BG63035B1

BG63035B1 - Ваксиниране in оvо срещу кокцидиоза

Info

Publication number: BG63035B1
Application number: BG100642A
Authority: BG
Inventors: Nigel Evans; R. Findly; Frederick Weber
Original assignee: Pfizer Inc.
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-05
Publication date: 2001-02-28
Also published as: MX9709868A; ATE200029T1; DZ2048A1; CO4440630A1; PL184002B1; MY121973A; RO113716B1; FI974439A0; AU5478296A; TW430558B; HU223707B1; JP3120860B2; CZ164396A3; CN1145168A; NZ286754A; EP0831897A1; ES2155129T3; IL118490A0; SK282004B6; GR3035938T3

Abstract

Изобретението се отнася до метод за ваксиниране на домашни птици срещу кокцидиоза, състоящ се в прилагане in ovo (в яйцето) на ефективна имунизираща доза от живи Eimeria спорозоити или мерозоити или на смес от тях. В един предпочитан вариант на изобретението домашните птици са пилета или пуйки.

Description

Област на техниката

Изобретението се отнася до метод за ваксиниране на домашни птици срещу кокцидиоза. По-специално изобретението се отнася до прилагане in ovo (в яйцето) на живи Eimeria spp. спорозоити или мерозоити, или смеси от тях, в яйца на домашни птици в процес на мътене, за да се имунизират новоизлюпените пилета срещу кокцидиоза.

Кокцидиозата е чревно заболяване на домашните птици, причинено чрез инфекция с вътреклетъчни протозоини паразити от рода Eimeria. Кокцидиозата е икономически найопустошителното паразитно заболяване при домашните птици. Установено е, че лекарствените средства срещу кокцидиозата и загубите от кокцидиоза струват на птицевъдната индустрия хиляди милиони долари всяка година.

Предшестващо състояние на техниката

В началото на 1950-те години е докладвано за предприемането на различни опити за ваксиниране на домашните птици срещу кокцидиоза. Известните методи за ваксиниране включват прилагане на живи Eimeria ооцисти на птици през храната или водата. Тези методи обаче са неудобни и неефективни, поради това, че не всички птици получават от предвидената доза ооцисти и много от тях остават или незащитени от ваксината, или получават патогенна инфекция.

J.M. Sharma и B.R.Burmester, Avian Dis 26: 134-149, 1981 докладват, че пилета, ваксинирани in ovo (в яйцето) с херпесвирус на пуйка, развиват имунитет срещу последваща заплаха от зараза с болестотворен вирус на Marek. В патентна публикация на ЕР 291173 е описан процес на имунизация, при който нерепликиращ имуноген се прилага в яйцето. Имуногените, описани в посочения патент, са генетично третирани Eimeria антиген и Eimeria ооцистен екстракт. Европейският патент поспециално изключва живи паразитни стадии, като тези, използвани в метода на ваксиниране съгласно изобретението.

Методът на ваксиниране съгласно изобретението включва прилагане in ovo (в яйце то) на живи Eimeria спорозоити или мерозоити, или смес от тях, в яйца на домашни птици в процес на мътене.

В достъпната литература се посочва, че такъв метод на ваксиниране няма да е ефективен, приложен in ovo, и трябва да се прилага след излюпването. J.U. Jeffers и G.E.Wagenbach, J.Parasit., 56(4): 656-662, 1970, докладват, че инжектиране in ovo на E.tenella спорозоити на 10 ден от инкубацията не дава достатъчна имунологична защита срещу последваща заплаха от зараза с E.tenella ооцисти. Фактически те докладват, че пилетата, които не са били третирани, имат по-голям процент на преживяване при последваща заплаха от зараза с E.tenella ооцисти, отколкото пилетата, които са били третирани in ovo със спорозоити. K.L. Watkins et al., Proc. VI th. Jntemational Coccidiosis Cont., Abstract El-2, Ontario, Canada, 1993, описват инокулиране in ovo c живи E.maxima cnopoцисти и споролирали ооцисти и установяват, че тяхното изследване не доказва, че прилагането in ovo дава защита срещу последваща заплаха от кокцидиозни E.maxima ооцисти 10 дни след излюпването. Watkins et al., по-нататък установяват, че значителна имунологична защита се осигурява, ако инокулирането се извърши веднага след излюпването, вместо в яйцето. Обратно на известното твърдение, методът на ваксиниране in ovo съгласно изобретението осигурява имунитет, който защитава излюпените птици срещу последваща заплаха от кокцидиоза.

