JP2017505814A - 天然材料のナノ懸濁液およびその調製方法 - Google Patents

天然材料のナノ懸濁液およびその調製方法 Download PDF

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Abstract

本開示は少なくとも1つの天然材料のナノ懸濁液を調製するための方法であって、(a)320μm未満の粒径(D90)を有する少なくとも1つの天然材料を用意するステップと、(b)ステップ(a)の前記少なくとも1つの天然材料を溶媒中に分散させるステップと、および(c)ステップ(b)の分散液を摩砕して粒径(D90)を1000nm未満とするステップとを含む方法に関する。このナノ懸濁液は医薬の調製のために有用である。

Description

本出願は、天然材料からのナノ懸濁液を調製するための方法、少なくとも1つの天然材料を含むナノ懸濁液、および医薬の調製のためのそのようなナノ懸濁液の使用に関する。
植物、シアノバクテリア、藻類または菌類等の天然材料は、疾患を治療する可能性を有する活性剤を含んでいる。天然材料からこれらの活性剤を溶出させるために、水性もしくはアルコールによる浸透または浸軟、錠剤もしくはカプセルの形態の乾燥した粉末抽出物、または注射用投与製剤等の種々の薬学的調製物が知られている。しかし、これらの種類の投与には、関連する多くの難点がある。成分の多くは胃腸管内で分解されるか、肝臓で初回通過代謝を受ける。さらに、集団の一部は丸剤を飲み込むことが困難であるか、そもそも固体を受け付けることができない。さらに、天然材料の活性剤の多くは水に難溶性である。したがって、多くの天然材料の活性剤の能力および治療効果には限界がある。
米国特許第5,858,410号明細書は、高圧均一化によって製造される、「ナノ懸濁液」と呼ばれる薬物調製物に関する。高圧均一化を用いる前に、ナノ懸濁液はパールミリングプロセスによって調製されたが、これは加圧均一化に比べて時間を要するプロセスである。この技術は、とりわけ米国特許第5,271,944号明細書の主題である。ナノ懸濁液を調製するために、低エネルギーアジテーター、タービンアジテーター、コロイドミル、ソノレーター、オリフィス、メディアミル、ローターステーターミキサーおよびソニケーター等の、いくつかの他の方法が用いられてきたが、その成功の程度は様々であった。
中国特許出願公開第1416847号明細書は、濃度20%から11.1%(w/w)の間における高圧均一化によって製造される、ラディックス・パナシス・クインケフォリイ(Radix Panacis Quinquefolii)(アメリカニンジン)のナノ懸濁液の調製に関する。
欧州特許出願公開第2226171号明細書は、最大30nmの平均繊維径を有するセルロース繊維を得るためのミルストーン型グラインダーによる木質材料(たとえばダグラスファー)の分解、およびそれから製造される対応するセルロース繊維複合体に関する。繊維の平均最小長さは50μmである。
しかし、ナノ懸濁液を調製するための先行技術の方法には、大量の天然材料、即ち高濃度の天然材料を有するナノ懸濁液を天然材料から調製するための方法が含まれていない。したがって、天然材料からナノ懸濁液を調製するための方法に対するニーズがまだ存在している。このナノ懸濁液は疾患の治療または予防において有利に用いることができる。
したがって、本開示の1つの目的は、医薬の調製に用いることができる、天然材料の全体または一部からのナノ懸濁液を調製するための方法を提供することである。
第1の態様において、本開示は請求項1に開示するナノ懸濁液を調製するための方法を提供する。
別の態様において、本開示は第1の態様の方法によって得られるナノ懸濁液を提供する。
別の態様において、本開示は動物、好ましくはヒトへの頬側、局所的もしくは口腔内適用のための医薬の調製における使用のため、または非経口、髄腔内、静脈内、経皮、または経粘膜適用、好ましくは動物、好ましくはヒトへの頬側、局所的もしくは口腔内適用のための医薬の調製における使用のための、第1の態様のナノ懸濁液を提供する。
別の態様において、本開示は癌、炎症性腸疾患(IBD)、関節炎、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、その他のウイルス性疾患、神経皮膚炎もしくは乾癬等の皮膚疾患、または多発性硬化症等の自己免疫疾患の治療または予防における使用のための、第1の態様のナノ懸濁液を提供する。
さらに別の態様において、本開示は医薬の調製のための第1の態様のナノ懸濁液の使用を提供する。
さらに別の態様においては、本開示は、癌、炎症性腸疾患(IBD)、関節炎、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、その他のウイルス性疾患、神経皮膚炎もしくは乾癬等の皮膚疾患、または多発性硬化症等の自己免疫疾患の治療または予防のための方法であって、それを必要とする患者への有効量の第1の態様のナノ懸濁液の投与することを含む方法を提供する。
コロイデーター(colloidator)の概略図である。 実施例1.1の摩砕に用いた比エネルギーにおけるオリーブ葉のナノ懸濁液の粒径(D90)を示す図である。 実施例1.3のオリーブ葉の抽出液およびナノ懸濁液の乾燥質量を示す図である。 実施例2.1の摩砕に用いた比エネルギーにおけるスピルリナのナノ懸濁液の粒径(D90)を示す図である。 実施例2.3のスピルリナの抽出液およびナノ懸濁液の乾燥質量を示す図である。 実施例3.1(実線)および3.2(点線)の摩砕に用いた比エネルギーにおけるアガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)(ABM)のナノ懸濁液の粒径(D90)を示す図である。 実施例3.1(実線)および3.3(点線)の摩砕に用いた比エネルギーにおけるアガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)(ABM)のナノ懸濁液の粒径(D90)を示す図である。 実施例3.5のアガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)(ABM)の抽出液およびナノ懸濁液の乾燥質量を示す図である。 実施例4.1で調製したアガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)の粉末に対する、アガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)のナノ懸濁液および様々な抽出液のβ−グルカン含量を示す図である。 実施例5.1で調製したシリカのナノ懸濁液に基づく物理的安定化の効果を示す図である。 実施例3.1で調製したアガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)のナノ懸濁液に基づく、プロパン−1,2,3−トリオールがない場合の化学的安定性の効果を示す図である。 実施例3.1で調製したアガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)のナノ懸濁液に基づく、20%(v/v)プロパン−1,2,3−トリオールがある場合の化学的安定性の効果を示す図である。 実施例3.1で調製したアガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)のナノ懸濁液に基づく、50%(v/v)プロパン−1,2,3−トリオールがある場合の化学的安定性の効果を示す図である。 5%(w/w)アガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)のナノ懸濁液(実施例3.1で調製)および5%(w/w)アガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)抽出液(実施例3.4で調製)のβ−1,3/1,6−グルカンの微分(differential)重量分率(即ち平均モル質量)を示す図である。 非刺激末梢血単核球(PBMC)、5%(w/w)アガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)ナノ懸濁液(実施例3.1で調製)で刺激したPBMC、および5%(w/w)アガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)抽出液(実施例3.4で調製)で刺激したPBMCの試料におけるデクチン−1陽性単球の相対量(%で表わす)を示す図である。 5%(w/w)アガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)ナノ懸濁液(実施例3.1で調製)および5%(w/w)抽出液(実施例3.4で調製)によって惹起されたサイトカインTNF−αのインビトロ誘導の比較を示す図である。 5%(w/w)アガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)ナノ懸濁液(実施例3.1で調製)および5%(w/w)抽出液(実施例3.4で調製)によって惹起されたインビトロ誘導におけるサイトカインIL−10の比較を示す図である。 5%(w/w)アガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)ナノ懸濁液(実施例3.1で調製)および5%(w/w)抽出液(実施例3.4で調製)によって惹起されたインビトロ誘導におけるサイトカインIL−6の比較を示す図である。 5%(w/w)アガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)ナノ懸濁液(実施例3.1で調製)による粒子分布を示す図である。 5%(w/w)アガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)ナノ懸濁液(実施例12で調製)による粒子分布を示す図である。 5%(w/w)アガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)ナノ懸濁液(実施例12で調製)の取り込みによって惹起されたインビボ誘導におけるCD25活性化T細胞CD3+CD25+を示す図である。 カプセル取り込みにおけるアガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)粉末によって惹起されたインビボ誘導におけるCD25活性化T細胞CD3+CD25+を示す図である。
本開示は少なくとも1つの天然材料を含むナノ懸濁液を調製するための方法であって、
a.320μm未満の粒径(D100)を有する少なくとも1つの天然材料を用意するステップと、
b.ステップa.の前記少なくとも1つの天然材料を溶媒中に分散させるステップと、
c.ステップb.の分散液を摩砕して粒径(D90)を1000nm未満(D90<1000nm)とするステップと
を含む方法に関する。
