CN112469437A - 制备和输送卵囊溶液的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了破坏溶液中卵囊外膜并将溶液输送至动物的系统和方法。所述系统包括容纳未破裂卵囊溶液的容器、卵囊处理室和输送出口。将未破裂的卵囊从容器中输送穿过处理室，一部分卵囊膜被破坏，释放出孢子囊，然后将所得溶液从处理室输送至输送出口，在此处将溶液输送至动物。还提供了疫苗接种方法，包括针对艾美球虫感染的疫苗接种。

Description

制备和输送卵囊溶液的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求Hutchins等人于2018年7月10日提交的美国临时申请62/696,261的权益，通过引用，该临时申请的全部内容纳入本申请中。本申请涉及发明人James Hutchins于2019年7月10日提交的共同未决的PCT申请，该PCT申请的序列号为______，代理人案卷号为673-04-PCT。此共同未决PCT申请通过引用全文纳入本申请中。

1.技术领域

本发明提供了破坏溶液中卵囊外膜并将溶液输送至动物的系统和方法。所述系统包括容纳未破裂卵囊溶液的容器、卵囊处理室和输送出口。将未破裂的卵囊从所述容器移动穿过处理室，一部分卵囊膜被破坏，释放出孢子囊，然后将所得溶液从处理室移动至输送出口，在此处将溶液输送至动物。

2.背景技术

2.1.技术领域

本文提供的“背景”描述是为了总体上呈现本发明的背景。在该背景技术部分中所描述的范围内，当前署名的发明人的工作以及在申请时未被视为现有技术的描述方面，均未被本发明明确或暗示承认为现有技术。

疫苗是保护人类和动物免受病原微生物(包括病毒、细菌和寄生虫)侵害的重要组分。简而言之，疫苗刺激免疫系统识别特定的病原体，从而建立防御系统，阻止将来遇到的自然界中的这种微生物。疫苗可以分为几大类，具体来说是：灭活疫苗或死疫苗、亚单位疫苗、野生型疫苗和减毒或改良活疫苗。野生型疫苗和减毒疫苗会给受体动物带来轻度感染。轻度感染通常会产生免疫反应，从而阻止将来发生更大的甚至致命的感染。

2.2.顶复门、艾美球虫、球虫病和疫苗

顶复门是具有复杂生命周期的单细胞孢子形成寄生虫的一类门。顶复门引发的人类常见疾病包括巴贝西虫病(巴贝西虫)、隐孢子虫病(隐孢子虫)、疟疾(疟原虫)和弓形虫病(弓形虫)。某些顶复门，例如隐孢子虫和弓形虫，对人和动物都有影响。其他顶复门，例如艾美球虫或泰勒虫只会影响动物。顶复门的生命周期很复杂，因为它具有有性和无性繁殖阶段。生命周期通常包括将其排泄到环境中的阶段以及存在于动物宿主内的其他阶段。对于许多顶复门而言，生命周期的某些阶段发生在一种宿主物种中，而其他阶段发生在另一种宿主物种中。另一方面，顶复门寄生虫艾美球虫通常具有宿主特异性，并且是单主寄生性的，即生命周期是特定于单一宿主物种的。

艾美球虫在野生和驯养的脊椎动物(例如牛、鸡、鱼、山羊、猪、兔子、爬行动物、绵羊和火鸡)中引发球虫病。不同的艾美球虫物种具有优选的胃肠道(GI)区域，在这些区域中它们进行繁殖并损坏胃肠道的上皮。

图1A和图1B示出了无论是野生型还是减毒型艾美球虫卵囊的生命周期的一部分。图1A描述了鸡体内艾美球虫卵囊摄取的外部过程的概况。初生雏鸡首先接种含有孢子化卵囊的疫苗(A)。然后孢子化卵囊在鸡的消化道中被处理，该过程在图1B中更详细地示出。感染持续经历多个生命阶段，最终形成未孢子化卵囊，并从鸡的粪便中排出(B)。从鸡中排出后，未孢子化卵囊随后在环境中暴露于热、水分和氧气，并在几天的时间内孢子化(C)。卵囊只有在孢子化后才具有感染力。然后，这些孢子化卵囊被鸡摄入，重复该循环。

图1B是鸡体内艾美球虫卵囊摄取内部过程的放大图。框形区域示出了卵囊繁殖生命周期的简化图，其中包含四个孢子囊的孢子化卵囊破裂，释放出孢子囊(D)。每个孢子囊内有两个子孢子。鸡的肠道内的酶促反应消化了孢子囊壁的端帽(未示出)，释放出子孢子。然后，运动的子孢子以物种特异性的方式在肠道的不同区域中寻找并感染肠道细胞(E)。例如，在鸡中，堆形艾美球虫感染上肠，巨型艾美球虫感染小肠，而柔嫩艾美球虫感染盲肠。

子孢子感染肠道细胞后，寄生虫的生命周期将继续经历无性繁殖的几个阶段。这些周期由几轮繁殖和扩增组成，导致艾美球虫的数量在其选定的肠道区域内大幅增加。在无性繁殖阶段进行扩增后，发生有性繁殖并导致产生卵囊，然后，卵囊会脱落在鸡的粪便中，被另一只鸡食用，如图1A所示。

整个过程大约需要7天，准确的时间因物种而异。脱囊过程和随后入侵宿主细胞发生在第0天至第3天之间。无性繁殖周期发生在第3天和第5天之间。有性繁殖阶段和随后卵囊脱落在粪便中发生在第5天和第7天之间。

球虫病是家禽的常见疾病。球虫病通常通过饲料中的离子载体或化学药品来控制。由于各种原因，包括但不限于离子载体和化学药品的成本较高、离子载体和其他化学药品对环境的影响、消费者对无药家禽的需求以及耐药性球虫的发展，因此，人们目前正在寻求替代控制措施。球虫病疫苗可能会大大减少或消除饲料中对控制球虫病的离子载体或化学药品的需求。由于缺乏大规模疫苗接种的一致性，疫苗并未得到广泛使用。如目前所提供的，家禽的艾美球虫疫苗第一轮感染和免疫效率低下，并且通常导致大量未免疫群体易感疾病。随后未免疫群体依赖于养殖场循环来诱导免疫力。第一轮感染禽类的输出造成其它大量未免疫群体发生感染。在第一轮感染后的一段时间内，消除未免疫性会产生较高的卵囊产量，从而导致易发生继发性细菌感染(例如坏死性肠炎)，需要抗生素来消除。在孵化当天对所有禽类进行有效的疫苗接种可避免艾美球虫感染所致的发病率、死亡率和体重减轻。参见Karimpour的PCT公开WO 2017/083663A1。

目前，由于性能不佳，因球虫病发病率和死亡率而造成的全球损失估计为3亿美元。此外，估计美国在球虫病控制方面每年花费9000万美元，而全球花费30亿美元(5mEditor,2013,High Cost of Coccidiosis in Broilers,The Poultry Site,https:// thepoultrysite.com/news/2013/02/high-cost-of-coccidiosis-in-broilers)。

目前人们认为，通过将卵囊与鸡的砂囊中的沙砾和饲料接触进行研磨，有助于促进卵囊膜裂开的过程。在孵化场将卵囊输送给未接种疫苗或未免疫禽类，会导致疫苗接种效率低下，因为肠道内没有足够的饲料或砂砾，无法帮助卵囊壁破裂释放出孢子囊。因此，最好是将孢子囊直接输送给初生禽类，因为它们的消化系统中可能没有任何砂砾或食物来帮助卵囊壁破裂并释放出孢子囊。在孵化场将孢子囊直接输送给未免疫禽类可以提高疫苗接种的效率，因为疫苗即使在没有沙砾或食物的情况下也可能具有传染性。雏鸡确实有能力在肠道内将释放的孢子囊处理到感染的子孢子阶段。这种孢子囊疫苗策略可以免去发展完全免疫需要的循环和第二轮感染。

以前曾有一些尝试使卵囊壁破裂，以产生能以孢子囊疫苗形式制造和运输的疫苗溶液。例如，其他人已经公开了采用玻璃珠研磨或摇动卵囊。另外，欧洲专利2,111,243B1(Hutchins等人，Embrex公司)公开了使用微通道从卵囊释放孢子囊的方法。

然而，先前破坏卵囊膜的各种尝试都是在配制冷冻保存溶液、冷冻、储存、随后输送和解冻的背景下进行的。具体地说，先前生产基于孢子囊的疫苗的方法有一个缺点，即产生的孢子囊必须悬浮在冷冻保存液中并长期储存在液氮中。这些方法在寄生虫学中关于保存孢子囊形式的主种系的领域中是众所周知的。还应该了解的是，冷冻保存后活孢子囊的回收率很低，通常只有5-10％。实时产生和输送孢子囊不需要低温保存，也避免了活孢子囊回收率低的问题。