Техническа същност на изобретението

Изобретението се отнася до метод за ваксиниране на домашни птици срещу кокцидиоза, състоящ се в прилагане in ovo през време на последната четвърт от периода на инкубиране на ефективна имунизираща доза от живи Eimeria спорозоити или мерозоити, или смеси от тях.

Терминът “домашни птици”, използван тук, освен ако не е посочено друго, включва пилета, пуйки, патици, диви птици, включително, но без да се ограничават до тях, пътпъдъци, фазани и гъски, и ратити, птици с плоска гръдна кост, включително, но без да се ограничава до тях, щрауси.

Терминът “in ovo” (в яйцето), използван тук, освен ако не е посочено друго, озна чава в процес на мътене на птиче яйце, съдържащо жив, развиващ се зародиш.

Терминът “прилагане in ovo” или “in ovo прилагане” използван тук, освен ако не е посочено друго, означава прилагане на ваксина съгласно изобретението в мътещото се птиче яйце, съдържащо жив, развиващ се зародиш, с всяко подходящо средство, позволяващо проникване и въвеждане на ваксината през черупката на яйцето. Такива средства за приложение включват, без ограничение, инжектиране на ваксината.

Терминът “последната четвърт от периода на инкубиране”, използван тук, освен ако не е посочено друго, означава последната четвърт от времето на инкубиране на развиването на яйцето при мътенето.

Терминът “Eimeria”, използван тук, освен ако не е посочено друго, означава един или повече видове от рода Eimeria, които заразяват домашните птици. Такива видове Eimeria включват тези, които са намерени в пилетата, включително E.tenella, E.acervulina, Е.maxima, E.necatrix, Е. mitis, Е.ргаесох и E.brunetti, и също така намерените в пуйки, включитлно E.meleagrimitis, E.adenoeides, Е. gallopavonis, E.dispersa, E.maleagridis, E.innocue и E.subrotunde, както и други видове Eimeria, които заразяват други домашни птици от посочените по-горе видове. Терминът “Eimeria” също така включва всички щамове от цитираните видове на Eimeria, включително, без ограничения, предварително развити щамове и атенюирани щамове, които включват предварително облъчени или третирани по друг начин щамове, така че те да не могат да се развият цялостно. Терминът “Eimeria” също така включва всички новооткрити щамове или видове на Eimeria, които заразяват домашните птици, както са дефинирани по-горе.

Терминът “спорозоити”, “спороцисти”, “ооцисти” и “мерозоити”, използвани съгласно изобретението, освен ако не е посочено друго, означават живи Eimeria спорозити, спороцисти, ооцисти и мерозоити.

Терминът “ефективна имунизираща доза”, използван тук, освен ако не е посочено друго, означава броя на спорозоити или мерозоити, или когато са смесени количествата на спорозоите и мерозоитите, достатъчни, за да се осигури имунна защита на излюпващите се птици, която защита е по-голяма от наследе ния имунитет на неимунизираните птици. Както се използват тук, термините “имунизиране” и “ваксиниране” са синоними и са взаимозаменяеми.

Предпочитана доза за приложение съгласно метода от изобретението включва от 10 до 10⁶ спорозоити или мерозоити, или когато са смесени, общият брой на спорозоитите и мерозоитите да е приблизително от 10 до 10‘.