本発明は、以下に説明的に記述するように、本明細書に具体的に開示していない任意の要素(単数または複数)、限定(単数または複数)なしに好適に実施することができる。
本発明を特定の実施形態に関して、またある図面を参照して記述するが、本発明はそれらに限定されず、特許請求の範囲のみによって限定される。これ以降説明する用語は、その他に指示しない限り、一般にその一般的意味において理解されるべきである。
本明細書および特許請求の範囲において「含む(comprising)」という用語を用いる場合、これはその他の要素を排除しない。本発明の目的のため、「からなる(consisting of)」という用語は、用語「含む(comprising)」の好ましい実施形態であると考えられる。これ以降、あるグループが少なくともある数の実施形態を含むと定義された場合、これは好ましくはこれらの実施形態のみからなるグループを開示しているとも理解されるべきである。
単数の名詞、たとえば「a」、「an」または「the」を指す不定冠詞または定冠詞を用いる場合、具体的に他に記述しない限り、これはその名詞の複数を含む。
「得られる(obtainable)」または「定義される(definable)」および「得られた(obtained)」または「定義された(defined)」という用語は、相互交換可能に用いられる。たとえばこれは、「得られた」または「定義された」という用語にはそのような限定された理解が好ましい実施形態として常に含まれるとしても、文脈による別段の明記がない限り、たとえばある実施形態がたとえば「得られた」という用語にかかる一連のステップによって得られなければならないということを示す意図はないという意味である。
本明細書において用いる「ナノ懸濁液」は、たとえば水、エタノール、またはそれらの混合物等の溶媒中のナノ粒子の懸濁液を指す。ナノ懸濁液は追加的に安定剤、またはその他の化合物を含んでもよい。ナノ懸濁液は溶媒中に懸濁したナノ粒子の形態で水難溶性化合物を含む。そのようなナノ懸濁液は、溶媒、脂質媒体、またはその両方に難溶性の化合物の「溶解度」(または分散性)を高めるために用いられる。「溶解度」が増大した結果として、難溶性化合物の血漿中濃度が高くなり、前記化合物の最大血漿中濃度への到達が速くなる。本開示において「懸濁液」および「分散液」という用語は、溶媒中の固体粒子を指し、相互交換可能に用いられる。
本明細書において用いる「ナノ粒子」は1000nm未満の粒径を有する粒子である。溶媒中の複合ナノ粒子は一次粒子であってもよく、小粒子から構成される凝集した粒子であってもよい。ナノ懸濁液中の粒径はレーザー回折アナライザー(たとえばBeckman Coulter LS13320またはHoriba LA−950)によって測定することができる。
本開示において用いる天然材料の「溶解度」または「溶解度限界」という用語は、溶媒中に溶解できる天然材料の最大量に関する。本開示の目的のため、特定の溶媒中における天然材料の溶解度は以下のように決定することができる。粒径D90が320μm未満の乾燥した天然材料を用いこれを最初の量として、5%または10%(w/w)の濃度で、蒸留水等の溶媒中の前記天然材料の懸濁液を調製する。前記懸濁液の調製のため、天然材料を60分間、30℃の温度で溶媒中に懸濁する。得られた懸濁液を次いで1500gで30分間遠心分離し、上清から沈殿を分離して、対照とするために秤量する。上清を60℃で24時間乾燥し、上清中に溶解した天然材料(乾燥ベース)を得て、秤量する。溶解度は以下の式:
溶解度(%)=上清の質量(乾燥ベース)×100/最初の天然材料粉末の質量(乾燥ベース)
を用いて計算される。
本開示において用いる「溶解度因子」という用語は、ナノ懸濁液を調製するために用いた溶媒中における天然材料の溶解度または溶解度限界に対する、本開示によるナノ懸濁液中の前記天然材料の量に関する。溶解度因子はナノ懸濁液中に存在する天然材料の量(%(w/w)で表わす)を、用いた溶媒中における前記天然材料の溶解度で割った値である。言い換えれば、溶解度因子を1とすれば、前記溶媒中における天然材料の溶解度限界に到達する。溶解度因子が1未満であればナノ懸濁液中の天然材料の量は溶解度限界未満であり、1を超える溶解度因子は前記溶媒に溶解できる天然材料の量を超える量の天然材料がナノ懸濁液中に存在していること、即ちナノ懸濁液中の天然材料の濃度がその溶解度限界を超えていることを示す。
本開示において用いる「セルロース繊維」という用語は、数百から1万を超えるβ−1,4−D−グルコース単位の直鎖を有する多糖からなり、1μmを超える繊維長を有する植物繊維(特に木材繊維)に関する。したがってセルロース繊維は直径1μm未満の球状または半軸1μm未満の楕円状の幾何形状を有するβ−1,3/1,6−グルカンからなっていない。
好ましい実施形態においては、少なくとも1つの天然材料は、植物、好ましくはチョウセンニンジンおよび/またはセルロース繊維を除く植物、シアノバクテリア、藻類および菌類からなる群から選択される。別の実施形態においては、天然材料はチョウセンニンジンおよび/またはセルロース繊維を含まない。本明細書において用いる植物はイチョウ綱(イチョウ)、グネツム綱、マツ綱(たとえば針葉樹)、および被子植物(顕花植物)を含んでもよい種子植物を含んでよく、これらはモクレン亜綱、ユリ亜綱(たとえばパイナップル)、キントラノオ目(たとえばセイヨウオトギリソウ、柳皮)、バラ亜綱(たとえばイラクサ)、アブラナ目(たとえばカリーカパパイヤ)、マメ目(たとえばゲンゲ)、シソ目(たとえばオリーブの木およびオリーブ葉)、マツムシソウ目(たとえばニワトコ)等の亜綱をさらに含んでよい。シアノバクテリアはたとえばスピルリナを含んでよい。藻類は紅色植物亜界(たとえば紅藻類、褐藻類および珪藻類)、緑藻類および緑色植物亜界を含んでよい。菌類はアクラシオ亜門、変形菌類、不等毛植物亜門、および真菌門(アガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)等のピラー菌類)を含んでよい。
別の好ましい実施形態においては、天然材料はイチョウ、パイナップル、セイヨウオトギリソウ、柳皮、イラクサ、カリーカパパイヤ、ゲンゲ、オリーブ葉、ニワトコ、スピルリナ、クロレラ藻類、紅藻類、褐藻類ならびに珪藻緑色藻類および緑色植物亜門、アガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)、ボスウェリア、イワベンケイ、キナ皮、トコン、ヒヨドリバナ、ブリオニアアニル、ナンバンコマツナギ(anil root)、クルクマ、デビルズクロー、キャッツクロー、ゴジアオイ、アマニ、オオアザミ(ホーリーシスル)、クサノオウ(セランダイン)、カプランペラルゴニア、エキナセア、ブドウの種である。
別の好ましい実施形態においては、天然材料はチョウセンニンジンおよび/またはセルロース繊維を含まない。
別の好ましい実施形態においては、少なくとも1つの天然材料は前記天然材料の一部または全体、好ましくは前記天然材料の全体である。本開示の方法は任意の天然材料について全体として、またはその一部として用いることができる。例として、根、茎、葉、果実、花、その他の植物の一部のみが、天然材料の種類に応じて用いることができる。
別の好ましい実施形態においては、ナノ懸濁液は少なくとも2つの天然材料の混合物を含む。したがって、ナノ懸濁液は単一の天然材料、または2つ以上の天然材料、即ち少なくとも2つの天然材料の混合物を含むナノ懸濁液であってよい。ナノ懸濁液はその上、同じ天然材料の異なる部分、たとえば根の部分および花の部分を含んでよく、および/またはナノ懸濁液は異なる種類の天然材料、たとえば異なる植物または植物およびシアノバクテリアを含んでもよい。
別の好ましい実施形態においては、ナノ懸濁液の調製において用いる天然材料はステップa.に先立ってステップa.1で乾燥され、好ましくは冷凍乾燥および/または熱乾燥される。
別の好ましい実施形態においては、ナノ懸濁液の調製に用いられ、上で開示したように本方法のステップa.で用意される天然材料は、15%未満(w<15%)、好ましくは12%未満(w<12%)、より好ましくは10%未満(w<10%)、最も好ましくは8%未満(w<8%)の含水率wを有する。
ナノ懸濁液の調製のために用いる天然材料の含水率は低いことが好ましい。本開示において用いる「含水率」または「残存水分」という用語は、以下の式:
残存水分含量[%]w=(mres−mdry)/(mwet−mdry)×100%
を用いて、含水または湿潤した材料の質量mwetおよび水を含まない乾燥した材料の質量mdryならびに残存水分を含んだ材料の質量mresから計算される天然材料等の材料の含水率wを指す。
ナノ懸濁液を調製する際には、そのような低い含水率が有利であり得る。さらに、天然材料の粒径(D100)を320μm未満にする際にもこれは有益であり得る。天然材料の含水率を低減させるためには当技術分野で公知の様々な方法があり、これらの方法のいずれも本開示と組み合わせて用いることができる。例として、天然材料は凍結乾燥(即ち冷凍乾燥)または熱乾燥することができる。乾燥ステップの前に、天然材料の種類に応じて天然材料を清浄化、皮むき、および/または芯抜きすることが有利であり得る。以下に、乾燥のための2つの例示的な方法を示す。
天然材料は凍結乾燥機を用いて、たとえば4ステップのプロセスで以下のようにして凍結乾燥することができる。
・天然材料を天然材料の大きさおよび構造に応じてナイフで約1〜2cmの小片に切断する。
・1〜2cmの小片をナイフミル(たとえばRetsch GmbH、GermanyのGrindomix(登録商標)200または300)に入れ、以下のパラメーターで粉砕する。2000rpmで10秒、続いて5000rpmで10秒、最後に10,000rpmで20秒。
・得られたパルプを−18℃で4時間凍結し、さらに凍結乾燥機に入れ、製品温度が20℃になるまで凍結乾燥する。
上記冷凍乾燥プロセスは例示的なものであり、当業者は天然材料の種類に応じてプロセスを適合させ得ることが理解される。例として、シアノバクテリアは前もって粉砕または切断せずに直接冷凍乾燥してよい。同様に、ナイフミル中で小片を切断するパラメーターも必要に応じて調整してよい。
天然材料は、残存水分含量が8%もの低さになるまで、天然材料中の化合物の熱感受性に応じて、たとえば36〜45℃の温度で、空気中またはオーブン中で乾燥することもできる。
別の好ましい実施形態においては、ナノ懸濁液の調製において用いられ、上で開示した方法のステップa.で用意される天然材料は、ステップa.1の乾燥の前および/または後に、好ましくはナイフミルで予備粉砕され、任意選択で320μm未満の粒径(D100)に篩分けされる。天然材料のそのような粉砕は天然材料をそのまま、即ち前もって切断または乾燥せずに、行なうことができる。あるいは、天然材料を上述のように小片に切断および/または乾燥してもよい。さらに、320μm未満の粒径(D100)を有する天然材料の粉末を得るために天然材料を篩分けしてもよい。
冷凍乾燥された天然材料の予備粉砕および篩分けの例示的な方法は下記の通りである。
