ES2891151T3 - Nanosuspensión de materiales naturales y método para su preparación - Google Patents

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Abstract

Un método para la preparación de una nanosuspensión estable que comprende al menos un material natural, en que el método comprende las etapas de a. Proporcionar al menos un material natural que tiene un tamaño de partículas (D100) de menos de 320 μm, distinto de un extracto; b. Dispersar dicho al menos un material natural de la etapa a. en un disolvente; c. Triturar la dispersión de la etapa b. hasta un tamaño de partículas (D90) por debajo de 1000 nm (D90 < 1000 nm), en que el al menos un material natural es dispersado en la etapa b. a una concentración de 0,5 a 20% (p/p), basada en la cantidad total de disolvente usado en la nanosuspensión y en que la etapa b. de dispersión o la etapa c. de trituración comprenden la adición de un estabilizador; en que el estabilizador se selecciona entre el grupo que consiste en fosfolípidos, polisorbatos, hidroxipropilcelulosa, (HPC), hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) y polivinilpirrolidona (PVP); copolímeros tribloques no iónicos, copolivinilpirrolidona; caprilocaproilpolioxil-8-glicéridos, lauroilpolioxil-32-glicéridos; gelatina; lecitina (fosfátidos); goma arábiga; colesterol; goma arábiga; polioxietileno-alquil-éteres; derivados de polioxietileno-aceite de ricino; ésteres de ácidos grasos de polioxietileno-sorbitán, ésteres de ácidos grasos de sorbitán; polietilenglicoles, poli(estearatos de oxietileno); mono- y di-glicéridos; dióxido de silicio coloidal; dodecilsulfato de sodio; silicato de magnesio-aluminio; trietanolamina; ácido esteárico; estearato de calcio; monoestearato de glicerol; alcohol cetoestearílico; cera emulsionante de cetomacrogol; alcoholes de cadena corta y media; Oleoil-polioxil-6-glicéridos; Plurol oleico; propano-1,2,3-triol, poli(alcohol vinílico) y sulfosuccinato de dioctil-sodio (DOSS); en que al menos un material natural se selecciona entre el grupo que consiste en plantas, cianobacterias, algas y hongos.

Description

DESCRIPCIÓN
Nanosuspensión de materiales naturales y método para su preparación
Campo de la invención
La presente solicitud se refiere a un método para la preparación de una nanosuspensión a partir de materiales naturales, a una nanosuspensión que comprende al menos un material natural y el uso de esta nanosuspensión para la preparación de un medicamento.
Antecedentes de la invención
Los materiales naturales, como las plantas, cianobacterias, algas y hongos contienen agentes activos que tienen la capacidad para tratar enfermedades. Con el fin de eluir estos agentes activos a partir de materiales naturales, se conoce una diversidad de preparaciones farmacéuticas que incluyen la percolación o maceración acuosa o alcohólica, extractos de polvos secos en forma de comprimidos o cápsulas o formulaciones de dosificaciones inyectables. Sin embargo, hay muchas desventajas asociadas con estos tipos de administración. Muchos de los ingredientes se degradan en el tracto gastrointestinal o experimentan un metabolismo de primera pasada en el hígado. Además, partes de la población experimentan una dificultad para tragar píldoras o son incapaces de tolerar cualesquiera sólidos. Además, muchos agentes activos o materiales naturales son escasamente solubles en agua. Por lo tanto, están limitados la potencia y los efectos terapéuticos de muchos agentes activos de materiales naturales.
La patente de EE.UU. n° 5.858.410 se refiere a preparaciones de fármacos denominadas "nanosuspensiones” que se producen mediante homogeneización a presión elevada. Antes del uso de la homogeneización a presión elevada, las nanosuspensiones se preparaban mediante un procedimiento en un molino de bola que es un procedimiento que requiere tiempos prolongados en comparación con la homogeneización a presión. Esta técnica es el objeto entre otras de la patente de EE.UU. n° 5.271.944. Se ha usado un cierto número de otros métodos para preparar nanosuspensiones con diversos grados de éxito, que incluyen agitadores de bajo consumo energético, agitadores de turbina, molinos coloidales, sonolatores, orificios, molinos de bolas pequeñas, mezcladores de rotor-estator y baños de ultrasonidos.
La solicitud de patente china n° CN1416847A se refiere a una preparación de una nanosuspensión de Radix Panacis Quinquefolii (ginseng americano) producida mediante homogeneización a presión elevada a una concentración entre 20% y 11,1% (p/p).
La publicación de patente europea n° EP 226171A1 se refiere a una disgregación de un material de madera (por ejemplo, abeto de Douglas) por medio de un triturador de tipo de muelas para proporcionar fibras de celulosa que tienen un diámetro medio de fibras como máximo de 30 nm y un material compuesto de fibras de celulosa preparado a partir de las mismas. Las fibras tienen una longitud media mínima de 50 |jm.
La solicitud de patente coreana KR 20110130104A se refiere a un fertilizante orgánico que comprende nanopartículas de algas marinas, polvo de mariscos, zeolita y otros materiales, en el que cada una de las diferentes partículas puede ser triturada hasta que se consigue un tamaño de 1 nm a 100 nm.
Sin embargo, los métodos de la técnica anterior para preparar una nanosuspensión carecen de un método para la preparación de una nanosuspensión a partir de materiales naturales con una cantidad elevada de material natural, es decir una concentración elevada de material natural. Por tanto, hay una necesidad de métodos para preparar una nanosuspensión a partir de materiales naturales, en que la nanosuspensión pueda ser ventajosamente usada en el tratamiento o prevención de enfermedades.
Sumario de la invención
Por tanto, es un objeto de la presente invención proporcionar un método para la preparación de una nanosuspensión a partir de la totalidad o parte de materiales naturales, que pueda ser usado en la preparación de un medicamento.
En un primer aspecto, la presente descripción proporciona un método para la preparación de una nanosuspensión estable que comprende al menos un material en que el método comprende las etapas de
a. Proporcionar al menos un material natural que tiene un tamaño de partículas (D100) de menos de 320 jm , distinto de un extracto;
b. Dispersar dicho al menos un material natural de la etapa a. en un disolvente;
c. Triturar la dispersión de la etapa b. hasta un tamaño de partículas (D90) por debajo de 1000 nm (D90 < 1000 nm),
en que el al menos un material natural es dispersado en la etapa b. a una concentración de 0,5 a 20% (p/p), basada en la cantidad total de disolvente usado en la nanosuspensión y en que la etapa b. de dispersión o la etapa c. de trituración comprende la adición de un estabilizador;
en que el estabilizador se selecciona entre el grupo que consiste en fosfolípidos, polisorbatos, hidroxipropilcelulosa, (HPC), hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) y polivinilpirrolidona (PVP); copolímeros tribloques no iónicos, copolivinilpirrolidona; caprilocaproilpolioxil-8-glicéridos, lauroilpolioxil-32-glicéridos; gelatina; lecitina (fosfátidos); goma arábiga; colesterol; tragacanto; polioxietileno-alquil-éteres; derivados de polioxietileno-aceite de ricino; ésteres de ácidos grasos de polioxietileno-sorbitán, ésteres de ácidos grasos de sorbitán; polietilenglicoles, poli(estearatos de oxietileno); mono- y di-glicéridos; dióxido de silicio coloidal; dodecilsulfato de sodio; silicato de magnesio-aluminio; trietanolamina; ácido esteárico; estearato de calcio; monoestearato de glicerol; alcohol cetoestearílico; cera emulsionante de cetomacrogol; alcoholes de cadena corta y media; oleoil-polioxil-6-glicéridos; Plurol oleico; propano-1,2,3-triol, poli(alcohol vinílico) y sulfosuccinato de dioctil-sodio (DOSS);
en que al menos un material natural se selecciona entre el grupo que consiste en plantas, cianobacterias, algas y hongos.
En otro aspecto, la presente descripción proporciona una nanosuspensión que puede ser obtenida según un método del primer aspecto.
En otro aspecto, la presente descripción proporciona una nanosuspensión según el primer aspecto, para ser usada en la preparación de un medicamento para una aplicación bucal, tópica u oral a un animal, preferentemente un ser humano, o para ser usada en la preparación de un medicamento para una aplicación parenteral, intratecal, intravenosa, transdérmica o transmucosal, preferentemente una aplicación bucal, tópica u oral, a un animal, preferentemente un ser humano.
En otro aspecto, la presente descripción proporciona una nanosuspensión según el primer aspecto para ser usada en el tratamiento o la prevención de cáncer, enfermedad de inflamación intestinal (IBD), artritis, virus de inmunodeficiencia humana (HIV), otras enfermedades víricas, enfermedades dermatológicas como neurodermatitis o soriasis o enfermedades autoinmunes, como esclerosis múltiple. Todavía en otro aspecto, la presente descripción proporciona el uso de una nanosuspensión según el primer aspecto para la preparación de un medicamento.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 muestra un dibujo esquemático de un coloidador;
la Fig.2 muestra el tamaño de partículas (D90) para una nanosuspensión de hojas de olivo a una energía específica usada para la trituración según el ejemplo 1.1;
la Fig. 3 muestra la masa seca de un extracto de una nanosuspensión de hojas de olivo según el ejemplo 1.3;
la Fig. 4 muestra el tamaño de partículas (D90) para una nanosuspensión de spirulina a una energía específica usada para la trituración según el ejemplo 2.1;
la Fig. 5 muestra la masa seca de un extracto de nanosuspensión de spirulina según el ejemplo 2.3;
la Fig. 6 muestra el tamaño de partículas (D90) para una nanosuspensión de agaricus subrufescens (ABM) a una energía específica usada para la trituración según los ejemplos 3.1 (línea continua) y 3.2 (línea de rayas);
la Fig. 7 muestra el tamaño de partículas (D90) para una nanosuspensión de agaricus subrufescens (ABM) a una energía específica usada para la trituración según los ejemplos 3.1 (línea continua) y 3.3 (línea de rayas);
la Fig. 8 muestra la masa seca de un extracto y de una nanosuspensión de agaricus subrufescens (ABM) según el ejemplo 3.5;
la Fig. 9 muestra el contenido de p-glucano de una nanosuspensión y diferentes extractos de agaricus subrufescens, en relación a un agaricus subrufescens preparado como en el ejemplo 4.1;
la Fig. 10 muestra el efecto de la estabilización física sobre la base de una nanosuspensión de sílice preparada como en el ejemplo 5.1; y
la Fig. 11 muestra el efecto de la estabilización química sin propano-1,2,3-triol sobre la base de una nanosuspensión de agaricus subrufescens preparada como en el ejemplo 3.1;
la Fig. 12 muestra el efecto de la estabilización química con 20% (v/v) de propano de 1,2,3-triol sobre la base de una nanosuspensión de agaricus subrufescens preparada como en el ejemplo 3.1;
la Fig. 13 muestra el efecto de la estabilización con 50% (v/v) de propano-1,2,3-triol sobre la base de una nanosuspensión de agaricus subrufescens preparada como en el ejemplo 3.1;
la Fig. 14 muestra la fracción de peso diferencial (es decir, masa molar media) de p-1,3/1,6-glucano de una nanosuspensión al 5% (p/p) de agaricus subrufescens (preparada como en el ejemplo 3.1) y un extracto al 5% (p/p) de agaricus subrufescens (preparado como en el ejemplo 3,4);
la Fig. 15 muestra la cantidad relativa de monocitos positivos a dectin-1 (en %) en una muestra de células mononucleares de sangre periférica sin estimular (PBMC), PBMC estimuladas con nanosuspensión al 5% (p/p) de agaricus subrufescens (preparada como en el ejemplo 3.1) y extracto al 5% (p/p) de agaricus subrufescens (preparada como en el ejemplo 3.4);
la Fig. 16 muestra la comparación de la inducción in vitro de citoquina TNF-alfa provocada por una nanosuspensión al 5% (p/p) de agaricus subrufescens (preparada como en el ejemplo 3.1) y un extracto al 5% (p/p) (preparado como en el ejemplo 3.4);
la Fig. 17 muestra la comparación de la citoquina IL-10 en una inducción in vitro provocada por una nanosuspensión al 5% (p/p) de agaricus subrufescens (preparada como en el ejemplo 3.1) y un extracto al 5% (p/p) (preparado como en el ejemplo 3.4);
la Fig. 18 muestra la comparación de la citoquina IL-6 en una inducción in vitro provocada por una nanosuspensión al 5% (p/p) de agaricus subrufescens (preparada como en el ejemplo 3.1) y un extracto al 5% (p/p) (preparado como en el ejemplo 3.4);
la Fig. 19 muestra la distribución de partículas mediante una nanosuspensión al 5% (p/p) de agaricus subrufescens (preparada como en el ejemplo 3.1);
la Fig. 20 muestra la distribución de partículas mediante una nanosuspensión al 5% (p/p) de agaricus subrufescens (preparada como en el ejemplo 12);
la Fig. 21 muestra la inducción in vivo de células CD3+CD5+ activadas por CDE25, provocada por una nanosuspensión al 5% (p/p) de agaricus subrufescens (preparada como en el ejemplo 12);
la Fig. 22 muestra La inducción in vivo de células T CD3+CD25+ activadas por CD25, provocada por un polvo de agaricus subrufescens en cápsula.
