JP2021530493A - オーシスト溶液を調製及び送達する方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、溶液中のオーシストの外膜を破壊し、溶液を動物に送達するためのシステム及び方法を提供する。このシステムは、溶液中に壊れていないオーシストを含む容器、オーシスト処理チャンバー、及び送達出口を含む。壊れていないオーシストは容器から処理チャンバーを通して移動させられ、オーシスト膜の一部が破壊されてスポロシストを放出し、得られた溶液は処理チャンバーから、溶液が動物に送達される送達出口に移動させらる。Ｅｉｍｅｒｉａ感染症に対するワクチン接種を含むワクチン接種の方法も提供される。

Description

関連出願の相互参照
この出願は、２０１８年７月１０日に出願された米国仮出願第６２／６９６，２６１号、Ｈｕｔｃｈｉｎｓ ｅｔ ａｌ．の利益を主張し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本出願は、発明者Ｊａｍｅｓ Ｈｕｔｃｈｉｎｓにより２０１９年７月１０日に出願された同時係属中のＰＣＴ出願シリアル番号 、代理人整理番号６７３−０４−ＰＣＴに関連する。この同時係属中のＰＣＴ出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

１．分野
本開示は、溶液中でオーシストの外膜を破壊し、溶液を動物に送達するためのシステム及び方法を提供する。システムは、壊れていないオーシストを溶液中に含む容器、オーシスト処理チャンバー、及び送達出口を含む。壊れていないオーシストは容器から処理チャンバーを通して移動させられ、オーシスト膜の一部が破壊されてスポロシストを放出し、得られた溶液は処理チャンバーから送達出口に移動させられ、そこで溶液が動物に送達される。

２．背景
２．１．イントロダクション
本明細書において提供される「背景」の説明は、開示の背景を一般的に提示することを目的とする。現在名前を挙げられている発明者の研究は、この背景の部分に記載された範囲において、また、出願時に先行技術として適格ではない可能性がある説明の側面は、いずれも本開示に対する先行技術として明示的にも暗示的にも認められない。

ワクチンは、ウイルス、細菌、及び寄生虫を含む病原性微生物からヒト及び動物を保護する重要な成分である。簡単には、ワクチンは免疫系を刺激して特定の病原体を認識させ、それによって自然界におけるその微生物との将来の遭遇から保護する防御システムを作る。ワクチンはいくつかの主要なクラス、特に、不活化又は死菌ワクチン、サブユニットワクチン、野生型ワクチン、及び、弱毒化又は変性生ワクチンに分けることができる。野生型及び弱毒化ワクチンは、レシピエント動物に軽度の感染を及ぼす。軽度の感染は、しばしば、将来、より大きな、恐らく致死的な感染が起こることを防ぐために、免疫反応を引き起こす。

２．２．アピコンプレックス門、Ｅｉｍｅｒｉａ、コクシジウム症、及びワクチン
アピコンプレックス門は、複雑な生活環を持つ単細胞の胞子形成寄生虫の門である。アピコンプレックス門によって引き起こされるよく知られたヒト疾患は、バベシア症（Ｂａｂｅｓｉａ）、クリプトスポリジウム症（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）、マラリア（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、及びトキソプラズマ症（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉ）を含む。アピコンプレックス門の疾患は、動物及び家畜にも影響を及ぼす。Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ及びＴｏｘｏｐｌａｓｍａ ｇｏｎｄｉｉなどのいくつかのアピコンプレックス門は、ヒト及び動物の両方に影響を及ぼす。Ｅｉｍｅｒｉａ又はＴｈｅｉｌｅｒｉａのような他のアピコンプレックス門は、動物のみに影響を及ぼす。アピコンプレックス門の生活環は、有性生殖期及び無性生殖期の両方を有するという点において複雑である。生活環は、しばしば、環境中に排泄されている期と、動物宿主内で起こる他の期との両方からなる。多くのアピコンプレックス門では、生活環のいくつかの期がある宿主種で起こり、他の期が別の宿主種で起こる。それに対して、アピコンプレックス門の寄生虫であるＥｉｍｅｒｉａは、一般的に、宿主特異的であり、単一宿主性である。つまり、生活環は、単一の宿主種に特異的である。

Ｅｉｍｅｒｉａは、ウシ、ニワトリ、魚類、ヤギ、ブタ、ウサギ、爬虫類、ヒツジ、及びシチメンチョウなどの野生脊椎動物及び家畜脊椎動物にコクシジウム症を引き起こす。様々なＥｉｍｅｒｉａ種は、消化管（ＧＩ）管の好ましい部分を有し、そこで生殖し、ＧＩ管の上皮に損傷を引き起こす。

野生型であるか弱毒化されているかにかかわらず、Ｅｉｍｅｒｉａオーシストの生活環の部分を図１Ａ及び図１Ｂに示す。図１Ａは、ニワトリにおけるＥｉｍｅｒｉａオーシストの取り込みで起こる外部プロセスの概要を表す。孵化日のニワトリは、まず、胞子形成オーシストを含むワクチンを接種される（Ａ）。その後、胞子形成オーシストは、ニワトリの消化管内で処理され、このプロセスを図１Ｂにより詳細に示す。感染は、多数の生活期を経て続き、最終的にニワトリの糞便内に排泄される胞子未形成オーシストが形成される（Ｂ）。鳥からの排泄に続き、胞子未形成オーシストは、環境中で熱、水分、及び酸素にさらされ、数日をかけて胞子形成オーシストとなる（Ｃ）。オーシストは、胞子形成されるまで感染性ではない。これらの胞子形成オーシストは、その後、ニワトリに摂取され、生活環が繰り返される。

図１Ｂは、ニワトリにおけるＥｉｍｅｒｉａオーシストの取り込みで起こる内部プロセスの拡大図を表す。枠で囲まれた領域は、オーシスト生殖生活環の簡略図を示し、４つのスポロシストを含む胞子形成オーシストが割れ、スポロシストを放出する（Ｄ）。それぞれのスポロシスト内には、２つのスポロゾイトがある。鳥の腸内の酵素反応は、スポロシスト壁のエンドキャップを消化し（図示されていない）、スポロゾイトを放出する。その後、運動性のスポロゾイトは、腸の様々な領域にある腸細胞を種特異的な方法で探し、感染する（Ｅ）。例えば、ニワトリでは、Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａは腸上部に感染し、Ｅ．ｍａｘｉｍａは小腸に感染し、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａは、盲腸に感染する。

スポロゾイトによる腸細胞の感染に続き、寄生虫の生活環は、無性生殖のいくつかの期を経て続く。これらの生活環は、いくつかの一連の生殖及び増幅（ｓｅｖｅｒａｌ ｒｏｕｎｄｓ ｏｆ ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）からなり、腸管の選択された領域におけるＥｉｍｅｒｉａの存在の大幅な増加をもたらす。無性生殖期によって生じた増幅の後、有性生殖が起こり、オーシストの産生につながる。その後、図１Ａに示すように、オーシストは、ニワトリの糞便中に脱落し、別のニワトリに消費される。

完全なプロセスには約７日かかり、正確な時間の長さは種によって変化する。脱嚢プロセスとその後の宿主細胞への侵入は、０日と３日の間で起こる。無性生殖期は、３日と５日の間で起こる。有性生殖期及びそれに続くオーシストの糞便中への脱落は、５日と７日の間で起こる。

コクシジウム症は、家禽によくみられる疾患である。コクシジウム症の制御は、通常、飼料中のイオノフォア又は化学物質を用いて達成される。これらに限定されないが、イオノフォア及び化学物質の高いコスト、イオノフォア及び他の化学物質の環境への影響、殺虫剤を使用しない家禽に対する消費者の需要、及び、耐性コクシジウム亜綱の発生を含む様々な理由から、現在、別の制御手段が探し求められている。コクシジウム症に対するワクチンは、コクシジウム症を制御するための飼料中のイオノフォア又は化学物質の必要性を劇的に減らす又は排除する可能性を有する。ワクチンは、大量のワクチン適用との均一性の欠如に起因し、広く使用されていない。現在送達されているように、家禽におけるＥｉｍｅｒｉａワクチンは、非効率的な一次感染（ｆｉｒｓｔ ｒｏｕｎｄ ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ）及び免疫を引き起こし、通常、疾患に感染しやすい大規模な未感作集団をもたらす。その後の未感作集団は、免疫を誘導するための飼育場での再循環（ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ）に依存する。一次感染した鳥からのアウトプットは、残りの未感作集団の大規模な感染を引き起こす。未感作の解消は、一次感染に続く期間における高いオーシストアウトプットをもたらし、これは、壊死性腸炎などの二次細菌感染に対する感受性を招き、解消のために抗生物質を必要とする。孵化日の全ての鳥に効果的なワクチン接種は、Ｅｉｍｅｒｉａ感染に関連する罹患率、死亡率、及び体重増加の欠如を回避することができるであろう。ＰＣＴ国際公開第２０１７／０８３６６３Ａｌ号、Ｋａｒｉｍｐｏｕｒ参照。

現在、業績不良、罹患率、及び死亡率に起因するコクシジウム症の世界的な影響は、３億ドルと推定される。さらに、コクシジウム症の制御のために、年間、米国では推定９０００万ドル、世界では３０億ドルが費やされている（５ｍ Ｅｄｉｔｏｒ，２０１３，Ｈｉｇｈ Ｃｏｓｔ ｏｆ Ｃｏｃｃｉｄｉｏｓｉｓ ｉｎ Ｂｒｏｉｌｅｒｓ，Ｔｈｅ Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｓｉｔｅ，https://thepoultrysite.com/news/2013/02/high-cost-of-coccidiosis-in-broilers）。

現在、オーシスト膜を割り開くプロセスは、ニワトリの砂嚢（ｇｉｚｚａｒｄ）における砂粒（ｇｒｉｔ）及び飼料と接するオーシストの粉砕によって促進されると考えられている。孵化場でのワクチン接種されていない又は未感作の鳥へのオーシストの送達は、腸が、オーシスト壁を割ってスポロシストを放出するプロセスを助ける十分な飼料又は砂粒を含まないため、オーシストの非効率的なワクチン接種をもたらす。そのため、オーシスト壁を壊し、スポロシストの放出を助ける砂粒又は飼料を消化器系に有しない可能性があるので、スポロシストを１日齢の孵化したての幼鳥に直接、送達することが好ましいであろう。孵化場での未感作の鳥へのスポロシストの直接の送達は、砂粒又は飼料がなくてもワクチンが感染することができるために、ワクチン接種の効率を改善することができる。若いニワトリは、放出されたスポロシストを感染したスポロゾイト期に腸内で処理する能力を持つ。このスポロシストワクチン戦略は、完全免疫の発達のための再循環及び二次感染（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｒｏｕｎｄｓ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）の必要性を防止するかもしれない。

スポロシストワクチンとして製造及び出荷されるワクチン溶液を生成する目的のために、オーシスト壁を割るいくつかの試みが以前になされてきた。例えば、他のものは、粉砕又はオーシストをガラスビーズと振とうすることを開示している。さらに、欧州特許第２，１１１，２４３Ｂ１号（Ｈｕｔｃｈｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｍｂｒｅｘ，Ｉｎｃ．）は、マイクロチャネルを使用してオーシストからスポロシストを放出する方法を開示している。

しかしながら、オーシスト膜を破壊する従来の試みは、凍結保存、凍結、貯蔵、それに続く送達、及び解凍のための溶液を調製するという状況の中で行われてきた。特に、スポロシストベースのワクチンを製造するための従来の方法は、得られたスポロシストを凍結保存溶液中に懸濁させ、液体窒素中に長期間保存しなければならないという欠点を有する。このようなプロセスは、寄生虫学の技術分野において、スポロシストの形でマスターシード系を保存することでよく知られている。また、凍結保存後の生存可能なスポロシストの回収率は低く、しばしば、５〜１０％に過ぎないことも認識されている。スポロシストのリアルタイムでの生成及び送達は、凍結保存の必要性及び結果として生じる生存可能な生物の低い回収を回避する。

別の課題は、スポロシストに損傷を与えることなくオーシスト膜を破壊することである。大きさが異なり、様々な保護壁の厚さと耐久性を有する多数のＥｉｍｅｒｉａ種から構成されるワクチンを加工する場合は、さらに困難になる。したがって、Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａのような小さな破裂抵抗力のある種の壁を壊すために必要とされる条件は、以前に放出されたスポロシストを損傷させるか、又は、Ｅ．ｍａｘｉｍａのような大きくより破裂されやすい種には厳しすぎる可能性がある。

送達の時、又は、新たに放出されたスポロシストが意図されたレシピエントに直接かつ直ちに送達されるインラインプロセスにおいて、オーシスト壁を割る試みはなされていない。

３．開示の概要
本明細書における実施形態は、改良されたワクチン接種のためのスポロシストのｉｎ ｓｉｔｕ放出に関するシステム及び方法に関する。本明細書に記載されたいくつかの実施形態は、オーシストの膜を破壊し、膜及びその内容物である生存可能なスポロシストを動物に送達するためのシステム及び方法に関する。