Повече се предпочита доза от 10³ до 10⁶спорозоити или мерозоити, или когато са смесени, общият брой на спорозоитите и мерозоитите да е приблизително от 10³ до 10⁶.

Друга предпочитана доза е от 10² до 10³спорозоити или мерозоити, или когато са смесени, общият брой на спорозоитите и мерозоитите да е приблизително от 10² до 10⁵.

Предпочитани домашни птици за ваксиниране съгласно метода от изобретението са пилетата.

Предпочитана доза за приложение в яйце на кокошка се състои от спорозоити или мерозоити, или смес от тях, на два или повече вида Eimeria, подбрани от група, състояща се от E.tenella, E.acervulina, E.maxima, E.necatrix, E.mitis, Е.ргаесох и E.brinetti. Дозата за предпочитане е от 10 до 10⁶ спорозоити или мерозоити, или смес от тях, за всеки от видовете, включени в тази доза.

Друга предпочитана домашна птица за ваксиниране съгласно метода от изобретението са пуйките.

Предпочитана доза за приложение в яйцето на пуйка се състои от спорозоити или мерозоити, или смес от тях, на два или повече вида Eimeria, подбрани от групата, състояща се от E.meleagrimitis, E.adenoeides, E.gallopavoris, E.dispersa, E.maleagridis, E.innocue и E.subrotunde. Предпочитаната доза е от 10 до 10⁶ спорозоити или мерозоити, или смес от тях, за всеки вид, включен в тази доза.

Други предпочитани птици, които могат да се ваксинират съгласно изобретението, са диви птици, патици и птици с плоска гръдна кост.

Методът съгласно изобретението включва комбинация на ваксиниране съгласно изобретението с добавен имунен стимулант, прилагани в яйцето по всяко време на инкубирането.

Предпочитан метод на приложение включва приложение на имунния стимулант in ovo едновременно с дозата от спорозоити или мерозоити, или смес от тях през последната четвърт от инкубационния период.

Настоящият метод на ваксиниране включва прилагане in ovo (в яйцето) през време на последната четвърт от инкубационния период на живи Eimeria спорозоити или мерозоити, или смеси от тях в яйца на домашни птици. При пилета се предпочита приложението в яйцето да се извърши между 15 и 20 ден от инкубирането и най-добре на 18 ден от инкубирането. При пуйки се предпочита приложението в яйцето да се осъществи между 21 и 26 ден от инкубирането.

Настоящият метод на ваксиниране може да се извърши, като се използва всеки подходящ начин за прилагане in ovo. Предпочита се настоящият метод на ваксиниране да се проведе чрез инжектиране. Съгласно един метод на инжектиране се прави дупка в черупката на яйцето откъм тъпия му край, като се използва игла с размер 18, за да се открие въздушната камера в яйцето. Игла 1,0-1,5 инча с размер 22 се прикрепва към спринцовка с подходящ размер (1-3 ml), като може да се постави през дупката и през мембраната на въздушната камера. Подходящ брой спорозоити или мерозоити или ако са смесени - подходящ брой от спорозоити и мерозоити, се суспендират в подходящ течен носител, например 10-500 μΐ от буфериран с фосфат физиологичен разтвор и след това се инжектира в яйцето. Подходящият обем зависи от размера на яйцето, което ще се третира, като яйце на шраус очевидно ще могат да поемат по-голям обем в сравнение с този на яйца на кокошка. Местоположението на инжекцията може да бъде в която и да е област на яйцето или на ембриона. Предпочита се инжектирането да се извърши аксиално през центъра на тъпата част на яйцето в амниона (обвивката на зародиша).

Алтернативно, автоматизирана система за инжектиране в яйцето може да се използва по метода на ваксиране съгласно изобретението. Такива системи са описани в патенти на US 4 681 063, 4 040 388, 4 469 047 и 4 593 646, които са включени в литературата. Известни са и други подходящи методи.