另一个挑战是在不破坏孢子囊的情况下破坏卵囊膜。当使用由多种艾美球虫组成的疫苗时，由于这些艾美球虫大小不同、其保护壁的厚度和耐久性也不同，因此，要在不破坏孢子囊的情况下破坏卵囊膜甚至变得更为困难。因此，较小的抗破裂物种(如堆形艾美球虫)破壁所需的条件可能会损坏先前释放的孢子囊，或者对于更易破裂的较大物种(如巨型艾美球虫)而言过于严格。

目前人们尚未尝试在输送时或在将新释放的孢子囊直接立即输送给指定受体的在线过程中破坏卵囊壁。

3.发明内容

本文的实施例涉及与原位释放孢子囊以改善疫苗接种有关的系统和方法。本文所述的一些实施例涉及破坏卵囊膜并将膜及其内容物活孢子囊输送至动物的系统和方法。

本文所述的其它实施例涉及以两部分输送以形成凝胶混合物的卵囊溶液。参见Hutchins 2019年7月10日提交的PCT申请___，代理案卷号No.673-04-PCT。

一个实施例涉及一种给动物接种疫苗抵抗艾美球虫的方法。该方法包括以下步骤：提供基于卵囊的溶液，使活的孢子囊从卵囊中释放出来，并将包含释放的孢子囊的溶液输送至动物。

另一个实施例涉及一种使卵囊外膜破裂并随后实时将其输送至动物的系统。所述系统包括容纳未破裂卵囊溶液的容器、卵囊处理室和输送出口。未破裂的卵囊从容器中移动穿过处理室，部分卵囊膜被破坏，释放出孢子囊。所得溶液从处理室移至输送出口，在此处将溶液输送至动物。

另一实施例涉及在将卵囊输送到动物时使卵囊破裂的方法。所述方法包括以下步骤：提供容纳一定体积的未破裂卵囊溶液的第一容器、处理室和输送装置。所述方法进一步包括将未破裂卵囊溶液从第一容器移到处理室中，并使溶液通过处理室，从而至少一部分孢子囊被释放到溶液中。所述方法还包括将溶液从处理室移动到输送装置，在该装置中，含有释放的孢子囊的经处理溶液被输送到动物。

还有一个实施例涉及一种将卵囊溶液输送到动物的系统。

本发明方法接种疫苗的优选经济禽类是鸡。

给鸡施用的优选组合物包括一个物种或多个物种的艾美球虫的孢子囊或孢子囊与卵囊的混合物，所述艾美球虫选自以下组：柔嫩艾美球虫、堆形艾美球虫、巨型艾美球虫、毒害艾美球虫、和缓艾美球虫、早熟艾美球虫、哈氏艾美球虫、变位艾美球虫和布氏艾美球虫。

本发明方法接种疫苗的另一种优选经济禽类是火鸡。给火鸡施用的优选组合物包括一个物种或多个物种的艾美球虫的孢子囊或孢子囊与卵囊的混合物，所述艾美球虫选自以下组：火鸡和缓艾美球虫、腺样艾美球虫、孔雀艾美球虫、分散艾美球虫、珠鸡艾美球虫、无毒艾美球虫、亚圆艾美球虫。

4.附图说明

概括地描述了本发明的各种实施例之后，现在将参考附图进行描述，这些附图没有按比例绘制并且未包括系统的所有组件。

图1A是艾美球虫卵囊和疫苗生命周期的图示。

图1B是鸡中艾美球虫卵囊生命周期的图示。

图2是第一实施例(高压均质机)的示意图。

图3是第一实施例的处理系统的放大图。

图4是第二实施例(珠(bead)处理)的示意图。

图5是第三实施例(超声处理)的示意图。

图6是第四实施例(转子-定子混合器)的示意图。

图7是第五实施例(振动板)的示意图。

图8是第六实施例(水力空化)的示意图。

图9是第七实施例(高压喷雾)的示意图。

5.具体实施方式

下面将参考附图更全面地描述本发明的各个方面，附图中示出了本发明的一些方面，但并非所有方面。事实上，本发明可以以许多不同的形式实施，并且不应被解释为限于此处所阐述的各个方面，相反，提供这些实施例是为了使本发明公开充分和完整，并将本发明的范围充分传达给本领域技术人员。

在整篇发明中，类似的数字表示类似的元件。在附图中，为了清晰起见，可以放大某些线的粗细度、各个层、组件、元件或特征。本文提到的所有出版物、专利申请、专利和其它文献都通过引用而纳入本申请中。

5.1.定义

本文使用的词语仅仅是为了描述特定实施例，并不是用于限制本发明。

本文所述词语“艾美球虫”是指并且包括感染鸡的艾美球虫种属，包括巨型艾美球虫、和缓艾美球虫、柔嫩艾美球虫、堆形艾美球虫、布氏艾美球虫、毒害艾美球虫、早熟艾美球虫、哈氏艾美球虫、变位艾美球虫及它们的任何组合。艾美球虫包括感染火鸡的种属，例如火鸡和缓艾美球虫、腺样艾美球虫、孔雀艾美球虫、分散艾美球虫、无毒艾美球虫、珠鸡艾美球虫、亚圆艾美球虫及它们的任何组合。艾美球虫还包括感染牛的种属，例如邱氏艾美球虫、牛艾美球虫、椭圆艾美球虫及它们的任何组合。艾美球虫还包括阿沙塔艾美球虫、巴库艾美球虫、槌状艾美球虫、福氏艾美球虫、颗粒艾美球虫、错乱艾美球虫、马耳斯卡艾美球虫、类绵羊艾美球虫、苍白艾美球虫、小型艾美球虫、威布里吉艾美球虫及它们的任何组合。此外，词语艾美球虫包括肠艾美球虫、维氏艾美球虫、梨形艾美球虫、盲肠艾美球虫、无残艾美球虫、黄艾美球虫、微小艾美球虫、大型艾美球虫、穿孔艾美球虫、中等艾美球虫、啮齿艾美球虫及它们的任何组合。

词语“动物”和“动物受试者”包括但不限于哺乳动物和/或禽类受试者。合适的哺乳动物受试者包括但不限于灵长类受试者(例如，人类受试者和非人类灵长类受试者，如猿猴)、猪、牛科动物(例如牛)、山羊、马、猫科动物、绵羊、犬科动物、鼠科动物(例如，小鼠、大鼠)和兔形目动物受试者。

本文使用的词语“禽类”和“禽类受试者”(即“鸟类”和“鸟类受试者”)旨在包括任何禽类物种的雄性和雌性，但主要包括商业饲养提供蛋、肉的家禽或宠物家禽。因此，词语“禽类”和“禽类受试者”特别包括但不限于鸡、火鸡、鸭子、鹅、鹌鹑、雉鸡、长尾鹦鹉、鹦鹉、凤头鹦鹉、鸵鸟、鸸鹋等。在具体实施例中，所述禽类受试者是鸡或火鸡。

本文所述的溶液实时输送是指卵囊膜被破坏或破裂从而使其中的内容物不再包含在卵囊膜内的系统或方法。本文所述的系统和方法应理解为在室温下大约24小时内或在冷藏条件下5天内输送。在孵化场，疫苗通常是在4到8小时轮转的过程中通过一个系统引入、储存和输送。

本文所述词语“卵囊减少百分数”定义为卵囊膜破坏从而释放包括孢子囊的内部成分。例如，卵囊减少90％的结果是剩余10％卵囊及90％卵囊转化为释放的孢子囊。

本文所述词语“整理”或“梳理”定义为鸡或其他动物自己或由另一动物用嘴整理摄取卵囊或其他材料，并随后消耗被整理的材料而引发感染的行为。

在疫苗感染性的背景下，本文所述词语“摄取”、“摄取百分比”或“％摄取”定义为接种疫苗后已经显示出顶复门(包括但不限于艾美球虫)感染阳性的受试者。

在本发明中，除非上下文中清楚表明，否则，单数形式“一”、“这个”也包括复数形式。应该进一步理解的是，在本说明书中，词语“包括”和/或“包含”指的是存在指定的特征、步骤、操作、元件和/或部件，但并不排除存在或加入一个或多个其它特征、步骤、操作、元件、部件和/或它们的组合。本发明可以适当地“包括”、“由”或“基本上由”权利要求中所述的步骤、元件和/或试剂组成。

还应指出的是，权利要求书编制时排除了任何可选要素。这样，此陈述旨在作为与权利要求要素的叙述结合使用诸如“仅”、“只”等排他性术语或使用“否定”限制的先行基础。

本文所述词语“和/或”包括一个或多个相关列出项目的任何和所有组合。本文所述词语诸如“在X和Y之间”和“大约在X与Y之间”之类的词语应被解释为包括X和Y。本文所述诸如“大约在X和Y之间”之类的词语是指“大约X与大约Y之间”。本文所述诸如“从大约X到Y”的词语表示“从大约X到大约Y”。

