JP2021530493A - オーシスト溶液を調製及び送達する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
この出願は、2018年7月10日に出願された米国仮出願第62/696,261号、Hutchins et al.の利益を主張し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本出願は、発明者James Hutchinsにより2019年7月10日に出願された同時係属中のPCT出願シリアル番号 、代理人整理番号673−04−PCTに関連する。この同時係属中のPCT出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本開示は、溶液中でオーシストの外膜を破壊し、溶液を動物に送達するためのシステム及び方法を提供する。システムは、壊れていないオーシストを溶液中に含む容器、オーシスト処理チャンバー、及び送達出口を含む。壊れていないオーシストは容器から処理チャンバーを通して移動させられ、オーシスト膜の一部が破壊されてスポロシストを放出し、得られた溶液は処理チャンバーから送達出口に移動させられ、そこで溶液が動物に送達される。
2.1.イントロダクション
本明細書において提供される「背景」の説明は、開示の背景を一般的に提示することを目的とする。現在名前を挙げられている発明者の研究は、この背景の部分に記載された範囲において、また、出願時に先行技術として適格ではない可能性がある説明の側面は、いずれも本開示に対する先行技術として明示的にも暗示的にも認められない。
アピコンプレックス門は、複雑な生活環を持つ単細胞の胞子形成寄生虫の門である。アピコンプレックス門によって引き起こされるよく知られたヒト疾患は、バベシア症(Babesia)、クリプトスポリジウム症(Cryptosporidium parvum)、マラリア(Plasmodium)、及びトキソプラズマ症(Toxoplasma gondii)を含む。アピコンプレックス門の疾患は、動物及び家畜にも影響を及ぼす。Cryptosporidium parvum及びToxoplasma gondiiなどのいくつかのアピコンプレックス門は、ヒト及び動物の両方に影響を及ぼす。Eimeria又はTheileriaのような他のアピコンプレックス門は、動物のみに影響を及ぼす。アピコンプレックス門の生活環は、有性生殖期及び無性生殖期の両方を有するという点において複雑である。生活環は、しばしば、環境中に排泄されている期と、動物宿主内で起こる他の期との両方からなる。多くのアピコンプレックス門では、生活環のいくつかの期がある宿主種で起こり、他の期が別の宿主種で起こる。それに対して、アピコンプレックス門の寄生虫であるEimeriaは、一般的に、宿主特異的であり、単一宿主性である。つまり、生活環は、単一の宿主種に特異的である。
本明細書における実施形態は、改良されたワクチン接種のためのスポロシストのin situ放出に関するシステム及び方法に関する。本明細書に記載されたいくつかの実施形態は、オーシストの膜を破壊し、膜及びその内容物である生存可能なスポロシストを動物に送達するためのシステム及び方法に関する。
このように本開示の様々な実施形態を一般的な用語で説明したので、次に、添付の図面を参照する。図面は、縮尺とおりに描かれておらず、システムの全ての構成要素を含まない。
本開示の様々な側面は、添付の図面を参照して以下で十分に説明され、全てではないが、いくつかの開示の側面が示される。実際、この開示は、多くの様々な形態で実施され得て、本明細書に記載された側面に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、これらの実施形態は、この開示が徹底的かつ完全であり、本発明の範囲を当業者に十分に伝えるように提供される。
本明細書において使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、本発明を限定することは意図されていない。
5.2.1.第1の実施形態−高圧均質化