Ооцисти могат да се получат по всеки от известните методи, по-специално описаните от J.F.Ryley et al., Parasitology 73:311-326, 1976 и P.LLong et al., Folia Veterinaria Latina VI#3,

201-217, 1976, които са включени в литературата. Съгласно един метод търговски бройлерни пилета на възраст приблизително 2 седмици, се заразяват с Eimera видове, представляващи интерес, чрез даване през устата на подходяща доза от спорулирали ооцисти. Например типична доза от използваните E.tenella е 200 000 спорулирали ооцисти/птица. След това се работи по известни методи за събиране и пречистване на ооцистите от заразните птици. За повечето видове Eimeria се събират фекалиите от заразени птици 5-7 дни след заразяването, смесват се и се филтруват, за да се отстранят едрите парчета, след това се центрофугират със скорост, достатъчна да се получи утайка от останалия фекалиен материал. За E.tenella се използва подобен метод, с изключение на това, че се взимат цекални (от сляпото черво) вътрешности на 6 ден след заразяването. Утайката се суспендира отново в наситен солев разтвор, в който ооцистите плуват, а повечето от замърсяващите отломки могат да се отстранят чрез центрофугиране. Ооцистната суспензия след това се разрежда пониска концентрация на соли. Ооцистите се промиват многократно, за да се отстрани солта, и се суспендират отново в разтвор на калиев бихромат (2,5% т/о). Ооцистната суспензия се инкубира при 29°С с разклащане (например 140 об./min) в продължение на приблизително 72 h, за да се предизвика спорулация на ооцистите. Алтернативно ооцистите могат да се третират с натриев хипохлорид и след това да се спорулират. Броят на спорулиралите ооцисти в ml се определя чрез директно преброяване, като се използва хемоцитометьр, и културата се съхранява до употребата й, за предпочитане при охлаждане.

За приготвянето на спороцисти калиевият бихромат се отстранява от ооцистната суспенция, описана по-горе, чрез многократно промиване на ооцистите, което включва отделяне на ооцистите чрез центрофугиране и отново суспензиране в дейонизирана или дестилирана вода. След отстраняването на бихромата, за което се съди по липсата на жълтооранжево оцветяване, ооцистната суспензия се смесва с равен обем натриев хипохлорид (избелване) и се инкубира при стайна температура 15 min. Избелващото средство след това се отстранява чрез многократно промиване и ооцистите се суспендират отново във физиологи чен солев разтвор или в дейонизирана вода. Ооцистите могат да се разчупят, за да освободят спороцисти, като се използват различни известни техники. Например ооцистите могат да се разчупят за освобождаване на спороцисти чрез смесване на ооцистите със стъклени перли с диаметър 1 -4 mm и разклащане наръка или на вотрекс или чрез разклащане в инкубатор, или при използване на ръчен хомогенизатор. Неразчупените ооцисти и ооцистните стени могат да се разделят от освободените спороцисти чрез диференциално центрофугиране в 50% Percoll™ (продаван от Фармация Биотех) или чрез 1 М захароза, както е описано в Dilski et al., Avian Deseases, 32: 235239,1988.

За получаването на спорозоити или богат на спорозоити препарат, който да се използва заедно с настоящото изобретение, спорозцоитите се изрязват от спороцитния препарат, описан по-горе. При един от начините, спороцисти, получени, както е описано по-горе, се отделят като утайка чрез центрофугиране, суспендират се отново в изрязващ буфер (0,5% тауродезоксихолева киселина и 0,25% трипсин в солев разтвор на фосфатен буфер, pH 8,0) и се инкубират при разклащане в продължение на един час при 41°С. Проба от получената суспензия се преброява, за да се определи броят на спорозоитите, спорозоитите се промиват един път, за да се отстрани изрязващият буфер, и отново се суспендира в солев фосфатен-буферен разтвор с желана концентрация за инжектиране in ovo. Този препарат съдържа спорозоити, спороцисти и ооцисти и без допълнително пречистване, може да се използва заедно с настоящия метод на ваксиниране. Пречистени спорозоити, на които са отстранени спороцистите и ооцистите, могат да се получат чрез DE-52 анио-обменна хроматография, както е описано от D.M.Schmatz et al., J.Protozool., 31: 181-183, 1984, включен тук с отметка. Дозата, която се използва съгласно метода на ваксиране, варира съобразно типа на домашната птица, която ще се ваксинира, и от вида Eimeria, който ще се използва във ваксината. Най-общо дозата може да бъде приблизително от 10 до 10⁶ спорозоити за яйце. За предпочитане е дозата да е приблизително от 10 до 10* спорозоити за яйце, и още по-добре приблизително от 10² до 10⁵ спорозоити за яйце.