除非特别规定，本发明使用的所有术语(包括技术名词和科学术语)的意义与本发明所属领域技术人员通常理解的相同。应该进一步理解的是，除非本发明明确定义，词语，例如常用字典中定义的词语，其意义应与其在本说明书和相关领域背景中的意义一致，不应解释为理想化的或过度正式的意义。为了简洁和/或清楚起见，可能没有详细描述众所周知的功能或构造。除非另外特别指出，否则操作(或步骤)的顺序不限于权利要求或附图中呈现的顺序。

在整个说明书中，词语“大约”和/或“近似”可以与数值和/或范围结合使用。词语“大约”应理解为是指接近所述值的那些值。例如，“大约40[单位]”可表示在40的±25％范围内(例如，从30到50)，在±20％、±15％、±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％、±1％、小于±1％或其中或其下的任何其他值或值范围的范围内。或者，根据上下文，词语“大约”可能指的是±半个标准偏差、±一个标准偏差或±两个标准偏差。此外，短语“小于大约[数值]”或“大于大约[数值]”应根据本文提供的词语“大约”的定义来理解。词语“大约”和“近似”可互换使用。

在整个说明书中，对某些数量提供了数值范围。应该理解的是，这些范围包括其中的所有子范围。因此，范围“从50到80”包括其中所有的可能范围(例如，51-79、52-78、53-77、54-76、55-75、60-70等)。此外，在给定范围内的所有值可以是由此涵盖的范围的端点(例如，范围50-80包括端点范围，例如55-80、50-75等)。

除非特别规定，本发明使用的所有词语(包括技术名词和科学术语)的意义与本发明所属领域技术人员通常理解的相同。描述了优选的方法、装置和材料，但是，与本文描述的那些方法或材料相似或等同的任何方法和材料都可以用于本公开的实践或测试中。本文公开的所有参考文献通过引用而全文纳入本发明中。

5.2.具体实施例

5.2.1.第一实施例-高压均质化

第一实施例10如图2所示。第一实施例10包括第一储器12。第一储器12被设计成容纳一定量的溶液14。溶液14包括悬浮在溶液中的疫苗(未示出)。第一实施例10的溶液14包括向家禽(即初生家禽)输送的基于艾美球虫卵囊的疫苗。任选溶液14包括蛋白水解酶。蛋白水解酶能够使疫苗在初生家禽的消化道中更有效地吸收，这将在下面进行更详细的说明。

关于溶液14，本文所述实施例包括但不限于艾美球虫卵囊，选自由巨型艾美球虫卵囊、和缓艾美球虫卵囊、柔嫩艾美球虫卵囊、堆形艾美球虫卵囊、布氏艾美球虫卵囊、毒害艾美球虫卵囊、早熟艾美球虫卵囊、哈氏艾美球虫卵囊、变位艾美球虫卵囊及它们的任何组合组成的感染鸡的群组；选自由火鸡和缓艾美球虫卵囊、腺样艾美球虫卵囊、孔雀艾美球虫卵囊、分散艾美球虫卵囊、无毒艾美球虫卵囊、珠鸡艾美球虫卵囊、亚圆艾美球虫卵囊及它们的任何组合组成的感染火鸡的群组的艾美球虫卵囊；选自由邱氏艾美球虫卵囊、牛艾美球虫卵囊、椭圆艾美球虫卵囊及它们的任何组合组成的感染牛的群组的艾美球虫卵囊；选自由阿沙塔艾美球虫卵囊、巴库艾美球虫卵囊、槌状艾美球虫卵囊、福氏艾美球虫卵囊、颗粒艾美球虫卵囊、错乱艾美球虫卵囊、马耳斯卡艾美球虫卵囊、类绵羊艾美球虫卵囊、苍白艾美球虫卵囊、小型艾美球虫卵囊、威布里吉艾美球虫卵囊及它们的任何组合组成的艾美球虫卵囊；及选自由肠艾美球虫卵囊、维氏艾美球虫卵囊、梨形艾美球虫卵囊、盲肠艾美球虫卵囊、无残艾美球虫卵囊、黄艾美球虫卵囊、微小艾美球虫卵囊、大型艾美球虫卵囊、穿孔艾美球虫卵囊、中等艾美球虫卵囊、啮齿艾美球虫卵囊及它们的任何组合组成的艾美球虫卵囊。

本文的实施例涉及用于从卵囊释放孢子囊的系统和方法。卵囊可以来自感染任何动物受试者，包括哺乳动物和禽类受试者的原生动物。

本文所述的一些实施例还涉及从原生动物卵囊释放子孢子的方法。尽管本申请侧重于艾美球虫，但其他一些原生动物构成称为“卵囊”的生命阶段，但可能在卵囊内包含子孢子，不会产生孢子囊。可以实施这些实施例，从卵囊内含有子孢子的任何种类的寄生虫卵囊中释放子孢子，并且将包括顶复门中的任何生物，并且还将包括但不限于隐孢子虫和疟原虫。词语“原生动物”、“卵囊”、“孢子囊”、“子孢子”和“裂殖子”具有本领域公认的含义。除非另有说明，否则这些词语指的是活的(即有生命的)原生动物、卵囊、孢子囊、子孢子和裂殖子，包括野生型或减毒形式。本发明还包括基因修饰的原生动物、卵囊、孢子囊、子孢子和裂殖子。

回到图2和第一实施例10，第一储器进口16固定到第一储器12的顶部。第一储器进口16将溶液14接收到第一储器12中。第一储器出口18固定到第一储器12。第一储器出口18与系统泵20连接。泵20设计为将溶液14从第一储器12输送并通过系统。

泵出口22固定在泵20和处理系统24之间。第一实施例10的处理系统24是高压均质机32。如图3所示，均质机32包括由压力阀28控制的高压源26和至少一个孔34。如图2所示，处理系统24还包括处理系统出口38。处理系统出口38位于处理系统内与处理系统进口36相对的一端。处理系统出口38通过第二储器进口42与第二储器40连接。第二储器40设计为容纳通过第二储器进口42接收的一定量的溶液。

第二储器40还包括第二储器出口44。第二储器出口44与输送装置46流体连接。在该第一实施例10中，输送装置46是雾化喷雾器。输送装置46具有输送进口48、喷嘴50及位于喷嘴50处的空气进口54，以在输送期间雾化喷雾羽流。空气进口54与气压源56流体连接。或者，输送装置46可以是液压喷嘴等。

在使用中，泵20被启动，从而通过第一储器出口18将溶液14从第一储器12输出，并通过处理系统进口36输送到处理系统24内。尽管采用泵来输送溶液，但是在任何实施例中，也可以采用包括重力、阀、气压和其他方法来输送流体。高压均质机32供应的高压空气用于使溶液14通过至少一个孔34。高压空气的压力超过500psi，优选为500至6000psi。

当溶液14在高压下移动通过孔34时，卵囊受到剪切力作用，卵囊膜将被破坏或破裂。溶液14通过孔34后，通过出口38离开均质机32，并通过进口42进入第二储器40。膜被破坏或破裂的每个卵囊都会导致游离的孢子囊释放到改良溶液52中。改良溶液52(释放的孢子囊和残留卵囊的组合物)被暂时储存在第二储器40中直到输送。

当改良溶液52准备好输送时，将改良溶液从第二储器40泵送通过第二储器出口44进入输送进口48。将改良溶液52泵入喷嘴50并与来自增压空气源56的增压空气混合。增压空气在喷嘴50处将改良溶液52雾化，以预定喷雾形式将预定体积的改良溶液输送到动物的特定目标。

在替代布置中，高压均质机32可以直接与输送装置46连接。这样，由均质机32产生的溶液直接经输送装置46输送，而不是临时储存在第二储器40中。

应该指出的是，本文描述的与卵囊破坏有关的实施例旨在实时输送。任何基于孢子囊的人工疫苗都需要冷冻保护剂来保持孢子囊的活力，以便长期保存，并采用液氮冷链进行输送。本文描述的涉及卵囊膜破裂以释放活的孢子囊的实施例并不需要冷冻保护剂溶液或任何其他特殊储存条件，例如冷冻保存。

喷雾被引导接触动物的预定位置。该系统设计为靶向动物的面部粘膜，尤其是眼睛或嘴巴。参见Karimpour的PCT公开WO 2017/083663A1。但是，应该理解的是，喷雾可以设计为靶向动物身体的其他部位。尽管已经认识到本文所述的实施例适用于所有动物，但是重点是输送影响家禽(特别是鸡，更特别是初生禽类)的艾美球虫。改良溶液中的游离孢子囊能够迅速进入初生禽类的消化道。孢子囊喷洒到禽类的眼睛、鼻腔或嘴中进入消化道。喷洒在禽类身体其他部位(如羽毛)的孢子囊可能通过整理(包括自己整理或其它禽类整理)而进入消化道。

肠道中的蛋白水解酶(包括胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶)，例如，消化孢子囊尖端的斯氏体，从而使传染性子孢子发生脱囊。这使小鸡能够迅速被艾美球虫感染，从而产生免疫反应。