・冷凍乾燥された粗な天然材料粉末をナイフミル(たとえばRetsch GmbH、GermanyのGrindomix(登録商標)200または300)に入れ、以下のパラメーターで粉砕する。2000rpmで10秒、続いて5000rpmで10秒、最後に10,000rpmで20秒。
・ナイフミルプロセスからの粗な天然材料粉末を、メッシュサイズ320μmの篩で篩分けする。
・320μmより大きな天然材料粒子を再びナイフミルに入れてさらに粉砕し、続いて320μmの篩で篩分けする。第2または第3の粉砕ステップの残留物は廃棄してよい。
同様に、熱乾燥された天然材料の予備粉砕および篩分けの例示的な方法は下記の通りである。
・熱乾燥された天然材料をナイフで約1〜2cmの小片に切断する。
・1〜2cmの小片をナイフミル(たとえばRetsch GmbH、GermanyのGrindomix(登録商標)200または300)に入れ、以下のパラメーターで粉砕する。2000rpmで10秒、続いて5000rpmで10秒、最後に10,000rpmで20秒。
・ナイフミルプロセスからの粗な天然材料粉末を、メッシュサイズ320μmの篩で篩分けする。
・320μmより大きな天然材料粒子を再びナイフミルに入れてさらに粉砕し、続いて320μmの篩で篩分けする。第2または第3の粉砕ステップの残留物は廃棄してよい。
ステップa.で得られる320μm未満の粒径(D100)を有する少なくとも1つの天然材料を、本開示の方法に従ってステップb.で溶媒に分散させる。
別の好ましい実施形態においては、溶媒は水、好ましくは蒸留水、または水とエタノールの混合物である。
溶媒として用いる水は通常水、精製水、蒸留水、2回もしくは3回蒸留水、または脱ミネラル水等、任意の種類の水であってよい。同様に、用いるエタノールも通常のエタノール、または水とエタノールの混合物であってよい。したがって、得られるナノ懸濁液は水性ナノ懸濁液、またはエタノール中のナノ懸濁液、または水とエタノールの混合物もしくは任意のその他の溶媒もしくは溶媒の混合物に基づくナノ懸濁液であってよい。本明細書で用いる「溶媒」という用語は、単一の溶媒または溶媒の混合物を指す。好ましくは、ナノ懸濁液が医薬として用いられる場合には、溶媒は薬学的に許容される溶媒である。
別の好ましい実施形態においては、ナノ懸濁液は水性ナノ懸濁液、または水とエタノールの混合物に基づくナノ懸濁液である。
ステップb.において天然材料を溶媒中に分散させる際には、天然材料は好ましくは用いる溶媒の全量に基づいて0.5〜20%(w/w)、好ましくは2〜10%(w/w)、さらに好ましくは2〜5%(w/w)、または5〜10%(w/w)の範囲の濃度を有する。本出願の別の好ましい実施形態においては、天然材料は好ましくは用いる溶媒の全量に基づいて0.5〜70%(w/w)、好ましくは40〜70%(w/w)、または10〜40%(w/w)の範囲の濃度を有する。天然材料の%(w/w)で表わした濃度は、ナノ懸濁液を調製するために用いる溶媒の全量に基づいている。例として、溶媒1000gに対して天然材料の粉末50gを用いて、5%(w/w)が調製される。前記濃度範囲内で、懸濁液のナノ懸濁液へのさらなる摩砕が容易になる。分散液は、溶媒と天然材料を、たとえば磁気攪拌器または任意のその他の回転デバイスを用いて好ましくは1000rpmまでの速度で撹拌することによって調製できる。
したがって、別の好ましい実施形態においては、少なくとも1つの天然材料はステップb.において、ナノ懸濁液に用いる溶媒の全量に基づいて0.5〜20%(w/w)、好ましくは2〜10%(w/w)、さらに好ましくは2〜5%(w/w)または5〜10%(w/w)の濃度で分散される。
特に好ましい実施形態においては、少なくとも1つの天然材料は、0.4を超える、または0.5を超える、または0.8を超える、または1を超える、または1.1をも超える溶解度因子をもたらす濃度でナノ懸濁液中に存在する。
ナノ懸濁液は安定剤の使用によって安定化されることが好ましい。そのような安定剤は、リン脂質、ポリソルベート、プロパン−1,2,3−トリオール(グリセリン)、静電的もしくは立体安定剤および界面活性剤からなる群から選択され得る。そのような安定剤はステップb.において、または摩砕ステップc.の間に、または摩砕ステップc.の後でも、分散液に添加され得る。リン脂質、非イオン性界面活性剤および乳化剤、たとえばポリソルベート等のいくつかの安定剤は、好ましくは分散ステップb.において好ましくはナノ懸濁液に添加される。ポロキサマー等の非イオン性トリブロックコポリマー等のその他の安定剤は、好ましくは摩砕ステップc.の間に添加される。プロパン−1,2,3−トリオールまたはジオクチルスルホコハク酸ナトリウム(DOSS)等のさらにその他の安定剤は、好ましくは摩砕ステップc.の後に添加される。分散ステップb.において安定剤を添加する場合、特に安定剤がリン脂質である場合には、天然材料の全量に基づいて50%〜200%(w/w)までの量で安定剤を添加することが好ましい。安定剤がポリソルベート等の非イオン性界面活性剤または乳化剤である場合には、これは溶媒の量に基づいて好ましくは1.5%(w/w)までの量で添加される。摩砕ステップc.の間に、2〜10μmまでの範囲の特定の粒径(D90)に達した場合、または摩砕ステップc.の間に粒径(D90)が、たとえば摩砕時間1時間の間に少なくとも4%、さらに低減しない場合、または摩砕ステップc.の間に粒径(D90)が、摩砕時間1時間の間に少なくとも10%増大した場合には、ポロキサマー等の非イオン性トリブロックコポリマー等の安定剤を添加することが好ましい。
好ましい実施形態においては、安定剤は、リン脂質、ポリソルベート、ホモポリマー、ブロックおよびグラフトコポリマー(ヒドロキシプロピルセルロース(HPC)、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)およびポリビニルピロリドン(PVP)等)等のポリマー、ポロキサマー(たとえばKolliphor(登録商標)P407またはポロキサマー188)等の非イオン性トリブロックコポリマー、コポリビニルピロリドン、Labrasol(登録商標)、Gelucire(登録商標)、ゼラチン、レシチン(ホスファチド)、アカシアガム、コレステロール、トラガカント、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンカスター油誘導体、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレンステアレート、モノおよびジグリセリド、コロイド状二酸化ケイ素、ドデシル硫酸ナトリウム、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、トリエタノールアミン、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、グリセロールモノステアレート、セトステアリルアルコール、セトマクロゴール乳化ワックス、短鎖および中鎖アルコール、Labrafil(登録商標)、Purol−oleique(登録商標)、プロパン−1,2,3−トリオール、ポリビニルアルコールならびにジオクチルスルホコハク酸ナトリウム(DOSS)からなる群から選択される。ポリソルベートの好ましい例はポリソルベート80およびポリソルベート20である。安定剤は、ポリソルベート80、ポリソルベート20、Kolliphor(登録商標)P407およびポロキサマー188からなる群から選択されることがさらに好ましい。特に好ましい実施形態においては、安定剤はKolliphor(登録商標)P407またはTween(登録商標)80等のポリソルベート80である。別の好ましい実施形態においては、分散ステップb.は、リン脂質およびポリソルベートからなる群から選択される安定剤の添加を含む。
別の好ましい実施形態においては、分散ステップb.は、ナノ懸濁液において用いる溶媒の全量に基づいて0.5〜2%(w/w)の量のポリソルベートの添加を含み、および/またはポリソルベートは、ポリソルベート80およびポリソルベート20からなる群から選択される。
別の好ましい実施形態においては、分散ステップb.は、天然材料の量に基づいて100%〜200%(w/w)の量、好ましくは130%〜170%(w/w)の量のリン脂質の添加を含み、好ましくはリン脂質は95(重量)%までのホスファチジルコリン、および20〜30(重量)%のリゾホスファチジルコリンを含む。リン脂質は20〜95%のホスファチジルコリン、好ましくは20〜75%のホスファチジルコリン、および20〜30%のリゾホスファチジルコリン(たとえばLipoid GmbH、GermanyのLipoid P100、P75、R LPC20)を含むことが好ましい。天然材料の全量に基づいてリン脂質を100〜300%(w/w)、より好ましくは50〜200%(w/w)の量で添加することも好ましい。
安定剤として立体安定剤を用いる場合には、立体安定剤はナノ粒子の表面に吸着され、または付着して、大きく濃密な立体バリアとなり、これがファンデルワールス引力に打ち勝つことにより、立体安定剤は凝集、集塊、またはさらには粒子の融合を低減する。立体安定剤は好ましくは薬学的に許容される賦形剤であり、ヒドロキシプロピルセルロース(HPC)、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)およびポリビニルピロリドン(PVP)等のホモポリマー、ブロックおよびグラフトコポリマー等のポリマーから選択され得る。特に好ましい立体安定剤は非イオン性トリブロックコポリマーKolliphor(登録商標)P407である。Kolliphor(登録商標)P407は2つの親水性ポリオキシエチレン鎖(ポリ(エチレンオキシド))に挟まれた中央の疎水性ポリオキシプロピレン鎖(ポリ(プロピレンオキシド))から構成される。立体安定剤は摩砕ステップc.の間に添加することが有利であり得る。したがって、立体安定剤を摩砕ステップc.の間に、さらに好ましくは粒子が5μm未満の粒径(D90)を有する時点で、0.5〜2%(w/w)の量で添加することが好ましい。
本開示のプロセスにおいて用いる別の好ましい安定剤はグリセリン(プロパン−1,2,3−トリオール)である。前記グリセリンは好ましくは摩砕ステップc.の後に、さらに好ましくは溶媒の全体積に基づいて30〜100%(v/v)または40〜100%(v/v)の量で、さらにより好ましくは40%(v/v)または50%(v/v)の量で添加される。
グリセリンに加えて、またはその代替として、静電的安定剤としてのジオクチルスルホコハク酸ナトリウム(DOSS)を、好ましくは溶媒の全量に基づいて0.5〜2%(w/w)の量で用いてもよく、好ましくは摩砕ステップc.の後に添加してもよい。
摩砕ステップc.の間に、320μm未満の粒径で天然材料を含む分散液は、1000nm未満の粒径(D90)まで摩砕される。これは任意の好適な摩砕機によって達成することができる。