Descripción detallada de la invención
La presente invención y su alcance están definidos por medio de las reivindicaciones anejas. La descripción más genérica de la invención se proporciona solamente para fines ilustrativos. Las realizaciones no abarcadas por estas reivindicaciones son solamente para fines de referencia.
La presente descripción se refiere a un método para la preparación de una nanosuspensión que comprende al menos un material natural, en que el método comprende las etapas de
a. proporcionar al menos un material natural que tiene un tamaño de partículas (D100) de menos de 320 |jm, distinto de un extracto;
b. Dispersar dicho al menos un material natural de la etapa a. en un disolvente;
c. triturar la dispersión de la etapa b) hasta un tamaño de partículas (D90) por debajo de 1000 nm (D90 < 1000 nm), de forma que se dispersa el al menos un material natural de la etapa b) a una concentración de 0,5 a 20% (p/p), basada en la cantidad total de disolvente usado en la nanosuspensión y de forma que la etapa b. de dispersión o la etapa c. de trituración comprende la adición de un estabilizante;
en que el estabilizador se selecciona entre el grupo que consiste en fosfolípidos, polisorbatos, hidroxipropilcelulosa (HPC), hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) y polivinilpirrolidona (PVC), copolímeros tribloques no iónicos, copolivinilpirrolidona, caprilocapropropil-polioxil-8-glicéridos, lauroil-polioxil-32-glicéridos, gelatina, lecitina (fosfátidos); goma arábiga, colesterol, tragacanto, polioxietileno-alquil-éteres, derivados de polioxietileno-aceite de ricino, ésteres de ácidos grasos de polioxietileno-sorbitán, ésteres de ácidos grasos de sorbitán, polietilenglicoles, poli(estearatos de etileno), mono- y di-glicéiridos, dióxido de silicio coloidal, dodecilsulfato de sodio, silicato de magnesio-aluminio, trietanolamina, ácido esteárico, estearato de calcio, monoestearato de glicerol, alcohol cetoestearílico, cera emulsionante cetomacrogol, alcoholes de cadena corta y media, oleoil-polioxil-6-glicéridos, Plurol oleico, propano-1,2,3-triol, poli(alcohol vinílico) y sulfosuccinato de dioctil-sodio (DOSS);
en que el al menos un material natural se selecciona entre el grupo que consiste en plantas, cianobacterias, algas y hongos.
La presente invención, como se describe ilustrativamente en lo que sigue, se puede poner en práctica adecuadamente en ausencia de cualquier elemento o elementos, limitación o limitaciones, no específicamente descritos en la presente memoria descriptiva.
La presente invención se describirá con respecto a realizaciones particulares y en referencia a ciertas figuras, pero la invención no está limitada a las mismas, sino solamente por medio de las reivindicaciones. Los términos que se exponen con posterioridad deben ser entendidos de forma general en su sentido habitual, salvo que se indique otra cosa.
Cuando la expresión “que comprende” se usa en la presente descripción y en las reivindicaciones, no excluye otros elementos. Para los fines de la presente invención, la expresión “que consiste en” se considera que es una realización preferida de la expresión “que comprende”. Si en lo que sigue un grupo se define que comprende al menos un cierto número de realizaciones, esto se debe entender también para describir un grupo que consiste preferentemente solo en estas realizaciones. Cuando se usa un artículo indefinido o definido para referirse a un sustantivo singular, por ejemplo, “uno”, “una”, “el”, “la”, esto incluye el plural de ese sustantivo, salvo que se establezca específicamente algo en contra.
Los términos como “obtenible”, o “definible” y “obtenido” o “definido” se usan de forma intercambiable. Esto significa, por ejemplo, que salvo que el contexto indique claramente otra cosa, el término “obtenido” no está previsto que indique, por ejemplo, que una realización deba ser obtenida, por ejemplo, mediante la secuencia de etapas que siguen al término “obtenido”, incluso aunque esta comprensión limitada esté siempre incluida en los términos “obtenido” o “definido” como una realización preferida.
Una “nanosuspensión” como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a una suspensión de nanopartículas en un disolvente, por ejemplo, agua, etanol o sus mezclas. La nanosuspensión puede comprender adicionalmente agentes estabilizantes u otros compuestos. Una nanosuspensión comprende un compuesto escasamente soluble en agua en la forma de nanopartículas en suspensión en un disolvente. Eta nanosuspensión se usa para mejorar la “solubilidad” (o dispersabilidad) de un compuesto que es escasamente soluble en un disolvente, un medio lípido o ambos. Como consecuencia de la “solubilidad” aumentada, se alcanza un nivel en plasma más elevado del compuesto escasamente soluble y se alcanza de forma más rápida el nivel máximo en plasma sanguíneo de dicho compuesto. Los términos “suspensión” y “dispersión” Se usan de forma intercambiable en la presente descripción y se refieren a partículas sólidas en un disolvente.
“Nanopartículas", como se usa en la presente memoria descriptiva, son partículas que tienen un tamaño de partículas por debajo de 1000 nm. Las nanopartículas de compuestos en el disolvente pueden ser partículas primarias o partículas aglomeradas compuestas por partículas más pequeñas. El tamaño de partículas de la nanosuspensión puede ser medido con un analizador de difracción láser (por ejemplo, un dispositivo Beckman Coulter LS 13320 o Horiba LA-950).
El término “solubilidad” o la expresión “límite de solubilidad” de un material, como se usa en la presente descripción se refiere a la cantidad máxima de material natural que puede ser disuelto en un disolvente. Para los fines de la presente descripción, la solubilidad de un material natural en un disolvente específico se puede determinar como sigue: se usa una cantidad inicial de material natural seco con un tamaño de partículas D90 < 320 |jm para preparar una suspensión de dicho material natural en un disolvente, como agua destilada a una concentración de 5% o 10% (p/p). para la preparación de dicha suspensión, el material natural se pone en suspensión durante 60 minutos en un disolvente a una temperatura de 30°C. La suspensión resultante se centrifuga seguidamente a 1500 g durante 30 minutos y los precipitados se separan de la materia sobrenadante y se pesan por motivos de control. La materia sobrenadante se seca a 60° C durante 20 h, dando lugar al material natural disuelto en la materia sobrenadante (base en seco) y se seca. La solubilidad se calcula usando la siguiente ecuación:
Solubilidad (%) = peso de materia sobrenadante (base en seco) x 100/peso de polvo de material natural inicial (base en seco).
La expresión “factor de solubilidad”, como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a la cantidad de un material natural en una nanosuspensión según la presente descripción, relativa a la solubilidad o límite de solubilidad de dicho material natural en el disolvente usado para preparar la nanosuspensión. El factor de solubilidad es la cantidad de material natural presente en la nanosuspensión (en % (p/p)) dividida por la solubilidad de dicho material natural en el disolvente usado. Dicho de otro modo, si se proporciona un factor de solubilidad de uno, se alcanza el límite de solubilidad de dicho material natural en dicho disolvente. A un factor de solubilidad por debajo de 1, la cantidad de material natural en la nanosuspensión está por debajo del límite de solubilidad y un factor de solubilidad por encima de 1 indica que está presente más de la cantidad de material natural soluble en dicho disolvente en la nanosuspensión, es decir, la concentración del material natural en la nanosuspensión está por encima de su límite de solubilidad.
La expresión “fibra de celulosa”, como se usa en la presente descripción, se refiere a una fibra vegetal (especialmente fibra de madera) que consiste en un polisacárido con una cadena lineal desde varios cientos hasta por encima de diez mil unidades de p-1,4-D-glucosa con una longitud de la fibra de > 1 |jm. Por lo tanto, las fibras de celulosa no consisten en p-1,3/1,6-glucano con una forma geométrica de esfera con un diámetro < 1 jm o un elipsoide con una longitud de semieje < 1 jm .
En una realización preferida, el material natural al menos único se selecciona entre el grupo que consiste en plantas, preferentemente plantas que excluyen ginseng y/o fibras de celulosa, cianobacterias, algas y hongos. En otra realización, el material natural no comprende ginseng y/o fibras de celulosa. Las plantas como se usan en la presente memoria descriptiva pueden comprender espermatofitina, que puede comprender ginkopsida (gingko), gnetopsida, coniferopsida (por ejemplo. conifera) y angioespermas (plantas de floración), que pueden comprender adicionalmente las subclases como magnólidas, liliidae (por ejemplo, piña), malpighiales (por ejemplo, hierba de San Juan o corcho de sauce), rosidae (por ejemplo, hortíga), brassicales (por ejemplo, carica papaya), fabales (por ejemplo, astragalus), lamiales (por ejemplo, olivo y hojas de olivos), dispsacales (por ejemplo, Sauco), las cianobacterias pueden comprender, por ejemplo, spirulina. Las algas pueden comprender los dominios rodobionta (por ejemplo, algas rojas, algas marrones y diatomeas), algas verdes y glaucobionta. Los hongos pueden comprender acrasobionta, myxomycota, heterokontobionta, y mycobionta (por ejemplo, hongos del pilar como agaricus subrufescens).
En otra realización preferida, los materiales naturales son ingko, piña, hierba de San Juan, corcho de sauce, ortiga, carica papaya, astragalus, hojas de olivo, sauco, espirulina, alga chlorella, algas rojas, algas marrones y diatomeas, algas verdes y glaucobionta, agaricus subrufescens, boswellia, rodiola rosea, corcho de Chinkona,, ipecacuana, boneset, bryony anil, raíz de anil, cúrcuma, garra del diablo, garra de gato, cistus incanus, semilla de lino, sylibum marianum (cardo sagrado), chelidonium majus (celandina), kaplan-pelargonie, equinácea, o semillas de uva.
En otra realización preferida, el material natural no comprende gingseng y/o fibras de celulosa.
En otra realización preferida, el material natural al meno único es una parte o la totalidad de dicho material natural, preferentemente la totalidad de dicho material natural. El método de la presente descripción puede ser usado para cualquier material natural como un conjunto o partes de mismo. Como un ejemplo, pueden ser usadas solo partes de una planta, como raíces, tallos, hojas, frutos, flores o similares, dependiendo del tipo de material natural.
En otra realización preferida, la nanosuspensión comprende una mezcla de al menos dos materiales naturales. Como tal, la nanosuspensión puede ser una nanosuspensión que contiene un único material natural o una mezcla de más de un material natural, es decir, al menos dos materiales naturales. La nanosuspensión puede comprender también partes diferentes del mismo material natural como, por ejemplo, partes de la raíz y partes de las flores y/o la nanosuspensión puede comprender tipos diferentes de materiales como, por ejemplo, plantas diferentes o una planta y una cianobacteria.