Мерозоити могат да се получат по различни известни методи. При един от методите спорозоитите се поставят в първични пилешки бъбречни клетки (РСК), които са отгледани в култура като клетъчни агрегати, при използване модификация на метода, описан от DJ.Doran, J.Parasit. 57: 891-900, 1971. РСК клетки се отглеждат при 40°С в 3% СО₂ в модифицирана RK2 среда - DMEM/F12 с Lглутамин и 15 mM HEPES, допълнен със зародишен говежди серум, пеницилин - стрептомицин, 15 тМ натриев бикарбонат, 10 mg/ml епидермален растежен фактор, 5 pg/ml инсулин, 5 pg/ml трансферни, 5 mg/ml селенова киселина и 0,01 μΜ хидрокортизон НС1, както е описано от S.D.Chung et al., J.Cell Biol. 95: 118126, 1982. РСК клетки се получават от бъбреци на 2- до 3-седмични пилета чрез смилане на бъбрека и след това - третиране на тъканите при 37°С с няколко смени на 0,2 mg/ml колагеназа (продавани от Worthington Biochemical Corp., Freehold, NJ) в солев фосфат-буферен разтвор. Клетъчните агрегати в супернатанта се промиват, суспендират се отново в модифицирана RK2 среда, съдържаща 5 % зародишен говежди серум, и се посява в колби за тьканна култура при плътност 10⁵ агрегати за cm². РСК клетките се инкубират 18 h при 40°С в 3% СО₂ и след това се заразяват с 4 х 10⁵спорозоити/cm². Заразените култури се отглеждат в модифицирана RK2 среда, съдържаща 2% зародишен говежди серум. След инкубиране в продължение на 24 h, за да се позволи инвазия, неинвазиралите спорозоити се отстраняват чрез разклащане на колбата и отстраняване на културалната среда. Клетъчният слой се промива веднъж с модифицирана RK2 среда, съдържаща 2% зародишен говежди серум, и културалната среда отново се изхвърля. Прибавя се прясна RK2 среда и културите се инкубират за още 48 до 54 h, докато мерозоитите се освобождават в културалната среда.

Пречистването на мерозоитите, за да се отстранят клетъчните остатъци на приемника, може да се извърши по различни известни методи. Във връзка с един метод, описан от J.A. Olson, Antimicrob. Agents Chemother. 34: 14351439, 1990, културалната среда, съдържаща освободените мерозоити, се събира и центрофугира при 450 х g 10 min, за да се концентрират мерозоитите. Утайката, съдържаща мерозоитите и остатъците на клетките на прием ника, се суспендира в 0,1 М NaCl - 0,05 М КС1 - 20% говежди серумен албумин и се прилага към DE-52 анионна обменна колона, уравновесена в 75 тМ Трис-40 mM NaH₂PO4 - 86 тМ NaCl - 100 тМ гликоза при pH 8,2. Мерозоитите преминават през колоната. Събраните от колоната мерозоити могат да се изследват за чистота чрез електронна микроскопия, както е описано от A.Kilijian, J'.Bioi.Chem. 249: 4650-4655, 1974. Най-общо дозата от мерозоити може да е в границите от 10 до 10⁶мерозоити за яйце. За предпочитане е да е в границите от 10 до 10⁵ мерозоити за яйце и най-добре е дозата да възлиза на 10² до 10^sмерозоити за яйце. Когато са смесени спорозоити и мерозоити, най-общо дозата, включваща общия брой мерозоити и спорозоити, може да е в граници от 10 до 10⁶ мерозоити за яйце. За предпочитане е да е в границите от 10 до 10⁵ мерозоити за яйце. Когато са смесени спорозоити и мерозоити, най-общо дозата, включваща общия брой мерозоити и спорозоити, може да е в граници от 10 до 10⁶ за яйце. За предпочитане е да е в границите от 10 до 10* спорозоити и мерозоити за яйце и найдобре е дозата да възлиза на 10² до 10⁵ мерозоити и спорозоити за яйце.