好ましい実施形態においては、前記摩砕ステップc.はウェットボールミル、好ましくはウェットボールアジテーターミルにおいて実施される。
さらに好ましい実施形態においては、前記摩砕ステップc.は、ウェットボールミル、好ましくはウェットボールアジテーターミル中で直径0.5〜1.5mmの粉砕ボールを用いる第1の摩砕ステップc.1、ウェットボールミル、好ましくはウェットボールアジテーターミル中で直径0.3〜0.4mmの粉砕ボールを用いる第2の摩砕ステップc.2、およびウェットボールミル、好ましくはウェットボールアジテーターミル中で直径0.05〜0.2mmの粉砕ボールを用いる第3の摩砕ステップc.2を含む。第2の摩砕ステップc.2は粒径(D90)が約3〜6μmに達するまで行ない、第3の摩砕ステップc.3は粒径(D90)が約80〜500nm、好ましくは80〜300nmに達するまで行なうことが好ましい。天然材料粉末の開始時の粒径(D100)が320μm未満である別の好ましい実施形態においては、前記摩砕ステップc.は、ウェットボールミル、好ましくはウェットボールアジテーターミル中で直径0.4〜0.5mmの粉砕ボールを用いる第1の摩砕ステップc.1、およびウェットボールミル、好ましくはウェットボールアジテーターミル中で直径0.05〜0.2mmの粉砕ボールを用いる第2の摩砕ステップc.2を含む。第1の摩砕ステップc.1は粒径(D90)が約2〜6μmに達するまで行ない、第2の摩砕ステップc.2は粒径(D90)が約80〜500nm、好ましくは80〜300nmに達するまで行なうことが好ましい。ミルチャンバー内の温度は25〜36℃、リム速度は10〜14m/s、好ましくは11〜14m/sとすることがさらに好ましい。
したがって、好ましい実施形態においては、ステップb.の分散液はステップc.において、動的光散乱またはレーザー回折アナライザーによって測定される粒径(D90)が500nm未満(D90<500nm)、好ましくは300nm未満(D90<300nm)、さらに好ましくは250nm未満(D90<250nm)、最も好ましくは200nm未満(D90<200nm)まで摩砕される。
したがって、得られるナノ懸濁液は動的光散乱またはレーザー回折アナライザーによって測定される500nm未満(D90<500nm)、好ましくは300nm未満(D90<300nm)、さらに好ましくは250nm未満(D90<250nm)、最も好ましくは200nm未満(D90<200nm)の粒径(D90)および40nmを超える粒径(D90>40nm)を有し得る。
得られるナノ懸濁液は単峰性懸濁液としての最良の安定性結果によってさらに特徴付けられ、単一モードは300nm未満、好ましくは200nm未満の平均値を有する。そのような単峰性懸濁液は、懸濁液を濾過することによって得ることができる。フィルターによって粒径は450nm未満、好ましくは300nm未満、さらに好ましくは220nm未満の粒径(D90)に低減することができる。フィルターデバイスとしては任意の最新技術のデバイス、たとえばSartorius Stedim Biotechフィルターを用いることができる。ナノ懸濁液が450nmにまで濾過されれば、そのような濾過は粒径分布の標準偏差をさらにより狭くすることができ、それが安定性に貢献する。代替として、単峰性懸濁液は対応するプロセス手段によっても達成することができる。例として、実施例12の懸濁液は濾過なしの単峰性懸濁液である。
摩砕ステップc.の間に、ある比エネルギーがナノ懸濁液に加えられる。比エネルギーは[kW]で表わしたウェットボールアジテーターミルの正味のエネルギー(全エネルギーからアイドリングドライブパワーを引いたもの)と[h]で表した摩砕時間の積を[t]で表わしたナノ懸濁液の全量([t]で表わした、溶媒、天然材料粉末および全ての安定剤の量)で割った値である。
上で開示した安定剤を用いる化学的安定化の代替として、ナノ懸濁液は図1に示すコロイデーター(たとえばLevigata GmbH、Germanyの改良型Kamena)を用いて物理的に安定化することもできる。このプロセスの間、ナノ懸濁液は容器(1)の中で、ローター(4)および支持ローター(5)の回転によって凹形シリンダー(3)の中に、バッフルプレートを介してその上端に、殆ど乱流のない形で導かれる。内部の凹形シリンダー(3)の中で、下向きのナノ懸濁液の流れ(7)は、凹形シリンダーの下端の出口におけるローター(4、5)によって撹拌された、逆回転する上向きのナノ懸濁液の流れと衝突する。ナノ懸濁液の下向きの流れとナノ懸濁液の反対向きの回転流との衝突において、ナノ粒子は摩擦によって帯電する。この静電気または粒子電荷によって、ナノ粒子の分離、したがって物理的安定化引き起こされ得る。その後、ナノ懸濁液は外側の双曲線形のシリンダーを反対方向に上昇する(6)。こうしてナノ懸濁液は上向きおよび下向きに整列した動きに固定される。ここで発生した熱エネルギーは容器(1)の二重壁(2)内に組み込まれた水冷装置によって伝導され、冷媒は二重壁に供給され、二重壁から除かれる(8a、8b、9a、9b)。
したがって、好ましい実施形態においては、ナノ懸濁液は摩砕ステップc.の後に、コロイデーター中で好ましくは酸素の添加とともにコロイド化ステップd.にさらに供される。そのようなコロイド化は、さらには安定剤の使用の代わりになることができ、さらなる好ましい実施形態においては、ナノ懸濁液は安定剤を一切含まず、特にプロパン−1,2,3−トリオールを一切含まない。
上に詳述したように、本開示のナノ懸濁液は化学的または物理的に安定化することができる。
本開示のナノ懸濁液はさらに酸素(O)を含んでよい。本開示については、水に多くの酸素が含有されていれば、酸素は水に物理的または化学的に溶解する等、水に溶解することができ、またはナノ粒子のいずれにも付着することもできる。ナノ懸濁液に過剰量の酸素を含有させるために、上記のコロイデーターを用いることができる。本開示の例示的な方法において、コロイド化プロセスの開始の約1分後に20〜30mg/リットルの酸素がナノ懸濁液中に含まれるまで、酸素を添加してよい。この種のプロセスによって、酸素が圧力によって溶液中に注入される圧力法とは対照的に、いわゆる吸入プロセスによって酸素がナノ懸濁液に添加される。酸素富化デバイスとして、必ずしもこれに制限するものではないが、Levigata Ltd.のウルトラコロイデーターを用いることができる。
本開示の好ましい実施形態においては、ナノ懸濁液は20〜30mg/lの酸素濃度を有する。
少なくとも1つの天然材料および任意選択の酸素に加えて、本開示のナノ懸濁液は、香味料、保存料、界面活性剤および浸透促進剤、たとえばリボフラビンまたはアスコルビン酸からなる群から選択される少なくとも1つの化合物を含んでもよい。
ナノ懸濁液は任意選択でステップc.の後の濾過ステップで、および任意選択でステップd.の前または後で、濾過してもよい。そのような濾過によって、ナノ懸濁液中のナノ粒子の大きさを必要に応じてさらに適合させることができる。例として、ナノ懸濁液の無菌濾過が挙げられる。そのような無菌フィルターによって粒径は450nm未満、好ましくは220nm未満の粒径(D90)に低減することができる。フィルターデバイスとしては標準のMiliporeフィルター等の任意の最新技術のデバイスを用いることができる。ナノ懸濁液が220nmにまで濾過されれば、そのような濾過によって粒径分布の標準偏差がさらにより狭くなり、安定性に寄与することができる。
本開示の好ましい実施形態においては、ナノ懸濁液はステップc.の後に、および任意選択でステップd.の前または後で、好ましくは無菌フィルターによって、さらに好ましくは450nm未満、より好ましくは220nm未満の粒径にまで濾過される。
ナノ懸濁液の使用の前に、ナノ懸濁液の濃度は必要に応じて適合させることができる。一方、ナノ懸濁液はさらなる溶媒の添加によって希釈してもよい。他方、ナノ懸濁液の濃度はさらなるステップe.において増大させてもよい。濃度の増大は、好ましくは乾燥チャンバー内における溶媒の蒸発によって、さらに好ましくは40℃を超えない温度で、また任意選択で減圧下で達成することができる。次いで最終のナノ懸濁液は好ましくはナノ懸濁液中に存在する溶媒の全量に基づいて10〜40%(w/w)、好ましくは10〜20%(w/w)の範囲の天然材料の濃度を有する。
したがって、好ましい実施形態においては、ナノ懸濁液の濃度はさらなるステップe.において、好ましくは乾燥チャンバー内における溶媒の蒸発によって、ナノ懸濁液中に存在する溶媒の全量に基づいて10〜40%(w/w)、好ましくは10〜20%(w/w)の天然材料の濃度まで増大される。
上述の調製方法から結論され、実験の部における実施例によって支持されるように、天然材料のナノ懸濁液は以下の要素によって抽出液と異なる。
活性成分の濃度
ナノ懸濁液は水溶性化合物等の抽出された部分のみでなく、その天然の組成の中にナノ粒子として天然材料の全体または一部を含んでいるので、ナノ懸濁液中の親水性ならびに疎水性の化合物の濃度は抽出液に比べて高い。抽出液中ではそれぞれの溶媒中のそれらの溶解度によって、親水性または疎水性の化合物のみが溶液中に存在する。
乾燥質量の量
ナノ懸濁液の性質から、乾燥質量は通常、ナノ懸濁液を形成するためにステップb.で添加した化合物の量と同じまたはほぼ同じである。それと対照的に、大部分の化合物の溶解度は100%よりかなり小さいので、抽出液の乾燥質量は常に、溶媒中に加えた化合物の量よりも少ない。
酸化
ナノ粒子は通常、限定された溶解度でナノ懸濁液中に分散しているので、化学反応の可能性は溶液系の製剤ほど高くない。したがって、ナノ懸濁液の化学的安定性は一般に溶液のそれよりも優れている。ナノ懸濁液の酸化安定性はアルミニウム表面における酸化層に類似した機構に帰せられる。ナノ粒子が水および酸素に曝されると、ナノ粒子表面における単層の劣化が生じる。この単層がナノ粒子の内部部分をさらなる劣化から保護し、それによりナノ懸濁液の酸化安定性を向上させる。
化学的安定化
ナノ粒子の独特のナノスケール構造は表面積と体積の比の顕著な増大をもたらし、それにより従来のミクロ粒子に比べてインビトロおよびインビボの両方で著しく異なる挙動がもたらされる。薬物のナノ結晶の利点にも関わらず、これらは複雑な製造および安定性の問題を含む種々の欠点を生じる。安定性は医薬品の安全性および有効性を担保する上での重要な視点の1つである。たとえば静脈内投与されるナノ懸濁液においては、大粒子(>5μm)の形成は毛細血管の閉塞および塞栓をもたらす可能性があり、したがって薬物の粒径および粒径分布は保存の間、厳密にモニターする必要がある。そのような大粒子は本発明のナノ懸濁液から除外される。
物理的安定化
粒子電荷はナノ懸濁液の物理的安定性を決定する要素の1つである。より多い粒子が均等に荷電していれば、粒子間の静電的反発が大きくなり、物理的安定性が高くなる。典型的には、粒子電荷はいわゆるゼータ電位として定量化され、これはたとえば電場内における粒子の電気泳動による移動度によって測定される。
ナノ懸濁液の調製のための上述の方法によってナノ懸濁液が得られる。したがって、本開示は本明細書に記載する方法のいずれか1つによって得られるナノ懸濁液にも関する。