第1の実施形態10を図2に示す。第1の実施形態10は、第1のリザーバー(reservoir)12を含む。第1のリザーバー12は、ある量の溶液14を保持するように設計されている。溶液14は、溶液中に懸濁されたワクチン(図示されていない)を含む。第1の実施形態10の溶液14は、家禽、すなわち1日齢の孵化したての幼鳥に送達するためのEimeria種のオーシストベースのワクチンを含む。任意に、溶液14はタンパク質分解酵素を含んでよい。タンパク質分解酵素は、幼鳥の消化管におけるワクチンのより効果的な取り込みを可能にし、これについては、以下で詳細に説明する。
本発明の第2の実施形態60を図4に示す。第1の実施形態10と同様の部分が、同様の番号インデックスで示される。第2の実施形態60は、入口16及び出口18を有し、ある量の溶液14を保持する第1のリザーバー12を含む。第2の実施形態60は、ポンプ20及び圧力源26もを含む。
第3の実施形態80は、第3の実施形態の処理システム81を除いて、上述の第1の実施形態10及び第2の実施形態60と同様である。図5に示された第3の実施形態80は、第1のリザーバー12及びポンプ20を含む。第3の実施形態80は、超音波プローブ110を容器112内にさらに含む。超音波プローブ110は、電源(図示されていない)をさらに含む。超音波処理は、溶液中に直接配置されたプローブ、又は、容器の外部に配置された間接的な発生源で行うことができる。間接的な発生源は、水で満たされた浴中での超音波処理のような発生源であり得る。超音波装置という用語は、超音波プローブ及び容器の外部の間接的な発生源を含む。
第4の実施形態120は、ローターステーターミキサー処理システム116を容器122内で使用し、図6に示される。ローターステーターミキサー116は、高速で回転する分散ヘッド又はジェネレーター124をその中に有する。第4の実施形態120は、ローターステーターミキサー116と流体連通する第1のリザーバー12、ポンプ20、及び送達デバイス46を含む。
第5の実施形態140は、図7に示され、処理システム146を除いて、上述の第1の実施形態10、第2の実施形態60、第3の実施形態80、及び第4の実施形態120と同様である。第5の実施形態140は、第1のリザーバー12及びポンプ20を含む。第5の実施形態140は、第5の処理システム146を格納容器147内に含み、一対のプレート144、145から構成されている。プレート144、145は、間にいくらかの間隔を開けて、一方が他方の上に取り付けられている。第1のプレート144は平坦であり、振動機構(図示されていない)に接続されている。振動機構は、プレート144を振動させる。第2のプレート145は、プレート144と145との間を通過する間にオーシスト膜を破壊するために必要に応じて、様々な程度の平滑さ又は粗さを有してよい。プレート144、145が互いの上にあるとき、第2のプレート145は、第1のプレート144と接触している。
第6の実施形態150は、局所圧力の減少及びそれに続く増加の結果として液体中で発生する気化、気泡生成、及び気泡内破のプロセスを説明する。キャビテーション(液体内の圧力の急激な変化により、圧力が上昇すると崩壊することができる小さな蒸気で満たされた空洞が形成される現象)が、圧力が液体の飽和蒸気圧を下回り、それに続いてその蒸気点を上回って回復すると起こる。これは、液体をくびれたチャネルに通過させることによって生成できる。気泡の生成プロセス、及びそれに続くキャビテーション気泡の生成と崩壊は、高いエネルギー密度と、気泡の表面に圧力をもたらす。初期の研究では、窒素によるキャビテーションが検討されたが、同様の結果を得るために任意のガスが使用できる。この例では、窒素は圧力下で対象生物(Eimeria)の細胞質に溶解する。環境との平衡に達した後、対象懸濁液は圧力の変化に突然さらされ、Eimeriaの細胞質に窒素気泡が形成される。細胞内における気泡形成とそれに続く気泡膨張のプロセスは、細胞膜を引き伸ばし、最終的に破壊させる。これらの気泡は、発泡の結果として細胞の外側に損傷を与える(圧力の低下の結果として水溶液からガスが逃げ、泡の生成と細胞の溶解につながる可能性がある。)。Eimeriaの複数種のオーシスト懸濁液で試験した場合、オーシスト外壁の溶解とそれに続く内部のスポロシストの放出が観察された。このプロセスは通常、加圧容器内で行われる。容器は、高圧に耐えることができる厚いステンレス鋼のケーシングと、ガスを送達するための入口及び調整可能な排出バルブを備えた出口ポートからなる。