本明細書に記載された他の実施形態は、ゲル混合物を作製するために２つの部分で送達されるオーシスト溶液に関する。２０１９年７月１０日に出願されたＰＣＴ出願 、Ｈｕｔｃｈｉｎｓ、代理人整理番号６７３−０４−ＰＣＴ参照。

一実施形態は、Ｅｉｍｅｒｉａに対して動物にワクチン接種する方法に関する。この方法は、オーシストベースの溶液を提供すること、生存可能なスポロシストをオーシストから放出させること、及び放出されたスポロシストを含む溶液を動物に送達することのステップを含む。

別の実施形態は、オーシストの外膜を破裂させ、その後、それを動物にリアルタイムで送達するためのシステムに関する。このシステムは、壊れていないオーシストを溶液中に含む容器、オーシスト処理チャンバー、及び送達出口を含む。壊れていないオーシストは、容器から処理チャンバーを通して移動させられ、オーシストの膜の一部が破壊されてスポロシストを放出する。得られた溶液は、処理チャンバーから、溶液が動物に送達される送達出口に移動させられる。

さらなる実施形態は、動物への送達の時にオーシストを破裂させる方法に関する。この方法は、ある量の壊れていないオーシストを溶液中に含むための第１の容器、処理チャンバー、及び送達デバイスを提供するステップを含む。この方法は、さらに、壊れていないオーシストの溶液を第１の容器から処理チャンバーに移動させること、及び、溶液を処理チャンバーに通すことを含み、それにより、スポロシストの少なくとも一部が溶液中に放出される。この方法は、溶液を処理チャンバーから、放出されたスポロシストを含む処理された溶液が動物に送達される送達デバイスに移動させることも含む。

さらに別の実施形態は、オーシスト溶液を動物に送達するためのシステムに関する。

本発明の方法によってワクチン接種される好ましい市販の鳥はニワトリである。

ニワトリに投与される好ましい組成物は、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ、Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ、Ｅ．ｍａｘｉｍａ、Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘ、Ｅ．ｍｉｔｉｓ、Ｅ．ｐｒａｅｃｏｘ、Ｅ．ｈａｇａｎｉ、Ｅ．ｍｉｖａｔｉ、及びＥ．ｂｒｕｎｅｔｔｉからなる群から選択されるＥｉｍｅｒｉａの１つ以上の種のスポロシスト又はスポロシストとオーシストとの混合物を含む。

本発明の方法によってワクチン接種される別の好ましい商品化された鳥は、シチメンチョウである。シチメンチョウに投与される好ましい組成物は、Ｅ．ｍｅｌｅａｇｒｉｍｉｔｉｓ、Ｅ．ａｄｅｎｏｅｉｄｅｓ、Ｅ．ｇａｌｌｏｐａｖｏｎｉｓ、Ｅ．ｄｉｓｐｅｒｓａ、Ｅ．ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ、Ｅ．ｉｎｎｏｃｕａ、及びＥ．ｓｕｂｒｏｔｕｎｄａからなる群から選択されるＥｉｍｅｒｉａの１つ以上の種のスポロシスト又はスポロシストとオーシストとの混合物を含む。

４．図面の簡単な説明
このように本開示の様々な実施形態を一般的な用語で説明したので、次に、添付の図面を参照する。図面は、縮尺とおりに描かれておらず、システムの全ての構成要素を含まない。

図１Ａは、Ｅｉｍｅｒｉａオーシスト及びワクチンの生活環を図示したものグラフ表示である。

図１Ｂは、ニワトリにおけるＥｉｍｅｒｉａオーシストの生活環を図示したものグラフ表示である。

図２は、第１の実施形態（高圧ホモジナイザー）の概略図である。

図３は、第１の実施形態の処理システムの拡大図である。

図４は、第２の実施形態（ビーズ処理）の概略図である。

図５は、第３の実施形態（超音波処理）の概略図である。

図６は、第４の実施形態（ローターステーターミキサー）の概略図である。

図７は、第５の実施形態（振動板）の概略図である。

図８は、第６の実施形態（流体力学的キャビテーション）の概略図である。

図９は、第７の実施形態（高圧噴霧）の概略図である。

５．開示の詳細な説明
本開示の様々な側面は、添付の図面を参照して以下で十分に説明され、全てではないが、いくつかの開示の側面が示される。実際、この開示は、多くの様々な形態で実施され得て、本明細書に記載された側面に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、これらの実施形態は、この開示が徹底的かつ完全であり、本発明の範囲を当業者に十分に伝えるように提供される。

同じ番号は、全体を通して同じ要素を指す。図では、明確にするために、特定の線、層、成分、要素、又は特徴の厚さが、強調されている場合がある。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

５．１．定義
本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、本発明を限定することは意図されていない。

本明細書で使用される場合、用語Ｅｉｍｅｒｉａは、Ｅ．ｍａｘｉｍａ、Ｅ．ｍｉｔｉｓ、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ、Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ、Ｅ．ｂｒｕｎｅｔｔｉ、Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘ、Ｅ．ｐｒａｅｃｏｘ、Ｅ．ｈａｇａｎｉ、Ｅ．ｍｉｖａｔｉ、及びそれらの任意の組み合わせからなるニワトリに感染するＥｉｍｅｒｉａ種を意味し、かつ、含む。Ｅｉｍｅｒｉａは、Ｅ．ｍｅｌｅａｇｒｉｍｉｔｉｓ、Ｅ．ａｄｅｎｏｅｉｄｅｓ、Ｅ．ｇａｌｌｏｐａｖｏｎｉｓ、Ｅ．ｄｉｓｐｅｒｓａ、Ｅ．ｉｎｎｏｃｕａ、Ｅ．ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ、及びＥ．ｓｕｂｒｏｔｕｎｄａのようなシチメンチョウに感染する種、及びそれらの任意の組み合わせを含む。Ｅｉｍｅｒｉａは、Ｅ．ｚｕｅｒｎｉｉ、Ｅ．ｂｏｖｉｓ、Ｅ．ｅｌｌｉｐｓｏｉｄａｌｉｓ、及びそれらの任意の組み合わせなどのウシに感染する種も含む。Ｅｉｍｅｒｉａは、Ｅ．ａｈｓａｔａ、Ｅ．ｂａｋｕｅｎｓｉｓ、Ｅ．ｃｒａｎｄａｌｌｉｓ、Ｅ．ｆａｕｒｅｉ、Ｅ．ｇｒａｎｕｌｏｓａ、Ｅ．ｉｎｔｒｉｃａｔａ、Ｅ．ｍａｒｓｉｃａ、Ｅ．ｏｖｉｎｏｉｄａｌｉｓ、Ｅ．ｐａｌｌｉｄａ、Ｅ．ｐａｒｖａ、Ｅ．ｗｅｙｂｒｉｄｇｅｎｓｉｓ、及びそれらの任意の組み合わせも含む。さらに、用語Ｅｉｍｅｒｉａは、Ｅ．ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ、Ｅ．ｖｅｊｄｏｖｓｋｙｉ、Ｅ．ｐｉｒｉｆｏｒｍｉｓ、Ｅ．ｃｏｅｃｉｃｏｌａ、Ｅ．ｉｒｒｅｓｉｄｕａ、Ｅ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ、Ｅ．ｅｘｉｇｕａ、Ｅ．ｍａｇｎａ、Ｅ．ｐｅｒｆｏｒａｎｓ、Ｅ．ｍｅｄｉａ、Ｅ．ｓｔｉｅｄａｅ、及びそれらの任意の組み合わせを含む。

用語「動物」及び「動物対象」は、これらに限定されないが、哺乳動物及び／又は鳥類の対象を含む。適切な哺乳動物対象は、これらに限定されないが、霊長類対象（例えば、ヒト対象及びサルなどの非ヒト霊長類対象）、ブタ、ウシ（例えば、畜牛）、ヤギ、ウマ、ネコ、ヒツジ、イヌ、ネズミ（例えば、マウス、ラット）、及びウサギ目対象を含む。

本明細書で使用される場合、用語「鳥類」及び「鳥類対象」（すなわち、「鳥」及び「鳥対象」）は任意の鳥類の種の雄及び雌を含むことが意図され、主に、卵、食肉、又はペットとして商業的に飼育される家禽を包含することが意図される。したがって、用語「鳥類」及び「鳥類対象」は、特に、これらに限定されないが、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、キジ、インコ、オウム、バタン、オカメインコ、ダチョウ、エミューなどを包含することが意図されている。特定の実施態様では、鳥類対象は、ニワトリ又はシチメンチョウである。

本明細書に記載された溶液のリアルタイム送達は、オーシスト膜が破壊されるか、又は別の方法で壊されて、その内容物がオーシスト膜内にもはや含まれないようにするシステム又は方法を意味する。本明細書おいて、システム及び方法は、室温で約２４時間以内、又は、冷蔵状態で５日間以内に送達されると理解される。孵化場では、ワクチンは、通常、４〜８時間のシフトにわたって、システムを通して導入され、貯蔵され、送達される。

本明細書で使用される場合、「オーシストのパーセント減少（ｐｅｒｃｅｎｔ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｏｏｃｙｓｔｓ）」という用語は、オーシスト膜を破壊して、スポロシストを含む内部成分を放出することとして定義される。例えば、オーシストの９０％減少は、１０％の残留オーシストと、放出されたスポロシストへのオーシストの９０％変換をもたらす。

本明細書で使用される場合、用語「羽づくろいすること（ｐｒｅｅｎｉｎｇ）」又は「羽づくろいする（ｐｒｅｅｎ）」は、ニワトリ又は他の動物の行為として、自身又は他の動物をグルーミングする行為を通してオーシスト又は他の物質を摂取すること、その後、羽づくろいされた物質を消費し、感染を開始することとして定義される。

本明細書で使用される場合、ワクチン感染性の文脈内での用語「獲得（ｔａｋｅ）」、「パーセント獲得（ｐｅｒｃｅｎｔ ｔａｋｅ）」、又は「％獲得（％ ｔａｋｅ）」は、これに限定されないがワクチン接種後のＥｉｍｅｒｉａを含むアピコンプレックス門感染に対して陽性であることが示された対象として定義される。

本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明確にそれ以外のことを明確に示唆していない限り、複数形も含むことが意図されている。この明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び／又は「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、記載された特徴、ステップ、操作、要素、及び／又は成分の存在を特定するが、１つ以上の他の特徴、ステップ、操作、要素、成分、及び／又はそれらのグループの存在又は追加を妨げないことがさらに理解される。本開示は、特許請求の範囲に記載されたステップ、要素、及び／又は試薬を、適切に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「のみからなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ）」、又は「実質的にのみからなる（ｃｏｎｓｉｓｔ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」ことができる。

さらに、特許請求の範囲は、任意の要素を除外するために起草され得ることに留意する。そのため、このステートメントは、特許請求の範囲の要素の列挙に関連して「単独で」、「のみ」などのような排他的な用語を使用するための、又は「否定的な」限定を使用するための先行する基礎として機能することが意図される。

本明細書で使用される場合、用語「及び／又は」は、関連して挙げられた項目の１つ以上のいずれか及び全ての組み合わせを含む。本明細書で使用される場合、「ＸとＹの間」及び「約ＸとＹの間」のような句は、Ｘ及びＹを含むと解釈されるべきである。本明細書で使用される場合、「約ＸとＹの間」のような句は、「約Ｘと約Ｙの間」を意味する。本明細書で使用される場合、「約ＸからＹまで」のような句は、「約Ｘから約Ｙまで」を意味する。

異なる定義がされていない限り、本明細書で使用される全ての用語（技術用語及び科学用語を含む）は、この発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。さらに、一般的に使用される辞書において定義されているような用語は、本明細書及び関連技術の文脈におけるそれらの意味と一致する意味を有すると解釈されるべきであり、本明細書において明確に定義されていない限り、理想的な又は過度に形式的な意味で解釈されるべきではないと理解される。よく知られた機能又は構成は、簡潔さ及び／又は明確さのために詳細に説明されないことがある。操作（又はステップ）の順序は、異なる示唆がされていない限り、特許請求の範囲又は図面に示された順序に限定されない。

本明細書を通して、用語「約（ａｂｏｕｔ）」及び／又は「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は、数値及び／又は範囲と共に使用され得る。用語「約」は、記載された値に近い値を意味すると理解される。例えば、「約４０［単位］」は、４０の±２５％以内（例えば、３０から５０まで）、±２０％以内、±１５％以内、±１０％以内、±９％以内、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、±１％、±１％未満、又は、それらの内若しくはそれらより下の他の値若しくは値の範囲を意味し得る。あるいは、文脈に応じて、用語「約」は、±半分の標準偏差、±１つの標準偏差、又は±２つの標準偏差を意味し得る。さらに、句「約［値］未満」又は「約［値］超」は、本明細書において提供される用語「約」の定義を考慮して理解されるべきである。用語「約」及び「およそ」は、交換して使用することができる。