En otra realización preferida, el material natural usado en la preparación de la nanosuspensión es secado en una etapa a.1, antes de la etapa a., preferentemente liofilizado y/o térmicamente secado.
En otra realización preferida, el material natural usado en la preparación de la nanosuspensión y proporcionado en la etapa a. del método anteriormente descrito tiene un contenido de agua w. por debajo de 15% (s < 15%), preferentemente por debajo de 12% (w< 12%), más preferentemente por debajo de 10% (w < 10%) y, lo más preferentemente, por debajo de 8% (w < 8%).
El contenido de agua del material natural usado para la preparación de la nanosuspensión tiene preferentemente un bajo contenido de agua. La expresión “contenido de agua” o "humedad residual" como se usan en la presente descripción se refieren al contenido de agua w del material, como el material natural, calculado a partir del peso de humedad o material húmedo mhúmedo el peso del material seco sin agua mseco y el peso del material con una humedad residual (mres mediante el uso de la siguiente fórmula: contenido de humedad residual [%] w = (mres -mseco)/(mhumedo - mseco)* 100%.
Este bajo contenido de agua puede ser ventajoso cuando se prepara la nanosuspensión. Además, puede ser útil cuando se lleva el material natural a un tamaño de partículas (D100) de menos de 320 jm . Hay diferentes métodos conocidos en la técnica para reducir el contenido de agua de un material natural y estos métodos pueden ser usados en combinación con la presente descripción. Como ejemplo, el material natural puede ser liofilizado (es decir, secado por congelación) o térmicamente secado. Puede ser ventajoso limpiar, pelar, y/o deshuesar los materiales naturales, dependiendo del tipo de material natural, antes de la etapa de secado. En lo que sigue, se proporcionan dos ejemplos de métodos para secar.
Los materiales naturales pueden ser liofilizados con un liofilizador, por ejemplo, un procedimiento en cuatro etapas como sigue:
• El material natural es cortado en trozos más pequeños de aproximadamente 1-2 cm con un cuchillo, dependiendo del tamaño y la estructura del material natural;
• Los trozos de 1-2 cm se ponen en un molino de cuchillas (por ejemplo, Grindomix® 200 o 300 de la entidad Retsch GmbH, Alemania) y se trituran con los siguientes parámetros: 10 s a 2000 rpm seguido de 10 s a 5000 rpm y 20 s terminales a 10.000 rpm;
• La pulpa resultante se congela a -18° C durante 4 h y se pone nuevamente en un liofilizador y se liofiliza hasta que la temperatura del producto sea de 20° C.
Debe entenderse que el procedimiento de liofilización anterior es un ejemplo, y un experto en la técnica puede adaptar el procedimiento, dependiendo del tipo de material natural. Como un ejemplo, una cianobacteria puede ser directamente liofilizada, sin trituración o corte anterior. Análogamente, también los parámetros para el corte de los trozos en un molino de cuchillos pueden ser ajustados según las necesidades.
Los materiales naturales pueden ser secados también con aire o en una estufa a una temperatura, por ejemplo, de 36-45° C, hasta que el contenido residual de humedad sea un valor bajo como de 8%, dependiendo de la sensibilidad térmica de los compuestos en el material natural.
En otra realización preferida, el material usado en la preparación de la nanosuspensión y proporcionado en la etapa a. del método anteriormente descrito es previamente triturado antes y/o después del secado en la etapa a.1, preferentemente en un molino de cuchillas y, opcionalmente, tamizado hasta un tamaño de partículas (D100) de menos de 320 |jm. Esta trituración del material natural se puede hacer con el material natural como tal, es decir, sin cortar o secar previamente, o el material natural puede ser cortado en trozos y/o secado, como se describió anteriormente. Adicionalmente, el material natural puede ser tamizado con el fin de proporcionar un polvo de material natural que tenga un tamaño de partículas (D100) de menos de 320 jm .
Un ejemplo de método para la pretrituración y tamizado del material natural liofilizado puede ser como sigue: • El polvo de material natural en curso liofilizado se pone en un molino de cuchillas (por ejemplo, Grindomix® 200 o 300 de la entidad Retsch GmbH, Alemania) y es triturado con los siguientes parámetros: 10 s a 2000 rpm seguido de 10 s a 5000 rpm y 20 s terminales a 10.000 rpm;
• El polvo de material natural en curso del procedimiento de molino de cuchillas es tamizado con un tamiz de un tamaño de mallas de 320 jm;
• Las partículas del material natural de más de 320 jm se ponen nuevamente en el molino de cuchillas para triturar adicionalmente y a continuación se tamizan con el tamiz de 320 jm . El material residual de la segunda o tercera etapa de trituración puede ser desechado.
Análogamente, un ejemplo de método para la pretrituración y tamizado de un material natural térmicamente secado puede ser como sigue:
• El material natural térmicamente secado se corta en trozos más pequeños de aproximadamente 1-2 cm con un cuchillo;
• Los trozos de 1-2 cm se ponen en el molino de cuchillas (por ejemplo, Grindomix® 200 o 300 de la entidad Retsch GmbH, Alemania) y se trituran con los siguientes parámetros: 10 s a 2000 rpm seguido de 10 s a 5000 rpm y 20 s terminales a 10.000 rpm.
• El polvo de material natural en curso del procedimiento de molino de cuchillas se tamiza con un tamiz de tamaño de malla de 300 jm ;
• Las partículas de material natural de más de 320 jm se ponen nuevamente en el molino de cuchillas para una trituración adicional seguida de tamizado con el tamiz de 320 jm . El material residual de la segunda o tercera etapa de trituración puede ser desechado.
El al menos un material natural que tiene un tamaño de partículas (D100) de menos de 320 jm proporcionado en la etapa a. se dispersa en un disolvente en la etapa b. según el método de la presente descripción.
En otra realización preferida, el disolvente es agua, preferentemente agua destilada o una mezcla de agua y etanol.
El agua usada como disolvente puede ser cualquier tipo de agua, como agua normal, agua purificada, agua destilada, agua bi- o tri-destilada o agua desmineralizada. Análogamente, también el etanol usado puede ser etanol normal o una mezcla de agua y etanol. Consecuentemente, la nanosuspensión resultante puede ser una nanosuspensión acuosa o una nanosuspensión en etanol o una nanosuspensión sobre la base de una mezcla de agua y etanol o cualquier otro disolvente o mezcla de disolventes. El término “disolvente” como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a un único disolvente o una mezcla de disolventes. Preferentemente, el disolvente es un disolvente farmacéuticamente aceptable si la nanosuspensión se usa como medicamento.
En otra, realización preferida la nanosuspensión es una nanosuspensión acuosa o una nanosuspensión sobre la base de una mezcla de agua y etanol.
Cuando se dispersa el material natural en la etapa b. en el disolvente, el material natural tiene preferentemente una concentración en el intervalo de 0,5 a 20% (p/p), basada en la cantidad total de disolvente usado, preferentemente de 2 a 10% (p/p), de forma adicionalmente preferida de 2 a 5% (p/p) o de 5 a 10 % (p/p). En otra realización preferida de la presente invención, el material natural tiene preferentemente una concentración en el intervalo de 0,5 a 70% (p/p), basada en la cantidad total de disolvente usado, preferentemente de 40 a 70% (p/p) o de 10 a 40% (p/p). La concentración del material natural en % (p/p) está basada en la cantidad total de disolvente usado para preparar la nanosuspensión. Como un ejemplo, con 50 g de polvo en un material natural para 1000 g de disolvente, se prepara un 5% (p/p). Con dicho intervalo de concentración, se facilita la trituración adicional de la suspensión hasta una nanosuspensión. La dispersión se puede preparar agitando el disolvente y el material natural (por ejemplo, por medio de un agitador magnético o cualquier otro dispositivo rotatorio, preferentemente con una velocidad de hasta 1000 rpm.
Consecuentemente, en otra realización, el al menos un material natural es dispersado en la etapa b. a una concentración de 0,5 a 20% (p/p), basada en la cantidad total del disolvente usado en la nanosuspensión, preferentemente de 2 a 10% (p/p), de forma adicionalmente preferida de 2 a 5% (p/p) o de 2 a 10% (p/p).
En una realización particularmente preferida, el al menos un material está presente en la nanosuspensión a una concentración que da lugar a un factor de solubilidad por encima de 0,4, o por encima de 0,5, o por encima de 0,8, o por encima de 1 o incluso por encima de 1,1.
Es preferido que la nanosuspensión sea estabilizada mediante el uso de un estabilizador. Este estabilizador se puede seleccionar entre el grupo que consiste en fosfolípidos, polisorbatos, propano-1,2,3-triol (glicerina), estabilizadores electrostáticos o estéricos y tensioactivos. Estos estabilizadores pueden ser añadidos a la preparación en la etapa b., o durante la etapa de trituración c., o incluso después de la etapa c. de trituración. Algunos estabilizadores se añaden preferentemente a la nanosuspensión preferentemente en la etapa b. de dispersión como fosfolípidos, tensioactivos no iónicos y emulsionantes, por ejemplo, polisorbato. Otros estabilizadores se añaden preferentemente durante la etapa c. de trituración, como copolímeros tribloques no iónicos, como poloxámeros. Incluso otros estabilizadores se añaden después de la etapa c. de trituración, como propano-1,2,3-triol o sulfosuccinato de dioctil-sodio (DOSS). Si se añade un estabilizador en la etapa b. de dispersión, es preferido añadir el estabilizador en una cantidad de 50% hasta 200% (p/p), basada en la cantidad total de material natural, en particular, si el estabilizador es un fosfolípido. Si los estabilizadores son un tensioactivo no iónico o un emulsionante, como polisorbato, se añaden preferentemente en una cantidad de hasta 1,5% (p/p), basada en la cantidad de disolvente. Durante la etapa c. de trituración, cuando se han alcanzado tamaños de partículas específicos (D90) en el intervalo de 2 hasta 10 |jm, o si el tamaño de partículas (D90) no se reduce más durante la etapa c. de trituración, por ejemplo, en al menos 4% durante un tiempo de trituración de 1 hora, o si el tamaño de partículas (D90) se aumenta durante la etapa c. de trituración en al menos 10% durante un tiempo de trituración de una hora, es preferido añadir un estabilizador, como un copolímero tribloques no iónico, como poloxámeros.
En una realización preferida, el estabilizador se selecciona entre el grupo que consiste en fosfolípidos, polisorbatos, hidroxipropilcelulosa (HPC), hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) o polivinilpirrolidona (PVP); copolímeros tribloques no iónicos como poloxámeros (por ejemplo, Kolliphor® P407 o poloxámero 188); copolivinilpirrolidona; Labrasol®; Gelucire®; gelatina, lecitina (fosfátidos); goma arábiga, colesterol, tragacanto, polioxietileno-alquil-éteres, derivados de polioxietileno-aceite de ricino, ésteres de ácidos grasos de polioxietileno-sorbitán, ésteres de ácidos grasos de sorbitán, polietilenglicoles, poli(estearatos de oxietileno); mono- y di-glicéridos; dióxido de silicio coloidal, dodecilsulfato de sodio, silicato de magnesio-aluminio, trietanolamina, ácido esteárico, estearato de calcio, monoestearato de glicerol, alcohol cetoestearílico, cera emulsionante de cetomacrogol, alcoholes de cadena corta y media Labrafil®; Purol-oleico®; propano 1,2,3-triol, poli(alcohol vinílico) y sulfosuccinato de dioctil-sodio (DOSS). Ejemplos preferidos de polisorbatos son polisorbato 80 y polisorbato 20, Kolliphor® P407 y poloxámero 1888. En una realización particularmente preferida, el estabilizador es Kolliphor® P407 o polisorbato 80, como Tween® 80. En otra realización preferida, la etapa b. de dispersión comprende la adición de un estabilizador seleccionado entre el grupo que consiste en un fosfolípido y un polisorbato.