オーシストをせん断し、無傷のスポロシストを放出する方法は、衝撃の力がオーシスト壁を破裂させて生存可能なスポロシストを放出するように、オーシストの懸濁液を静止物体に高速で噴霧することを含み得る。さらに、オーシストの懸濁液を回転ディスクなどの動く対象に噴霧して、遭遇する力の組み合わせがオーシストをせん断してもよい。噴霧された懸濁液の速度及び回転ディスクの速度は、剪断プロセスの最適化を提供するために調整され得る。回転ディスクの表面の特徴は、オーシストを剪断するために必要に応じて、様々な程度の平滑さ又は粗さを生み出すように変更され得る。
上述の実施形態は、溶液をシステムの中を移動させる手段として、しばしば、ポンプと呼ばれるが、高圧空気及び重力供給などの他のでデバイスも使用され得ることが想定されることがさらに理解される。
本明細書に開示された方法及びシステムは、他の抗原を送達するベクターとして機能するように、組換え修飾されたEimeriaと共に使用され得る。破壊された細胞材料を含む鳥又は他の動物のためのワクチンは、ウイルス感染細胞に由来するワクチン又は天然若しくは組換えタンパク質産物又は哺乳動物細胞、植物細胞、真菌細胞、酵母細胞、又は細菌細胞などの細胞内断片を産生するために使用される細胞系に由来するワクチンを含む、本明細書に記載されたシステム及び方法によって投与され得る。
6.1.強制給餌(gavage)(オーシスト対スポロシスト)
経口強制給餌、つまり口からの送達は、鳥へのオーシストの送達のゴールドスタンダードであると考えられている。市販のブロイラーワクチンを使用した研究では、経口強制給餌による結果は、予想よりも変動することがわかった。特に、以下の結果は、強制給餌によって送達されたオーシストからの感染性が、Eimeria種及び試験日によって大きく異なることを示した。この観察により、陽性対照のための別の送達手段として、眼への投薬(点眼薬)を試験することになった。さらに、オーシストを破壊してスポロシストを放出することは、強制給餌によって送達された場合、より効果的であることがわかった。オーシスト膜の破壊は、手動プロセスにより4mmガラスビーズと共に複数種オーシストの懸濁液を振とうすることによって達成された。1日齢の孵化したての幼鳥は、オーシストを割るために素嚢に飼料が必要であるという仮説が立てられるかもしれない。実験環境及び通常の孵化場では、幼鳥は、保管及び輸送に起因して3〜8時間にわたって飼料を受け取らず、オーシストが未処理で腸管を通過することができる。点眼薬によるワクチン接種は、腸に到達するオーシストの動きを遅くし、オーシストを様々な酵素にさらす可能性がある。
別の実験では、オーシストの破壊は、手動プロセスにより4mmガラスビーズと共に複数種オーシストの懸濁液を振とうすることによって達成された。残留オーシストの計数により、E.maximaオーシストの約64%がスポロシストに、E.tenellaオーシストの51%がスポロシストに、E.acervulinaオーシストの17%がスポロシストに変換されたことが示された。孵化日の雛(処理あたり15羽)に、オーシスト、又は、ガラスビーズで放出されたスポロシストを残留オーシストと共に強制給餌により接種し、7日目に腸内容物を収集した。
別の実験では、オーシスト膜の破壊は、手動プロセスにより4mmガラスビーズと共に複数種オーシストの懸濁液を振とうすることによって達成された。残りのオーシストの計数により、E.maximaオーシストの約52%がスポロシストに、E.tenellaオーシストの26%がスポロシストに、E.acervulinaオーシストの47%がスポロシストに変換されたことを示された。孵化日の雛(処理あたり15羽)に、オーシスト、又は、ガラスビーズで放出されたスポロシストと残留オーシストを点眼薬により接種し、7日目に腸内容物を収集した。