本明細書を通して、数値範囲は特定の量に対して提供される。これらの範囲は、それらの中の全ての下位範囲（ｓｕｂｒａｎｇｅｓ）を含むと理解されるべきである。したがって、範囲「５０から８０まで」は、その中の全ての可能な範囲が含まれる（例えば、５１〜７９、５２〜７８、５３〜７７、５４〜７６、５５〜７５、６０〜７０等）。さらに、定められた範囲内の全ての値は、それによって包含される範囲の終点であってよい（例えば、範囲５０〜８０は、５５〜８０、５０〜７５等のような終点を持つ範囲を含む）。

異なる定義がされていない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、この開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。好ましい方法、デバイス、及び材料が説明されているが、本明細書に記載されているものと類似又は同等の任意の方法及び材料を、本開示の実施又は試験に使用することができる。本明細書において引用される全ての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

５．２．特定の実施形態
５．２．１．第１の実施形態−高圧均質化
第１の実施形態１０を図２に示す。第１の実施形態１０は、第１のリザーバー（ｒｅｓｅｒｖｏｉｒ）１２を含む。第１のリザーバー１２は、ある量の溶液１４を保持するように設計されている。溶液１４は、溶液中に懸濁されたワクチン（図示されていない）を含む。第１の実施形態１０の溶液１４は、家禽、すなわち１日齢の孵化したての幼鳥に送達するためのＥｉｍｅｒｉａ種のオーシストベースのワクチンを含む。任意に、溶液１４はタンパク質分解酵素を含んでよい。タンパク質分解酵素は、幼鳥の消化管におけるワクチンのより効果的な取り込みを可能にし、これについては、以下で詳細に説明する。

溶液１４に関して、本明細書に記載された実施形態は、これらに限定されないが、Ｅｉｍｅｒｉａオーシストを含み、Ｅｉｍｅｒｉａオーシストは、Ｅ．ｍａｘｉｍａオーシスト、Ｅ．ｍｉｔｉｓオーシスト、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａオーシスト、Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａオーシスト、Ｅ．ｂｒｕｎｅｔｔｉオーシスト、Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘオーシスト、Ｅ．ｐｒａｅｃｏｘオーシスト、Ｅ．ｈａｇａｎｉオーシスト、Ｅ．ｍｉｖａｔｉオーシスト、及びこれらの任意の組み合わせからなるニワトリに感染する群から選択され；Ｅ．ｍｅｌｅａｇｒｉｍｉｔｉｓオーシスト、Ｅ．ａｄｅｎｏｉｄｅｓオーシスト、Ｅ．ｇａｌｌｏｐａｖｏｎｉｓオーシスト、Ｅ．ｄｉｓｐｅｒｓａオーシスト、Ｅ．ｉｎｎｏｃｕａオーシスト、Ｅ．ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓオーシスト、Ｅ．ｓｕｂｒｏｔｕｎｄａオーシスト、及びこれらの任意の組み合わせからなるシチメンチョウに感染する群から選択されるＥｉｍｅｒｉａオーシスト；Ｅ．ｚｕｅｒｎｉｉオーシスト、Ｅ．ｂｏｖｉｓオーシスト、Ｅ．ｅｌｌｉｐｓｏｉｄａｌｉｓオーシスト、及びこれらの任意の組み合わせからなるウシに感染する群から選択されるＥｉｍｅｒｉａオーシスト；Ｅ．ａｈｓａｔａオーシスト、Ｅ．ｂａｋｕｅｎｓｉｓオーシスト、Ｅ．ｃｒａｎｄａｌｌｉｓオーシスト、Ｅ．ｆａｕｒｅｉオーシスト、Ｅ．ｇｒａｎｕｌｏｓａオーシスト、Ｅ．ｉｎｔｒｉｃａｔａオーシスト、Ｅ．ｍａｒｓｉｃａオーシスト、Ｅ．ｏｖｉｎｏｉｄａｌｉｓオーシスト、Ｅ．ｐａｌｌｉｄａオーシスト、Ｅ．ｐａｒｖａオーシスト、Ｅ．ｗｅｙｂｒｉｄｇｅｎｓｉｓオーシスト、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるＥｉｍｅｒｉａオーシスト；及び、Ｅ．ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓオーシスト、Ｅ．ｖｅｊｄｏｖｓｋｙｉオーシスト、Ｅ．ｐｉｒｉｆｏｒｍｉｓオーシスト、Ｅ．ｃｏｅｃｉｃｏｌａオーシスト、Ｅ．ｉｒｒｅｓｉｄｕａオーシスト、Ｅ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓオーシスト、Ｅ．ｅｘｉｇｕａオーシスト、Ｅ．ｍａｇｎａオーシスト、Ｅ．ｐｅｒｆｏｒａｎｓオーシスト、Ｅ．ｍｅｄｉａオーシスト、Ｅ．ｓｔｉｅｄａｅオーシスト、及びこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるＥｉｍｅｒｉａオーシスト、を含む。

本明細書における実施形態は、オーシストからスポロシストを放出するためのシステム及び方法に関する。オーシストは、哺乳類対象及び鳥類対象を含むあらゆる動物対象に感染する原生動物由来であり得る。

本明細書に記載されたいくつかの実施形態は、また、原生動物のオーシストからスポロゾイトを放出する方法に関する。この出願は、Ｅｉｍｅｒｉａに焦点を当てているが、いくつかの他の原生動物は「オーシスト（ｏｏｃｙｓｔ）」と呼ばれる生活期を形成するが、オーシスト内にスポロゾイトを含み、スポロシストを産出しない場合がある。実施形態は、オーシスト内にスポロゾイトを含む寄生虫の任意の種のオーシストからスポロゾイトを放出するために実施することができ、アピコンプレックス門の任意の生物を含み、これらに限定されないが、クリプトスポリジウム及びプラスモジウムも含む。用語「原生動物（ｐｒｏｔｏｚｏａ）」、「オーシスト（ｏｏｃｙｓｔ）」、「スポロシスト（ｓｐｏｒｏｃｙｓｔ）」、「スポロゾイト（ｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ）」及び「メロゾイト（ｍｅｒｏｚｏｉｔｅ）」は、この技術分野において受け入れられている意味を有する。異なる定義がされていない限り、これらの用語は、生きた（すなわち、生存可能な）原生動物、オーシスト、スポロシスト、スポロゾイト及びメロゾイトを指すことを意図され、野生型又は弱毒化形態を含む。また、本明細書においては、遺伝子改変された原生動物、オーシスト、スポロシスト、スポロゾイト、及びメロゾイトも含まれる。

図２及び第１の実施形態１０に戻ると、第１のリザーバー入口１６は、第１のリザーバー１２の上部に固定されている。第１のリザーバー入口１６は、溶液１４を第１のリザーバー１２内に受け入れる。第１のリザーバー出口１８は、第１のリザーバー１２に固定されている。第１のリザーバー出口１８は、システムポンプ２０に接続されている。ポンプ２０は、溶液１４を、第１のリザーバー１２からシステムを通して移動させるように設計されている。

ポンプ出口２２は、ポンプ２０と処理システム２４との間に固定されている。第１の実施形態１０の処理システム２４は、高圧ホモジナイザー３２である。ホモジナイザー３２は、図３に示される、圧力バルブ２８及び少なくとも１つのオリフィス３４によって制御される高圧源２６を含む。処理システム２４は、図２に示される処理システム出口３８をさらに含む。処理システム出口３８は、処理システム内において、処理システム入口３６の反対側の端に配置されている。処理システム出口３８は、第２のリザーバー入口４２によって第２のリザーバー４０に接続されている。第２のリザーバー４０は、第２のリザーバー入口４２を通して受け取られたある量の溶液を保持するように設計されている。

第２のリザーバー４０は、第２のリザーバー出口４４も含む。第２のリザーバー出口４４は、送達デバイス４６に流体的に接続されている。この第１の実施形態１０において、送達デバイス４６は、霧状噴霧器である。送達デバイス４６は、送達中に立ち上る噴霧（ａ ｐｌｕｍｅ ｏｆ ｓｐｒａｙ）を霧状にするために、送達入口４８、ノズル５０、及びノズル５０に空気入口５４を有する。空気入口５４は、空気圧源５６と流体接続されている。あるいは、送達デバイス４６は、油圧スプレーノズルなどであってよい。

使用中、ポンプ２０は、溶液１４を、第１のリザーバー出口１８を通して第１のリザーバー１２の外へ移動させ、処理システム入口３６を通して処理システム２４内に移動させるように作動する。溶液の移動にポンプが使用される一方で、重力、バルブ、空気圧、及び他の方法を含む他の方法が、実施形態のいずれかにおける流体の移動に使用され得る。高圧ホモジナイザー３２によって供給される高圧空気は、溶液１４を少なくとも１つのオリフィス３４を通して移動させるために使用される。高圧空気は、５００ｐｓｉを超え、好ましくは５００〜６，０００ｐｓｉの範囲内である。

溶液１４が高圧下でオリフィス３４を通って移動するとき、オーシストは剪断力を受け、オーシスト膜は破壊又は破裂する。溶液１４がオリフィス３４を通った後、出口３８を通ってホモジナイザー３２を出て、入口４２を通って第２のリザーバー４０に移動する。膜が破壊又は破裂したそれぞれのオーシストは、遊離スポロシストを変性溶液５２に放出する。変性溶液５２（放出されたスポロシストと残留オーシストの組み合わせ）は、送達まで第２のリザーバー４０に一時的に保存される。

変性溶液５２が送達の準備ができると、変性溶液は、第２のリザーバー４０から第２のリザーバー出口４４を通して送達入口４８にポンプで送られる。変性溶液５２は、ノズル５０にポンプで送られ、加圧空気源５６からの加圧空気と混合される。加圧空気は、ノズル５０で変性溶液５２を霧状にして、動物の特定の対象に所定の噴霧プロファイルの形態で所定量の変性溶液を送達する。

別の構成では、高圧ホモジナイザー３２が、送達デバイス４６に直接接続されていてよい。この方法においては、ホモジナイザー３２によって生成された溶液は、第２のリザーバー４０に一時的に保存されるのではなく、送達デバイス４６を介して直接送達される。

オーシストの破壊に関する本明細書に記載された実施形態は、リアルタイムで送達されることが意図されていると留意されるべきである。スポロシストに基づき製造されたワクチンは、長期保存のためにスポロシストの生存能力を維持する凍結防止剤と、送達のための液体窒素コールドチェーンの実現を必要とするであろう。生存可能なスポロシストを放出するためのオーシスト膜の破壊に関する本明細書に記載された実施形態は、凍結防止剤溶液又は凍結保存などの他の特別な貯蔵条件を必要としない。

噴霧プロファイルは、所定の位置で動物に接触するように向けられている。本システムは、動物の顔の粘膜、特に眼又は口を対象とするように設計されている。ＰＣＴ国際公開第２０１７／０８３６６３Ａ１号、Ｋａｒｉｍｐｏｕｒ参照。ただし、噴霧プロファイルは、動物の体の他の部分を対象とするように設計できると理解される。本明細書に記載された実施形態は全ての動物に適用可能である可能性があると認識されるが、焦点は、家禽、特にニワトリ、より具体的には１日齢の孵化したての幼鳥に影響を与えるＥｉｍｅｒｉａの送達にある。変性溶液中の遊離スポロシストは、幼鳥の消化管に速やかに侵入することができる。鳥の眼、鼻腔、又は口に噴霧されたスポロシストは、消化管に移動する。羽毛などの鳥の体の他の部分に噴霧されたスポロシストは、自分自身の羽づくろいや他の鳥の羽づくろいなどの羽づくろいを通じて消化管に侵入し得る。

トリプシン又はキモトリプシンを含む腸管内のタンパク質分解酵素は、例えば、スポロシストの先端でスチーダ小体を消化し、感染性スポロゾイトの脱嚢を起こさせる。これにより、雛鳥はＥｉｍｅｒｉａに速やかに感染し、結果として免疫反応を起こす。

高圧ホモジナイザー２４（又は以下で詳細に説明される他の処理システム）は、システムに接続される必要がなく、処理をオフラインで実施でき、容器４０に送達することができると理解される。高圧ホモジナイザー２４又は他のシステムによるワクチンの処理は、噴霧送達システムの外部で、しかし、孵化場で送達するためのワクチンの準備とリアルタイムで同時に起こり得る。

５．２．２．第２の実施形態−ビーズ処理
本発明の第２の実施形態６０を図４に示す。第１の実施形態１０と同様の部分が、同様の番号インデックスで示される。第２の実施形態６０は、入口１６及び出口１８を有し、ある量の溶液１４を保持する第１のリザーバー１２を含む。第２の実施形態６０は、ポンプ２０及び圧力源２６もを含む。