Спорозоитите и мерозоитите, или сместа от тях, може да се инжектира в яйцето във всяка физиологично подходяща среда. За предпочитане е те да са суспендирани във физиологино балансиран физиологичен разтвор, като фосфатно-буферен физиологичен разтвор. Подбраната среда може евентуално да включва едно или повече суспендиращи средства, включително физиологично подходящи телове, желатини, хидрозоли, целулоза или полизахаридни смоли.

За предпочитане е при метода на ваксиниране съгласно изобретението спорозоитите или мерозоитите, или сместа от тях на два или повече Eimeria вида да се инжектира в яйцето едновременно. Съгласно настоящия метод за ваксиниране спорозоитите или мерозоитите, или сместа от тях от всички идентифицирани видове на Eimeria, които заразяват домашни птици, като пилета, да се инжектира в яйцето едновременно или на серии, в подходящи дюзи, за да се осигури имунна защита срещу всички видове.

Заедно с метода на ваксиниране могат да се използват имунни стимуланти. Подходя щи имунни стимуланти са, без ограничение цитокини, фактори на растежа, хемокини, супернатанти от клетъчни култури на лимфоцити, моноцити или клетки от лимфоидни органи, клетъчни препарати или клетъчни екстракти, например препарати на Staphylococcus aureus или липополизахариди, митогени или добавки, включително фармацевтични вещества с ниско молекулно тегло. Имунният стимулант може да се приложи в яйцето през всяко време от периода на инкубиране. За предпочитане е имунният стимулант да се приложи в яйцето в средата, съдържаща дозата от Eimeria спорозоити или мерозоити, или на смес от тях.

Примери за изпълнение на изобретението и приложение на изобретението

Ефективността на настоящото изобретение при ваксинирането срещу кокцидиоза се илюстрира със следните примери. Всяка от дозите се инжектира в яйцето във физиологично приемлив физиологичен разтвор, както е описано по-горе. Ефективността на даден препарат се определя чрез проследяване на ефекта му върху скоростта на излюпване и теглото на пилетата при излюпването, последваща заплаха от инфекция, производството на ооцисти, приръста на теглото и патогенност (степен на увреждане). Степента на увреждане се преценява съгласно протокола, описан от J.K. Johnson и W.M.Reid, Exp. Parasitol. 28: 30-36, 1970, съгласно който стойност 0 означава липса на заболяване, а стойност 4 представлява максимална патология.

Пример 1. Кокоши яйца се инжектират на 18 ден от инкубирането с препарат, съдържащ 10⁵ E.tenella спорозоити за яйце. Препаратът не е пречистван, за да се отстранят спороцистите и ооцистите. Всяка доза съдържа също така приблизително 10⁴ E.tenella спороцисти и приблизително 10* E.tenella ооцисти. За контрола яйцата се инжектират само с фосфатно-буферен физиологичен разтвор. При популацията птици, третирана със спорозоити, средното разпространение на ооцисти на 7 ден след излюпването е 1.1 х 10⁶ ооцисти на птица. Неимунизирани птици и третираните със спорозоити птици се заразяват с различни дози спорулирали ооцисти от E.tenella, приложени през устата с тръба за хранене в дните 7, 14 и 21 след излюпването. Данните са посоче6 ни в таблица 1.