次の一連の実験では、スポロシストの放出は、手動プロセスにより4mmガラスビーズと共に複数種オーシストの懸濁液を振とうすることによって達成された。残りのオーシストの計数により、プロセスは、大きなオーシスト(E.maxima種)の少なくとも66%がスポロシストに、中型のオーシスト(E.tenella種)の75%がスポロシストに、小さなオーシスト(E.acervulina及び他の小さな種)の13%がスポロシストに変換したと計算された。孵化日の雛(処理あたり15羽)を静止位置に保持し、上述の未処理のオーシスト処理又はガラスビーズで放出されたスポロシスト処理のいずれか用いてデバイスから噴霧した。噴霧は、雛の顔面粘膜に向けられた、液体と空気の両方の圧力を利用する空気噴霧ノズルを経て投与した。その後、鳥に飼料と水を与え、7日間にわたり成長させた後、それぞれの鳥の腸内容物を収集するために屠殺した。以下は、これらのそれぞれの噴霧ワクチン接種の実験に関連するデータ表である。
6.5.1.オーシスト減少数−in vitro
混合Eimeria種のオーシストを含む液体懸濁液を、高圧ホモジナイザー(HPH)IKA model 2000−4で様々な圧力で処理した。細胞懸濁液を、HPHの入口に投入し、圧力の範囲(200〜1500bar)で処理し、その後、出口から出した。液体製剤に含まれる無傷のオーシストを、HPHにさらす前後にMcMasterの浮遊チャンバーを使用して計数した。結果を以下の表に示す。
6.6.1.オーシスト減少数−in vitro
混合Eimeria種を含む液体オーシスト懸濁液は、シングルパスのインラインローターステーター状のデバイスであるIKA Magic Labによって、様々な速度で処理された。細胞懸濁液を、Magic Labのホッパーに投入され、1〜3個のローターステータージェネレーターで様々な速度(3,000〜26,000rpm)で処理し、出口から出した。この実験に使用されたジェネレーターは6Fモデルであった。液体製剤中の無傷のオーシストを、Magic Labデバイスで処理する前後にMcMasterの浮遊チャンバーを使用して計数した。結果を以下の表に示す。
6.7.1.流体力学的キャビテーションでのin vitro研究
初期試験には、窒素充電器用アタッチメントとコンセントを備えた、低コストでリークのない強化アルミニウムホイップクリームディスペンサー(EurKitchen EK−WHIP−18)を使用した。混合Eimeria製剤を含む液体をキャニスターに投入し、窒素ガスカートリッジを追加し、その後、キャニスターを数回反転させて、ガスに液体を飽和させた。キャニスターを逆さまにし、バルブを開いて圧力降下を発生させ、液体を放出させた。流体力学的キャビテーションへの曝露の前後に液体製剤を計数して、破壊されたオーシストのパーセンテージを種ごとに決定した。場合によっては、液体が処理されてシステムから放出され、システムに再投入され、その後、流体力学的キャビテーションにさらに2又は3回さらされて、より多くの細胞が破壊されたが、これは、ガスの圧力と量を初期システム試験で制御できなかったためである。
この一連の実験では、流体力学的キャビテーションを使用してオーシスト膜の破壊を完了し、オーシストのアウトプットモデルにより感染性を評価した。残りのオーシストの数を算出し、以下に示す。孵化日の雛(処理あたり15羽)に、オーシスト、又は、残留オーシストを伴う流体力学的キャビテーション放出スポロシストのいずれかを噴霧ワクチン接種により接種し、7日目に腸内容物を収集した。
以下の表20及び21のデータは、細胞破壊容器流体力学的キャビテーションによる細胞破壊プロセスの有効性を示す。表20と表21の両方のデータは、同じ実験から収集した。
前のセクションでは、オーシスト膜を破壊してスポロシストを放出し、ワクチンの性能を向上させる方法について説明した。初期試験は、手動プロセスと自動プロセスの両方で第1のブロイラー鶏コクシジウム症ワクチンを用いて実施された。ここでは、第2のブロイラー鶏コクシジウム症ワクチン、第1及び第2の採卵用鶏コクシジウム症ワクチン、及び第1のシチメンチョウコクシジウム症ワクチンにおいて、オーシスト膜を破壊するプロセスを説明する。
以下の番号を付したステートメントは、開示の一般的な説明を提供し、添付の特許請求の範囲を限定することは意図されていない。
Claims (20)
- 以下のステップを含む、Eimeriaに対して動物にワクチン接種する方法:
Eimeriaオーシストの溶液を提供することであって、前記オーシストは、外膜を有し、生存可能なスポロシストをその中に含むこと;
前記Eimeriaオーシスト外膜の少なくとも一部を破壊し、変性溶液をもたらすこと;及び