第２の実施形態６０は、第２の処理システム６２をさらに含む。第２の処理システム６２は、ある量の溶液１４を保持することができる容器６４を含む。容器６４は、入口３６及び出口３８を有する。容器６４は、ガラス、セラミック又は金属ビーズなどのようなある量のアジテーター７０を含む。アジテーター７０は、球形ビーズ、又は、ある量で撹拌されたときに、その量に含まれる任意の溶液を粉砕する、粉々にする、又は他の方法で破壊する能力を有する任意の他の形状及び材料であり得ることに留意されるべきである。容器６４は、その軸の周りを回転できるように、水平、垂直、又はある角度で取り付けられている。容器６４は、容器６４をその水平軸上で回転させることができるスピナー７２に接続されている。スピナー７２は、作動時に容器を振動又は振とうすることを可能にする振動機構も有する。使用中、容器６４内でアジテーターにさらされた後の溶液１４は、以下でより詳細に説明される第２の変性溶液７４をもたらす。

第２の処理システム６２の出口３８は、入口４２によって第２のリザーバー４０に接続されている。第１の実施形態１０と同様に、第２のリザーバー出口４４は、最終的に動物に送達される送達デバイス４６に接続されている。

送達デバイス４６は、入口４８への第２の変性溶液７４の流れを制御するためのバルブを有する入口４８を含む。送達デバイス４６は、噴霧プロファイルを変更していくらかの噴霧を生じさせるように、又は、ノズル５０から流体の安定した流れを動物に直接提供するように、変更され得ることに留意されるべきである。

第２の実施形態６０の別の構成は、第１の実施形態１０に関して上述の別の構成と同様である。第２の実施形態６０は、第２の変性溶液７４をノズル５０に直接送達し、結果として第２のリザーバー４０の必要性を除外するように設計され得ることが想定される。

使用中、ポンプ２０及び圧力源２６が作動すると、ポンプは、溶液１４を、リザーバー出口１８を通して第１のリザーバー１２から第２の処理システム６２に移動させる。第２の処理システム６２は、スピナー７２によってその軸に沿って回転させられる。さらに、スピナー７２は、容器６４を振動及び／又は振とうさせる。振動及び回転により、アジテーター７０が容器の内壁に衝突して跳ね返り、溶液中のオーシスト膜の少なくとも一部が破壊され、結果としてそこに含まれるスポロシストが放出される。溶液１４中の破壊されたオーシスト膜及び生存可能なスポロシストは、第２の変性溶液７４を生成する。得られた第２の変性溶液７４は、容器６４から第２のリザーバー４０にポンプで送られ、そこで送達されるまで一時的に保持される。

送達の時間になると、第２の変性溶液７４は、第２のリザーバー４０から送達デバイス４６にポンプで送られる。第２の変性溶液７４は、送達デバイス入口４８からノズル５０にポンプで送られ、圧力源５６からの加圧空気と混合される。加圧空気は、ノズル５０で第２の変性溶液７４を霧状にして、所定の量の変性溶液７４を、所定の噴霧プロファイルの形態で、動物の特定の対象、この実施形態では１日齢の孵化したての幼鳥に送達する。

第２の実施形態６０の別の構成では、第２の変性溶液７４は、容器６４からノズル５０及び１日齢の孵化したての幼鳥の顔面粘膜に直接ポンプで送られる。最近破壊されたオーシスト膜と放出されたスポロシストは、幼鳥によって摂取され、消化管に速やかに感染する。幼鳥は、Ｅｉｍｅｒｉａに対する免疫反応を迅速に発達させ、良好な健康状態を維持することができる。

５．２．３．第３の実施形態−超音波処理
第３の実施形態８０は、第３の実施形態の処理システム８１を除いて、上述の第１の実施形態１０及び第２の実施形態６０と同様である。図５に示された第３の実施形態８０は、第１のリザーバー１２及びポンプ２０を含む。第３の実施形態８０は、超音波プローブ１１０を容器１１２内にさらに含む。超音波プローブ１１０は、電源（図示されていない）をさらに含む。超音波処理は、溶液中に直接配置されたプローブ、又は、容器の外部に配置された間接的な発生源で行うことができる。間接的な発生源は、水で満たされた浴中での超音波処理のような発生源であり得る。超音波装置という用語は、超音波プローブ及び容器の外部の間接的な発生源を含む。

溶液１４内の液体懸濁液中のオーシストは、作動すると振動する超音波プローブ１１０に近接して容器１１２を通過させられる。振動の好ましい範囲は、約１８ｋＨｚから１ＭＨｚの間である。溶液１４に与えられたエネルギーは、オーシスト膜の少なくとも一部を破壊するキャビテーションのサイクルを生じさせる。システムを通る振動周波数及び流速は、生存可能なスポロシストが無傷で容器１１２を出る間に、オーシスト膜が破壊されるように制御される。得られた第３の実施形態の溶液１１４は、噴霧器などの送達デバイス４６に直接送達されるか、又は第１の実施形態１０及び第２の実施形態６０の及びそれらの代替物に関する上述の第２のリザーバー４０などの保持容器に送達される。

第３の実施形態８０の別の構成では、第３の変性溶液１１４は、容器１１２からノズル５０及び１日齢の孵化したての幼鳥の顔面粘膜に直接ポンプで送られる。最近放出されたスポロシストと残留オーシストは、幼鳥によって摂取され、消化管に速やかに感染する。幼鳥は、Ｅｉｍｅｒｉａに対する免疫反応を迅速に発達させ、良好な健康状態を維持することができる。

様々な商用ベンダーが、様々な構成を持つ超音波破砕機を提供している。ベンダーの例は、Ｑｓｏｎｉｃａ（Ｎｅｗｔｏｎ，ＣＴ）及びＨｉｅｌｓｃｈｅｒ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ ＧＭＢＨ（Ｔｅｌｔｏｗ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が含まれる。

５．２．４．第４の実施形態−ローターステーターミキサー
第４の実施形態１２０は、ローターステーターミキサー処理システム１１６を容器１２２内で使用し、図６に示される。ローターステーターミキサー１１６は、高速で回転する分散ヘッド又はジェネレーター１２４をその中に有する。第４の実施形態１２０は、ローターステーターミキサー１１６と流体連通する第１のリザーバー１２、ポンプ２０、及び送達デバイス４６を含む。

使用中、ローターステーターミキサー１１６が作動し、これは、分散ヘッド又はジェネレーター１２４を高速で回転させる。ミキサー１１６は、第１のリザーバー１２から溶液１４を受け取る。溶液１４は、高速で回転する分散ヘッド又はジェネレーター１２４にさらされる。これは、ミキサー１１６の内部で生成された力の結果として、オーシスト膜の少なくとも一部への剪断をもたらし、スポロシストの少なくとも一部が放出される。得られた溶液１１８は、送達デバイス４６に移動させられ、そこで動物に送達される。上述したように、第４の実施形態１２０の別の構成は、溶液１１８を受け取るための第２のリザーバー４０を含み、これは、その後、１日齢の孵化したての幼鳥に送達される。

５．２．５．第５の実施形態−振動板
第５の実施形態１４０は、図７に示され、処理システム１４６を除いて、上述の第１の実施形態１０、第２の実施形態６０、第３の実施形態８０、及び第４の実施形態１２０と同様である。第５の実施形態１４０は、第１のリザーバー１２及びポンプ２０を含む。第５の実施形態１４０は、第５の処理システム１４６を格納容器１４７内に含み、一対のプレート１４４、１４５から構成されている。プレート１４４、１４５は、間にいくらかの間隔を開けて、一方が他方の上に取り付けられている。第１のプレート１４４は平坦であり、振動機構（図示されていない）に接続されている。振動機構は、プレート１４４を振動させる。第２のプレート１４５は、プレート１４４と１４５との間を通過する間にオーシスト膜を破壊するために必要に応じて、様々な程度の平滑さ又は粗さを有してよい。プレート１４４、１４５が互いの上にあるとき、第２のプレート１４５は、第１のプレート１４４と接触している。

使用中、溶液１４は、第５の処理システム１４６に移動させられる。溶液１４の流れは、プレート１４４、１４５の間に向けられる。振動機構が作動して、第１のプレート１４４を第２のプレート１４５に対して振動させる。溶液１４がプレート１４４、１４５の間を移動するとき、溶液１４中のオーシストの膜の少なくともいくつかは、それらが２つのプレートの間を通過するときに破壊され、変性溶液１４８を生成する。改変された溶液１４８は、送達デバイス４６に直接送達されるか、又は第２のリザーバー４０などの保持容器に送達される。

５．３．第六の実施形態−流体力学的キャビテーション
第６の実施形態１５０は、局所圧力の減少及びそれに続く増加の結果として液体中で発生する気化、気泡生成、及び気泡内破のプロセスを説明する。キャビテーション（液体内の圧力の急激な変化により、圧力が上昇すると崩壊することができる小さな蒸気で満たされた空洞が形成される現象）が、圧力が液体の飽和蒸気圧を下回り、それに続いてその蒸気点を上回って回復すると起こる。これは、液体をくびれたチャネルに通過させることによって生成できる。気泡の生成プロセス、及びそれに続くキャビテーション気泡の生成と崩壊は、高いエネルギー密度と、気泡の表面に圧力をもたらす。初期の研究では、窒素によるキャビテーションが検討されたが、同様の結果を得るために任意のガスが使用できる。この例では、窒素は圧力下で対象生物（Ｅｉｍｅｒｉａ）の細胞質に溶解する。環境との平衡に達した後、対象懸濁液は圧力の変化に突然さらされ、Ｅｉｍｅｒｉａの細胞質に窒素気泡が形成される。細胞内における気泡形成とそれに続く気泡膨張のプロセスは、細胞膜を引き伸ばし、最終的に破壊させる。これらの気泡は、発泡の結果として細胞の外側に損傷を与える（圧力の低下の結果として水溶液からガスが逃げ、泡の生成と細胞の溶解につながる可能性がある。）。Ｅｉｍｅｒｉａの複数種のオーシスト懸濁液で試験した場合、オーシスト外壁の溶解とそれに続く内部のスポロシストの放出が観察された。このプロセスは通常、加圧容器内で行われる。容器は、高圧に耐えることができる厚いステンレス鋼のケーシングと、ガスを送達するための入口及び調整可能な排出バルブを備えた出口ポートからなる。

第６の実施形態１５０は、図８に示され、第６の処理システム１５４を除いて、上述の第１の実施形態１０、第２の実施形態６０、第３の実施形態８０、第４の実施形態１２０、及び第５の実施形態１４０と同様である。第６の実施形態１５０は、第１のリザーバー１２及びポンプ２０を含む。第６の実施形態１５０は、加圧された金属筐体１５２、及びガス入口バルブ１５６から構成される第６の処理システム１５４を含む。加圧された金属筐体１５２は、充填コネクタ１５８を介してガスタンク源１６０に接続されている。ガスは、充填コネクタ１５８を通して入口バルブ１５６に送られ、そこで、ガスは、金属筐体１５４内に存在する水溶液（図示されていない）を飽和させる。溶液は、前の実施形態と同様の方法で、入口３６を介して筐体に入る。レギュレーター（図示されていない）が、最適な飽和を達成するためにガスフローから生じる圧力を制御するために使用される。

使用中、溶液１４は、第６の処理システム１５４に移動させられる。その後、第６の処理システム１５４は、密封され、加圧される。タンク１６０が密閉された加圧タンク１５２に窒素を放出すると、窒素は圧力下でオーシストの細胞質に溶解する。環境との平衡に達した後、タンク１６０からの窒素の流れは停止され、筐体１５２は解放される。流体力学的キャビテーションが、圧力の急激な変化によりオーシストの細胞質内で発生し、外膜の少なくとも一部が破壊され、内部の内容物、すなわちスポロシストが放出される。これは、変性溶液１６２を生成し、これは、送達デバイス４６に直接送達されるか、又は、第２のリザーバー４０などの保持容器に送達される。

５．４．第７の実施形態−高圧噴霧
オーシストをせん断し、無傷のスポロシストを放出する方法は、衝撃の力がオーシスト壁を破裂させて生存可能なスポロシストを放出するように、オーシストの懸濁液を静止物体に高速で噴霧することを含み得る。さらに、オーシストの懸濁液を回転ディスクなどの動く対象に噴霧して、遭遇する力の組み合わせがオーシストをせん断してもよい。噴霧された懸濁液の速度及び回転ディスクの速度は、剪断プロセスの最適化を提供するために調整され得る。回転ディスクの表面の特徴は、オーシストを剪断するために必要に応じて、様々な程度の平滑さ又は粗さを生み出すように変更され得る。

第７の実施形態１７０は、図９に示され、第７の処理システム１７２を除いて、上述の第１の実施形態１０、第２の実施形態６０、第３の実施形態８０、第４の実施形態１２０、第５の実施形態１４０、及び第６の実施形態１５０と同様である。第７の実施形態１７０は、第１のリザーバー１２及びポンプ２０を含む。第７の実施形態１７０は、高圧噴霧又は流体の流れを送達するノズル１７８又は他のシステムを含む第７の処理システム１７２を含む。流体はノズルから放出され、容器１７４の壁などの固体の静止面又は回転プレート１７６のいずれかに衝突する。