应该理解的是，高压均质机24(或以下详细描述的其他处理系统)不必与系统连接，从而允许离线进行处理并输送至容器40。用高压均质机24或其他系统处理疫苗可以在喷雾输送系统之外进行，但与制备要在孵化场输送的疫苗实时同步。

5.2.2.第二实施例-珠子处理

本发明的第二实施例60如图4所示。与第一实施例10相似的部分将用相似的数字表示。第二实施例60包括第一储器12，其具有进口16和出口18，并容纳一定量的溶液14。第二实施例60还包括泵20和压力源26。

第二实施例60还包括第二处理系统62。第二处理系统62包括能够容纳一定量溶液14的容器64。容器64具有进口36和出口38。容器64还包含一定量的搅拌器70，例如玻璃、陶瓷或金属珠等。应当注意的是，搅拌器70可以是球形珠粒，或者是任何其他形状和材料，当在一定体积中进行搅拌时，它们能够压碎、粉碎或破坏该体积中所含的溶液。容器64水平安装、垂直安装或成一定角度从而围绕其轴旋转。容器64与旋转器72连接，所述旋转器能够使容器64在其水平轴上旋转。旋转器72还具有振动特征，使其在被启动时能够振动或摇动容器。在使用中，溶液14在暴露于容器64中的搅拌器之后，产生第二改良溶液74，下面将对此改良溶液74进行更详细地描述。

第二处理系统62的出口38通过进口42与第二储器40连接。正如在第一实施例10中一样，第二储器出口44连接到输送装置46，在此处，容易最终被输送到动物体内。

输送装置46包括具有阀的进口48，以控制流到进口48的第二改良溶液74的流量。应当注意的是，输送装置46可以改变，从而改变喷雾方式，产生更多或更少的雾化或从喷嘴50直接向动物提供稳定的流体流。

第二实施例60的替代布置类似于上面提及第一实施例10时的替代布置。可以预见，第二实施例60可以设计为将第二改良溶液74直接输送到喷嘴50，从而不再需要第二储器40。

使用时，当泵20和压力源26被启动时，泵通过储器出口18将溶液14从第一储器12输入到第二处理系统62。第二处理系统62通过旋转器72沿其轴转动。此外，旋转器72使容器64振动和/或摇动。振动和旋转导致搅拌器70撞击内部容器壁并从其弹回，导致溶液中的至少一些卵囊膜破裂，从而释放出其中包含的孢子囊。溶液14中破裂的卵囊膜和活的孢子囊形成第二改良溶液74。将得到的第二改良溶液74从容器64中泵送到第二储器40中，暂时容纳在此处直至输送。

当需要输送时，将第二改良溶液74从第二储器40泵送到输送装置46。将第二改良溶液74从输送装置进口48泵入喷嘴50，并与来自压力源56的增压空气混合。增压空气在喷嘴50处将第二改良溶液74雾化，以预定喷雾形式将预定体积的改良溶液74输送到动物(在此实施例中，是初生动物)的特定目标。

在第二实施例60的替代布置中，第二改良溶液74直接从容器64泵送到喷嘴50和初生动物的面部粘膜。刚破裂的卵囊膜和释放出的孢子囊被初生动物摄入并迅速感染消化道。初生动物能够迅速对艾美球虫产生免疫反应，并保持健康。

5.2.3.第三实施例-超声处理

除了第三实施例的处理系统81之外，第三实施例80与上述的第一实施例10和第二实施例60类似。图5所示的第三实施例80包括第一储器12和泵20。第三实施例80还在容器112内包括超声探头110。超声探头110还包括电源(未示出)。超声处理可以通过将探头直接放置在溶液中或通过放置在容器外面的间接超声源而进行。间接源可以是在充满水的槽中的超声处理源。词语超声发生器包括超声探头和容器外部的间接源。

溶液14中液体悬浮的卵囊通过紧邻超声探头110的容器112，超声探头110在启动时振动。振动的优选范围是大约18kHz至1MHz之间。传递给溶液14的能量产生气蚀循环，使至少一些卵囊膜破裂。控制振动频率和通过系统的流速，从而使卵囊膜破裂而活的孢子囊完好地离开容器112。如以上关于第一实施例10和第二实施例60及其替代方案所述，第三实施例溶液114或者直接输送到输送装置46(如喷雾器)，或者输送到容纳容器中(如第二储器40)。

在第三实施例80的替代布置中，第三改良溶液114直接从容器112泵送到喷嘴50和初生动物的面部粘膜。刚释放出的孢子囊和残留的卵囊被初生动物摄入并迅速感染消化道。初生动物能够迅速对艾美球虫产生免疫反应，并保持健康。

许多商业供应商提供不同配置的超声发生器。供应商的实例包括Qsonica公司(康涅狄格州牛顿市)和Hielscher Ultrasonics公司(德国Teltow)。

5.2.4.第四实施例–转子-定子混合器

第四实施例120在容器122内使用转子/定子混合器处理系统116，如图6所示。转子/定子混合器116中具有高速旋转的分散头或发生器124。第四实施例120还包括第一储器12、泵20及与转子/定子混合器116流体连通的输送装置46。

使用时，转子/定子混合器116被启动，导致分散头或发生器124高速旋转。混合器116从第一储器12接收溶液14。溶液14暴露于高速旋转的分散头或发生器124。由于混合器116内部产生的力，导致至少一些卵囊膜被剪切，从而释放至少一些孢子囊。所得溶液118被输送到输送装置46，在此处被输送至动物。如上所述，第四实施例120的替代布置将包括第二储器40以接收溶液118，溶液118随后被输送到初生动物。

5.2.5.第五实施例-振动板

第五实施例140在图7中示出，除了处理系统146之外，其与上述的第一实施例10、第二实施例60、第三实施例80和第四实施例120相似。第五实施例140包括第一储器12和泵20。第五实施例140包括在容器147内由一对板144、145组成的第五处理系统146。板144、145一个安装在另一个上面，两者之间留有一些空间。第一块板144是平坦的，并且与振动机构(未示出)连接。振动机构使板144振动。第二块板145可根据需要具有不同程度的平滑度或粗糙度，从而使卵囊膜通过板144和145之间时被破坏。当板144、145一个在另一个上面时，第二块板145与第一块板144接触。

使用时，溶液14被输送到第五处理系统146内。溶液14被引导在板144、145之间流动。启动振动机构，从而使第一块板144相对于第二块板145振动。当溶液14在板144、145之间流动时，溶液14中卵囊的至少一些膜在它们穿过两个板之间时被破坏，从而形成改良溶液148。改良溶液148可以直接输送到输送装置46，或可以输送到容纳容器，如第二储器40。

5.3.第六实施例-水力空化

第六实施例150描述了由于局部压力降低和然后升高而在液体中发生汽化、产生气泡和气泡内爆的过程。如果压力降到液体的饱和蒸气压以下，然后恢复到高于蒸发点，就会发生空化现象(即液体中压力快速变化导致形成小的充满蒸气的空腔，当压力升高时，这些空腔发生塌陷的一种现象)。这种现象可以利用液体通过狭窄的通道发生。气泡的生成过程以及随后空化气泡的生成和破裂会导致高能量密度以及气泡表面上的压力。在最初的研究中，探索了用氮气空化，但是任何气体都可以产生类似的结果。在此实例中，氮气在压力下溶解在目标生物(艾美球虫)的细胞质中。与环境达到平衡后，将目标悬浮液突然暴露于压力变化，从而在艾美球虫的细胞质中形成氮气泡。细胞内气泡形成和随后气泡膨胀的过程导致细胞膜拉伸并最终破裂。这些气泡由于冒泡而损坏细胞的外部(由于压力下降导致气体从水溶液中逸出，可能导致泡沫产生以及细胞裂解)。当在艾美尔球虫的多种卵囊悬浮液中进行测试时，观察到卵囊外壁裂解并随后释放出内部孢子囊。该过程通常在加压容器中进行。该容器由能承受高压的厚不锈钢外壳组成，带有输送气体的进口及配备可调节排放阀的出口。

第六实施例150在图8中示出，除了第六处理系统154之外，其与上述的第一实施例10、第二实施例60、第三实施例80、第四实施例120和第五实施例140相似。第六实施例150包括第一储器12和泵20。第六实施例150包括第六处理系统154，其由带压金属外壳152和进气阀156组成。带压金属外壳152通过加气连接器158与气罐源160连接。气体通过加气连接器158进入进气阀156，其中气体使金属外壳154中存在的水溶液(未显示)饱和。溶液以类似于先前实施例的方式通过进口36进入外壳。调节器(未显示)用于控制气流产生的压力，以达到最佳饱和度。

使用时，溶液14被输送到第六处理系统154内。然后将第六处理系统154密封并加压。当罐160将氮气释放到密封的加压罐152中时，氮气在压力下溶解到卵囊的细胞质中。在与环境达到平衡之后，停止来自罐160的氮气流，并且解除外壳152的密封。由于压力突然变化，卵囊的细胞质内发生水力空化，导致至少一些外膜被破坏，并释放出内部内容物，即孢子囊。这样就形成了改良溶液162，其直接输送到输送装置46，或输送到容纳容器，如第二储器40。