前記変性溶液を動物に送達すること。 - 前記生存可能なスポロシストが、前記破壊された膜から放出される、請求項1に記載の方法。
- 前記変性溶液が、前記膜を破壊するときに動物に送達される、請求項1に記載の方法。
- 前記変性溶液が、前記変性溶液をもたらす前記破壊から5日以内に前記動物に送達される、請求項1に記載の方法。
- 前記変性溶液が、噴霧によって送達される、請求項1に記載の方法。
- 前記Eimeriaオーシストが、個々のEimeria種のEimeriaオーシストである、請求項1に記載の方法。
- 前記Eimeriaオーシストが、2種以上のEimeria種を含むEimeriaワクチンからのEimeriaオーシストである、請求項1に記載の方法。
- 前記Eimeriaオーシストの溶液が、濃縮ワクチン溶液である、請求項1に記載の方法。
- 前記Eimeriaオーシストの溶液が、希釈ワクチン溶液である、請求項1に記載の方法。
- Eimeriaオーシストの外膜を破壊し、得られた溶液を動物にリアルタイムで送達するシステムであって、以下を含み:
Eimeriaオーシストを溶液中に含む容器であって、前記オーシストは、外膜を有し、生存可能なスポロシストをその中に含む、容器;
前記Eimeriaオーシストの少なくとも一部の外膜が破壊され、変性溶液をもたらすオーシスト処理チャンバー;及び
送達出口、
これにより、前記変性溶液が、前記容器から前記処理チャンバーを通して、得られた溶液が動物に送達される前記送達出口に移動させられる、システム。 - 前記生存可能なスポロシストが、前記破壊された膜から放出される、請求項10に記載のシステム。
- 前記オーシスト処理チャンバーが、高圧ホモジナイザー、ローターステーターミキサー、硬質ビーズを含むチャンバー容器とそれに取り付けられた撹拌機、一対の振動板、超音波装置、流体力学的キャビテーション装置、高圧噴霧器、又はそれらの組み合わせからなる群の少なくとも1つである、請求項10に記載のシステム。
- 前記ホモジナイザーが、約3000psiの圧力を提供する、請求項11に記載のシステム。
- 破裂したEimeriaオーシストの数が、最長寸法が20ミクロン未満であるEimeriaオーシストの約5%と50%の間であり、最長寸法が20ミクロンと30ミクロンの間のサイズの範囲にあるEimeriaオーシストの約15%と75%の間であり、最長寸法が30ミクロン超のEimeriaオーシストの約25%と90%の間である、請求項1に記載のシステム。
- 前記Eimeriaオーシストを含む溶液が、少なくとも1種のタンパク質分解酵素を含む、請求項10に記載のシステム。
- 前記タンパク質分解酵素が、トリプシン、キモトリプシン又はそれらの混合物である、請求項15に記載のシステム。
- 前記Eimeriaオーシストを含む溶液が、濃縮ワクチン溶液である、請求項10に記載のシステム。
- 前記Eimeriaオーシストを含む溶液が、緩衝塩、糖、タンパク質又はタンパク質加水分解物、染料、又は増粘剤を含む水性希釈剤をさらに含む、請求項10に記載のシステム。
- 動物への送達時にオーシスト膜を破壊する方法であって、以下のステップを含む方法:
ある量のEimeriaオーシストを溶液中に含むための容器を提供することであって、オーシストは、外膜を有し、生存可能なスポロシストをその中に含むこと;
前記オーシストの外膜を破壊するためのシステムを提供すること;
送達デバイスを提供すること;
前記溶液を第1の容器から前記システムに移動させること:
前記溶液を処理チャンバーに通し、それにより前記Eimeriaオーシスト膜の少なくとも一部が破壊され、変性溶液をもたらすこと;及び
前記変性溶液を、前記システムから、前記変性溶液が動物に送達される前記送達デバイスに移動させること。 - 前記システムが、高圧ホモジナイザー、超音波装置、ローターステーターミキサー、中に硬質ビーズを含む容器とそれに取り付けられた撹拌機、一対の振動板、流体力学的キャビテーション装置、高圧噴霧器、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも1つを含む、請求項19に記載の方法。
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