さらに、本開示のナノ懸濁液は医薬または補助食品等のサプリメントの調製において使用することができる。本開示のナノ懸濁液は動物、好ましくはヒトへの頬側、局所および/または口腔内適用のための医薬の調製において有利に使用できる。
天然材料のナノ懸濁液は、経粘膜ルートを経由して投与される可能性を含む際立った利点を提供する。天然材料のナノ懸濁液は単位体積あたりより高い濃度の活性剤および小粒子の非水溶性活性剤を含み、したがって、免疫細胞によって免疫調節性活性剤が取り込まれ、免疫調節性活性剤の粒径が小さいことが必要とされる、免疫調節性薬物の新たな可能性を提供する。
口腔を通しての物質の取り込み容量には限界があるので、口腔内投与のためには薬物は好ましくは液体であり、低用量で有効である必要がある。さらに、口腔を通して投与される薬物の粒子はナノメートル範囲、たとえば約300nm未満である必要があり、そうでなければ口腔を経由する通過は制限される。本開示のナノ懸濁液は300nm未満の粒径D90で提供されるので、ナノ懸濁液は口腔内投与に有利に用いることができる。
口腔内においては、生物活性剤の投与の2つの一般に認められたルートがある。舌下送達は、口底部の内側を覆う粘膜を通して行なわれる。舌下ルートは透過性が高く血液の供給が豊富であるので、舌下腺ルートを経由する輸送によって、作用の開始が早く、送達時間が短い必要があり投与頻度が少ない、透過性が高い活性剤に適した送達ルートが得られる。第2の一般に認められたルートは頬粘膜を経由する。この領域は頬の内側を覆う粘膜を包含している。この領域も血液の供給が豊富で強固であり、ストレスまたは損傷の後の細胞回復時間が短くなる。頬粘膜は舌下領域よりも透過性が低いが、平滑で比較的動きにくい粘膜が拡張することにより、生物活性剤の維持放出および制御放出送達のための高度に望ましい吸収経路を提供する。その他の経粘膜投与ルートと同様、2つの主な利点としては肝による初回通過代謝および胃腸管内でのプレシステミックな除去が避けられることが挙げられる。
さらに、任意の公知の浸透促進剤が、本開示によるナノ懸濁液の通過を増大させ得る。
経口投与とは別に、本開示のナノ懸濁液は動物、好ましくはヒトへの、非経口、髄腔内、静脈内、経皮、または経粘膜適用にも使用することができる。したがって、本開示の好ましい実施形態は、動物、好ましくはヒトへの、非経口、髄腔内、静脈内、経皮、または経粘膜適用、好ましくは頬側、局所的または口腔内適用のための医薬の調製におけるナノ懸濁液の使用に関する。
本開示は、天然材料の安定なナノ懸濁液、前記ナノ懸濁液を調製する方法、および対象の血流中への生物活性剤の送達の促進を可能にする前記ナノ懸濁液の使用を提供する。そのようなナノ懸濁液が身体、たとえば頬粘膜を含む口腔の領域と接触すると、所望の生物学的反応を誘起するのに充分な量で化合物が血流中に吸収される。したがって、ナノ懸濁液は通常のまたはミクロ流動化されたスプレイ、エアロゾルまたは液体によって送達することができる。送達は非経口、髄腔内、静脈内、経皮、経粘膜、および薬物送達のための一般に認められた任意または全ての方法で達成することができる。
たとえば抽出液と比較した、本明細書に開示した方法によって調製したナノ懸濁液の最も顕著な差別化要素としては、(i)天然材料の主要活性成分の平均モル質量−平均モル質量が小さければ生体利用効率が高い、(ii)特定のヒト受容体によるヒト体内における天然材料の主要活性成分の認識度(いわゆる病原体認識受容体またはトール様受容体TLR;TLRによる検出の程度が高くさえあれば、引き続くシグナルカスケートによって高められた免疫刺激効果が開始される)、および(iii)その結果としての、ヒト体内における天然材料の主要活性成分の効果がある。天然材料であるアガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)について、これらの差別化要素は、アガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)の主要活性成分としての、水不溶性であるβ−1,3/1,6−グルカンを用いた、以下の実施例7〜9に示されている。
本開示のナノ懸濁液は、癌、炎症性腸疾患(IBD)、関節炎、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、その他のウイルス性疾患、神経皮膚炎もしくは乾癬等の皮膚疾患、または多発性硬化症、血管炎、関節リウマチもしくは皮膚筋炎等の自己免疫疾患の治療または予防において使用することができる。
本開示のナノ懸濁液は、たとえば天然材料から調製された抽出液と比べて、より長期にわたって、より高い濃度の天然材料の活性剤を血流中に提供するために効果的である。このことは、そのような天然材料に含まれる疎水性化合物について特に当てはまる。さらに、ナノ懸濁液はたとえば抽出液と比べて、ナノメートル範囲の免疫刺激性がより高い粒子をより高い量で含んでおり、これらはそれぞれの免疫サブポピュレーションによってより良く取り込まれ、または認識されるので、天然材料からの免疫調節化合物を含むナノ懸濁液は、より広く、より強い様式で免疫系を刺激する。
(実施例)
実験の部
以下、本発明をより詳細に説明する。しかし、保護の範囲は添付した特許請求の範囲によってのみ決定され、以下の実施例のいずれによっても制限されないことが理解される。以下の実施例は発明の理解を助けるために説明され、本明細書に記載し、特許請求する発明を具体的に限定すると解釈すべきではない。現在知られているか、または後に開発される全ての均等物の置換を含めて、当業者の領域内に含まれる本発明の変形、ならびに処方の変更または実験的設計の変更は、本明細書に組み込まれた本発明の範囲内にあると考えるべきである。
実施例1.1:オリーブ葉のナノ懸濁液の安定な製剤
乾燥したオリーブ葉粉末(粒径D90<320μm、残存水分<5%)200gを再蒸留水4000gに加えて、オリーブ葉粉末の水中5%(w/w)分散液とした。粒径D90<320μmのオリーブ葉粉末の溶解度は1.44%(w/w)である。これに基づくと、ナノ懸濁液の5%(w/w)の濃度はオリーブ葉粉末の溶解度限界よりも3.5倍(溶解度因子)高い。粒径(D90)が約380nmになるまでは大きさ0.4〜0.5mmのイットリウムで安定化されたジルコニアボールを用い、次いで最終粒径(D90)が272nmに達するまでは大きさ0.1mmのイットリウムで安定化されたジルコニアボールを用いて、分散液をウェットボールアジテーターミル(X1型、Buehler AG、Switzerland)で粒径(D90)400nm未満まで摩砕した。粒径(D90)が380nmになったところでTween(登録商標)80を14.5g(0.4%(w/w))加えた。これにより粒径が340nmまで低下した。粒径(D90)が約340nmになったところでさらにKolliphor(登録商標)P407を29g(0.7%(w/w))加えることによって、粒径(D90)が272nmまで顕著に低下した(図2参照)。摩砕に用いた比エネルギーの量[kWh/t]が図2から分かる。
実施例1.2:オリーブ葉の抽出(比較)
同量のオリーブ粉末(200g、粒径D90<320μm)を再蒸留水4000gで、温度22℃で2時間抽出した。
実施例1.3:乾燥質量の比較
上で調製した抽出液(実施例1.2)およびナノ懸濁液(実施例1.1)の乾燥質量の量を、抽出液およびナノ懸濁液をそれぞれ0.45μmのフィルター(Millipore、セルロースエステル膜)を用いて濾過することによって決定した。濾過した固体を乾燥し、濾過した粒子の乾燥質量を決定した。図3からも分かるように、同じ濃度(5%(w/w))のオリーブ葉粉末で、抽出液の0.3%(w/w))に比べてナノ懸濁液の乾燥質量の量は4.5%(w/w)である。
実施例2.1:スピルリナナノ懸濁液の安定な製剤
スピルリナ粉末(10%(w/w)、粒径D90<150μm、残存水分<5%)300gおよびKolliphor(登録商標)P407 60gを再蒸留水3000gに加えて、スピルリナの水中分散液とした。粒径D90<150μmのスピルリナ粉末の溶解度は0.52%(w/w)である。これに基づくと、ナノ懸濁液の10%(w/w)の濃度はスピルリナ粉末の溶解度限界よりも19.2倍(溶解度因子)高い。粒径(D90)が約120nmになるまでは大きさ0.4〜0.5mmのイットリウムで安定化されたジルコニアボールを用い、次いで最終粒径(D90)である80nmになるまでは大きさ0.1mmのイットリウムで安定化されたジルコニアボールを用いて、分散液をウェットボールアジテーターミル(X1型、Buehler AG、Switzerland)で粒径(D90)約80nmまで摩砕した。摩砕に用いた比エネルギーの量[kWh/t]が図4から分かる。
実施例2.2:スピルリナの抽出(比較)
同量のスピルリナ粉末(300g、粒径D90<150μm)を再蒸留水3000gで、温度22℃で2時間抽出した。
実施例2.3:乾燥質量の比較
上で調製した抽出液(実施例2.2)およびナノ懸濁液(実施例2.1)の乾燥質量の量を、抽出液およびナノ懸濁液をそれぞれ0.45μmのフィルター(Millipore、セルロースエステル膜)を用いて濾過することによって決定した。濾過した固体を乾燥し、濾過した粒子の乾燥質量を決定した。図5からも分かるように、同じ濃度(10%(w/w))のスピルリナ粉末で、抽出液の3.3%(w/w))に比べてナノ懸濁液の乾燥質量の量は9.4%(w/w)である。
実施例3.1:5%P100、0.5%Tween(登録商標)80および1%Kolliphor P407によるアガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)キノコナノ懸濁液の安定な製剤
アガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)の粉末(粒径D90<320μm、残存水分<5%)150g、Lipoid P100(5%(w/w))150gおよびポリソルベートTween(登録商標)80(0.5%(w/w))15gを再蒸留水3000gに加えて、アガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)粉末の水中5%(w/w)分散液とした。粒径D90<320μmのアガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)粉末の溶解度は3.2%(w/w)である。これに基づくと、ナノ懸濁液の5%(w/w)の濃度はアガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)粉末の溶解度限界よりも1.6倍(溶解度因子)高い。粒径(D90)が約6.3μmになるまでは大きさ0.4〜0.5mmのイットリウムで安定化されたジルコニアボールを用い、次いで最終粒径(D90)が240nmに達するまでは大きさ0.1mmのイットリウムで安定化されたジルコニアボールを用いて、分散液をウェットボールアジテーターミル(X1型、Buehler AG、Switzerland)で摩砕した。摩砕に用いた比エネルギーの量[kWh/t]が図6(実線)から分かる。粒径(D90)が約6.3μmになったところでKolliphor(登録商標)P407を30g(1%(w/w))加えた。ナノ懸濁液の最終粒径(D90)は240nmであった(図6−実線も参照)。