使用中、溶液１４は、第７の処理システム１７２に移動させられる。溶液１４の流れは、ノズル１７８を通って向けられる。容器１７４の壁又は回転プレート１７６に対する溶液１４の衝撃の力は、オーシスト膜の少なくとも一部を破壊し、変性溶液１８０の生成をもたらす。変性溶液１８０は、送達デバイス４６に直接送達されるか、又は、第２のリザーバー４０などの保持容器に送達される。

５．５．追加の実施形態
上述の実施形態は、溶液をシステムの中を移動させる手段として、しばしば、ポンプと呼ばれるが、高圧空気及び重力供給などの他のでデバイスも使用され得ることが想定されることがさらに理解される。

これらの実施形態は、オーシスト及びスポロシストベースの溶液に焦点を合わせているが、本明細書に記載された溶液は、ウイルス、細菌、酵母、哺乳動物細胞、植物細胞、又は任意の遺伝子改変された生物からなるワクチンを含む他の生ワクチンを含み得ることがさらに理解される。そのようなウイルス、細菌などを含む溶液が、ワクチンの特定の特性に基づいて、ある実施形態に他の実施形態よりも適している可能性があることは、当業者には明らかである。

本明細書に記載されたシステム及び方法は、ワクチン応答の効率の向上が、割れたオーシストから新たに放出され、その後、噴霧によって送達されてＥｉｍｅｒｉａ感染を始めるスポロシストを使用して達成できることを実証する。上述のシステム及び方法を使用した一連の実験が完了した。結果を以下に示す。オーシストベースのワクチンに対する、ワクチン接種の時にスポロシストを生成し、スポロシストベースのワクチンを送達することの利点は、予想外に陽性であり、レシピエントに予想よりも高い反応を生じさせた。

本明細書に記載された解決策は、Ｅｉｍｅｒｉａオーシストベースのワクチンであるが、本明細書に記載されたシステム及び方法を使用して送達することもできる他のオーシストベースのワクチンがあり得ることが想定されることを理解されるべきである。好ましい実施形態は、主にニワトリ及びシチメンチョウ用のＥｉｍｅｒｉａワクチンに関するが、当業者は、ウシ、ヤギ、ウサギ、又はヒツジなどの哺乳動物用のＥｉｍｅｒｉａワクチンに関する他の実施形態を認識するであろう。また、本明細書に開示された技術は、そのようなワクチンが野生型であるか弱毒化されているかにかかわらず、任意の種の改良されたアピコンプレックス門ワクチンに有用である。

本明細書に開示されたシステム及び方法は、水産養殖での使用に適合させることができる。魚類に感染するＥｉｍｅｒｉａの例は、これらに限定されないが、Ｅ．ａｕｒａｔｉ、Ｅ．ｂａｕｅｒｉ、Ｅ．ｌｅｐｉｄｏｓｉｒｅｎｉｓ、Ｅ．ｌｅｕｃｉｓｃｉ、Ｅ．ｒｕｔｉｌｉ、及びＥ．ｖａｎａｓｉを含む。ワクチン接種の目的で、より感染性の高い生活期の放出を促進するために適用可能な場合、これらの種に破壊プロセスを適用することができる。

本明細書に記載された全ての実施形態は、動物に個別に又はまとめて適用できることにも留意すべきである。本明細書に記載された実施形態は、木箱（ｃｒａｔｅ）又は他の容器に含まれ、水溶液の送達を受ける、孵化したての幼鳥又は他の動物の大きな群に適用できること留意されるべきである。送達は、混合するとゲルを形成する二成分水溶液の形態であり得る。発明者Ｊａｍｅｓ Ｈｕｔｃｈｉｎｓにより２０１９年７月１０日に出願されたＰＣＴ出願シリアル番号 、代理人整理番号６７３−０４−ＰＣＴ参照。

５．６．組換えタンパク質を送達するためのベクターとしてのＥｉｍｅｒｉａ
本明細書に開示された方法及びシステムは、他の抗原を送達するベクターとして機能するように、組換え修飾されたＥｉｍｅｒｉａと共に使用され得る。破壊された細胞材料を含む鳥又は他の動物のためのワクチンは、ウイルス感染細胞に由来するワクチン又は天然若しくは組換えタンパク質産物又は哺乳動物細胞、植物細胞、真菌細胞、酵母細胞、又は細菌細胞などの細胞内断片を産生するために使用される細胞系に由来するワクチンを含む、本明細書に記載されたシステム及び方法によって投与され得る。

最近の研究は、Ｅｉｍｅｒｉａがうまくトランスフェクトされ、外来抗原を発現するために使用され得ることを示している。そのような抗原は、家禽に影響を与える疾患に対するウイルス、細菌、若しくは他の抗原、又は、単独で又は抗原と組み合わせて使用されて免疫系を刺激する他のタンパク質若しくは配列を含むことが期待される。さらに、Ｅｉｍｅｒｉａの他の種からの抗原を発現させることができ、Ｅｉｍｅｒｉａの単一種の投与からＥｉｍｅｒｉａの複数の種に対する交差防御（ｃｒｏｓｓ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ）を発達させることができる。例えば、Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．と他の研究者は、Ｅｉｍｅｒｉａ寄生虫が多価ワクチンベクターとして開発されることを示す結果を示し、これらの研究の拡大を推奨している。Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｅｉｍｅｒｉａ ｓｐｅｃｉｅｓ ｐａｒａｓｉｔｅｓ ａｓ ｎｏｖｅｌ ｖａｃｃｉｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａｎｔｉ−Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ−ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ＣｊａＡ，Ｖａｃｃｉｎｅ ３０（１６）２６８３−２６８８；Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｓｔａｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ：Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＹＦＰ−ＹＦＰ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｔｈｒｏｕｇｈｏｕｔ ｔｈｅ ｌｉｆｅ ｃｙｃｌｅ，Ｉｎｔ’ｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｆｏｒ Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ，３９（１）１０９−１１７；及びＭａｒｕｇａｎ−Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｖｉｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｔｏｚｏａｎ ｐａｒａｓｉｔｅ Ｅｉｍｅｒｉａ ｔｅｎｅｌｌａ ａｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｃｈｉｃｋｅｎ ｉｍｍｕｎｅ ｓｙｓｔｅｍ，Ｐａｒａｓｉｔｅｓ ＆ Ｖｅｃｔｏｒｓ ９：４６３（ｐｕｂ．Ａｕｇ．２６，２０１６，１４ｐａｇｅｓ）参照。同様に、Ｅｉｍｅｒｉａ又は他のアピコンプレックス門は、特定の宿主に他の抗原を送達するためのベクターとして設計することができる。

以下の例は、開示をさらに説明するものであり、範囲を限定することは意図されていない。この開示は、説明された特定の実施形態に限定されず、それ自体、もちろん、変化し得ると理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定することは意図されていないことも理解されるべきである。

６．例
６．１．強制給餌（ｇａｖａｇｅ）（オーシスト対スポロシスト）
経口強制給餌、つまり口からの送達は、鳥へのオーシストの送達のゴールドスタンダードであると考えられている。市販のブロイラーワクチンを使用した研究では、経口強制給餌による結果は、予想よりも変動することがわかった。特に、以下の結果は、強制給餌によって送達されたオーシストからの感染性が、Ｅｉｍｅｒｉａ種及び試験日によって大きく異なることを示した。この観察により、陽性対照のための別の送達手段として、眼への投薬（点眼薬）を試験することになった。さらに、オーシストを破壊してスポロシストを放出することは、強制給餌によって送達された場合、より効果的であることがわかった。オーシスト膜の破壊は、手動プロセスにより４ｍｍガラスビーズと共に複数種オーシストの懸濁液を振とうすることによって達成された。１日齢の孵化したての幼鳥は、オーシストを割るために素嚢に飼料が必要であるという仮説が立てられるかもしれない。実験環境及び通常の孵化場では、幼鳥は、保管及び輸送に起因して３〜８時間にわたって飼料を受け取らず、オーシストが未処理で腸管を通過することができる。点眼薬によるワクチン接種は、腸に到達するオーシストの動きを遅くし、オーシストを様々な酵素にさらす可能性がある。

ワクチン接種前のオーシスト膜の機械的破壊は、スポロシストの処理を容易にし、高い割合の鳥が効果的にワクチン接種され、７日目に高いレベルのオーシスト産生（アウトプット）が検出されるという結果をもたらす。これは、小さな種、例えば、Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａより、Ｅ．ｍａｘｉｍａのような大きな種、及び、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａのような中型の種に重要であると思われる。小さな種は、割れていてもいなくても、同様に感染性があるように見える。研究は、大きなオーシスト、続いて中型のオーシストの膜の破壊に焦点を当てた。ブロイラーの雛に、１倍用量の市販のワクチンを、孵化日にワクチン接種した。それぞれの鳥から７日目に腸内容物を収集し、ＭｃＭａｓｔｅｒチャンバーによりオーシストを種ごとに数えた。

表１：オーシスト又はスポロシストの強制給餌の感染性の比較

時間の経過に伴い、強制給餌ワクチン接種は、７日目の様々な結果によって検出されるように、一貫性のない感染性をもたらした。より期待の持てる結果は、スポロシストを放出するように処理されたワクチンと点眼薬によって送達されたワクチンとで認められた。

６．２．強制給餌オーシスト対スポロシスト
別の実験では、オーシストの破壊は、手動プロセスにより４ｍｍガラスビーズと共に複数種オーシストの懸濁液を振とうすることによって達成された。残留オーシストの計数により、Ｅ．ｍａｘｉｍａオーシストの約６４％がスポロシストに、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａオーシストの５１％がスポロシストに、Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａオーシストの１７％がスポロシストに変換されたことが示された。孵化日の雛（処理あたり１５羽）に、オーシスト、又は、ガラスビーズで放出されたスポロシストを残留オーシストと共に強制給餌により接種し、７日目に腸内容物を収集した。

表２：オーシスト、又は、残留オーシストを伴うスポロシストの強制給餌による反応の頻度と振幅の比較

反応の頻度について上に示した改善は、スポロシスト処理に感染している鳥とオーシスト処理に感染している鳥のパーセンテージとの差である。反応の振幅について示した改善は、オーシスト処理の鳥１羽あたりのオーシストのアウトプットで割った、スポロシスト処理の鳥１羽あたりのオーシストのアウトプットである。

この特定のケースでは、オーシストベースのワクチンと比較して、残留オーシストを含むスポロシストワクチンを経口ワクチン接種した雛では、反応の頻度と振幅の両方が増加した。

強制給餌された鳥で観察された感染性の様々な比率は、孵化場で投与されたオーシストベースのワクチンの有効性についての問題を提起する。孵化場でオーシストベースのワクチンを投与された鳥は、Ｅ．ｍａｘｉｍａオーシストをスポロシストの期に処理するために特に重要な、飼料と砂粒が消化管に存在しない。もしそうであれば、これらの鳥は、一次感染において低レベルのＥ．ｍａｘｉｍａ感染性を示すリスクがある。その後、二次感染において、大規模な未感作集団が、損傷した腸組織における二次細菌感染の追加のリスクと共に、きわめて高い感染とアウトプット比率のリスクを提供することになる。確かに、この状況はしばしばあり、ある人たちが、ワクチン接種を回避し、代わりに飼料中に抗コクシジウム剤及び化学物質を使用する主な理由の１つである。孵化場で眼噴霧によって投与されるスポロシストベースのワクチンの使用は、一次感染におけるＥ．ｍａｘｉｍａの感染性を著しく改善する可能性があり、結果として、飼育施設での重度のコクシジウム症感染と二次感染中の副次的な感染のリスクを防ぐ。

６．３．点眼薬オーシスト対スポロシスト
別の実験では、オーシスト膜の破壊は、手動プロセスにより４ｍｍガラスビーズと共に複数種オーシストの懸濁液を振とうすることによって達成された。残りのオーシストの計数により、Ｅ．ｍａｘｉｍａオーシストの約５２％がスポロシストに、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａオーシストの２６％がスポロシストに、Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａオーシストの４７％がスポロシストに変換されたことを示された。孵化日の雛（処理あたり１５羽）に、オーシスト、又は、ガラスビーズで放出されたスポロシストと残留オーシストを点眼薬により接種し、７日目に腸内容物を収集した。

表３：オーシスト、又は、残留オーシストを含むスポロシストワクチンの点眼薬投与による反応の頻度と振幅の比較

スポロシスト処理群は、Ｅ．ｍａｘｉｍａ及びＥ．ｔｅｎｅｌｌａに対する反応の頻度及び振幅の両方に改善された結果をもたらしたことがわかった。未処理の対照鳥の腸内容物には、オーシストは観察されなかった。