Таблица 1

Имунизирани спрямо неимунизирани птици

Реакция спрямо различни дози на зараза в различни периоди след излюпването

	Степен на увреждане 6 дни след заразата	Приръст на теглото 6 дни след заразата^в^
Група'	Доза на зараза^{1 2}	неимунизирани	имуниз. in ovo³	неимунизиани	имуниз. inovo³
заразени на 7 ден след излюпва-	0	0	0	188	167
нето	2.5 х 10³	3.0	0.3*	154	153
	5 х 10³	3.1	1.2*	153	167
	1 х 10⁴	3.7	1.4*	123	165*
заразени на 14 ден след излюпва-	0	0	0	266	278
нето	2.5х10³	2.4	0.4*	260	269
	5 х 10³	2.8	1.1*	244	265
	1 х 10⁴	3.3	1.6*	235	259
заразени на 21 ден след излюпва-	0	0.1	0	361	357
нето	2.5х10³	2.3	0.7*	375	358
	5 x10^s	2.1	0.8*	332	344
	1 х 10⁴	2.8	1.4*	337	395*

¹ Всяка от групите се подлага на еднократно заразяване със спорулирали ооцисти в дните 7, 14 или 21 след излюпването, така например птиците, заразени на 21 ден след излюпването, не се заразяват на 7 или 14 ден след излюпването.

² Дозата на заразяване е броят на спорулирали ооцисти за птица.

³ Имунизирането в яйцето се извършва с 10³ спорозоити в 18 ден от инкубационния период.

* Има значителна разлика от неимунизираните птици (р< 0,05, ANOVA).

Данните от таблица 1 ясно показват, че имунизираните птици са по-малко чувствителни към инфекцията от неимунизираните, което се вижда от степента на увреждане и от подобрения приръст на теглото при имунизираните птици. Данните също така демонстрират, че методът от изобретението придава имунитет на пилетата от сравнително ранна възраст (в първите седем дни след излюпването). Нещо повече, данните показват, че имунитетът продължава при растежа и развитието на пилетата. Придаването на имунитет на пилетата в ранния етап от развитието им осигурява значително предимство в индустрията за бройлер ни пилета, тъй като бройлерите обикновено се продават на пазара, когато станат на 6 седмици.

Пример 2. Кокоши яйца се инжектират 5 на 18 ден от инкубирането с физиологичен разтвор (контрола) или с препарат, съдържащ различни дози спорозоити на E.tenella, както е показано в таблица 2, което осигурява предзаразните резултати. Използваният спорозои10 тен препарат за всяка доза съдържа 62% спорозоити, 9% спороцисти и 29% ооцисти. Всяка доза, съдържаща 10⁵ спорозоити, съдържа общо 1,6 х 10⁵ паразитни стадии (спорозоити, спороцисти и ооцисти).

Таблица 2

Ефект при ваксиниране in ovo (в яйцето) върху процента на излюпване и теглото

Спорозоити У инжектирани на яйце на 18 ден от инкубирането	Излюпени (%)	I ΐ Тегло при излюпването ! Я
0	94	! 48.2
0	94	! 48.0 1
\|θ3	100	ί 49.4
10⁴	97	47Ό
Ϊ0³	94	49.1 I

Данните от таблица 2 показват, че пилетата, излюпени от яйца, инжектирани с живи спорозоити, са практически идентични с тези от неимунизирани яйца по отношение на процента на излюпване и теглото при излюпването. След това пилетата се заразяват на 14 ден след излюпването с 1,25 х 10⁴ спорулира40 ни ооцисти на E.tenella за птица, приложени през устата със сонда за хранене. Получените резултати са дадени в таблица 3.

Таблица 3.