5.4.第七实施例-高压喷雾

一种剪切卵囊并释放完好孢子囊的方法可以包括将卵囊悬浮液高速喷洒到静态物体上，从而冲击力使卵囊壁破裂而释放出活的孢子囊。另外，可以将卵囊的悬浮液喷洒到移动目标(如转盘)上，从而利用力的组合剪切卵囊。可以调节喷雾悬浮液的速度和转盘的速度来优化剪切过程。可以改变转盘的表面特征，从而产生剪切卵囊所需的不同程度的光滑度或粗糙度。

第七实施例170在图9中示出，除了第七处理系统172之外，其与上述的第一实施例10、第二实施例60、第三实施例80、第四实施例120、第五实施例140和第六实施例150相似。第七实施例170包括第一储器12和泵20。第七实施例170包括第七处理系统172，其包括喷嘴178或其他系统以输送高压喷雾或流体流。流体将从喷嘴中喷出，并撞击在固定的固体表面(例如容器174的壁或转板176)上。

使用时，溶液14被输送到第七处理系统172内。溶液14被引导流过喷嘴178。溶液14撞到容器174的壁或转板176上的冲击力将至少破坏一些卵囊膜，得到改良溶液180。改良溶液180可以直接输送到输送装置46，或可以输送到容纳容器，如第二储器40。

5.5.其它实施例

还应当理解的是，尽管上述实施例通常将泵作为使输送溶液通过系统的装置，但是可以预见也可以使用其他手段，例如高压空气和重力。

还应该理解的是，尽管这些实施例重点关注的是基于卵囊和孢子囊的溶液，但是本文所述的溶液可以包含其他活疫苗，包括由病毒、细菌、酵母、哺乳动物细胞、植物细胞或任何基因修饰的生物组成的那些活疫苗。对于本领域技术人员显而易见的是，根据疫苗的特定特性，包含任何所述病毒、细菌等的溶液可能适合不同的实施例。

本文所述的系统和方法证明，使用刚从破裂的卵囊中释放出来，然后通过喷雾输送以引发艾美球虫感染的孢子囊可以提高疫苗反应的效率。我们已经完成了使用上述系统和方法的一系列实验。结果如下。与基于卵囊的疫苗相比，在接种疫苗时产生孢子囊和输送基于孢子囊的疫苗的优势出乎意料地明显，并且在受体中产生高于预期的反应效果。

应当理解的是，虽然本文所述的溶液是基于艾美球虫卵囊的疫苗，但是可以预见的是，也可以使用本文所述的系统和方法来输送其他基于卵囊的疫苗。虽然优选的实施例主要涉及用于鸡和火鸡的艾美球虫疫苗，但是本领域的普通技术人员会认识到涉及用于哺乳动物(如牛、山羊、兔子或绵羊)的艾美球虫疫苗的其他实施方案。而且，本文公开的技术可用于任何物种的改良顶复门疫苗，无论这种疫苗是野生型还是减毒型。

本文公开的系统和方法可以适于在水产养殖中使用。感染鱼类的艾美球虫的例子包括但不限于E.aurati、E.baueri、E.lepidosirenis、E.leucisci、E.rutili和E.vanasi。在适当的情况下，可以对这些物种进行破裂过程，以促进为疫苗接种目的释放更多的感染性生命阶段。

还应指出的是，本文所述的所有实施例可单独或整体应用于动物。应当理解的是，本文所述的实施例可以应用于装在板条箱或其他容器中并接受水溶液输送的大量的初生动物或其他动物。所述输送可以是混合时形成凝胶的双组分水溶液形式。参见发明人JamesHutchins于2019年7月10日提交的PCT申请，序列号为______，代理人案卷号为673-04-PCT。5.6.以艾美球虫为载体输送重组蛋白

本文公开的方法和系统可以与重组修饰的艾美球虫一起使用，作为输送其他抗原的载体。包含破坏的细胞物质的禽类或其他动物的疫苗可以通过本文所述的系统和方法施用，包括源自病毒感染细胞的疫苗或源自用于产生天然或重组蛋白产物或亚细胞片段(如哺乳动物细胞、植物细胞、真菌细胞、酵母细胞或细菌细胞)的细胞系的疫苗。

最近的研究表明，艾美球虫可以成功转染并用于表达外源抗原。可以预期，这些抗原可以包括病毒、细菌或影响家禽疾病的其他抗原或其他蛋白质或序列，以刺激免疫系统单独使用或与抗原结合使用。另外，可以表达来自其他艾美球虫物种的抗原，从而允许通过施用单种艾美球虫对多种艾美尔球虫进行交叉保护。例如，Clark等和其他人的研究结果表明，艾美球虫寄生虫可以作为多价疫苗载体开发，并鼓励了这些研究的扩展。参见Clark etal.,2012,Eimeria species parasites as novel vaccine delivery vectors:Anti-Campylobacter jejuni protective immunity induced by Eimeriatenella-deliveredCjaA,Vaccine 30(16)2683-2688；Yanet al.,2009,Stable transfection ofEimeriatenella:Constitutive expression of the YFP-YFP molecule throughout thelife cycle,Int’l Journal for Parasitology,39(1)109-117；及Marugan-Hernandezetal.,2016,Viral proteins expressed in the protozoan parasite Eimeria tenellaare detected by the chicken immune system,Parasites&Vectors 9:463(pub.Aug.26,2016,14页)。类似地，艾美球虫或其他顶复门可以被设计为载体，用于将其他抗原递送到特定的宿主。

下述实施例进一步阐明本发明，但并非限制本发明的范围。应该理解的是，本发明不限于所描述的特定实施例，因为这些实施例当然可以变化。还应该理解的是，本文所用的术语仅用于描述具体的实施例，而不是用于限制本发明的范围，本发明的范围仅受所附权利要求书的限制。

6.示例

6.1.管饲法(卵囊vs.孢子囊)

口服管饲，即经口输送，被认为是将卵囊输送给禽类的金标准。在使用商品肉鸡疫苗的研究中，经口管饲的结果比预期的更变化多端。具体而言，以下结果表明，管饲法输送卵囊的感染性在艾美球虫各物种之间以及在测试日期之间差异很大。鉴于这一观察结果，我们测试了眼睛施用方式(滴眼)，作为阳性对照的替代施用方式。此外，我们发现，采用管饲法输送时，破坏卵囊释放出孢子囊更有效。卵囊膜的破坏是通过人工摇动带有4mm玻璃珠的多种卵囊悬浮液来完成的。假设初生动物在其嗉囊中需要饲料来破碎卵囊。在实验环境和正常孵化场中，由于储存和运输，初生动物在3到8个小时内不接收食物，从而使卵囊未经处理就通过了肠道。通过滴眼接种疫苗可能会减慢卵囊到达肠道的运动，并使卵囊暴露于不同的酶。

接种前卵囊膜的机械破坏使孢子囊更容易处理，从而导致更大比例的禽类得到了有效的疫苗接种，并且在第7天检测到更高水平的卵囊产生(输出)。与更小的物种，例如堆形艾美球虫相比，这一点对于较大的物种，例如巨型艾美球虫，和中等的物种，例如柔嫩艾美球虫，似乎更为重要。较小的物种在破裂与不破裂时似乎都具有相同的感染力。这项研究的重点是破坏较大卵囊的膜，然后破坏中等卵囊的膜。在孵化当天，给肉鸡接种1倍剂量的商业疫苗。在第7天收集每只鸡的肠中内容物，并通过McMaster的腔室按种类对卵囊进行计数。

表1：卵囊或孢子囊管饲法的感染性比较

随着时间的推移，管饲疫苗接种会导致感染力不一致，如第7天的结果差异较大所示。我们注意到，处理成释放孢子囊的疫苗以及滴眼输送的疫苗，呈现出更可喜的结果。

6.2.管饲卵囊vs.孢子囊

在另一个实验中，卵囊破裂是通过手动操作用4mm玻璃珠摇动多种卵囊悬浮液来完成的。对剩余的卵囊进行计数，结果表明，大约64％的巨型艾美球虫卵囊转化为孢子囊，51％的柔嫩艾美球虫卵囊转化为孢子囊，而17％的堆形艾美球虫卵囊转化为孢子囊。经口管饲法给初生鸡(每次处理15只)接种卵囊或包含残留卵囊的经玻璃珠处理释放的孢子囊，并在第7天收集肠道中的内容物。