実施例3.2:10%P100、0.5%Tween(登録商標)80および1%Kolliphor P407によるアガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)キノコナノ懸濁液の安定な製剤
アガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)の粉末(粒径D90<320μm)150g、Lipoid P100(10%(w/w))300gおよびポリソルベートTween(登録商標)80(0.5%(w/w))15gを再蒸留水3000gに加えて、アガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)粉末の水中5%(w/w)分散液とした。粒径(D90)が約6.3μmになるまでは大きさ0.4〜0.5mmのイットリウムで安定化されたジルコニアボールを用い、次いで最終粒径(D90)が368nmに達するまでは大きさ0.1mmのイットリウムで安定化されたジルコニアボールを用いて、分散液をウェットボールアジテーターミル(X1型、Buehler AG、Switzerland)で摩砕した。摩砕に用いた比エネルギーの量[kWh/t]が図6(点線)から分かる。粒径(D90)が約2.6μmになったところでKolliphor(登録商標)P407を30g(1%(w/w))加えた。ナノ懸濁液の最終粒径(D90)は368nmであった(図6−点線も参照)。
実施例3.3:5%P100、0.75%Tween(登録商標)80によるアガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)キノコナノ懸濁液の安定な製剤
アガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)の粉末(粒径D90<320μm)150g、Lipoid P100(5%(w/w))150gおよびポリソルベートTween(登録商標)80(0.5%(w/w))15gを再蒸留水3000gに加えて、アガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)粉末の水中5%(w/w)分散液とした。大きさ0.4〜0.5mmのイットリウムで安定化されたジルコニアボールを用いて、分散液をウェットボールアジテーターミル(X1型、Buehler AG、Switzerland)で摩砕した。摩砕に用いた比エネルギーの量[kWh/t]が図7(点線)から分かる。比エネルギー15170kWh/tでナノ懸濁液の粒径(D90)は343nmに低減された(図7−点線も参照)。比エネルギーを増大させて摩砕を継続した後、粒径が急激に増大した。これは集塊の原因と考えられる粒子の表面積の増大によるものであろう。ポリソルベートTween(登録商標)80をさらに7.5g追加(全体で0.75%(w/w)になる)しても、粒径は顕著に低減しなかった。比較として、1%のKolliphor(登録商標)P407(上の実施例3.2)および0.5%のポリソルベートTween(登録商標)80を追加した同じナノ懸濁液は、粒径のさらなる減少および安定性のさらなる低下を示す(図7−実線参照)。
実施例3.4:アガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)キノコの抽出(比較)
同量のアガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)粉末(150g、粒径D90<320μm)を再蒸留水3000gで、温度22℃で2時間抽出した。
実施例3.5:乾燥質量の比較
上で調製した抽出液(実施例3.4)およびナノ懸濁液(実施例3.1)の乾燥質量の量を、抽出液およびナノ懸濁液をそれぞれ0.45μmのフィルター(Millipore、セルロースエステル膜)を用いて濾過することによって決定した。濾過した固体を乾燥し、濾過した粒子の乾燥質量を決定した。図8からも分かるように、同じ濃度(5%(w/w))のアガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)粉末で、抽出液の0%(w/w))に比べてナノ懸濁液の乾燥質量の量は4.4%(w/w)である。
実施例4.1:活性成分の濃度
アガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)の主要な活性剤はβ−1,3/1,6−グルカンであり、したがってアガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)の様々な抽出液およびアガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)のナノ懸濁液の濃度を比較するための参照材料としてこのグルカンを用いることができる。実施例3.1の5%(w/w)ナノ懸濁液および実施例3.4のアガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)の5%(w/w)抽出液とは別に、実施例3.4と同様の方法でさらなる抽出液を調製した。図9の他の抽出物の型も全て同じパラメーター(アガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)粉末150g、溶媒3000g、抽出時間2時間)で、図9に示す異なる溶媒(再蒸留水および60%(v/v)エタノール(EtOH))および異なる温度(室温22℃および80℃)を用い行なった。
図9に、抽出液およびナノ懸濁液の調製に用いた純粋なアガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)粉末に関連する、アガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)粉末の種々な抽出液および実施例3.1のナノ懸濁液のβ−1,3/1,6−グルカン含量の比較を示す。室温のエタノール抽出で僅か2%、再蒸留水中80℃で46%までであるのと比較して、ナノ懸濁液中には粉末が98%のβ−1,3/1,6−グルカン含量で取り込まれる。これにより、ナノ懸濁液中には粉末分画からの殆ど全てのβ−1,3/1,6−グルカンが保持されることが示される。
実施例5.1:シリカナノ懸濁液の安定な製剤
シリカ粉末(粒径D90<25nm)100gを再蒸留水2000gに加えて、シリカ粉末の水中5%(w/w)分散液とした。上に詳述した物理的安定化によってシリカナノ懸濁液を安定化した。レーザー回折アナライザーZetasizer(Malvern Instruments、UK)によって測定したゼータ電位を物理的パラメーターとして、物理的安定化の効果を評価した。即ち、コロイデーターによる物理的安定化の前後にゼータ電位を測定した。コロイデーター中、3000min−1、3分間の物理的安定化により、ゼータ電位は−0.84mVから−10.4mVに減少した。これは物理的安定化がない場合の値に比べて顕著な低減である(図10参照)。
実施例6において、様々なナノ懸濁液の長期安定性を検討した。ナノ懸濁液の沈降、浮遊または圧密化等の脱混合現象を分類し、定量化するために、分析用遠心分離機(LUM GmbH、GermanyのLumifuge)を用いて加速安定性試験を行なった。この試験は、ナノ懸濁液の安定性を決定するために行なった。ナノ粒子の沈降、浮遊または圧密化がないか僅かであれば、ナノ懸濁液は長期に安定であると考えられる。
加速安定性試験において、ナノ懸濁液を2000g(g=重力定数=9.81m/s)の遠心分離で加速した。Lumifugeを用いて、試料の全長にわたって空間分解および時間分解された消光プロファイルを得た。平行光(I)によって試料セル全体を照明し、上面から下面まで試料全体にわたって直線的に配置したマイクロスケールの分解能を有する数千個のセンサーによって、透過光Iを検出する。透過率をlg(I/I)によって消光に換算し、粒子濃度を計算することができる。
長期にわたって安定なナノ懸濁液を得るため、プロパン−1,2,3−トリオールを添加してナノ懸濁液の粘度を増大させ、ナノ懸濁液中におけるナノ粒子の沈降を防ぐことができる。以下の実施例は、プロパン−1,2,3−トリオールの添加の効果を示す。
実施例6.1:プロパン−1,2,3−トリオールが0%の場合のアガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)キノコナノ懸濁液の長期安定製剤
実施例3.1で調製したナノ懸濁液を取り、プロパン−1,2,3−トリオールを添加せずに磁気攪拌器で約30分間撹拌した。次いで上述のように、ナノ懸濁液の沈降、浮遊または圧密化等の脱混合現象を分類し、定量化するために、分析用遠心分離機(LUM GmbH、GermanyのLumifuge)を用いて加速安定性試験を行なった。
図11に、プロパン−1,2,3−トリオールが0%の場合のナノ懸濁液の光透過率曲線を示す。見てとれるように、2000gの遠心場において最初の回転で大粒子が沈降し(透過率40%から約25%の間は明灰色の線)、次いでさらなる大粒子が次の回転でそれに続き、20分後までにキュベットの底部に沈降物を生ずる。透過率は開始時の44%から10%にまで減少し(キュベットの底部における沈降物)、2000gの遠心場における沈降プロセスを表わしている。これは、ナノ懸濁液が長期には不安定であることを示している。
実施例6.2:20%のプロパン−1,2,3−トリオールを含むアガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)キノコナノ懸濁液の長期安定製剤
実施例3.1で調製したナノ懸濁液500mlを取り、20%(v/v)のプロパン−1,2,3−トリオールを添加した。得られた混合物を磁気攪拌器で約30分間撹拌した。次いで、上述の加速安定性試験を行なった。
図12に、20%のプロパン−1,2,3−トリオールを含むナノ懸濁液の光透過率曲線を示す。見てとれるように、2000gの遠心場において沈降する大粒子の量(透過率50%から40%の間は明灰色の線)は最初の回転ではずっと少なく、20分後にキュベットの底部に沈降物が生じる。透過率は開始時の58%から10%にまで減少し(キュベットの底部における沈降物)、2000gの遠心場における沈降プロセスを表わしている。これは、20%(v/v)のプロパン−1,2,3−トリオールの添加によってナノ懸濁液の安定性が増大し得ることを示している。
実施例6.3:50%のプロパン−1,2,3−トリオールを含むアガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)キノコナノ懸濁液の長期安定製剤