６．４．噴霧によるスポロシストの送達
次の一連の実験では、スポロシストの放出は、手動プロセスにより４ｍｍガラスビーズと共に複数種オーシストの懸濁液を振とうすることによって達成された。残りのオーシストの計数により、プロセスは、大きなオーシスト（Ｅ．ｍａｘｉｍａ種）の少なくとも６６％がスポロシストに、中型のオーシスト（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ種）の７５％がスポロシストに、小さなオーシスト（Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ及び他の小さな種）の１３％がスポロシストに変換したと計算された。孵化日の雛（処理あたり１５羽）を静止位置に保持し、上述の未処理のオーシスト処理又はガラスビーズで放出されたスポロシスト処理のいずれか用いてデバイスから噴霧した。噴霧は、雛の顔面粘膜に向けられた、液体と空気の両方の圧力を利用する空気噴霧ノズルを経て投与した。その後、鳥に飼料と水を与え、７日間にわたり成長させた後、それぞれの鳥の腸内容物を収集するために屠殺した。以下は、これらのそれぞれの噴霧ワクチン接種の実験に関連するデータ表である。

表４：研究Ａのためのオーシスト又はスポロシストが噴霧された鳥の反応の頻度と振幅

表５：研究Ｂのためのオーシスト又はスポロシストが噴霧された鳥の反応の頻度と振幅

表６：研究Ｃのためのオーシスト又はスポロシストが噴霧された鳥の反応の頻度と振幅

オーシストの計数により、感染の頻度と反応の振幅の両方がスポロシスト処理によって改善されたことがわかった。

３つの実験全てにわたって、未処理の対照鳥の腸内容物にオーシストは観察されず、点眼薬により接種された陽性対照は、実験的噴霧処理群よりも高い感染性の頻度及び振幅をもたらした。

表４、５、及び６に示された結果は、予期できなかったと理解されるべきである。結果は、スポロシストワクチン接種を経たワクチンの予想よりも高い取り込みが、雛で起こったことを示している。これは、部分的には、雛が消化管内で壊れていないオーシストを適切に処理できないことが一因であると考えられる。雛のスポロシストによる感染は、かなりの数の雛がスポロシストを処理して感染することができるが、オーシストでは感染しないことを示す。この効果は、Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａよりもＥ．ｍａｘｉｍａ及びＥ．ｔｅｎｅｌｌａに多く見られる。したがって、雛の素嚢（ｃｒｏｐ）及び砂嚢を含む上部消化器系には研磨物質が存在しないため、Ｅ．ｍａｘｉｍａオーシスト及びＥ．ｔｅｎｅｌｌａオーシストは簡単には壊れないと考えられる。スポロシストは、雛の消化器系にスポロゾイトの脱嚢のための研磨物質を必要としない。スポロシストは、消化管内で、プロテアーゼなどの酵素によって、感染性のスポロゾイトの生活期に簡単に処理される。

別の実験では、鳥に、静止状態でワクチン接種し、成長させ、７日目に鳥の腸内容物を収集するために屠殺したところ、スポロシスト対オーシストの接種の影響が見られた。ただし、この場合、雛には、液圧と空気圧の両方ではなく、液圧のみを利用したノズルで噴霧した。空気圧の欠如は、霧状の円錐形と比べて、ワクチンの流れのような液体ディスペンスを生成した。この実験の結果を、以下の表に示す。

表７：空気圧なしでオーシスト又はスポロシストが噴霧された鳥の反応の頻度と振幅

未処理の対照鳥の腸内容物にオーシストは観察されず、点眼薬により接種された陽性対照は、実験的噴霧処理群よりも高い感染性の頻度及び振幅をもたらした。応答の頻度と応答の振幅は、Ｅ．ｍａｘｉｍａの方が数値的に大きく、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａとＥ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａの程度は小さかった。これらの結果は、ノズルからの噴霧パターンにかかわらず、残留オーシストを伴うスポロシスト溶液の投与が、オーシスト溶液と比較して改善された結果をもたらすことを示す。

オーシストを手動で処理してスポロシストを放出させることに加えて、ＩＫＡ Ｕｌｔｒａ Ｔｕｒｒａｘデバイス（ＩＫＡ^（Ｒ）−Ｗｅｒｋｅ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．，Ｓｔａｕｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）とガラスビーズを使用して自動で処理した。ガラスビーズをワクチン容量に加え（ホウケイ酸ガラスボール、サイズ１〜６ｍｍ）、４，０００〜８，０００ｒｐｍで２０〜２４０秒間にわたり処理した。オーシストせん断の結果は、再現性が改善された手動プロセスと同等であった。ＩＫＡ ＵＴＴＤデバイスによって処理された後の残りのオーシストの計数により、Ｅ．ｍａｘｉｍａオーシストの約７６％がスポロシストに、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａオーシストの７０％がスポロシストに、Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａオーシストの４６％がスポロシストに変換されたことが示された。前述の方法と同じ方法で、ブロイラー雛を使用した実験により、以下の結果が得られた。

表８：オーシスト、又は、ＩＫＡ ＵＴＴＤデバイスによって処理された、残留オーシストを伴うスポロシストを噴霧された鳥の反応の頻度と振幅

未処理の対照鳥の腸内容物にオーシストは観察されず、点眼薬により接種された陽性対照は、実験的噴霧処理群よりも高い感染性の頻度及び振幅をもたらした。反応の頻度及び応答の振幅は、数値的に、Ｅ．ｍａｘｉｍａ及びＥ．ｔｅｎｅｌｌａでに大きく、Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａでは小さかった。このデータは、ＩＫＡ ＵＴＴＤデバイスがオーシストをせん断してスポロシスト／残留オーシスト溶液を生成し、手動振とうプロセスと同様の結果を提供できることを示唆する。さらに別の実験では、スポロシストとオーシストのワクチン接種の違いを見ることができる。この実験では、スポロシストの放出は、４ｍｍガラスビーズと共に複数種オーシストの懸濁液を手で振とうすることによって達成された。このスポロシスト／残留オーシスト溶液及びオーシストのみの溶液を、顔面粘膜に向けて孵化日に投与した。２％アルギン酸ナトリウム溶液を投与する第１のセットと、３．０％塩化カルシウム溶液中のワクチンを投与する第２のセットとの２セットのノズルが使用された。これらの２つの溶液が鳥の表面で接触すると、ゲルが形成される。ゲルの生成は、オーシスト／スポロシストワクチンを、通常の水性噴霧と比較してより長く水和状態に保ち、鳥の潜在的な毛づくろいの時間を長くするという仮説が立てられる。２０１９年７月１０日に出願されたＰＣＴ番号 、Ｈｕｔｃｈｉｎｓ、代理人整理番号６７３−０４−ＰＣＴ参照。この実験の結果を、以下の表に示す。

表９：ゲル中のオーシスト又は残留オーシストを伴うスポロシストを噴霧した鳥の反応の頻度と振幅

未処理の対照鳥の腸内容物にオーシストは観察されず、点眼薬により接種された陽性対照は、実験的噴霧処理群よりも高い感染性の頻度及び振幅をもたらした。これらの結果は、ゲル製剤のスポロシストが、反応の頻度及び振幅の両方でオーシストのみを上回ったことを示す。より小さいＥ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ種の感染性は、スポロシストではなくオーシストとして投与された場合でも、比較的高いことが留意されるべきである。感染性データは、Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａオーシストが、飼料と砂粒が存在するか否かにかかわらず、ニワトリの消化管で、スポロシストの生活期に、その後、スポロゾイトの生活期に、効率的に処理されることを示す。

強制給餌の感染性の証拠は、Ｅ．ｍａｘｉｍａが、特に、消化管に飼料又は砂利が存在しなければ、ｉｎ ｖｉｖｏでスポロシスト期へ処理されない可能性があることを示す。Ｅ．ｍａｘｉｍａと、やや程度は低いがＥ．ｔｅｎｅｌｌａとからの感染性は、投与前にオーシストの生活期をスポロシストの生活期に前処理することによって増強される。しかし、ｉｎ ｖｉｔｒｏでは、より大きなＥ．ｍａｘｉｍａオーシストを割るために必要なせん断力は、より小さなＥ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａオーシストを割るために必要なせん断力よりもはるかに小さくなる（欧州特許第２，１１１，２４３Ｂ１（Ｈｕｔｃｈｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｅｍｂｒｅｘ，Ｉｎｃ．））。したがって、使用時にスポロシストを生成するシステムは、より大きなオーシスト種を割るｉｎ ｖｉｔｒｏ効率と、より小さなオーシスト種を処理するｉｎ ｖｉｖｏ効率を組み合わせて、より強力なワクチン効果をもたらす補完的な作用を提供する。

６．５．高圧ホモジナイザーの結果
６．５．１．オーシスト減少数−ｉｎ ｖｉｔｒｏ
混合Ｅｉｍｅｒｉａ種のオーシストを含む液体懸濁液を、高圧ホモジナイザー（ＨＰＨ）ＩＫＡ ｍｏｄｅｌ ２０００−４で様々な圧力で処理した。細胞懸濁液を、ＨＰＨの入口に投入し、圧力の範囲（２００〜１５００ｂａｒ）で処理し、その後、出口から出した。液体製剤に含まれる無傷のオーシストを、ＨＰＨにさらす前後にＭｃＭａｓｔｅｒの浮遊チャンバーを使用して計数した。結果を以下の表に示す。

表１０：高圧均質化（ＨＰＨ）を用いて様々な圧力で処理された残留オーシストの比較

結果は、圧力が高いほど、オーシストの減少パーセントが高くなり、したがって、スポロシストの放出パーセントが高くなったことを示した。

オーシスト又はスポロシストを噴霧した鳥の反応の頻度と振幅−ｉｎ ｖｉｖｏ

この実験では、鳥を、オーシスト溶液、又はＩＫＡ ＨＰＨ ２０００−４デバイスによって処理された、残留オーシストを伴うスポロシスト溶液からなるノズル噴霧にさらした。その後、鳥に飼料と水を与え、成長させ、７日目にそれぞれの腸内容物を収集するために屠殺した。この実験の結果を以下の表に示す。

表１１：未処理のオーシスト対ＩＫＡ ＨＰＨ ２０００−４によって２００ｂａｒで処理されたオーシストの感染性の比較

表１２：未処理のオーシスト対ＩＫＡ ＨＰＨ ２０００−４によって５００ｂａｒで処理されたオーシストの感染性の比較

１５羽の未処理の対照鳥の腸内容物には、どの種のオーシストも観察されなかった。点眼薬により接種された陽性対照は、感染性の１００％の頻度（全ての種にわたって）と、実験的処理群と比較して、より高い振幅（全ての種にわたって）をもたらした。ＩＫＡ ＨＰＨのオーシスト減少パーセントは、ｉｎ ｖｉｔｒｏデータからは満足のいくように見えたが、均質化プロセスから生成されたスポロシストも損傷を受けたため、ｉｎ ｖｉｖｏデータでは低い頻度と振幅の反応が得られるという仮説が立てられる。

６．６．ローターステーター状デバイスの結果
６．６．１．オーシスト減少数−ｉｎ ｖｉｔｒｏ
混合Ｅｉｍｅｒｉａ種を含む液体オーシスト懸濁液は、シングルパスのインラインローターステーター状のデバイスであるＩＫＡ Ｍａｇｉｃ Ｌａｂによって、様々な速度で処理された。細胞懸濁液を、Ｍａｇｉｃ Ｌａｂのホッパーに投入され、１〜３個のローターステータージェネレーターで様々な速度（３，０００〜２６，０００ｒｐｍ）で処理し、出口から出した。この実験に使用されたジェネレーターは６Ｆモデルであった。液体製剤中の無傷のオーシストを、Ｍａｇｉｃ Ｌａｂデバイスで処理する前後にＭｃＭａｓｔｅｒの浮遊チャンバーを使用して計数した。結果を以下の表に示す。

表１３：ローターステーターを用いて様々な速度で処理された残留オーシストの比較

オーシストの減少はＥ．ｍａｘｉｍａで一貫して観察されたが、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａでは変動する減少が観察され、Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａでは非常に小さいの減少が観察された。

オーシスト又はスポロシストを噴霧した鳥の反応の頻度と振幅−ｉｎ ｖｉｖｏ

この実験では、孵化日のブロイラー雛を、オーシスト溶液、又はＩＫＡ Ｍａｇｉｃ Ｌａｂデバイスによって処理された、残留オーシストを伴うスポロシスト溶液からなるノズル噴霧にさらした。その後、鳥に飼料と水を与え、成長させ、７日目に鳥の腸内容物を収集するために屠殺した。この実験の結果を以下の表に示す。