表2：管饲卵囊或含残留卵囊的孢子囊的反应频率和幅度的比较

上面显示的反应频率的改善是孢子囊和卵囊处理感染的鸡的百分数之间的差异。反应幅度的改善是孢子囊处理的每只鸡的卵囊产量除以卵囊处理的每只鸡的卵囊产量。

在这种特定情况下，与基于卵囊的疫苗相比，口服含残留卵囊的孢子囊疫苗的雏鸡的反应频率和反应幅度均增加。

经观察，管饲鸡的感染率各不相同，这引发了人们对孵化场使用卵囊疫苗的有效性的质疑。孵化场中使用基于卵囊的疫苗的鸡在消化道中缺乏食物和粗砂，这些对于将巨型艾美球虫卵囊处理为孢子囊阶段可能尤其重要。如果这样的话，这些鸡在第一轮感染期间将存在较低水平的巨型艾美球虫感染风险。随之而来的是，在第二轮感染过程中，大量未免疫鸡群将面临极高的感染和输出风险，另外还存在受损肠组织继发细菌感染的风险。实际上，这种情况经常发生，并且是有些孵化场不接种疫苗而在饲料中使用抗球虫药和化学药品的主要原因之一。在孵化场通过眼喷雾剂施用基于孢子囊的疫苗有可能显著改善第一轮感染期间巨型艾美球虫的感染力，从而避免养殖设施发生严重的球虫病感染和在第二轮感染期间发生继发感染的风险。

6.3.滴眼卵囊vs.孢子囊

在另一个实验中，卵囊膜破裂是通过手动操作用4mm玻璃珠摇动多种卵囊悬浮液来完成的。对剩余的卵囊进行计数，结果表明，大约52％的巨型艾美球虫卵囊转化为孢子囊，26％的柔嫩艾美球虫卵囊转化为孢子囊，而47％的堆形艾美球虫卵囊转化为孢子囊。经滴眼施用给初生鸡(每次处理15只)接种卵囊或经玻璃珠处理释放的孢子囊和残留卵囊，并在第7天收集肠道中的内容物。

表3：滴眼施用卵囊或含残留卵囊的孢子囊的反应频率和幅度的比较

我们发现，孢子囊处理组对巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫的反应频率和幅度均得到了改进的结果。未处理的对照鸡的肠中内容物未观察到卵囊。

6.4.喷雾输送孢子囊

在以下一组实验中，通过用手摇动含4mm玻璃珠的多种卵囊悬浮液来释放孢子囊。通过对剩余卵囊进行计数，可以计算出该过程至少将66％的大卵囊(巨型艾美球虫)转化为孢子囊，将75％的中等卵囊(柔嫩艾美球虫)转化为孢子囊，将13％的小卵囊(堆形艾美球虫和其它小物种)转化为孢子囊。将初生雏鸡(每次处理15只)保持在固定位置，并从装置采用未处理的卵囊或玻璃珠释放的孢子囊进行喷雾处理，如上所述。喷雾是通过空气雾化喷嘴施用的，所述喷嘴利用液体和气压面对雏鸡面部粘膜。然后给这些鸡食物和水，使其成长7天，然后处死以收集每只鸡肠中的内容物。以下是与这些相应的喷雾疫苗接种实验相关的数据表。

表4：研究A喷洒卵囊或孢子囊的鸡的反应频率和幅度

表5：研究B喷洒卵囊或孢子囊的鸡的反应频率和幅度

表6：研究C喷洒卵囊或孢子囊的鸡的反应频率和幅度

通过对卵囊计数发现，孢子囊处理可以改善感染的频率和反应的幅度。

在所有三个实验中，未处理的对照鸡的肠道内容物中均未观察到卵囊，而通过滴眼接种的阳性对照的感染率和幅度均高于实验喷雾处理组。

应当理解的是，表4、5和6中列出的结果是出乎意料的。这些结果表明，在雏鸡中通过孢子囊疫苗接种的疫苗摄入量高于预期。我们认为，这部分归因于雏鸡无法正确处理消化道中未破裂的卵囊。雏鸡中孢子囊的感染表明，大量的雏鸡能够处理并感染孢子囊，但不能被卵囊感染。对于巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫来说，这种效果比堆形艾美球虫更为明显。因此，我们认为，由于雏鸡的上消化系统(包括嗉囊和砂囊)缺乏磨料，因此不易破坏巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫卵囊。孢子囊在鸡的消化系统中不需要磨料使子孢子脱囊。孢子囊很容易在消化道中被酶(如蛋白酶)处理成感染性子孢子的生命周期。

在另一个实验中，在固定环境中给鸡接种疫苗，让其成长，并在第7天处死以收集肠道中的内容物，观察孢子囊与卵囊接种的影响。然而，在这种情况下，喷嘴只使用液体压力而不是液体压力和空气压力对小鸡进行喷雾。与疫苗的锥形雾化相比，气压缺乏导致形成类流流体分配。这些实验的结果在下表中给出。

表7：无气压喷洒卵囊或孢子囊的鸡的反应频率和幅度

未处理的对照鸡的肠道内容物中均未观察到卵囊，而通过滴眼接种的阳性对照的感染率和幅度均高于实验喷雾处理组。巨型艾美球虫的反应频率和反应幅度在数值上较大，而柔嫩艾美球虫和堆形艾美球虫的较小。这些结果表明，不管采用哪种喷嘴喷雾模式，与卵囊溶液相比，施用包含残留卵囊的孢子囊溶液的结果都得到改善。

除了手动处理卵囊以释放孢子囊外，还使用带有玻璃珠的IKA Ultra Turrax装置(

GmbH&Co.，德国Staufen)进行自动化处理。将玻璃珠(硼硅酸盐玻璃球，尺寸1-6mm)添加到疫苗中，并在4000-8000rpm下处理20-240秒。卵囊剪切的结果与手动过程相当，重复性得到改善。采用IKA UTTD装置处理后，对剩余的卵囊进行计数，结果表明，大约76％的巨型艾美球虫卵囊转化为孢子囊，70％的柔嫩艾美球虫卵囊转化为孢子囊，而46％的堆形艾美球虫卵囊转化为孢子囊。使用与上述相同的方法对肉仔鸡进行实验，结果如下。

表8：喷洒卵囊或喷洒IKA UTTD设备处理的含残留卵囊的孢子囊的鸡的反应频率和幅度

未处理的对照鸡的肠道内容物中均未观察到卵囊，而通过滴眼接种的阳性对照的感染率和幅度均高于实验喷雾处理组。巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫的反应频率和反应幅度在数值上较大，而堆形艾美球虫的较小。此数据表明，IKA UTTD设备可以剪切卵囊，得到孢子囊/残留卵囊溶液，结果与手动摇动相似。在另一个实验中，可以看到接种孢子囊和卵囊的区别。在该实验中，通过用手摇动含4mm玻璃珠的多种卵囊悬浮液来释放孢子囊。将这种孢子囊/残留卵囊溶液及仅含卵囊的溶液向初生雏鸡的面部粘膜施用。使用两组喷嘴，第一组使用溶于2％海藻酸钠溶液中的疫苗，第二组使用溶于3.0％氯化钙溶液中的疫苗。当这两种溶液在鸡的表面接触时，就会形成凝胶。根据假设，与一般的水喷雾相比，凝胶的产生可以使卵囊/孢子囊疫苗保持更长的水合时间，延长了鸡可能的整理时间。参见Hutchins于2019年7月10日提交的PCT No____，代理人案卷号673-04-PCT。这些实验的结果在下表中给出。

表9：喷洒凝胶形式卵囊或含残留卵囊的孢子囊的鸡的反应频率和幅度

未处理的对照鸡的肠道内容物中均未观察到卵囊，而通过滴眼接种的阳性对照的感染率和幅度均高于实验喷雾处理组。这些结果表明，凝胶孢子囊制剂仅在反应频率和幅度上都优于卵囊。我们注意到，即使作为卵囊而不是孢子囊施用，较小的堆形艾美球虫的感染性也相对较高。感染性数据表明，无论是否存在饲料和粗砂，在鸡的消化道中均可将堆形艾美球虫卵囊有效地处理到孢子囊的生命阶段，然后再处理到子孢子的生命阶段。

管饲感染性证据表明，在消化道中没有饲料或粗砂的情况下，特别是巨型艾美球虫，可能无法在体内处理到孢子囊阶段。通过在施用前将卵囊生命阶段预处理到孢子囊生命阶段，可增强巨型艾美球虫的感染力，并增强柔嫩艾美球虫的感染力，但后者的增强程度相比更低些。然而，在体外，使更大的巨型艾美球虫卵囊破裂所需的剪切力远小于使更小的堆形艾美球虫卵囊破裂所需的剪切力。(欧洲专利2,111,243B1(Hutchins et al.,Embrex,Inc.))。因此，在使用时产生孢子囊的系统提供了互补作用，将使较大卵囊物种破裂的体外效率与处理较小卵囊物种的体内效率相结合，从而产生了更强大的疫苗功效。