実施例3.1で調製したナノ懸濁液500mlを取り、50%(v/v)のプロパン−1,2,3−トリオールを添加した。得られた混合物を磁気攪拌器で約30分間撹拌した。次いで、上述の加速安定性試験を行なった。
図13に、50%のプロパン−1,2,3−トリオールを含むナノ懸濁液の光透過率曲線を示す。見てとれるように、2000gの遠心場において20分の間に沈降はなかった(透過率50%から約53%の間は明灰色の線)。キュベットの底部に沈降物はなかった。これは、50%(v/v)のプロパン−1,2,3−トリオールの添加によってナノ懸濁液の安定性がさらに増大することを示している。
いずれも濃度5%(w/w)のアガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)キノコナノ懸濁液および抽出液のβ−1,3/1,6−グルカンの平均モル質量
図14に、実施例3.1で調製したアガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)ナノ懸濁液および実施例3.4で調製した抽出液のβ−1,3/1,6−グルカンの微分重量分率(即ち平均モル質量)を示す(ナノ懸濁液1:検出器注入量20μl;ナノ懸濁液2:検出器注入量10μl;抽出液:検出器注入量10μl)。分析方法の信頼性を示すため、アガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)ナノ懸濁液のモル質量を2つの注入量で測定したが、これらは安定であることが示された。アガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)ナノ懸濁液の活性物質β−1,3/1,6−グルカンの平均モル質量は15から16kDaの間であり、抽出液のそれは135kDaである。これは、本明細書に記載した天然材料からナノ懸濁液を調製する方法によって主要活性物質β−1,3/1,6−グルカンのモル質量が顕著に低下することを示している。これにより、投与した際にナノ懸濁液中に存在するβ−1,3/1,6−グルカンの吸収が大きくなる。
いずれも濃度5%(w/w)のアガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)キノコナノ懸濁液および抽出液のβ−1,3/1,6−グルカンの検出
デクチン−1はヒト体内でβ−1,3/1,6−グルカンを検知する免疫細胞上の主要な受容体である。図15に、それぞれ非刺激末梢血単核球(PBMC)、5%(w/w)のアガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)ナノ懸濁液(実施例3.1で調製)および5%(w/w)のアガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)抽出液(実施例3.4で調製)で刺激したPBMCの試料中におけるデクチン−1陽性単球の相対量(%で表わす)を示す。5%(w/w)のアガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)ナノ懸濁液で刺激すると、PBMCの数が非刺激試料に対して409%増加したのに対して、5%(w/w)のアガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)抽出液で刺激した場合の増加は122%であった。
濃度5%(w/w)のアガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)キノコナノ懸濁液および抽出液によるサイトカインTNF−αの誘導
TNF−αは疾患の進行における主要なサイトカインの1つである。図16に、アガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)ナノ懸濁液(実施例3.1で調製)および抽出液(実施例3.4で調製)によって惹起されたサイトカインTNF−αのインビトロ誘導の比較を示す。アガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)ナノ懸濁液によるTNF−αの誘導は抽出液に比べて60倍高い。
いずれも濃度5%(w/w)のアガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)キノコナノ懸濁液および抽出液によるサイトカインIL−10の誘導
図17に、アガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)ナノ懸濁液(実施例3.1で調製)および抽出液(実施例3.4で調製)によって惹起されたインビトロ誘導における、主要な炎症誘発性サイトカインの1つとしてのサイトカインIL−10の比較を示す。アガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)ナノ懸濁液によるIL−10の誘導は抽出液に比べて26.5倍高い。
いずれも濃度5%(w/w)のアガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)キノコナノ懸濁液および抽出液によるヒト体内で得られる効果としてのサイトカインIL−6の誘導
図18に、アガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)ナノ懸濁液(実施例3.1で調製)および抽出液(実施例3.4で調製)によって惹起されたインビトロ誘導における、主要な炎症誘発性サイトカインの1つとしてのサイトカインIL−6の比較を示す。アガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)ナノ懸濁液によるIL−10の誘導は抽出液に比べて6.7倍高い。
濃度5%(w/w)のアガリクス(agaricus)キノコナノ懸濁液および7.5%脂質の粒子分布の改良
アガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)の粉末(粒径D90<320μm)150g、Lipoid P100(7.5%(w/w))225gおよびポリソルベートTween(登録商標)80(0.5%(w/w))15gを再蒸留水3000gに加えて、アガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)粉末の水中5%(w/w)分散液とした。粒径(D90)が約15μmになるまでは大きさ0.4〜0.5mmのイットリウムで安定化されたジルコニアボールを用い、次いで最終粒径(D100)が375nmに達するまでは大きさ0.1mmのイットリウムで安定化されたジルコニアボールを用いて、分散液をウェットボールアジテーターミル(X1型、Buehler AG、Switzerland)で摩砕した。粒径(D90)が約4μmになったところでKolliphor(登録商標)P407を30g(1%(w/w))加えた。ナノ懸濁液の最終粒径(D100)は375nmであった。得られたナノ懸濁液の濾過は不要であった。
2.5%(w/w)のLipoid P100をさらに加えることにより、実施例3.1と比べて2つの主要な改善が得られた。第1に、実施例3.1における粒径(D100)の10μm(図19参照)に比べて、375nm(図20参照)の最終粒径(D100)が得られた。第2に、実施例3.1における二峰性の粒子分布に比べて、単峰性の粒子分布が得られた(それぞれ図19および図20参照)。オストワルド熟成が生じ不安定なナノ懸濁液をもたらす可能性があるので、ナノ懸濁液を安定に保つためには、粒子分布を単峰性にしてオストワルド熟成を避けまたは低減することが好ましい。2つの実施例のより詳細な粒子分布からも相違は明白である。実施例3.1においてD10粒径は0.108μm、D50粒径は0.159μm、D90粒径は0.240μm、D100粒径は10μmである(図19参照)。これと対照的に、実施例12の詳細な粒径分布は、D10粒径が0.065μm、D50粒径が0.104μm、D90粒径が0.178μm、D100粒径が0.375μmである(図20参照)。
ヒト体内で得られる効果としての実施例12のアガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)キノコナノ懸濁液によるCD25活性化T細胞の誘導
CD25活性化T細胞は、ヘルパーT細胞2(Th2)からヘルパーT細胞1(Th1)への応答のシフトを誘起すると考えられる重要なT細胞のサブポピュレーションの1つである。Th1応答へのTh1/Th2バランスのシフトは、免疫系のウイルス防御能力の増大に関与している。以下の実施例において、アガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)を含む実施例12のナノ懸濁液を用い、市販のアガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)の粉末と比較して、CD25活性化T細胞の増加をヒトで試験した。
実施例12で調製したナノ懸濁液をプロパン−1,2,3−トリオール(グリセリン)と混合して、40%のグリセリンを含む混合物とした。ポンプスプレイアクチュエーターにより、8名のヒトからなる第1のグループに3.78ml/日の用量でこの混合物を投与した。この用量はアガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)105mg(乾燥固体量)に相当する。前記第1のグループにおいては、CD25活性化T細胞は開始後4週間以内に33%増加した(図21参照)。比較のため、8名のヒトからなる第2のグループには、カプセル化されたアガリクス・サブルフェセンス(agaricus subrufescens)粉末(粒径約220μm)を推奨される一日用量2520mgで投与した。前記第2のグループにおいては、CD25活性化T細胞は開始後4週間以内に11.5%増加した(図22参照)。
以上のデータから分かるように、実施例12のナノ懸濁液によって粉末に比べて約3倍のCD25活性化T細胞の増加がもたらされる。換言すれば、実施例12のナノ懸濁液は従来の粉末より約3倍活性が高い。粉末に比べて用量が24分の1と少なかったので、このことはさらにいっそう驚くべきことである。
1 容器
2 二重壁
3 凹形シリンダー
4 ローター
5 ローター、支持ローター
6 ナノ懸濁液は上昇する
7 ナノ懸濁液の下向きの流れ
8a 冷媒は二重壁に供給される
8b 冷媒は二重壁から除かれる
9a 冷媒は二重壁に供給される
9b 冷媒は二重壁から除かれる

Claims (35)

  1. 少なくとも1つの天然材料を含むナノ懸濁液を調製するための方法であって、
    a.320μm未満の粒径(D100)を有する少なくとも1つの天然材料を用意するステップと、
    b.ステップa.の前記少なくとも1つの天然材料を溶媒中に分散させるステップと、