En otra realización preferida, la etapa b. de dispersión comprende la adición de un polisorbato en una cantidad de 0,5 a 2% (p/p), basada en la cantidad total del disolvente usado en la nanosuspensión y/o de modo que el polisorbato se selecciona entre el grupo que consiste en polisorbato 80 y polisorbato 20.
En otra realización preferida, la etapa b. de dispersión comprende la adición de un fosfolípido en una cantidad de 100% a 200% (p/p), preferentemente en una cantidad de 130% a 170% (p/p), basada en la cantidad del material natura, de modo que preferentemente, el fosfolípido contiene hasta 95% (en peso) de fosfatidilcolina y de 20 a 30% (en peso) de lisofosfatidilcolina. Es preferido que el fosfolípido contenga 20-95% de fosfatidilcolina, preferentemente 20-75% de fosfatidil colina y 20-30% de lisofosfatidilcolina (por ejemplo, Lipoid P100, P75, R LPC20 de la entidad Lipoid GmbH, Alemania). Puede ser preferido también añadir el fosfolípido en una cantidad de 100 a 300% (p/p), más preferentemente de 50 a 200% (p/p), basada en la cantidad total del material natural.
Cuando se usan estabilizadores estéricos como estabilizadores, el estabilizador estérico es adsorbido o unido sobre la superficie de la nanopartícula y produce una barrera estérica densa que supera las fuerzas de atracción de Van der Waals y, por tanto, el estabilizador estérico reduce la agregación, aglomeración o incluso la fusión de partículas. Los estabilizadores estéricos son preferentemente excipientes que son farmacéuticamente aceptables y se pueden seleccionar entre hidroxipropilcelulosa (HPC), hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) y polivinilpirrolidona (PVP). Un estabilizador estérico particularmente preferido es el copolímero tribloques no iónico Kolliphor® P407. El Kolliphor® P407 está compuesto por una cadena hidrófoba central de polioxipropileno (poli(óxido de propileno)) flanqueada por dos cadenas hidrófilas de polioxietileno poli(óxido de etileno). Puede ser ventajoso añadir un estabilizador estérico durante la etapa c. de trituración. Por tanto, es preferido añadir un estabilizador estérico en una cantidad de 0,5 a 2 (p/p) durante la etapa c. de trituración, de forma adicionalmente preferida cuando las partículas tienen un tamaño de partículas (D90) de menos de 5 |jm.
Otro estabilizador preferido usado en el procedimiento de la presente descripción es glicerina (propano-1,2,3-triol). Dicha glicerina es añadida preferentemente después de la etapa c. de trituración, de forma adicionalmente preferida en una cantidad de 30 a 100% (v/v) o de 40 a 100% (v/v), incluso más preferentemente en una cantidad de 40% (v/v) o de 50% (v/v), basada en el volumen total del disolvente.
Además de glicerina, o de forma alternativa a la misma, se puede usar sulfosuccinato de dioctil-sodio (DOSS) como un estabilizador electrostático, preferentemente en una cantidad de 0,5 a 2% (p/p), basada en la cantidad total del disolvente y añadido preferentemente después de la etapa c. de trituración.
Durante la etapa c. de trituración, la dispersión que contiene el material natural a un tamaño de partículas de menos de 320 jm es triturada hasta un tamaño de partículas (D90) de menos de 1000 nm. Esto se puede conseguir en cualquier triturador adecuado.
En una realización preferida, dicha etapa c. de trituración se lleva a cabo en un molino de bolas en húmedo, preferentemente en un molino agitador de bolas en húmedo.
En una realización preferida adicional, dicha etapa c. de trituración comprende una primera etapa c.1 de trituración en un molino de bolas en húmedo, preferentemente un molino agitador de bolas en húmedo con un diámetro de bolas de trituración de 0,5 a 1,5 mm, y una segunda etapa c.2 de trituración en un molino de bolas en húmedo, preferentemente un molino agitador de bolas en húmedo, con un diámetro de bolas de trituración de 0,3 a 0,4 mm y una tercera etapa c.2 de trituración en un molino de bolas en húmedo, preferentemente un molino agitador de bolas en húmedo con un diámetro de bolas de trituración de 0,05 a 0,2 mm. Es preferido que la segunda etapa c.2 de trituración se use hasta que se alcance un tamaño de partículas (D90) de aproximadamente 3 a 6 jm y la tercera etapa c. 3 de trituración se usa hasta que se alcanza un tamaño de partículas (D90) de aproximadamente 80 a 500 nm, preferentemente de 80 a 300 nm. En otra realización preferida con un tamaño de partículas (D100) de partida del polvo del material natural por debajo de 320 jm , dicha etapa c. de trituración comprende una primera etapa c.1 de trituración en un molino de bolas en húmedo, preferentemente un molino agitador de bolas en húmedo con un diámetro de bolas de trituración de 0,4 a 0,5 mm y una segunda etapa c.2 de trituración en un molino de bolas en húmedo, preferentemente un molino agitador de bolas en húmedo, con un diámetro de bolas de trituración de 0,05 a 0,2 mm. Es preferido que la primera etapa c.1 de trituración se use hasta que se alcance un tamaño de partículas (D90) de aproximadamente 2 a 6 jm , y la segunda etapa c.2 de trituración se usa hasta que se alcance un tamaño de partículas (D90) de aproximadamente 80 a 500 nm, preferentemente de 80 a 300 nm. Es adicionalmente preferido tener una temperatura en el recinto del molino de 25 a 36° C y una velocidad en los bordes de 10 a 14 m/s, preferentemente de 11 a 14 m/s.
Consecuentemente, en una realización preferida, la dispersión de la etapa b. es triturada en la etapa c. hasta un tamaño de partículas (D90) por debajo de 500 nm (D90< 500 nm), preferentemente por debajo de 300 nm (D90 < 300 nm), de forma adicionalmente preferida o por debajo de 250 nm (D90 < 250 nm) y, lo más preferentemente, por debajo de 200 nm (D90 < 200 nm), medida mediante dispersión de luz dinámica de un analizador de difracción láser.
La nanosuspensión resultante puede tener por tanto un tamaño de partículas (D90) por debajo de 500 nm (D90 < 500 nm), Preferentemente por debajo de 300 nm (D90 < 300 nm), De forma adicionalmente preferida por debajo de 250 nm (D90 < 250 nm) y, lo más preferentemente, por debajo de 200 nm (D90 < 200 nm), medida mediante un analizador de dispersión de luz dinámica o de difracción láser y un tamaño de partículas por encima de 40 nm (D90 > 400 nm).
La nanosuspensión resultante puede ser adicionalmente caracterizada para unos mejores resultados de estabilización en forma de una suspensión monomodal, de forma que el modo único tiene un valor medio de menos de 300 nm, preferentemente por debajo de 200 nm. Esta suspensión monomodal puede ser conseguida filtrando la suspensión. El filtro puede reducir el tamaño de partículas hasta un tamaño de partículas (D90) por debajo de 450 nm, preferentemente por debajo de 300 nm, de forma adicionalmente preferida por debajo de 220 nm. Puede ser usado un dispositivo de filtración en cualquier estado del dispositivo, como un filtro Sartorius Stedim Biotech. Si la nanosuspensión se filtra hasta 450 nm, esta filtración hace que la desviación típica de la distribución del tamaño de partículas sea incluso más estrecha, lo que puede contribuir a la estabilización, de forma alternativa, se puede conseguir también una suspensión monomodal por los correspondientes medios de tratamiento. Como un ejemplo, la suspensión del ejemplo 12 es una suspensión monomodal sin filtración.
Durante la etapa c. de trituración, es aplicada una cierta energía específica a la nanosuspensión. La energía específica se define como la energía neta (energía bruta menos potencia de energía en parada) del molino agitador de bolas en húmedo en [kW] las veces del tiempo de trituración en [h] dividido por la cantidad total de la nanosuspensión en [t] que es la cantidad del disolvente, polvo de material natural y estabilizadores en [t].
En una forma alternativa para la estabilización química usando estabilizadores como se describió anteriormente, la nanosuspensión puede ser también físicamente estabilizada por medio de un coloidador (por ejemplo, un dispositivo modificado de tipo Kamena de la entidad Levigata GmbH, Alemania), como se expone también en la Fig. 1. Durante este procedimiento, la nanosuspensión es guiada en un recipiente (1) mediante la rotación de un rotor (4) y el rotor (5) de soporte a un cilindro con cabo (3) en su extremo superior a través de placas separadoras de una manera casi exenta de turbulencia. En el interior del cilindro cóncavo (3) la corriente (7) de nanosuspensión descendente golpea la rotación en sentido contrario de la corriente de nanosuspensión ascendente, provocada por los rotores (4, 5) a la salida en el extremo superior del cilindro cóncavo. En la colisión de la corriente descendente de la nanosuspensión y la corriente rotatoria antipodal de la nanosuspensión, las partículas reciben una carga estática por fricción. Esta carga estática o carga de las partículas puede provocar una separación de las nanopartículas y, por lo tanto, una estabilización física. Posteriormente, la nanosuspensión se eleva (6) en el cilindro hiperbólico exterior en la dirección inversa. De este modo, la nanosuspensión es ajustada en un movimiento alineado ascendente y descendente. La energía térmica así provocada es conducida por medio de un enfriador de agua integrado en la pared doble (2) del recipiente (1), en la que es suministrado el medio de enfriamiento y es desviada de la pared doble (8a, 8b, 9a, 9b).
Por lo tanto, en una realización preferida, la nanosuspensión es adicionalmente sometida a una etapa d. de coloidación en un coloidador a continuación de la etapa c. de trituración, preferentemente con la adición de oxígeno. Esta coloidación puede sustituir además el uso de estabilizadores y, en una forma adicional preferida, la nanosuspensión no contiene estabilizadores, en particular no contiene propano-1,2,3-triol.
Como se describió en detalle con anterioridad, la nanosuspensión de la presente invención puede ser química o físicamente estabilizada.
La nanosuspensión de la presente descripción puede contener adicionalmente oxígeno, (O2). Para la presente descripción si el agua está enriquecida con oxígeno, el oxígeno puede ser disuelto en agua, como física o químicamente disuelto en agua, y adherirse a cualquiera de las nanopartículas. Con el fin de enriquecer la nanosuspensión con una cantidad extra de oxígeno, puede ser usado el coloidador anteriormente descrito. En un ejemplo de método de la presente descripción, aproximadamente un minuto después del comienzo del procedimiento de coloidación, puede ser añadido oxígeno hasta que esté contenido de 20 a 30 mg/litro de oxígeno en la nanosuspensión. Mediante este tipo de procedimiento, el oxígeno es añadido a la nanosuspensión mediante un procedimiento denominado de succión, de forma contraria al método a presión, en el que el oxígeno es insertado en una solución por medio de presión. Como dispositivo de enriquecimiento de oxígeno, pero no necesariamente restringido al mismo, puede ser usado el ultracoloidador de la entidad Levigata Ltd.
En una realización preferida de la presente descripción, la nanosuspensión tiene una concentración de oxígeno de 20 a 30 mg/l.
Además del al menos un material natural y el oxígeno opcional, la nanosuspensión de la presente invención puede comprender también al menos un compuesto seleccionado entre el grupo que consiste en sabores, conservantes, tensioactivos y mejoradores de la penetración, como riboflavina o ácido ascórbico.
La nanosuspensión puede ser opcionalmente filtrada en una etapa de filtración después de la etapa c. y, opcionalmente, antes o después de la etapa d. Con esta filtración, el tamaño de las nanopartículas en la nanosuspensión puede ser adicionalmente adaptado a las necesidades. Como un ejemplo, se puede mencionar la filtración esterilizada de la nanosuspensión. Esta filtración esterilizada puede reducir el tamaño de partículas hasta un tamaño de partículas (D90) por debajo de 450 nm, preferentemente por debajo de 220 nm. Como dispositivo de filtración se puede usar cualquier dispositivo del estado de la técnica, como un filtro Millipore estándar. Si la nanosuspensión se filtra a 220 nm, esta filtración hace que la desviación típica de la distribución de los tamaños de partículas sea aún más estrecha, lo que puede contribuir a la estabilización.