表１４：未処理のオーシスト対ＩＫＡ Ｍａｇｉｃ Ｌａｂによって１６，０００ｒｐｍで処理されたオーシストの感染性の比較

表１５：未処理のオーシストとＩＫＡ Ｍａｇｉｃ Ｌａｂによって２６，０００ｒｐｍで処理されたオーシストの感染性の比較

１５羽の未処理の対照鳥の腸内容物には、どの種のオーシストも観察されなかった。点眼薬により接種された陽性対照は、感染性の１００％の頻度（全ての種にわたって）と、実験的処理群と比較して、より高い振幅（全ての種にわたって）をもたらした。両方のＭａｇｉｃ Ｌａｂ処理群でＥ．ｍａｘｉｍａの反応の頻度が増加したが、これらのそれぞれの処理群の反応の振幅は、オーシスト処理群に属するものよりも小さかったものの、依然として許容範囲内であった。応答の頻度と振幅は、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａで最も顕著に増加しました。これらの結果は、Ｅ．ｍａｘｉｍａオーシストが使用された条件下で過剰に処理されたことを示している可能性がある。

６．７．流体力学的キャビテーション実験
６．７．１．流体力学的キャビテーションでのｉｎ ｖｉｔｒｏ研究
初期試験には、窒素充電器用アタッチメントとコンセントを備えた、低コストでリークのない強化アルミニウムホイップクリームディスペンサー（ＥｕｒＫｉｔｃｈｅｎ ＥＫ−ＷＨＩＰ−１８）を使用した。混合Ｅｉｍｅｒｉａ製剤を含む液体をキャニスターに投入し、窒素ガスカートリッジを追加し、その後、キャニスターを数回反転させて、ガスに液体を飽和させた。キャニスターを逆さまにし、バルブを開いて圧力降下を発生させ、液体を放出させた。流体力学的キャビテーションへの曝露の前後に液体製剤を計数して、破壊されたオーシストのパーセンテージを種ごとに決定した。場合によっては、液体が処理されてシステムから放出され、システムに再投入され、その後、流体力学的キャビテーションにさらに２又は３回さらされて、より多くの細胞が破壊されたが、これは、ガスの圧力と量を初期システム試験で制御できなかったためである。

この開示の目的のために、既に流体力学的キャビテーションを受けた液体を放出し、その後、その同じ液体を同じ容器に再投入し、流体力学的キャビテーションに再びさらす行為は、「パス」と呼ばれる。したがって、この時点から、用語「パス１」、「パス２」、又は「パス３」は、液体を流体力学的キャビテーションのプロセスに設定された回数さらす行為を表すために使用される。回数は「パス」に続く数字で定義される。

表１６：ホイップクリームディスペンサー流体力学的キャビテーションの複数サイクルで処理された残留オーシストの比較

実験１（表１６を参照）は、新しい細胞破壊技術を追求する価値を評価するために実施し、実験２は、技術をさらに検討するために実施した。最終的に、実験１は、ガラスビーズと共に振とうするなどの以前に検討されたオーシストせん断技術を使用した初期試験と同様に実施された全ての種で、オーシストからスポロシストへの同等の変換を示した。実験２では、「パス２」は「パス１」より優れた変換を示したが、「パス３」は「パス２」と同等の結果を示し、窒素キャビテーションへの曝露の増加が、必ずしも変換をさらに改善しないことを示した。

以前に確立されたＥｕｒＫｉｔｃｈｅｎアプローチの限られたパラメーターの条件での流体力学的キャビテーションの成功に続き、プロトコルは、市販グレードの流体力学的細胞破壊装置を組み込むためにさらに改良され、そのプロセスは、第６の実施形態でより詳細に検討される。

窒素充填コネクション（Ｐａｒｒ^ＴＭ１８３１）を通して様々な圧力１０００ｐｓ、ｉ及び１５００ｐｓｉ、で窒素ガスが供給された細胞破壊容器（Ｐａｒｒ^ＴＭ４６３９）を使用し、その後、窒素ガスを希釈ワクチンに５分間にわたり溶解させることにより、さらに研究を実施した。

圧力と時間の詳細が提供されているが、プロセスの詳細はより広い範囲で起こり得ることを述べるべきである。この範囲は、５００〜５０００ｐｓｉの圧力範囲、１〜３０分続く曝露時間、及び組成が異なる希釈剤からなることができる。これらの組成物は、蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、及びこれら２つと異なる他のものからなることができる。

表１７：細胞破壊容器流体力学的キャビテーションの複数の圧力により処理された残留オーシストのｉｎ ｖｉｔｒｏ比較

液体製剤を、流体力学的キャビテーションによる処理の前後に、ＭｃＭａｓｔｅｒの浮遊チャンバー法により計数した。結果は、両方の試験圧力が、オーシストの約５０％と２５％を、大きな種と小さな種のそれぞれで、スポロシストに変換できたことを示した。中型の種の変換は、より高い試験圧力で増加した。

６．７．２．ｉｎ ｖｉｖｏ流体力学的キャビテーション研究（第１の方法）
この一連の実験では、流体力学的キャビテーションを使用してオーシスト膜の破壊を完了し、オーシストのアウトプットモデルにより感染性を評価した。残りのオーシストの数を算出し、以下に示す。孵化日の雛（処理あたり１５羽）に、オーシスト、又は、残留オーシストを伴う流体力学的キャビテーション放出スポロシストのいずれかを噴霧ワクチン接種により接種し、７日目に腸内容物を収集した。

以下の表１８及び１９のデータは、ＥｕｒＫｉｔｃｈｅｎ流体力学的キャビテーション放出スポロシストのｉｎ ｖｉｖｏ送達の有効性を示す。表１９のデータは、表１８のデータとは別の実験で収集した。

表１８：当業者によるホイップクリームディスペンサーの流体力学的キャビテーションの複数サイクルのｉｎ ｖｉｖｏ感染性の比較

表１９：当業者によるホイップクリームディスペンサーの流体力学的キャビテーションの複数サイクルのｉｎ ｖｉｖｏ感染性の比較

未処理の対照鳥の腸内容物にオーシストは観察されなかった。この実験の点眼薬対照は、実験的処理群と比較して、より高い反応の頻度と振幅をもたらした。表１８は、異なる「パス」番号の有効性の比較を示し、表１９は、オーシストの眼噴霧送達と比較した、最も良好に機能する「パス２」の有効性を示す。

６．７．３．ｉｎ ｖｉｖｏ流体力学的キャビテーション研究（第２の方法）
以下の表２０及び２１のデータは、細胞破壊容器流体力学的キャビテーションによる細胞破壊プロセスの有効性を示す。表２０と表２１の両方のデータは、同じ実験から収集した。

表２０：細胞破壊容器流体力学的キャビテーション（１０００ｐｓｉ）のｉｎ ｖｉｖｏ感染性の比較

表２１：細胞破壊容器流体力学的キャビテーション（１５００ｐｓｉ）のｉｎ ｖｉｖｏ感染性の比較

未処理の対照鳥の腸内容物にはオーシストは観察されなかった。この実験の点眼薬対照は、実験群と比較して、反応のより高い頻度と振幅をもたらした。１０００ｐｓｉの処理では、Ｅ．ｍａｘｉｍａとＥ．ｔｅｎｅｌｌａの応答の頻度が改善され、全ての種で応答の振幅が改善された。１５００ｐｓｉの処理では、Ｅ．ｍａｘｉｍａとＥ．ｔｅｎｅｌｌａの応答の頻度が改善されたが、しかし、Ｅ．ｍａｘｉｍａとＥ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａの振幅には影響がなかったが、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａの応答の振幅は大幅に増加した。

予想通り、細胞破壊容器によって実施された改良された流体力学的キャビテーション技術は、制御しにくいホイップクリームディスペンサーアプローチを上回った。Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａを除く全ての種は、改善された感染性を示し、Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａオーシストのアウトプットに関しては、両方の細胞破壊容器圧力パラメーターが明らかな増加を示した。

６．８．追加のワクチンを用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ実験
前のセクションでは、オーシスト膜を破壊してスポロシストを放出し、ワクチンの性能を向上させる方法について説明した。初期試験は、手動プロセスと自動プロセスの両方で第１のブロイラー鶏コクシジウム症ワクチンを用いて実施された。ここでは、第２のブロイラー鶏コクシジウム症ワクチン、第１及び第２の採卵用鶏コクシジウム症ワクチン、及び第１のシチメンチョウコクシジウム症ワクチンにおいて、オーシスト膜を破壊するプロセスを説明する。

手動で処理するために、ワクチンをガラスビーズに加え、激しく振とうした。大、中、小のオーシストの数を数え、手動処理の前後で比較した。さらに、ワクチンのアリコートをビーズミルに追加してサンプルを処理する自動システムが使用された。この例では、使い捨て分散機システム（ＩＫＡ ＵＬＴＲＡ−ＴＵＲＲＡＸ Ｔｕｂｅ Ｄｒｉｖｅ ｓｙｓｔｅｍ）を使用したが、同様のシステムでも同様の結果が得られると予想される。

計数の目的で、試験ワクチンに含まれるオーシストは、Ｃｏｎｗａｙ ａｎｄ ＭｃＫｅｎｚｉｅ（Ｐｏｕｌｔｒｙ Ｃｏｃｃｉｄｉｏｓｉｓ：Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｕｎｅ ２００７，Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ）に概説されているように、サイズに基づいて大、中、小に分類された。試験セットには、次のＥｉｍｅｒｉａ種が含まれていた：様々な市販の供給源からの、Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ、Ｅ．ａｄｅｎｏｅｉｄｓ、Ｅ．ｂｒｕｎｅｌｌｉ、Ｅ．ｈａｇａｎｉ、Ｅ．ｍｅｌｅａｇｒｉｍｉｔｉｓ、Ｅ．ｍｉｖａｔｉ、Ｅ．ｍａｘｉｍａ、Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘ、Ｅ．ｐｒａｅｃｏｘ、及びＥ．ｔｅｎｅｌｌａ。セットには、非弱毒化株と弱毒化（早熟）株の両方の少なくとも１つの種が含まれていた。各サンプルを３回計数し、平均を以下に示す。

表２２：第１の採卵用鶏コクシジウム症ワクチンを用いたオーシストの減少

表２３：第２の採卵用鶏コクシジウム症ワクチンを用いたオーシストの減少

表２４：第２のブロイラー鶏コクシジウム症ワクチンを用いたオーシストの減少

表２５：第１のシチメンチョウコクシジウム症ワクチンを用いたオーシストの減少

結果は、試験された多種多様なワクチンのせん断に対するオーシストの一般的な感受性を示し、説明されたシステム及びプロセスが広い適用性を持つことを示す。

７．開示の一般化されたステートメント（ｓｔａｔｅｍｅｎｔｓ）
以下の番号を付したステートメントは、開示の一般的な説明を提供し、添付の特許請求の範囲を限定することは意図されていない。

ステートメント１：以下のステップを含む、Ｅｉｍｅｒｉａに対して動物にワクチン接種する方法：Ｅｉｍｅｒｉａオーシストの溶液を提供することであって、前記オーシストは、外膜を有し、生存可能なスポロシストをその中に含むこと；前記Ｅｉｍｅｒｉａオーシスト外膜の少なくとも一部を破壊し、変性溶液をもたらすこと；及び、前記変性溶液を動物に送達すること。

ステートメント２：以下のステップを含む、アピコンプレックス門疾病に対して動物にワクチン接種する方法：アピコンプレックス門オーシストの溶液を提供することであって、前記オーシストは、外膜を有し、生存可能なスポロシストをその中に含むこと；前記アピコンプレックス門オーシスト外膜の少なくとも一部を破壊し、変性溶液をもたらすこと；及び、前記変性溶液を動物に送達すること。

ステートメント３：前記生存可能なスポロシストが、前記破壊された膜から放出される、ステートメント１〜２のいずれかに記載の方法。

ステートメント４：前記変性溶液が、前記膜を破壊するときに動物に送達される、ステートメント１〜３のいずれかに記載の方法。

ステートメント５：前記変性溶液が、前記変性溶液をもたらす前記破壊から５日以内に前記動物に送達される、ステートメント１〜４のいずれかに記載の方法。

ステートメント６：前記変性溶液が、噴霧によって送達される、ステートメント１〜５のいずれかに記載の方法。

ステートメント７：前記Ｅｉｍｅｒｉａオーシスト又は前記アピコンプレックス門オーシストが、１種のＥｉｍｅｒｉａ種のＥｉｍｅｒｉａオーシスト又は１種のアピコンプレックス門種のアピコンプレックス門オーシストである、ステートメント１〜６のいずれかに記載の方法。

ステートメント８：前記Ｅｉｍｅｒｉａオーシスト又は前記アピコンプレックス門オーシストが、２種以上のＥｉｍｅｒｉａ種を含むＥｉｍｅｒｉａワクチンからのＥｉｍｅｒｉａオーシスト又は２種以上のアピコンプレックス門を含むアピコンプレックス門ワクチンからのアピコンプレックス門オーシストである、ステートメント１〜７のいずれかに記載の方法。

