を含み、ここでスポロゾイト及び
   メロゾイトの合計数が10²−10⁵の範囲である請求項１記
   載の方法。
5. 【請求項５】家禽がニワトリである請求項２記載の方
   法。
6. 【請求項６】投与量がアイメリア・テネラ（E.tenell
   a）、アイメリア・アセルブリナ（E.acervulina）、ア
   イメリア・マクシマ（E.maxima）、アイメリア・ネカト
   リックス（E.necatrix）、アイメリア・ミティス（E.mi
   tis）、アイメリア・プレコックス（E.praecox）及びア
   イメリア・ブルネッティ（E.brunetti）からなる群より
   選択される２以上のアイメリア種のスポロゾイト又はメ
   ロゾイト又はその混合物を含む請求項５記載の方法。
7. 【請求項７】投与量を卵内注入によって投与する請求項
   ６記載の方法。
8. 【請求項８】抱卵のいずれかの時点において免疫刺激剤
   を卵内投与することをさらに含んでなる請求項２記載の
   方法。
9. 【請求項９】免疫刺激剤を投与量のスポロゾイト又はメ
   ロゾイト又はスポロゾイト及びメロゾイトの混合物と同
   時に卵内投与する請求項８記載の方法。
10. 【請求項１０】投与量がメロゾイトを含んでなる請求項
    ２記載の方法。
11. 【請求項１１】投与量がスポロゾイトを含んでなる請求
    項２記載の方法。
12. 【請求項１２】スポロゾイトがスポロシスト及びオーシ
    ストを除去するように予め精製されている精製11記載の
    方法。
13. 【請求項１３】家禽がシチメンチョウである請求項２記
    載の方法。
14. 【請求項１４】投与量がアイメリア・メレアグリミティ
    ス（E.meleagrimitis）、アイメリア・アデノエイデス
    （E.adenoeides）、アイメリア・ガロパボニス（E.gall
    opagonis）、アイメリア・ディスペルサ（E.dispers
    a）、アイメリア・メレアグリディス（E.meleagridi
    s）、アイメリア・イノキュア（E.innocua）及びアイメ
    リア・スブロツンダ（E.subrotunda）からなる群より選
    択される２以上のアイメリア種のスポロゾイト又はメロ
    ゾイト又はその混合物を含む請求項13記載の方法。
15. 【請求項１５】投与量を卵内注入により投与する請求項
    14記載の方法。
16. 【請求項１６】家禽が狩猟鳥、アヒル又は走鳥類である
    請求項２記載の方法。