En una realización preferida de la presente descripción la nanosuspensión se filtra después de la etapa c. y, opcionalmente, antes o después de la etapa d., preferentemente con un filtro esterilizado, de forma adicionalmente preferida hasta un tamaño de partículas por debajo de 450 nm y, más preferentemente por debajo de 220 nm.
Antes de usar la nano suspensión, la concentración de la nanosuspensión puede ser adaptada a las necesidades. Por una parte, la nanosuspensión puede ser diluida mediante la adición de un disolvente adicional. Por otra parte, la concentración de la nanosuspensión puede ser aumentada en una etapa e. adicional. El aumento de la concentración se puede conseguir mediante la evaporación de disolvente, preferentemente en un recinto de secado, de forma adicionalmente preferida a una temperatura que no sobrepase 40° C y, opcionalmente a presión reducida. La nanosuspensión final tiene por tanto de forma preferente una concentración de material natural en el intervalo de 10 a 40% (p/p), preferentemente de 10 a 20% (p/p), basada en la cantidad total de disolvente presente en la nanosuspensión.
Por lo tanto, en una realización preferida, la concentración de la nanosuspensión es aumentada en una etapa adicional e. mediante la evaporación de disolvente, preferentemente en un recinto de secado, hasta una concentración del material natural de 10 a 40% (p/p), preferentemente de 10 a 20% (p/p), basado en la cantidad total de disolvente presente en la nanosuspensión.
Como conclusión del método anteriormente descrito de preparación y con el apoyo de los ejemplos de la sección experimental, la nanosuspensión de materiales naturales difiere de un extracto en los siguientes factores:
Concentración de componentes activos
Como la nanosuspensión contiene la totalidad o partes del material natural en su composición natural en forma de nanopartículas, y no solamente partes extraídas, como compuestos solubles en agua, la concentración de compuestos hidrófilos, así como hidrófobos es mayor en la nanosuspensión en comparación con un extracto. En un extracto solamente están en solución compuestos hidrófilos o hidrófobos debido a su solubilidad en el disolvente respectivo.
Cantidad de masa seca
Debido a la naturaleza de una nanosuspensión, la masa seca habitualmente es igual o casi igual que la cantidad de compuesto añadido en la etapa b. para formar una nanosuspensión. En contraste con esto, la masa seca de un extracto es siempre menor que la cantidad de compuesto puesto en un disolvente, ya que la solubilidad de la mayoría de los compuestos es considerablemente menor que 100%.
Oxidación
Como las nanopartículas están habitualmente dispersadas en nanosuspensiones con una solubilidad limitada, la posibilidad de reacciones químicas no es tan sustancial como en las formulaciones basadas en soluciones. Consecuentemente, la estabilidad química de las nanosuspensiones es generalmente mayor que la de las soluciones. La estabilidad de oxidación de una nanosuspensión es atribuida a un mecanismo análogo a una capa oxidada sobre la superficie de aluminio. La degradación monocapa de la superficie de la nanopartícula es creada una vez que es expuesta al agua y oxígeno. La monocapa puede proteger la parte interna de las nanopartículas de una degradación adicional y, por tanto, aumentar la estabilidad de la oxidación de las nanosuspensiones.
Estabilización química
La estructura a escala nanométrica única de las nanopartículas proporciona aumentos significativos de la relación de área superficial a volumen, que da lugar a un comportamiento apreciablemente diferente, tanto in vitro como in vivo, en comparación con las micropartículas tradicionales. A pesar de las ventajas de los nanocristales de fármacos, presentan varios inconvenientes que incluyen una fabricación compleja y problemas de estabilidad. La estabilidad es uno de los aspectos críticos para asegurar la seguridad y la eficacia de los productos de fármacos. En nanosuspensiones administradas por vía intravenosa, por ejemplo, la formación de partículas mayores (> 5% |jm) podría conducir a un bloqueo de la capilaridad y a un embolismo y, por tanto, el tamaño de partículas y la distribución de tamaños del fármaco tiene que ser estrechamente verificado durante el almacenamiento. Estas partículas mayores están excluidas por medio de la presente nanosuspensión.
Estabilización física
La carga de partículas es uno de los factores que determinan la estabilidad física de las nanosuspensiones. Cuantas más partículas tengan igual carga, mayor es la repulsión electrostática entre las partículas y mayor es la estabilidad física. Normalmente, la carga de partículas se cuantifica como el denominado potencial zeta, que es medido, por ejemplo, a través de la movilidad electroforética de las partículas de un campo eléctrico.
El método anteriormente descrito para la preparación de una nanosuspensión da lugar a una nanosuspensión. Consecuentemente, la presente descripción se refiere también a una nanosuspensión que puede ser obtenida según uno de los métodos descritos de la presente memoria descriptiva.
Además, la nanosuspensión de la presente invención puede ser usada en la preparación de un medicamento o complemento, como un complemento alimenticio. La nanosuspensión de la presente descripción puede ser usada ventajosamente en la preparación de un medicamento para una aplicación bucal, tópica y/o oral a un animal, preferentemente un ser humano.
Las nanosuspensiones de materiales naturales presentan distintas ventajas que incluyen la posibilidad de ser administradas a través de la vía transmucosal. Las nanosuspensiones de materiales naturales contienen una concentración más elevada de agentes activos por unidad de volumen, partículas más pequeñas de agentes activos n solubles en agua y, por lo tanto, proporcionan nuevas posibilidades para fármacos inmunomoduladores, en los que los agentes activos inmunomoduladores son absorbidos por células inmunes que requieren un tamaño de partículas pequeño de los agentes activos inmunomoduladores.
Para una administración en la cavidad oral, el fármaco debe ser preferentemente líquido y eficaz en dosificaciones bajas, ya que la capacidad de absorción de sustancias a través de la cavidad oral es limitada. Además, las partículas de un fármaco administrado a través de la cavidad oral deben estar en un intervalo nanométrico, por ejemplo, menor que aproximadamente 300 nm, ya que de lo contrario el paso a través de la cavidad oral es limitado. Como la nanosuspensión de la presente descripción puede ser proporcionada con un tamaño de partículas D90 por debajo de 300 nm, la nanosuspensión puede ser ventajosamente usada para una administración en la cavidad oral.
En la cavidad oral, hay generalmente dos vías de administración reconocidas para un agente biológicamente activo. El suministro sublingual se consigue a través de las membranas mucosales que recubren la parte inferior de la boca. Debido a la elevada permeabilidad y el elevado suministro de sangre, el transporte a través de la vía sublingual da lugar a una aparición rápida de acción, proporcionando una vía de suministro apropiada para agentes activos altamente permeables con requisitos de un período de suministro corto y un régimen de dosificación no frecuente. La segunda vía generalmente reconocida es a través de la mucosa bucal. Esta zona abarca las membranas mucosales del recubrimiento interno de los carrillos. Esta zona tiene también un elevado suministro de sangre, es robusta y proporciona un tiempo de recuperación celular corto a continuación de una tensión o deterioro. Aunque la mucosa bucal es menos permeable que la zona sublingual, la extensión y la suavidad y la mucosa relativamente inmóvil proporcionan una trayectoria de absorción altamente deseable para el suministro de liberación sostenida y liberación controlada de agentes biológicamente activos. Como con las demás vías de administración transmucosales, dos ventajas principales incluyen evitar el metabolismo de primer paso hepático y la eliminación presistémica con el tracto gastrointestinal.
Adicionalmente, cualquier mejorador de la penetración conocido puede aumentar el paso de la nanosuspensión según la presente descripción.
Aparte de la administración oral, la nanosuspensión de la presente descripción puede ser usada también para una aplicación parenteral, intratecal, intravenosa, transdérmica o transmucosal a un animal, preferentemente un ser humano. Consecuentemente, una realización preferida de la presente descripción se refiere al uso de una nanosuspensión en la preparación de un medicamento para una aplicación parenteral, intratecal, intravenosa, transdérmica o transmucosal, preferentemente una aplicación bucal, tópica u oral a un animal, preferentemente un ser humano.
La presente descripción proporciona una nanosuspensión estable de materiales naturales, métodos para preparar dichas nanosuspensiones y al uso de dichas nanosuspensiones y al uso de dicha nanosuspensiones, que hace posible un suministro mejorado de los agentes biológicamente activos en la corriente sanguínea de un sujeto, tras el contacto de esta nanosuspensión con el cuerpo, por ejemplo, con una zona de la cavidad oral que incluye la mucosa bucal, el compuesto es absorbido en la corriente sanguínea en una cantidad suficiente para provocar una respuesta biológica deseada. Consecuentemente, las nanosuspensiones pueden ser suministradas por medio de una pulverización normal o microfluidizada, un aerosol o un líquido. El suministro puede ir acompañado de métodos parenterales, intratecales, intravenosos, transdérmicos, transmucosales y cualesquiera otros comúnmente reconocidos para el suministro de fármacos.
Los factores diferenciadores más significativos de una nanosuspensión preparada según los métodos descritos en la presente memoria descriptiva en comparación, por ejemplo, con un extracto, son (i) la masa molar media de los componentes activos principales del material natural, cuanto menor es la masa molar media, mayor es la biodisponibilidad (ii) el grado de reconocimiento de los componentes activos principales del material natural en el organismo humano mediante receptores humanos específicos (denominados receptores de reconocimiento de patógenos o receptores de tipo peaje TLR; solamente si el grado de detección mediante TLR es elevado, un efecto estimulador inmune aumentado puede ser iniciado mediante la cascada de sales siguiente) y (iii) el efecto resultante de los componentes activos principales del material natural en el organismo humano. Para el material natural agaricus subrufescens, estos factores diferenciadores se presentan en los ejemplos 7 a 9 siguientes usando p-1,3/1,6-glucano como el componente activo principal de agaricus subrufescens, que es insoluble en agua.
Las nanosuspensiones de la presente descripción pueden ser usadas en el tratamiento o la prevención de cáncer, enfermedad de inflamación intestinal (IBD), artritis, virus de inmunodeficiencia humana (HIV), otras enfermedades víricas, enfermedades dermatológicas como neurodermatitis o soriasis o enfermedades autoinmunes como esclerosis múltiple, vasculitis, artritis reumatoide o dermatomiositis.
Las nanosuspensiones de la presente descripción son eficaces para proporcionar concentraciones más elevadas de los agentes activos de materiales naturales en la corriente sanguínea durante un período de tiempo más prolongado, en comparación, por ejemplo, con los extractos preparados a partir de los materiales naturales. Esto se aplica especialmente a compuestos hidrófobos contenidos en estos materiales naturales. Además, las nanosuspensiones que contienen compuestos moduladores inmunes a partir de materiales naturales estimulan el sistema inmune de una manera más amplia y más intensa, ya que contienen más partículas estimuladoras inmunes en el intervalo nanométrico y en mayor cantidad, que son mejor absorbidas o reconocidas por la subpoblación inmune respectiva en comparación, por ejemplo, con los extractos.
Sección experimental
En lo que sigue, la presente invención se ilustra más en detalle. Sin embargo, debe entenderse que el alcance de la protección está determinado solamente por las reivindicaciones anejas, y no está restringido en modo alguno por los ejemplos que siguen. Los ejemplos siguientes se exponen para ayudar a la comprensión de la invención y no se debe ser concebir que limitan específicamente la invención descrita y reivindicada en la presente memoria descriptiva.
Ejemplo 1:
Ejemplo 1.1: Formulación estable de una nanosuspensión de hojas de olivo.