Отнасяния към зараза на неимунизирани птици спрямо птици, третирани in ovo, с различни дози спорозоити

Спорозоити, инжектирани на яйце на 18 ден от инкубирането	Приръст на теглото на птица за период от шест дни след заразяването	Степен на увреждане на 6 ден след заразяването	Ооцисти на птица (х 10⁶) на 6 ден след заразяването
0	278	3,2	12,3
0 незаразена контрола	321	0	0,003*
10³	289	2,6*	11,2
10*	291	2,7	12,2
10^s	304*	1,4*	1,4*

* Значително различни от неимунизираната група (получила солев разтвор), подложена на зараза (р < 0,05, ANOVA)

Данните от таблица 3 показват, че за всеки параметър (приръст на теглото, степен на увреждане, плътност на ооцистите), пилета, излюпени от яйца, инжектирани с различни дози спорозоитен препарат, доказват наличието на имунитет. В сравнение с контролните птици, които са третирани само с физиологичен разтвор и които са подложени на зараза, птиците, имунизирани in ovo със спорозоитен препарат, показват по-голям приръст на тегло и намалени увреждания. В допълнение птиците, имунизирани in ovo със спорозиотен препарат, пропускат по-малко ооцисти в сравнение с контролните птици след заразяване, с което се вижда, че инфекцията е по-малка в имунизираните птици.

Claims

Патентни претенции

1. Метод за ваксиниране на домашни птици срещу кокцидиоза, състоящ се в прилагане in ovo (в яйцето) през време на последната четвърт от периода на инкубиране на ефективна имунизираща доза от живи Eimeria спорозоити или мерозоити, или на смес от тях.
2. Метод съгласно претенция 1, при който дозата се състои от 10 до 10⁶ спорозоити или мерозоити, или от тяхна смес, характеризиращ се с това, че общият брой на тези спорозоити и мерозоити е от порядъка на 10 до 10⁶.
3. Метод съгласно претенция 1, при който дозата се състои от 10³ до 10⁶ спорозоити или мерозоити, или от тяхна смес, характеризиращ се с това, че общият брой на тези спорозоити и мерозоити е от порядъка на 10³ до 10⁶.
4. Метод съгласно претенция 1, при който дозата се състои от 10² до 10^s спорозоити или мерозоити, или от тяхна смес, характеризиращ се с това, че общият брой на тези спорозоити и мерозоити е от порядъка на 10² до 10^s.
5. Метод съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че домашната птица е пиле.
6. Метод съгласно претенция 5, характеризиращ се с това, че дозата съдържа спорозоити или мерозоити, или тяхна смес от два или повече вида Eimeria, подбрани от група, състояща се от E.teneila, E.acervulina, Е.maxima, E.necatrix, E.mitis, E.praecox и E.brunetti.
7. Метод съгласно претенция 6, характеризиращ се с това, че дозата се прилага чрез инжектиране in ovo.
8. Метод съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че се прилага допълнително in ovo и имунен стимулант през всяко време на инкубирането.
9. Метод съгласно претенция 8, характеризиращ се с това, че имунният стимулант се прилага in ovo едновременно с дозата от спорозоити или мерозоити, или смес от тези спорозоити или мерозоити.
10. Метод съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че дозата се състои от мерозоити.
11. Метод съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че дозата се състои от спорозоити.
12. Метод съгласно претенция 11, характеризиращ се с това, че спорозоитите са пречистени, за да се отстранят спороцистите и ооцистите.
13. Метод съгласно претенция 2, характеризиращ се с това, че домашната птица е пуйка.
14. Метод съгласно претенция 13, характеризиращ се с това, че дозата съдържа спорозоити или мерозоити, или тяхна смес от два или повече вида Eimeria, подбрани от група, състояща се от E.meleagrimitis, E.adenoeides, E.gallopavonis, E.dispersa, E.maleagridis, E. 5 innocue и E.subrotunde.
15. Метод съгласно претенция 14, характеризиращ се с това, че дозата се прилага чрез инжектиране in ovo.
16. Метод съгласно претенция 2, харак10 теризиращ се с това, че домашната птица е дива птица, патица или ратит, птица с плоска гръдна кост.