    c.ステップb.の前記分散液を摩砕して粒径(D90)を1000nm未満(D90<1000nm)とするステップと
    を含む方法。
  2. 前記少なくとも1つの天然材料が植物、シアノバクテリア、藻類および菌類からなる群から選択され、および/または前記天然材料はチョウセンニンジンおよび/またはセルロース繊維を含まない、請求項1に記載の方法。
  3. 前記少なくとも1つの天然材料が前記天然材料の一部または全体、好ましくは前記天然材料の全体である、請求項1または2に記載の方法。
  4. 前記ナノ懸濁液が少なくとも2つの天然材料の混合物を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記天然材料がステップa.に先立ってステップa.1で乾燥され、好ましくは凍結乾燥および/または熱乾燥される、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
  6. ステップa.で用意される前記天然材料が、15%未満(w<15%)、好ましくは12%未満(w<12%)、より好ましくは10%未満(w<10%)、最も好ましくは8%未満(w<8%)の含水率wを有する、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記天然材料がステップa.1の前記乾燥の前および/または後に、好ましくはナイフミルで予備粉砕され、任意選択で320μm未満の粒径(D100)に篩分けされる、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記溶媒が水、好ましくは蒸留水、または水とエタノールの混合物である、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記ナノ懸濁液が水性ナノ懸濁液、または水とエタノールの混合物に基づくナノ懸濁液である、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記少なくとも1つの天然材料がステップb.において、前記ナノ懸濁液に用いる溶媒の全量に基づいて0.5〜20%(w/w)、好ましくは2〜10%(w/w)、さらに好ましくは2〜5%(w/w)、または5〜10%(w/w)の濃度で分散される、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記分散ステップb.または前記摩砕ステップc.が安定剤の添加を含み、好ましくは前記分散ステップb.がリン脂質および/またはポリソルベートの添加を含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記分散ステップb.が0.5〜2%(w/w)の量のポリソルベートの添加を含み、および/または前記ポリソルベートが、ポリソルベート80およびポリソルベート20からなる群から選択される、請求項11に記載の方法。
  13. 前記分散ステップb.が、前記天然材料の全量に基づいて50〜200%(w/w)の量のリン脂質の添加を含み、好ましくは前記リン脂質が95(重量)%までのホスファチジルコリン、および/または20〜30(重量)%のリゾホスファチジルコリンを含む、請求項11に記載の方法。
  14. ステップc.の前記摩砕がウェットボールアジテーターミルにおいて実施される、請求項1から13のいずれか一項に記載の方法。
  15. 摩砕ステップc.が、ウェットボールミル、好ましくはウェットボールアジテーターミル中で直径0.5〜1.5mmの粉砕ボールを用いる第1の摩砕ステップc.1、ウェットボールミル、好ましくはウェットボールアジテーターミル中で直径0.3〜0.4mmの粉砕ボールを用いる第2の摩砕ステップc.2、およびウェットボールミル、好ましくはウェットボールアジテーターミル中で直径0.05〜0.2mmの粉砕ボールを用いる第3の摩砕ステップc.2を含む、請求項14に記載の方法。
  16. 摩砕ステップc.が、ウェットボールミル、好ましくはウェットボールアジテーターミル中で直径0.4〜0.5mmの粉砕ボールを用いる第1の摩砕ステップc.1、およびウェットボールミル、好ましくはウェットボールアジテーターミル中で直径0.05〜0.2mmの粉砕ボールを用いる第2の摩砕ステップc.2を含む、請求項14に記載の方法。
  17. 摩砕ステップc.が、粒径D90<9μm、好ましくはD90<3μm、より好ましくはD90<800nm、最も好ましくはD90<300nmの時点での安定剤の添加を含み、好ましくは前記安定剤が静電的および/または立体安定剤である、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記安定剤が、リン脂質、ポリソルベート、ホモポリマー、ブロックおよびグラフトコポリマー(ヒドロキシプロピルセルロース(HPC)、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)およびポリビニルピロリドン(PVP)等)等のポリマー、ポロキサマー(たとえばKolliphor(登録商標)P407またはポロキサマー188)等の非イオン性トリブロックコポリマー、コポリビニルピロリドン、Labrasol(登録商標)、Gelucire(登録商標)、ゼラチン、レシチン(ホスファチド)、アカシアガム、コレステロール、トラガカント、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンカスター油誘導体、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール、ポリオキシエチレンステアレート、モノおよびジグリセリド、コロイド状二酸化ケイ素、ドデシル硫酸ナトリウム、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、トリエタノールアミン、ステアリン酸、ステアリン酸カルシウム、グリセロールモノステアレート、セトステアリルアルコール、セトマクロゴール乳化ワックス、短鎖および中鎖アルコール、Labrafil(登録商標)、Purol−oleique(登録商標)、プロパン−1,2,3−トリオール、ポリビニルアルコールならびにジオクチルスルホコハク酸ナトリウム(DOSS)からなる群から選択され、好ましくは前記安定剤がポリソルベート80、ポリソルベート20、Kolliphor(登録商標)P407およびポロキサマー188からなる群から選択される、請求項11または17に記載の方法。
  19. 摩砕ステップc.が終了した後におけるプロパン−1,2,3−トリオール(グリセリン)の添加を含む、請求項1から18のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記安定剤が、前記溶媒の全体積に基づいて30〜100%(v/v)の量の、好ましくは40%(v/v)または50%(v/v)の量のグリセリンである、請求項19に記載の方法。
  21. 前記ナノ懸濁液が摩砕ステップc.の後に、コロイデーター中で好ましくは酸素の添加とともにコロイド化ステップd.にさらに供され、前記ナノ懸濁液がプロパン−1,2,3−トリオールを必ずしも含まない、請求項1から20のいずれか一項に記載の方法。
  22. 前記ナノ懸濁液が20〜30mg/lの酸素濃度を有する、請求項21に記載の方法。
  23. 前記ナノ懸濁液がステップc.の後に、および任意選択でステップd.の前または後で、好ましくは無菌フィルターによって、さらに好ましくは450nm未満、より好ましくは220nm未満の粒径にまで濾過される、請求項1から22のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記ナノ懸濁液が、香味料、保存料、界面活性剤および浸透促進剤からなる群から選択される少なくとも1つの化合物を追加的に含む、請求項1から23のいずれか一項に記載の方法。
  25. ステップb.の前記分散液が、動的光散乱またはレーザー回折アナライザーによって測定される粒径(D90)が500nm未満(D90<500nm)、好ましくは300nm未満(D90<300nm)、さらに好ましくは250nm未満(D90<250nm)、最も好ましくは200nm未満(D90<200nm)まで摩砕される、請求項1から24のいずれか一項に記載の方法。
  26. 前記ナノ懸濁液の濃度が、さらなるステップe.において、好ましくは乾燥チャンバー内における溶媒の蒸発によって、前記ナノ懸濁液の全体積に基づいて10〜40%(w/w)、好ましくは10〜20%(w/w)の天然材料の濃度まで増大される、請求項1から25のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記少なくとも1つの天然材料が、0.4を超える、または0.5を超える、または0.8を超える、または1を超える、または1.1をも超える溶解度因子をもたらす濃度で前記ナノ懸濁液中に存在する、請求項1から26のいずれか一項に記載の方法。
  28. 請求項1から27のいずれか一項に記載の方法によって得られるナノ懸濁液。
  29. 医薬またはサプリメント、好ましくは補助食品の調製における使用のための、請求項28に記載のナノ懸濁液。
  30. 動物、好ましくはヒトへの頬側、局所または口腔内適用のための医薬の調製における使用のための、請求項28に記載のナノ懸濁液。
  31. 動物、好ましくはヒトへの、非経口、髄腔内、静脈内、経皮、または経粘膜適用、好ましくは頬側、局所的または口腔内適用のための医薬の調製における使用のための、請求項28に記載のナノ懸濁液。
  32. 癌、炎症性腸疾患(IBD)、関節炎、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、その他のウイルス性疾患、神経皮膚炎もしくは乾癬等の皮膚疾患、または多発性硬化症、血管炎、関節リウマチもしくは皮膚筋炎等の自己免疫疾患の治療または予防における使用のための、請求項28に記載のナノ懸濁液。
  33. 医薬の調製のための、請求項28に記載のナノ懸濁液の使用。
  34. 癌、炎症性腸疾患(IBD)、関節炎、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、その他のウイルス性疾患、神経皮膚炎もしくは乾癬等の皮膚疾患、または多発性硬化症等の自己免疫疾患の治療または予防のための医薬の調製のための、請求項28に記載のナノ懸濁液の使用。
  35. 癌、炎症性腸疾患(IBD)、関節炎、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、その他のウイルス性疾患、神経皮膚炎もしくは乾癬等の皮膚疾患、または多発性硬化症等の自己免疫疾患の治療または予防のための方法であって、それを必要とする患者への有効量の請求項28に記載のナノ懸濁液の投与することを含む方法。
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