Se añadieron 200 g de polvo de hojas de olivo (tamaño de partículas D90: < 320 |jm, humedad residual < 5%) a 400 g de agua bidestilada, dando lugar a una suspensión al 5% (p/p) de polvo de hojas de olivo en agua. La solubilidad del polvo de hojas de olivo con un tamaño de partículas de D90<320 jm es de 1,44% (p/p). Basándose en esto, la concentración de la nanosuspensión es de 5% (p/p) que es un factor de 3,5 (factor de solubilidad) por encima del límite de solubilidad del polvo de hojas de olivo. La dispersión se trituró hasta un tamaño de partículas (D90) por debajo de 400 nm en un molino agitador de bolas en húmedo (tipo XI, Buehler AG, Suiza) usando bolas de circonia, estabilizadas con itrio con un tamaño de 0,4 a 0,5 mm, hasta que el tamaño de partículas (D90) es de aproximadamente 380 nm y, usando seguidamente bolas de circonia estabilizadas con Itrio con un tamaño de 0,1 mm hasta que se alcanza el tamaño de partículas final (D90) de 272 mm. A un tamaño de partículas (D90) de 380 nm, se añadieron 14,5 g 0,4% (p/p)) de Tween® 80. Esto redujo el tamaño de partículas hasta 340 nm. Una adición adicional de 29 g (0,7% (p/p)) de Kolliphor® P407 a un tamaño de partículas (D90) de aproximadamente 340 nm redujo significativamente el tamaño de partículas (D90) hasta 272 nm (véase la Fig. 2). La cantidad de energía específica [kWh/t] usada para la trituración se puede observar en la Fig. 2.
Ejemplo 1.2: Extracción de una hoja de olivo (comparativo)
Se extrajo la misma cantidad de polvo de olivo (200 g, tamaño de partículas D90: < 320 jm ) en 4000 g de agua bidestilada durante 2 horas a una temperatura de 22° C
Ejemplo 1.3: Comparación de masa seca
La cantidad de masa seca del extracto (ejemplo 1.2) y la nanosuspensión (ejemplo 1.1) anteriormente preparada se determinó filtrando el extracto y la nanosuspensión, respectivamente, con un filtro de 0,45 jm (Millipore, membrana de éster de celulosa). Los sólidos filtraron se secaron y se determinó la masa seca de las partículas filtradas. Como se puede observar también a partir de la Fig. 3, la cantidad de masa seca de la nanosuspensión es de 4,5% (p/p) en comparación con 0,3% (p/p) del extracto con la misma concentración de polvos de hojas de olivo (5% (p/p)).
Ejemplo 2:
Ejemplo 2.1: Formulación estable de spirulina
Se añadieron 300 g de polvo de spirulina (10% (p/p), tamaño de partículas D90: < 150 |jm, humedad residual < 5%) y 60 g de Kolliphor® P 407 a 3000 g de agua bidestilada, dando lugar a una dispersión de spirulina en agua. La solubilidad del polvo de spirulina con un tamaño de partículas D90 < 150 jm es 0,52% (p/p). Basado en esto, la concentración de la nanosuspensión de 10% (p/p) es un factor de 19,2 (factor de solubilidad) por encima del límite de solubilidad del polvo de spirulina. La dispersión se trituró hasta un tamaño de partículas (D90) de aproximadamente 80 nm en un molino agitador de bolas en húmedo (tipo XI, Buehler AG, Suiza) usando bolas de circonia estabilizadas con itrio con un tamaño de 0,4 a 0,5 mm hasta que el tamaño de partículas (D90) es de aproximadamente 120 nm y usando seguidamente bolas de circonia estabilizadas con itrio con un tamaño de 0,1 mm hasta el tamaño de partículas final (D90) de 80 nm. La cantidad de energía específica [kWh/t] usada para la trituración se puede observar a partir de la Fig. 4.
Ejemplo 2.2: Extracción de una spirulina (comparativo)
Se extrajo la misma cantidad de polvo de spirulina (300 g, tamaño de partículas D90: < 150 jm ) en 3000 g de agua bidestilada durante 2 horas a una temperatura de 22° C.
Ejemplo 2.3: Comparación de masa seca
La cantidad de masa seca del extracto (ejemplo 2.2) y la nanosuspensión (ejemplo 2.1) anteriormente preparada se determinó filtrando el extracto y la nanosuspensión, respectivamente con un filtro de 0,45 jm (Millipore, membrana de éster de celulosa). Los sólidos filtrados se secaron y se determinó la masa seca de las partículas filtradas. Como se puede observar también a partir de la Fig. 5, la cantidad de masa seca de la nanosuspensión es de 9,4% (p/p) en comparación con 3,3% (p/p) del extracto con la misma concentración de polvo de spirulina (10% (p/p)).
Ejemplo 3:
Ejemplo 3.1: Formulación estable de una nanosuspensión de hongos de agaricus agaricus subrufescens con 5% de P100, 0,5% de Tween® 80 y 1 % de Kolliphor P407.
Se añadieron 150 g de agaricus subrufescens (tamaño de partículas D90: < 320 jm , humedad residual < 5%) 150 g de P100 (5% (p/p) y 15 g de polisorbato Tween® 80 (0,5% (p/p) a 3000 g de agua bidestilada, dando lugar a una dispersión al 5% (p/p) de polvo de agaricus subrufescens en agua. La solubilidad del polvo de agaricus subrufescens con un tamaño de partículas D90 < 320 es de 3,2% (p/p). Basándose en esto, la concentración de la nanosuspensión de 5% (p/p) es un factor de 1,66 (factor de solubilidad) por encima del límite de solubilidad del polvo de agaricus subrufescens. La dispersión se trituró en un molino agitador de bolas en húmedo (tipo XI, Buehler AG, Suiza) usando bolas de circonia estabilizadas con itrio con un tamaño de 0,4 a 0,5 mm, hasta que el tamaño de partículas (D90) es de aproximadamente 6,3 jm y usando seguidamente bolas de circonia estabilizadas con itrio con un tamaño de 0,1 mm hasta que se alcanza el tamaño de partículas final (D90) de 240 nm. La cantidad de energía específica [kWh/t] usada para la trituración se puede observar a partir de la Fig. 6 (línea continua). A un tamaño de partículas (D90) de aproximadamente 6,3 jm , se añadieron 6,3 jm , 30 g (1% p/p)) de Kolliphor® P407. El tamaño de partículas final (D90) de la nanosuspensión fue de 240 nm (véase también la Fig. 6 - línea continua).
Ejemplo 3.2: Formulación estable de una nanosuspensión de hongos agaricus subrufescens 10% P100, 0,5% Tween® 80 y 1% Kolliphor P407.
Se añadieron 150 g de polvo de agaricus subrufescens (tamaño de partículas D90: < 320 jm ), 300 g de Lipoid P100 (10% (p/p)) y 15 g de polisorbato Tween® 80 (0,5% (p/p)) a 3000 g de agua bidestilada, dando lugar a una dispersión al 5% (p/p) de polvo de agaricus subrufescens en agua. La dispersión se trituró en un molino agitador de bolas en húmedo (tipo XI, Buehler AG, Suiza) usando bolas de circonia estabilizadas con itrio con un tamaño de 0,4 a 0,5 mm hasta que el tamaño de partículas (D90) es de aproximadamente 6,3 jm y usando seguidamente bolas de circonia estabilizadas con itrio con un tamaño de 0,1 mm hasta que se alcanza el tamaño de partículas final (D90) de 368 nm. La cantidad de energía específica [kWh/t] usada para la trituración se puede observar a partir de la Fig. 6 (línea de rayas). A un tamaño de partículas (D90) de aproximadamente 2,6 jm , se añadieron 30 g (1% (p/p)) de Kolliphor® p407. El tamaño de partículas final (D90) de la nanosuspensión fue de 368 nm (véase también la Fig. 3 - línea de rayas).
Ejemplo 3.3: Formulación estable de una nanosuspensión de hongos agaricus agaricus subrufescens 5% P100, 0,75% Tween® 80
Se añadieron 150 g de polvo de agaricus subrufescens (tamaño de partículas D90: < 320 jm ), 150 g de Lipoid P100 (5% (p/p)) y 15 g de polisorbato Tween® 80 (0,5% (p/p)) a 3000 g de agua bidestilada, dando lugar a una suspensión al 5% (p/p) de polvo de agaricus subrufescens en agua. La dispersión se trituró en un molino agitador de bolas en húmedo (tipo Xl, Buehler AG, Suiza) usando bolas de circonia estabilizadas con itrio con un tamaño de 0,4 a 0,5 mm. La cantidad de energía específica [kWh/t] usada para la trituración se puede observar a partir de la Fig. 7 (línea de rayas). El tamaño de partículas (D90) de la nanosuspensión se redujo hasta 342 nm a una energía específica de 15170 kWh/t (véase también la Fig. 7 - línea de rayas). Después de una trituración continuada a una energía específica elevada, el tamaño de partículas aumentó de repente debido probablemente a la elevada área superficial de la partícula, que puede ser una causa de aglomeración. Incluso la adición de 7,5 g adicionales de polisorbato Tween® 80 (que da lugar a un total de 0,75% (p/p)) no redujo significativamente el tamaño de partículas. En comparación, la misma nanosuspensión, pero con una cantidad adicional de 1% de Kolliphor® P407 (ejemplo 3.2 anterior) y 0,5% de polisorbato Tween® 80 muestra una disminución adicional del tamaño de partículas y también de la estabilización (véase Fig. 7- línea continua).
Ejemplo 3.4: Extracción de un hongo agaricus subrufescens (comparativo)
Se extrajo la misma cantidad de polvo de agaricus subrufescens (150 g, tamaño de partículas D90: < 320 |jm) en 3000 g de agua bidestilada durante 2 horas a una temperatura de 22° C.
Ejemplo 3.5: Comparación de masa seca
La cantidad de masa seca del extracto (ejemplo 3.4) y la nanosuspensión (ejemplo 3.1) anteriormente preparada se determinó filtrando el extracto y la nanosuspensión, respectivamente, con un filtro de 0,45 jm (Millipore, membrana de éster de celulosa). Los sólidos filtrados se secaron y 'se determinó la masa seca de las partículas filtradas. Como se puede observar también a partir de la Fig. 8, La cantidad de masa seca de la nanosuspensión es de 4,4% (p/p), en comparación con 0% (p/p) del extracto con la misma concentración de polvo de agaricus subrufescens (5% (p/p)).
Ejemplo 4:
Ejemplo 4.1: Concentración de componentes activos
El agente activo conductor de agaricus subrufescens es p-1,3/1,6-glucano y este glucano puede ser usado, por tanto, como material de referencia para comparar la concentración de extractos diferentes de agaricus subrufescens y nanosuspensión de agaricus subrufescens. Aparte del 5% (p/p de la nanosuspensión del ejemplo 3.1 y el 5% (p/p) del extracto de agaricus subrufescens del ejemplo 3.4, se prepararon extractos adicionales de una manera análoga a la del ejemplo 3.4. los otros tipos de extractos en la Fig. 9 se hicieron todos con los mismos parámetros (150 g de polvo de agaricus subrufescens para 3000 g de disolvente, tiempo de extracción de 2 h) con diferentes disolventes (agua destilada y 60% v/v) de etanol (EtOH) y diferentes temperaturas (temperatura ambiente de 22° C y 80° C), como se indica en la Fig. 9.
La Fig. 9 muestra la comparación del contenido de (3-1,3/1,6-glucano para diferentes extractos de polvo de agaricus subrufescens y la nanosuspensión del ejemplo 3.1, en relación al polvo de agaricus subrufescens puro usado para la preparación de los extractos y la nanosuspensión. En la nanosuspensión, se incorpora un 98% del contenido de p-1,3/1,6-glucano de polvo, en comparación con solo un 2% del extracto en etanol a temperatura ambiente y hasta 46% a 80° C en agua bidestilada. Esto muestra que en la nanosuspensión se retiene casi la totalidad del p-1,3/1,6-glucano de la fracción de polvo.