6.5.高压均质机的结果

6.5.1.卵囊减少计数-体外

通过高压均质机(HPH)IKA(型号2000-4)在不同压力下处理包含混合艾美尔球虫物种卵囊的液体悬浮液。将细胞悬浮液装入到HPH的进口，在一定压力范围(200–1500bar)下进行处理，然后从出口分配。在暴露于HPH之前和之后，使用McMaster的浮选室对液体制剂中包含的完整卵囊进行计数。结果如下表所示。

表10：不同压力下高压均质(HPH)处理后残留卵囊的比较

结果表明，压力越高，卵囊减少百分数越高，从而孢子囊释放百分数越高。

喷洒卵囊或孢子囊的鸡的反应频率和幅度-体内

在该实验中，将鸡暴露于由卵囊溶液或IKA HPH 2000-4装置处理的含残留卵囊的孢子囊溶液组成的喷嘴喷雾。然后，向鸡提供食物和水，让其成长，并在第7天处死，收集单只鸡的肠中内容物。这些实验的结果在下表中给出。

表11：未处理卵囊和200bar条件下IKA HPH 2000-4处理的卵囊的感染性比较

表12：未处理卵囊和500bar条件下IKA HPH 2000-4处理的卵囊的感染性比较

15只未处理的对照鸡的肠中内容物未观察到任何物种的卵囊。与实验处理组相比，通过滴眼接种的阳性对照产生的感染频率为100％(所有物种)，且幅度更高(所有物种)。尽管从体外数据来看，IKA HPH的卵囊减少百分数看起来令人满意，但根据假设，均质化过程中产生的孢子囊也受到了损害，因此导致体内数据的频率和幅度反应较差。

6.6.转子-定子类装置的结果

6.6.1.卵囊减少计数-体外

通过IKA Magic Lab(单程，在线，转子-定子类装置)以不同的速度处理含有混合艾美球虫物种卵囊的悬浮液。将细胞悬浮液加入到Magic Lab的料斗中，通过1-3个转子定子发生器以不同的速度(3,000-26,000rpm)进行处理，然后从出口分配。用于该实验的发生器型号是6F。在采用Magic Lab装置进行处理之前和之后，使用McMaster的浮选室对液体制剂中包含的完整卵囊进行计数。结果如下表所示。

表13：转子-定子在不同速度下处理后残留卵囊的比较

据观察，巨型艾美球虫的卵囊减少百分数一致，而柔嫩艾美球虫的卵囊减少百分数有所变化，堆形艾美球虫的卵囊减少百分数最低。

喷洒卵囊或孢子囊的鸡的反应频率和幅度-体内

在该实验中，将初生雏鸡暴露于卵囊溶液或由IKA Magic Lab装置处理的含残留卵囊的孢子囊溶液组成的喷嘴喷雾。然后，向鸡提供食物和水，让其成长，并在第7天处死，收集单只鸡的肠中内容物。这些实验的结果在下表中给出。

表14：未处理卵囊和16,000rpm条件下IKA Magic Lab处理的卵囊的感染性比较

表15：未处理卵囊和26,000rpm条件下IKA Magic Lab处理的卵囊的感染性比较

15只未处理的对照鸡的肠中内容物未观察到任何物种的卵囊。与实验处理组相比，通过滴眼接种的阳性对照产生的感染频率为100％(所有物种)，且幅度更高(所有物种)。在两个Magic Lab处理组中，巨型艾美球虫的反应频率均增加，但是，各个处理组的反应幅度均小于卵囊处理组，但仍在可接受的范围内。柔嫩艾美球虫的反应频率和幅度最突出。这些结果可能表明，在所使用的条件下，巨型艾美球虫卵囊被过度处理。

6.7.水力空化实验

6.7.1.水力空化的体外研究

为了进行初始试验，使用了低成本、无泄漏且配备充氮装置和出口的强化铝搅打奶油分配器(EurKitchen EK-WHIP-18)。将包含混合艾美尔虫制剂的液体装入罐中，加入氮气筒，然后将罐倒转几次，让气体将液体饱和。将罐倒置，打开阀门，以产生压力降并释放液体。在暴露于水力空化之前和之后对液体制剂进行计数，以确定各物种破裂卵囊的百分数。在某些情况下，对液体进行处理并将其从系统中释放出来，装回到系统中，然后再进行两次或三次水力空化，以破坏更多的细胞，因为在初步系统试验中，无法控制压力和气体量。

在本发明中，释放已经经历了水力空化的液体，然后将同一液体重新装回到同一容器中以再次暴露于水力空化的行为被称为“程(Pass)”。因此，从这一点开始，术语“1程”、“2程”或“3程”用于表示将液体暴露于水力空化过程的次数。次数将由“程”前面的数字定义。

表16：多周期搅打奶油分配器水力空化处理后残留卵囊的比较

开展实验1(参见表16)来评估新细胞破坏技术的价值，开展实验2进一步探索该技术。最后，实验1表明，所有物种卵囊向孢子囊的转化相当，与前面探索的卵囊剪切技术(例如与玻璃珠摇动)的早期试验类似。在实验2中，与“1程”相比，“2程”显示出更好的转化，而“3程”与“2程”的结果相当，表明增加氮气空化暴露并不一定会进一步提高转化。

在先前建立的EurKitchen方法的有限参数下成功完成水力空化之后，进一步完善了该方案，组合使用商用级水力细胞破坏器，并在第六实施例中对该方法进行了更详细的探讨。

通过使用细胞破坏容器(Parr^TM4639)开展进一步的研究，其中通过充氮连接(Parr^TM1831)供应不同压力-1000psi和1500psi的氮气，然后让氮气溶解到稀释疫苗中5分钟。

尽管提供了压力和时间的详细信息，但应该指出的是，该过程的详细信息可以在更宽的范围内发生。该范围可以包括500–5000psi的压力，持续1–30分钟的暴露时间以及组成不同的稀释剂。这些组合物可以由蒸馏水、磷酸盐缓冲盐水(PBS)和二者的其他变体组成。

表17：多个压力下的细胞破坏容器水力空化处理后残留卵囊的体外比较

水力空化处理之前和之后，通过McMaster浮选室方法对液体制剂进行计数。结果表明，在大物种和小物种中，两种试验压力都能分别将50％和25％的卵囊转化为孢子囊。在较高的试验压力下，中等物种的转化增加。

6.7.2.体内水力空化研究(第一种方法)

在这一系列实验中，利用水力空化完成了卵囊膜的破坏，并通过卵囊产量模型评估了感染性。计算剩余卵囊的数量，如下所示。经喷雾接种法给初生鸡(每次处理15只)接种卵囊或经水力空化释放且包含残留卵囊的孢子囊，并在第7天收集肠道中的内容物。

下面表18和19中的数据证明了体内输送EurKitchen水力空化释放的孢子囊的有效性。表19中的数据是在与表18中的数据分开的实验中收集的。

表18：多个搅打奶油分配器水力空化周期的体内感染性比较

表19：搅打奶油分配器水力空化的体内感染性比较

未处理的对照鸡的肠中内容物未观察到卵囊。与实验处理组相比，该实验滴眼控制实现了更高的频率和幅度。表18表明了不同“程”数与卵囊眼喷雾输送相比的比较效果，表19表明，“2程”的效果最佳。

6.7.3.体内水力空化研究(第二种方法)

下表20和21中的数据证明了通过细胞破裂容器水力空化的细胞破裂过程的有效性。表20和表21中的数据均来自同一实验。

表20：细胞破裂容器水力空化(1000psi)的体内感染性比较

表21：细胞破裂容器水力空化(1500psi)的体内感染性比较

未处理的对照鸡的肠中内容物未观察到卵囊。与实验处理组相比，该实验滴眼控制实现了更高的频率和幅度。1000psi的处理表明巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫的反应频率提高，所有物种的反应幅度都提高。1500psi的处理表明巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫的反应频率有所改善，但对巨型艾美球虫和堆形艾美球虫的幅度没有影响，而柔嫩艾美球虫的幅度反应有很大的增加。

正如预期的那样，由细胞破裂容器表示的改进水力空化技术优于难以控制的搅打奶油分配器方法。除堆形艾美球虫外，所有物种均显示出感染力改善，而对柔嫩艾美球虫卵囊产量而言，两种细胞破裂容器压力参数均显示出明显的增加。

6.8.其他疫苗的体外实验

在前面的部分中，描述了破坏卵囊膜以释放孢子囊改善疫苗性能的方法。最初的测试是通过人工和自动方法对第一种肉鸡球虫疫苗进行的。本文描述了第二种肉鸡球虫病疫苗，第一层和第二层鸡球虫病疫苗以及第一种火鸡球虫病疫苗的卵囊膜破坏过程。

为了进行手动处理，将疫苗添加到玻璃珠中并剧烈摇动。对大、中和小卵囊的数量进行计数，并比较手动处理前后的数量。另外，使用了自动化系统，其中将等分疫苗添加到珠磨机中并对样品进行了处理。在这种情况下，使用了一次性分散系统(IKA ULTRA-TURRAX管驱动系统)，但是预期任何类似的系统都可以产生相似的结果。