ステートメント９：前記Ｅｉｍｅｒｉａオーシスト又は前記アピコンプレックス門オーシストの溶液が、濃縮ワクチン溶液である、ステートメント１〜８のいずれかに記載の方法。

ステートメント１０：前記Ｅｉｍｅｒｉａオーシスト又は前記アピコンプレックス門オーシストの溶液が、希釈ワクチン溶液である、ステートメント１〜９のいずれかに記載の方法。

ステートメント１１：Ｅｉｍｅｒｉａオーシストの外膜を破壊し、得られた溶液を動物にリアルタイムで送達するシステムであって、以下を含み：Ｅｉｍｅｒｉａオーシストを溶液中に含む容器であって、前記オーシストは、外膜を有し、生存可能なスポロシストをその中に含む、容器；前記Ｅｉｍｅｒｉａオーシストの少なくとも一部の外膜が破壊され、変性溶液をもたらすオーシスト処理チャンバー；及び、送達出口、これにより、前記変性溶液が、前記容器から前記処理チャンバーを通して、得られた溶液が動物に送達される前記送達出口に移動させられる、システム。

ステートメント１２：アピコンプレックス門オーシストの外膜を破壊し、得られた溶液を動物にリアルタイムで送達するシステムであって、以下を含み：アピコンプレックス門オーシストを溶液中に含む容器であって、前記オーシストは、外膜を有し、生存可能なスポロシストをその中に含む、容器；前記アピコンプレックス門オーシストの少なくとも一部の外膜が破壊され、変性溶液をもたらすオーシスト処理チャンバー；及び、送達出口、これにより、前記変性溶液が、前記容器から前記処理チャンバーを通して、得られた溶液が動物に送達される前記送達出口に移動させられる、システム。

ステートメント１３：前記生存可能なスポロシストが、前記破壊された膜から放出される、ステートメント１１〜１２のいずれかに記載のシステム。

ステートメント１４：前記オーシスト処理チャンバーが、高圧ホモジナイザー、ローターステーターミキサー、硬質ビーズを含むチャンバー容器とそれに取り付けられた撹拌機、一対の振動板、超音波装置、流体力学的キャビテーション装置、高圧噴霧器、又はそれらの組み合わせからなる群の少なくとも１つである、ステートメント１１〜１３のいずれかに記載のシステム。

ステートメント１５：前記ホモジナイザーが、約３０００ｐｓｉの圧力を提供する、ステートメント１１〜１４のいずれかに記載のシステム。

ステートメント１６：破裂したＥｉｍｅｒｉａオーシスト又はアピコンプレックス門オーシストの数が、最長寸法が２０ミクロン未満であるオーシストの約５％と５０％の間であり、最長寸法が２０ミクロンと３０ミクロンの間のサイズの範囲にあるオーシストの約１５％と７５％の間であり、最長寸法が３０ミクロン超のオーシストの約２５％と９０％の間である、ステートメント１１〜１５のいずれかに記載のシステム。

ステートメント１７：前記Ｅｉｍｅｒｉａオーシスト又は前記アピコンプレックス門オーシストを含む溶液が、少なくとも１種のタンパク質分解酵素を含む、ステートメント１１〜１６のいずれかに記載のシステム。

ステートメント１８：前記タンパク質分解酵素が、トリプシン、キモトリプシン又はそれらの混合物である、ステートメント１７に記載のシステム。

ステートメント１９：前記Ｅｉｍｅｒｉａオーシスト又は前記アピコンプレックス門オーシストを含む溶液が、濃縮ワクチン溶液である、ステートメント１１〜１８のいずれかに記載のシステム。

ステートメント２０：前記Ｅｉｍｅｒｉａオーシスト又は前記アピコンプレックス門オーシストを含む溶液が、緩衝塩、糖、タンパク質又はタンパク質加水分解物、染料、又は増粘剤を含む水性希釈剤をさらに含む、ステートメント１１〜１８のいずれかに記載のシステム。

ステートメント２１：動物への送達時にオーシスト膜を破壊する方法であって、以下のステップを含む方法：ある量のＥｉｍｅｒｉａオーシストを溶液中に含むための容器を提供することであって、オーシストは、外膜を有し、生存可能なスポロシストをその中に含むこと；前記オーシストの外膜を破壊するためのシステムを提供すること；送達デバイスを提供すること；前記溶液を第１の容器から前記システムに移動させること：前記溶液を処理チャンバーに通し、それにより前記Ｅｉｍｅｒｉａオーシスト膜の少なくとも一部が破壊され、変性溶液をもたらすこと；及び、前記変性溶液を、前記システムから、前記変性溶液が動物に送達される前記送達デバイスに移動させること。

ステートメント２２：動物への送達時にオーシスト膜を破壊する方法であって、以下のステップを含む方法：ある量のアピコンプレックス門オーシストを溶液中に含むための容器を提供することであって、オーシストは、外膜を有し、生存可能なスポロシストをその中に含むこと；前記オーシストの外膜を破壊するためのシステムを提供すること；送達デバイスを提供すること；前記溶液を第１の容器から前記システムに移動させること：前記溶液を処理チャンバーに通し、それにより前記アピコンプレックス門オーシスト膜の少なくとも一部が破壊され、変性溶液をもたらすこと；及び、前記変性溶液を、前記システムから、前記変性溶液が動物に送達される前記送達デバイスに移動させること。

ステートメント２３：前記システムが、高圧ホモジナイザー、超音波装置、ローターステーターミキサー、中に硬質ビーズを含む容器とそれに取り付けられた撹拌機、一対の振動板、流体力学的キャビテーション装置、高圧噴霧器、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つを含む、ステートメント２１〜２２のいずれかに記載の方法。

ステートメント２４：前記ホモジナイザーが、約３０００ｐｓｉの圧力を提供する、ステートメント２１〜２３のいずれかに記載のシステム。

ステートメント２５：破裂したオーシストの数が、最長寸法が２０ミクロン未満であるオーシストの約５％以上であり、最長寸法が２０ミクロンと３０ミクロンの間のサイズの範囲にあるオーシストの約１５％以上であり、最長寸法が３０ミクロン超のオーシストの約２５％以上である、ステートメント２１〜２４のいずれかに記載のシステム。

ステートメント２６：Ｅｉｍｅｒｉａオーシスト又はアピコンプレックス門を含む前記溶液が、濃縮ワクチン溶液である、ステートメント２１〜２５のいずれかに記載のシステム。

上記の説明は、例示的な実施形態及び例の単なる代表であることを理解すべきである。読者の便宜のために、上記の説明は、全ての可能な実施形態の限られた数の代表的な例、つまり、開示の原理を教示する例に焦点を当てている。この説明は、全ての可能なバリエーション、又は説明されたそれらのバリエーションの組み合わせさえも、網羅的に列挙しようとしていない。その代替の実施形態が、本開示の特定の部分について提示されていない可能性があり、又は、さらなる説明されていない代替の実施形態が、ある部分について利用可能である可能性があることは、それらの代替の実施形態の放棄と解釈されるべきではない。当業者は、それらの説明されていない実施形態の多くが、本開示の原理の適用の違いではなく、技術及び材料の違いを含むことを理解するであろう。したがって、本開示は、以下の特許請求の範囲及び均等物に記載される範囲未満に限定されることを意図するものではない。

参照による援用

本明細書で引用される全ての参考文献、記事、刊行物、特許、特許刊行物、及び特許出願は、全ての目的のためにそれらの全体が参照により組み込まれる。しかしながら、ここで引用されている参考文献、記事、刊行物、特許、特許出版物、及び特許出願についての言及は、世界のいずれの国においても、有効な先行技術を構成する又は一般的知識の一部を形成するという認識又は提案として解釈されるべきではない。本開示は、その詳細な説明に関連して記載されているが、前述の説明は、例示することを意図しており、範囲を限定することを意図していないことを理解すべきである。他の側面、利点、及び改変は、以下に記載される特許請求の範囲内である。本明細書で引用される全ての刊行物、特許、及び特許出願は、個々の刊行物又は特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (20)

1. 以下のステップを含む、Ｅｉｍｅｒｉａに対して動物にワクチン接種する方法：
   Ｅｉｍｅｒｉａオーシストの溶液を提供することであって、前記オーシストは、外膜を有し、生存可能なスポロシストをその中に含むこと；
   前記Ｅｉｍｅｒｉａオーシスト外膜の少なくとも一部を破壊し、変性溶液をもたらすこと；及び
   前記変性溶液を動物に送達すること。
2. 前記生存可能なスポロシストが、前記破壊された膜から放出される、請求項１に記載の方法。
3. 前記変性溶液が、前記膜を破壊するときに動物に送達される、請求項１に記載の方法。
4. 前記変性溶液が、前記変性溶液をもたらす前記破壊から５日以内に前記動物に送達される、請求項１に記載の方法。
5. 前記変性溶液が、噴霧によって送達される、請求項１に記載の方法。
6. 前記Ｅｉｍｅｒｉａオーシストが、個々のＥｉｍｅｒｉａ種のＥｉｍｅｒｉａオーシストである、請求項１に記載の方法。
7. 前記Ｅｉｍｅｒｉａオーシストが、２種以上のＥｉｍｅｒｉａ種を含むＥｉｍｅｒｉａワクチンからのＥｉｍｅｒｉａオーシストである、請求項１に記載の方法。
8. 前記Ｅｉｍｅｒｉａオーシストの溶液が、濃縮ワクチン溶液である、請求項１に記載の方法。
9. 前記Ｅｉｍｅｒｉａオーシストの溶液が、希釈ワクチン溶液である、請求項１に記載の方法。
10. Ｅｉｍｅｒｉａオーシストの外膜を破壊し、得られた溶液を動物にリアルタイムで送達するシステムであって、以下を含み：
    Ｅｉｍｅｒｉａオーシストを溶液中に含む容器であって、前記オーシストは、外膜を有し、生存可能なスポロシストをその中に含む、容器；
    前記Ｅｉｍｅｒｉａオーシストの少なくとも一部の外膜が破壊され、変性溶液をもたらすオーシスト処理チャンバー；及び
    送達出口、
    これにより、前記変性溶液が、前記容器から前記処理チャンバーを通して、得られた溶液が動物に送達される前記送達出口に移動させられる、システム。
11. 前記生存可能なスポロシストが、前記破壊された膜から放出される、請求項１０に記載のシステム。
12. 前記オーシスト処理チャンバーが、高圧ホモジナイザー、ローターステーターミキサー、硬質ビーズを含むチャンバー容器とそれに取り付けられた撹拌機、一対の振動板、超音波装置、流体力学的キャビテーション装置、高圧噴霧器、又はそれらの組み合わせからなる群の少なくとも１つである、請求項１０に記載のシステム。
13. 前記ホモジナイザーが、約３０００ｐｓｉの圧力を提供する、請求項１１に記載のシステム。
14. 破裂したＥｉｍｅｒｉａオーシストの数が、最長寸法が２０ミクロン未満であるＥｉｍｅｒｉａオーシストの約５％と５０％の間であり、最長寸法が２０ミクロンと３０ミクロンの間のサイズの範囲にあるＥｉｍｅｒｉａオーシストの約１５％と７５％の間であり、最長寸法が３０ミクロン超のＥｉｍｅｒｉａオーシストの約２５％と９０％の間である、請求項１に記載のシステム。
15. 前記Ｅｉｍｅｒｉａオーシストを含む溶液が、少なくとも１種のタンパク質分解酵素を含む、請求項１０に記載のシステム。
16. 前記タンパク質分解酵素が、トリプシン、キモトリプシン又はそれらの混合物である、請求項１５に記載のシステム。
17. 前記Ｅｉｍｅｒｉａオーシストを含む溶液が、濃縮ワクチン溶液である、請求項１０に記載のシステム。
18. 前記Ｅｉｍｅｒｉａオーシストを含む溶液が、緩衝塩、糖、タンパク質又はタンパク質加水分解物、染料、又は増粘剤を含む水性希釈剤をさらに含む、請求項１０に記載のシステム。
19. 動物への送達時にオーシスト膜を破壊する方法であって、以下のステップを含む方法：
    ある量のＥｉｍｅｒｉａオーシストを溶液中に含むための容器を提供することであって、オーシストは、外膜を有し、生存可能なスポロシストをその中に含むこと；
    前記オーシストの外膜を破壊するためのシステムを提供すること；
    送達デバイスを提供すること；
    前記溶液を第１の容器から前記システムに移動させること：
    前記溶液を処理チャンバーに通し、それにより前記Ｅｉｍｅｒｉａオーシスト膜の少なくとも一部が破壊され、変性溶液をもたらすこと；及び
    前記変性溶液を、前記システムから、前記変性溶液が動物に送達される前記送達デバイスに移動させること。
20. 前記システムが、高圧ホモジナイザー、超音波装置、ローターステーターミキサー、中に硬質ビーズを含む容器とそれに取り付けられた撹拌機、一対の振動板、流体力学的キャビテーション装置、高圧噴霧器、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項１９に記載の方法。
    
    

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