Ejemplo 5:
Ejemplo 5.1: Formulación estable de una nanosuspensión de sílice
Se añadieron 100 g de polvo de sílice (tamaño de partículas D90: < 25 nm) a 2000 g de agua bidestilada, dando lugar a una dispersión al 5% (p/p) de polvo de sílice en agua. La nanosuspensión de sílice se estabilizó por medio de la estabilización física descrita en detalle con anterioridad. El potencial zeta, medido por medio del analizador de difracción láser Zetasizer (Malvern Instruments, Reino Unido) se tomó como parámetro físico para valorar el efecto de la estabilización física. Consecuentemente, se midió el potencial zeta antes y después de la estabilización física con el coloidador. Debido a la estabilización física en el coloidador durante 3 minutos a 3000 min-1, el potencial zeta se redujo desde -0,84 mV hasta -10,4 mV. Esto es una reducción significativa en comparación con el valor sin estabilización física (véase la Fig. 10).
Ejemplo 6:
En el ejemplo 6, se ensayaron diferentes nanosuspensiones en cuanto a su estabilidad a largo plazo. Se hizo un ensayo de la estabilidad acelerada con una centrifugadora analítica (Lumifuge de la entidad LUM GmbH, Alemania) para clasificar y cuantificar los fenómenos de desmezclado, como la sedimentación, flotación o consolidación, de la nanosuspensión. Este ensayo se usó para determinar la estabilidad de la nanosuspensión. Una nanosuspensión se considera que es estable a largo plazo si hay ninguna o solo algo de sedimentación, flotación o consolidación de nanopartículas.
En el ensayo de estabilidad acelerada, la nanosuspensión fue acelerada en la centrifugadora con 2000 g (g = fuerza de constante de gravedad= 9,81 m/s2). Con la ayuda de la extinción resuelta en espacio y tiempo de Lumifuge, se obtuvieron los perfiles sobre la longitud completa de la muestra. La luz paralela (I0) ilumina la celda de la muestra completa y la luz transmitida l es detectada por miles de detectores dispuestos linealmente a través de la muestra completa desde la parte superior a la parte inferior, con una resolución a microescala. La transmisión es convertida en extinción mediante Ig (l/l0) y se puede calcular la concentración de partículas.
Con el fin de conseguir una nanosuspensión estable a largo plazo, se puede añadir propano-1,2,3-triol para aumentar la viscosidad de la nanosuspensión y evitar la sedimentación de las nano partículas en la nanosuspensión. Los siguientes ejemplos muestran el efecto de la adición de propano-1,2,3-triol. Ejemplo 6.1: Formulación estable a largo plazo de una nanosuspensión de agaricus subrufescens con 0% de propano-1,2,3-triol.
Ejemplo 6.1: Formulación estable a largo plazo de una nanosuspensión de hongos agaricus subrufescens con 0% de propano-ñ1,2,3-triol
Se tomó la nanosuspensión preparada como en el ejemplo 3.1 y se agitó durante 30 minutos con un agitador magnético, sin adición de propano-1,2,3-triol. Seguidamente, se hizo un ensayo de estabilidad acelerada con una centrifugadora analítica (Lumifuge de la entidad LUM GmbH, Alemania) para clasificar y cuantificar los fenómenos de desmezclado como sedimentación, flotación o consolidación, de la nanosuspensión, como se describió anteriormente.
La Fig. 11 muestra la curva de transmisión de luz de la nanosuspensión con 0% de propano-1,2,3-triol. Como se puede observar, las partículas mayores sedimentan bajo un campo de 2000 g en la primera revolución (líneas grises claras entre 40% y aproximadamente 25% de transmisión), seguidamente las partículas más grandes adicionales siguen en las siguientes revoluciones hasta después de 20 minutos y se forma un sedimento en la parte inferior de la cubeta. La velocidad de transmisión disminuye desde 44% al comenzar hasta 10% (sedimento en la parte inferior de la cubeta), ilustrando el procedimiento de sedimentación bajo un campo de 2000 g: eso muestra la inestabilidad a largo plazo de la nanosuspensión.
Ejemplo 6.2: Formulación estable a largo plazo de una nanosuspensión de hongos agaricus agaricus subrufescens con 20% de propano-1,2,3-triol
Se tomaron 500 ml de la nanosuspensión preparada como en el ejemplo 3.1 y se añadió 20% (v/v) de propano-1.2.3- triol. La mezcla resultante se agitó durante aproximadamente 30 minutos con un agitador magnético. Seguidamente se hizo el ensayo de estabilidad acelerada anteriormente descrito.
La Fig. 12 muestra la curva de transmisión de luz de la nanosuspensión con 20% de propano-1,2,3-triol. Como se puede observar, la cantidad de partículas más grandes líneas grises claras entre 50% y 40% de transmisión) que sedimentaron bajo el campo de 2000 g es mucho menor que en las primeras revoluciones, hasta después de 20 minutos se forma un sedimento en la parte inferior de la cubeta. La velocidad de transmisión disminuye desde 58% al comienzo hasta 10% (sedimento en la parte inferior de la cubeta) ilustrando el procedimiento de sedimentación bajo el campo de 2000 g. Esto muestra que mediante la adición de 20% (v/v) de propano-1,2,3-triol, la estabilidad de la nanosuspensión puede ser aumentada.
Ejemplo 6.3: Formulación estable a largo plazo de una nanosuspensión de hongos agaricus agaricus subrufescens con 50% de propano-1,2,3-triol
Se tomaron 500 ml de la nanosuspensión preparada como en el ejemplo 3.1 y se añadió 50% (v/v) de propano-1.2.3- triol. La mezcla resultante se agitó durante aproximadamente 30 minutos con un agitador magnético. Seguidamente, se hizo el ensayo de estabilidad acelerada anteriormente descrito.
La Fig. 13 muestra la curva de transmisión de luz de la nanosuspensión con 50% de propano-1,2,3-triol. Como se puede observar, no hay sedimentación durante los 20 minutos bajo el campo de 2000 g (líneas grises claras entre 50% y aproximadamente 40% de transmisión). No hay sedimento en la parte inferior de la cubeta. Esto muestra que mediante la adición de 50% (v/v) de propano-1,2,3-triol, se aumenta adicionalmente la estabilidad de la nanosuspensión.
Ejemplo 7: Masa molar media p-1,3/1,6-glucano de nanosuspensión y extracto de hongos agaricus subrufescens ambos con 5% (p/p) de concentración
La Fig. 14 muestra la fracción de peso diferencial (es decir, masa molar media) de p-1,3/1,6-glucano de la nanosuspensión de agaricus subrufescens preparada como en el ejemplo 3.1 y en el extracto preparado como en el ejemplo 3.4 (nanosuspensión 1: 20 |jl de volumen inyectado en el detector, nanosuspensión 2: 10 |jl de volumen inyectado en el detector, extracto: 10 j l de volumen inyectado en el detector). La masa molar de la nanosuspensión de agaricus subrufescens se midió con dos volúmenes inyectados con el fin de mostrar la fiabilidad del método analítico, que mostró que era estable. La masa molar media de la sustancia activa p-1,3/1,6-glucano de la nanosuspensión de agaricus subrufescens es entre 15 y 16 kDa y la del extracto es de 135 kDa. Esto muestra que el método para preparar una nanosuspensión a partir de materiales naturales descrito en la presente memoria descriptiva reduce la masa molar de la sustancia activa principal p-1,3/1,6-glucano significativamente. Esto da lugar a una resorción mayor del p-1,3/1,6-glucano presente en la nanosuspensión cuando es administrada.
Ejemplo 8: detección de p-1,3/1,6-glucano de nanosuspensión y extracto de hongos agaricus subrufescens ambos con 5% (p/p) de concentración
El dectin-1 es el receptor principal de células inmunes que detecta p-1,3/1,6-glucano en el organismo humano. La Fig. 15 muestra la cantidad relativa de monocitos positivos a dectin-1 (en %) en una muestra de células mononucleares de sangre periférica sin estimular (PBMC), PBMC estimuladas con 5% (p/p) de nanosuspensión de agaricus subrufescens (preparada como en el ejemplo 3.1) y 5% (p/p) de extracto de agaricus subrufescens (preparado como en el ejemplo 3.4), respectivamente. El número de PBMC es aumentado en 409% cuando se estimula con 5% (p/p) de nanosuspensión de agaricus subrufescens con relación a una muestra sin estimular en comparación con un aumento de 122% a una estimulación con 5% (p/p) de extracto de agaricus subrufescens.
Ejemplo 9: inducción de citoquina TNF-alfa por medio de nanosuspensión y extracto de hongos agaricus subrufescens ambos con 5% (p/p) de concentración
El TNF-alfa es una de las citoquinas principales en el desarrollo de la enfermedad. La Fig.16 muestra la comparación de la inducción in vitro de citoquina TNF-alfa provocada por nanosuspensión (preparada como en el ejemplo 3.1) y extracto (preparado como en el ejemplo 3.4) de agaricus subrufescens. La inducción de TNF-alfa por la nanosuspensión de agaricus subrufescens es mayor en un factor de 60 en comparación con el extracto.
Ejemplo 10: inducción de citoquina IL-10 mediante nanosuspensión y extracto de hongos agaricus subrufescens ambos con 5% (p/p) de concentración
La Fig. 17 muestra la comparación de citoquina IL-10 como una de las principales citoquinas proinflamatorias en una inducción in vitro provocada por nanosuspensión, preparada como en el ejemplo 3.1) y extracto (preparado como en el ejemplo 3.4) de agaricus subrufescens. La inducción de IL-10 mediante nanosuspensión de agaricus subrufescens es mayor en un factor de 26,5 en comparación con el extracto.
Ejemplo 11: inducción de citoquina IL-6 mediante nanosuspensión y extracto de homos agaricus subrufescens ambos con 5% (p/p) de concentración como un efecto resultante en el organismo humano
La Fig. 18 muestra la comparación de la citoquina IL-6 como una de las principales citoquinas proinflamatorias, en una inducción in vitro provocada por nanosuspensión (preparada como en el ejemplo 3.1) y extracto (preparado como en el ejemplo 3.4) de agaricus subrufescens. La inducción de IL-10 mediante nanosuspensión de agaricus subrufescens es mayor en un factor de 6,7 en comparación con el extracto.
Ejemplo 12: mejora de la distribución de partículas en una nanosuspensión de hongos agaricus subrufescens con 5% (p/p) y 7,5% de concentración de lípidos
Se añadieron 150 g de polvo de agaricus subrufescens (tamaño de partículas D90: 320 |jm), 225 g de Lipoid P100 (7,5% p/p)) y 15 g de polisorbato Tween® 80 (0,5% (p/p)) a 3000 g de agua bidestilada, dando lugar a una dispersión de 5% (p/p) de polvo de agaricus subrufescens en agua. La dispersión se trituró en un molino agitador de bolas en húmedo (tipo XI, Buehler AG, Suiza) usando bolas de circonia estabilizadas con itrio con un tamaño de 0,4 a 0,5 mm hasta que el tamaño de partículas (D90) es de aproximadamente 15 jm y usando seguidamente bolas de circonia estabilizadas con itrio con un tamaño de 0,1 mm hasta que se alcanza el tamaño de partículas final (D100) de 375 mm. A un tamaño de partículas (D90) de aproximadamente 4 mm, se añadieron 30 g (1% (p/p)) de Kolliphor® P407. El tamaño de partículas final (D100) de la nanosuspensión fue de 375 nm. No fue necesaria una filtración de la nanosuspensión resultante.
Mediante la adición de un 2,5% (p/p) adicional de Lipoid P100 en comparación con el ejemplo 3.1, se consiguieron dos mejoras importantes. En primer lugar, se consiguió un tamaño de partículas final (D100) de 375 nm (véase la figura 20) en comparación con un tamaño de partículas (D100) de 10 jm (véase la figura 19) en el ejemplo 3.1. En segundo lugar, resultó una distribución de partículas monomodal, en comparación con la distribución de partículas bimodal del ejemplo 3.1 (véanse las figuras 19 y 20, respectivamente). Para mantener una nanosuspensión estable, se prefirió tener una distribución de partículas monomodal para evitar o reducir la maduración de Ostwald que se puede producir y resultar en una nanosuspensión inestable. La diferencia es también clara a partir de la distribución de partículas más detallada de los dos ejemplos. En el ejemplo 3.1, el tamaño de partículas D10 es de 0,108 jm , el tamaño de partículas D50 es de 0,159 jm , el tamaño de partículas D90 es de 0,240 jm y el tamaño de partículas D100 es de 10 jm (véase la Fig. 19). En contraste con esto, la distribución de partículas detallada del ejemplo 12 es de un tamaño de partículas D10 de 0,65 jm , un tamaño de partículas D50 de 0,104 jm , un tamaño de partículas D90 de 0,178 jm y un tamaño de partículas D100 de 0,375 jm (véase la Fig.10).
Ejemplo 13: inducción de células T activadas CD25 mediante nanosuspensión de hongos agaricus subrufescens del ejemplo 12 como un efecto resultante en el organismo humano
Las células T activadas CD25 son una subpoblación importante de células T que se considera que inducen un desplazamiento de la respuesta de células 2 T-helper (Th2) a células 1 T-helper (Th1). Un desplazamiento en el equilibrio de Th1/Th2 hacia una respuesta de Th1 es responsable de un aumento en la capacidad de defensa de virus en el sistema inmune. En el siguiente ejemplo, el aumento de células T activadas CD25 fue ensayado en seres humanos con una nanosuspensión según el ejemplo 12 que contenía agaricus subrufescens en comparación con un polvo de agaricus subrufescens disponible en el mercado.
La nanosuspensión preparada como en el ejemplo 12 se mezcló con propano-1,2,3-triol(glicerina) para dar lugar a una mezcla que contenía 40% de glicerina. Esta mezcla se administró a un primer grupo de ocho seres humanos a una dosis de 3,78 ml/día por medio de un actuador de bomba rociadora. Esta dosis corresponde a 105 mg de agaricus subrufescens (contenido de sólidos secos). En dicho primer grupo, las células T activadas CD25 aumentaron en un 33% en 4 semanas desde el comienzo (véase la Fig. 21). Para fines comparativos, un segundo grupo de ocho seres humanos recibió polvo de agaricus subrufescens en cápsulas (tamaño de partículas de aproximadamente 220 |jm) a la dosis diaria recomendada de 2520 mg. En dicho segundo grupo, Las células T activadas CD25 aumentaron en 11,5% en 4 semanas desde el comienzo (véase la Fig. 22).
Como se puede observar a partir de los datos anteriores, la nanosuspensión del ejemplo 12 da lugar a un aumento de aproximadamente tres veces de células T activadas CD25, en comparación con un polvo. Dicho de otro modo, la nanosuspensión del ejemplo 12 es aproximadamente tres veces más potente que el polvo convencional. Esto es incluso más sorprendente ya que la dosis fue inferior en un factor de 24, en comparación con el polvo.

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Un método para la preparación de una nanosuspensión estable que comprende al menos un material natural, en que el método comprende las etapas de
a. Proporcionar al menos un material natural que tiene un tamaño de partículas (D100) de menos de 320 |jm, distinto de un extracto;
b. Dispersar dicho al menos un material natural de la etapa a. en un disolvente;
c. Triturar la dispersión de la etapa b. hasta un tamaño de partículas (D90) por debajo de 1000 nm (D90 < 1000 nm),
en que el al menos un material natural es dispersado en la etapa b. a una concentración de 0,5 a 20% (p/p), basada en la cantidad total de disolvente usado en la nanosuspensión y en que la etapa b. de dispersión o la etapa c. de trituración comprenden la adición de un estabilizador;
en que el estabilizador se selecciona entre el grupo que consiste en fosfolípidos, polisorbatos, hidroxipropilcelulosa, (HPC), hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) y polivinilpirrolidona (PVP); copolímeros tribloques no iónicos, copolivinilpirrolidona; caprilocaproilpolioxil-8-glicéridos, lauroilpolioxil-32-glicéridos; gelatina; lecitina (fosfátidos); goma arábiga; colesterol; goma arábiga; polioxietileno-alquil-éteres; derivados de polioxietileno-aceite de ricino; ésteres de ácidos grasos de polioxietileno-sorbitán, ésteres de ácidos grasos de sorbitán; polietilenglicoles, poli(estearatos de oxietileno); mono- y di-glicéridos; dióxido de silicio coloidal; dodecilsulfato de sodio; silicato de magnesio-aluminio; trietanolamina; ácido esteárico; estearato de calcio; monoestearato de glicerol; alcohol cetoestearílico; cera emulsionante de cetomacrogol; alcoholes de cadena corta y media;
Oleoil-polioxil-6-glicéridos; Plurol oleico; propano-1,2,3-triol, poli(alcohol vinílico) y sulfosuccinato de dioctil-sodio (DOSS);
en que al menos un material natural se selecciona entre el grupo que consiste en plantas, cianobacterias, algas y hongos.
2. El método según la reivindicación 1, en el que al menos un material natural es una parte o la totalidad de dicho material natural, preferentemente la totalidad de dicho material natural.
3. El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el material natural es secado en una etapa a.1, antes de la etapa a. preferentemente liofilizado y/o térmicamente secado y/o
en que el material natural proporcionado en la etapa a. tiene un contenido de agua w por debajo de 15% (w < 15%), preferentemente por debajo de 12% (w < 12%), más preferentemente por debajo de 10% (w < 10%) y, lo más preferentemente, por debajo de 8% (w < 8%).
4. El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el material natural es pretriturado antes y/o después de la etapa a.1 de secado, preferentemente en un molino de cuchillas y, opcionalmente, tamizado hasta un tamaño de partículas (D100) de menos de 320 jm .
5. El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el al menos un material natural es dispersado en la etapa b. a una concentración de 2 a 10% (p/p), basada en la cantidad total de disolvente usado en la nanosuspensión, preferentemente de 2 a 5% (p/p) o de 5 a 10% (p/p).
6. El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa b. de dispersión comprende la adición de un estabilizador, preferentemente en que la etapa b. de dispersión comprende la adición de un fosfolípido y/o un polisorbato, preferentemente
a. en que la etapa b. de dispersión comprende la adición de un polisorbato en una cantidad de 0,5 a 2% (p/p) y/o en que el polisorbato se selecciona entre el grupo que consiste en polisorbato 80 y polisorbato 20, o b. en que la etapa b. de dispersión comprende la adición de un fosfolípido en una cantidad de 50 a 200% (p/p), basada en la cantidad total del material natural, preferentemente en que el fosfolípido contiene hasta 95% (en peso) de fosfatidilcolina y/o de 20 a 30 (en peso) de lisofosfatidilcolina; o
c. en que el estabilizador es un polímero seleccionado entre el grupo que consiste en hidroxipropilcelulosa (HPC), hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) y polivinilpirrolidona (PVP); o en que el estabilizador se selecciona entre el grupo que consiste en polisorbato 80, polisorbato 20, poloxámero 407 y poloxámero 188.
7. El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa c. de trituración se lleva a cabo en un molino de agitador de bolas en húmedo, preferentemente
a. en que la etapa c. de trituración comprende una primera etapa c.1 de trituración en un molino de bolas en húmedo, preferentemente un molino agitador de bolas en húmedo con un diámetro de bolas de trituración de 0,5 a 1,5 mm, y una segunda etapa c.2 de trituración en un molino de bolas en húmedo, preferentemente un molino agitador de bolas en húmedo, con un diámetro de bolas de trituración de 0,3 a 0,4 mm y una tercera etapa c.2 de trituración en un molino de bolas en húmedo, preferentemente un molino agitador de bolas en húmedo con un diámetro de bolas de trituración de 0,05 a 0,2 mm, o
b. en que la etapa c. de trituración comprende una primera etapa c.1 de trituración en un molino de bolas en húmedo, preferentemente un molino agitador de bolas en húmedo, con un diámetro de bolas de trituración de 0,4 a 0,5 mm y una segunda etapa c.2 de trituración en un molino de bolas en húmedo, preferentemente un molino agitador de bolas en húmedo, con un diámetro de bolas de trituración de 0,05 a 0,2 mm.
8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa c. de trituración comprende la adición de un estabilizador, preferentemente, en el que el estabilizador es un estabilizador electrostático y/o estérico, a un tamaño de partículas D90 < 9 |jm, preferentemente D90 < 3 |jm, más preferentemente D90 < 800 nm y, lo más preferentemente, D90 < 300 nm, preferentemente en que el estabilizador se selecciona entre el grupo que consiste en fosfolípidos, polisorbatos, hidroxipropilcelulosa, (HPC), hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) y polivinilpirrolidona (PVP); copolímeros tribloques no iónicos, como poloxámeros (por ejemplo, poloxámero 407 o poloxámero 188); copolivinilpirrolidona; caprilocaproilpolioxil-8-glicéridos, lauroilpolioxil-32-glicéridos; gelatina; lecitina (fosfátidos); goma arábiga; colesterol; tragacanto; polioxietileno-alquil-éteres; derivados de polioxietilenoaceite de ricino; ésteres de ácidos grasos de polioxietileno-sorbitán, ésteres de ácidos grasos de sorbitán; polietilenglicoles, poli(estearatos de oxietileno); mono- y di-glicéridos; dióxido de silicio coloidal; dodecilsulfato de sodio; silicato de magnesio-aluminio; trietanolamina; ácido esteárico; estearato de calcio; monoestearato de glicerol; alcohol cetoestearílico; cera emulsionante de cetomacrogol; alcoholes de cadena corta y media; oleoilpolioxil-6-glicéridos; Plurol oleico; propano-1,2,3-triol, poli(alcohol vinílico) y sulfosuccinato de dioctil-sodio (DOSS), preferentemente en que el estabilizador se selecciona entre el grupo que consiste en polisorbato 80, polisorbato 20, poloxámero 407 y poloxámero 188.
9. El método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en que el método comprende la adición de propano-1,2,3-triol (glicerina) después de que ha terminado la etapa c. de trituración, preferentemente
en que el estabilizador es glicerina en una cantidad de 30 a 100% (v/v), preferentemente en una cantidad de 40% (v/v) o 50% (v/v), basada en el volumen total del disolvente.
10. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en que la nanosuspensión es sometida adicionalmente a una etapa d. de coloidación en un coloidador a continuación de la etapa c. de trituración, preferentemente con la adición de oxígeno, en que la nanosuspensión no contiene necesariamente propano-1,2,3-triol.
11. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la nanosuspensión es filtrada después de la etapa c. y, opcionalmente, antes o después de la etapa d., preferentemente con un filtro esterilizado, de forma adicionalmente preferida hasta un tamaño de partículas por debajo de 450 nm y, más preferentemente, por debajo de 220 nm, y/o en que la nanosuspensión comprende adicionalmente al menos un compuesto seleccionado entre el grupo que consiste en sabores, conservantes, tensioactivos y mejoradores de la penetración.
12. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la dispersión de la etapa b. es triturada hasta un tamaño de partículas (D90) por debajo de 500 nm (D90 < 500 nm), preferentemente por debajo de 300 nm (D90 < 300 nm), de forma adicionalmente preferida por debajo de 250 nm (D90 < 250 nm) y, lo más preferentemente, por debajo de 200 nm (D90 < 200 nm), medido mediante un analizador de dispersión de luz dinámico o de difracción láser.
13. Método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la concentración de la nanosuspensión es aumentada en una etapa e. adicional mediante evaporación de disolvente, preferentemente en un recinto de secado, hasta una concentración del material natural de 10 a 40% (p/p), preferentemente de 10 a 20% (p/p), basada en el volumen total de la nanosuspensión y/o en que el al menos un material natural está presente en la nanosuspensión a una concentración que da lugar un factor de solubilidad de más de 0,4, o más de 0,5, o más de 0,8, o más de 1 o, incluso, más de 1,1.
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