为了进行计数，将试验疫苗中包含的卵囊根据Conway和McKenzie中提出的标准按其尺寸分为大、中和小卵囊(Poultry Coccidiosis:Diagnostic and TestingProcedures,3rd Edition,June 2007,Wiley-Blackwell)。以下试验中包含的艾美球虫物种如下：来自不同商业来源的堆形艾美球虫、腺样艾美球虫、哈氏艾美球虫、火鸡和缓艾美球虫、变位艾美球虫、巨型艾美球虫、毒害艾美球虫、早熟艾美球虫、柔嫩艾美球虫。该集合包括至少一种物种的非减毒和减毒(早熟)菌株。每个样品计数三次，平均值列在下面。

表22：采用第1层鸡球虫病疫苗的卵囊减少数

表23：采用第2层鸡球虫病疫苗的卵囊减少数

表24：采用第2种肉鸡球虫病疫苗的卵囊减少数

表25：采用第1种火鸡球虫病疫苗的卵囊减少数

*疫苗中没有大卵囊或小卵囊。

结果表明，对试验的多种疫苗来说，卵囊普遍具有剪切敏感性，表明所描述的系统和方法具有广泛的适用性。

7.本发明的一般性陈述

以下编号的陈述提供了本发明的一般描述，并且并非限制所附的权利要求。

陈述1：一种动物艾美球虫疫苗接种的方法，包括以下步骤：提供艾美球虫卵囊溶液，所述卵囊具有外膜并在其中含有活的孢子囊；破坏至少一些艾美球虫卵囊的外膜，从而得到改良溶液；将所述改良溶液输送给动物。

陈述2：一种预防动物患顶复门疾病的方法，包括以下步骤：提供顶复门卵囊溶液，所述卵囊具有外膜并在其中含有活的孢子囊；破坏至少一些顶复门卵囊的外膜，从而得到改良溶液；将所述改良溶液输送给动物。

陈述3：如陈述1-2中任一项所述的方法，所述活的孢子囊从破裂的膜处释放。

陈述4：如陈述1-3中任一项所述的方法，其中在破坏膜时将改良溶液输送至动物。

陈述5：如陈述1-3中任一项所述的方法，其中在破坏膜得到改良溶液的5天内将改良溶液输送至动物。

陈述6：如陈述1-5中任一项所述的方法，其中所述改良溶液通过喷雾输送。

陈述7：如陈述1-6中任一项所述的方法，其中所述艾美尔球虫或顶复门卵囊是单一艾美尔球虫物种的艾美球虫卵囊或单一顶复门物种的顶复门卵囊。

陈述8：如陈述1-6中任一项所述的方法，其中所述艾美尔球虫或顶复门卵囊是包含两种或多种艾美尔球虫物种的艾美球虫疫苗的艾美球虫卵囊或两种或多种顶复门物种的顶复门卵囊。

陈述9：如陈述1-8中任一项所述的方法，其中所述艾美尔球虫或顶复门卵囊的溶液是浓缩疫苗溶液。

陈述10：如陈述1-8中任一项所述的方法，其中所述艾美尔球虫或顶复门卵囊的溶液是稀释的疫苗溶液。

陈述11：一种破坏艾美球虫卵囊外膜并实时将所得溶液输送给动物的系统，所述系统包括：容器，容器内包含艾美球虫卵囊溶液，所述卵囊具有外膜并且其中包含活的孢子囊；卵囊处理室，其中至少一些艾美球虫卵囊的外膜在该室内被破坏，从而得到改良溶液；和输送出口，通过输送出口，将改良溶液从容器经处理室输送到输送出口，在该处将改良溶液输送至动物。

陈述12：一种破坏顶复门卵囊外膜并实时将所得溶液输送给动物的系统，所述系统包括：容器，容器内包含顶复门卵囊溶液，所述卵囊具有外膜并且其中包含活的孢子囊；卵囊处理室，其中至少一些顶复门卵囊的外膜在该室内被破坏，从而得到改良溶液；输送出口，通过输送出口，将改良溶液从容器经处理室输送到输送出口，在该处将改良溶液输送至动物。

陈述13：如陈述11-12所述的系统，其中所述活的孢子囊从破裂的膜处释放。

陈述14：如陈述11-13中任一项所述的系统，其中所述卵囊处理室是由以下各项组成的组中的至少一种：高压均质机、转子定子混合器、包含硬珠及连接搅拌器的腔室容器、一对振动板、超声器、水力空化装置、高压喷雾器，或它们的组合。

陈述15：如陈述11-14中任一项所述的系统，其中所述均质机提供约3000psi的压力。

陈述16：如陈述11-15中任一项所述的系统，其中破裂的艾美尔球虫或顶复门卵囊的数量在最长尺寸小于20微米的卵囊中是约5％至50％，最长尺寸20微米至30微米的卵囊中是约15％至75％，最长尺寸大于30微米的卵囊中是约25％至90％。

陈述17：如陈述11-16中任一项所述的系统，其中所述含有艾美球虫或顶复门卵囊的溶液包含至少一种蛋白水解酶。

陈述18：如陈述17所述的系统，其中所述蛋白水解酶是胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或它们的混合物。

陈述19：如陈述11-18中任一项所述的系统，其中所述含有艾美尔球虫或顶复门卵囊的溶液是浓缩疫苗溶液。

陈述20：如陈述11-18中任一项所述的系统，其中所述含有艾美球虫或顶复门卵囊的溶液还包含水性稀释剂，所述水性稀释剂包含缓冲盐；糖；蛋白质或蛋白质水解物；染料；或增稠剂。

陈述21：一种输送给动物时破坏卵囊膜的方法，所述方法包括以下步骤：提供容纳一定体积艾美球虫卵囊溶液的容器，所述卵囊具有外膜并且在其中包含活的孢子囊；提供破坏卵囊外膜的系统；提供输送装置；将溶液从第一容器输送到所述系统；使溶液通过处理室，从而使至少一些艾美球虫卵囊膜破裂，得到改良溶液；及将改良溶液从所述系统输送至所述输送装置，在所述输送装置将改良溶液输送至动物。

陈述22：一种输送给动物时破坏卵囊膜的方法，所述方法包括以下步骤：提供容纳一定体积顶复门卵囊溶液的容器，所述卵囊具有外膜并且在其中包含活的孢子囊；提供破坏卵囊外膜的系统；提供输送装置；将溶液从第一容器输送到所述系统；使溶液通过处理室，从而使至少一些顶复门卵囊膜破裂，得到改良溶液；及将改良溶液从所述系统输送至所述输送装置，在所述输送装置将改良溶液输送至动物。

陈述23：如陈述21-22中任一项所述的方法，其中所述系统是由以下各项组成的组中的至少一种：高压均质机、超声器、转子定子混合器、其中包含硬珠及连接搅拌器的容器、一对振动板、水力空化装置、高压喷雾器或它们的组合。

陈述24：如陈述21-23中任一项所述的方法，其中所述均质机提供大于约3000psi的压力。

陈述25：如陈述21-24中任一项所述的方法，其中破裂卵囊的数量在最长尺寸小于20微米的卵囊中是至少约5％，最长尺寸20微米至30微米的卵囊中是至少约15％，最长尺寸大于30微米的卵囊中是至少约25％。

陈述26：如陈述21-25中任一项所述的方法，其中所述艾美尔球虫或顶复门卵囊溶液是浓缩疫苗溶液。

应当理解的是，以上描述仅是说明性实施例和实例的代表。为了方便读者，以上描述重点关注的是教导本发明原理的所有可能实施例和实例的数量有限的代表性实例。所述描述并非详尽地列举所描述的所有可能的变化或甚至这些变化的组合。本发明的特定部分可能没有提出替代实施例，或者一部分可能没有进一步描述替代实施例，这不能被认为排除那些替代实施例。普通技术人员将理解的是，那些未描述的实施例中的许多实施例涉及技术和材料上的差异，而非本发明原理应用上的差异。因此，本发明的范围不限于小于以下权利要求和等效内容中规定的范围。

引用纳入

本文引用的所有参考文献、文章、出版物、专利、专利公开和专利申请通过引用整体并入本发明中。但是，本文中提到引用的任何参考文献、文章、出版物、专利、专利公开和专利申请并非也不应被视为承认或以任何形式建议它们构成世界上任何国家有效的现有技术或构成公知技术的一部分。应当理解的是，虽然已经结合具体实施例对本发明进行了描述，但是前面的描述旨在阐明本发明而不是限制本发明的范围。其他方面、优点和改动都属于以下提出的权利要求的范围。本说明书中提及的所有公开、专利和专利申请以引用的方式全部纳入本申请中，其引用的程度就如同已特定地及个别地将各个公开或专利申请内容以引用的方式纳入一般。

Claims (20)

1.一种动物艾美球虫疫苗接种的方法，包括以下步骤：

提供艾美球虫卵囊溶液，所述卵囊具有外膜并在其中含有活的孢子囊；

破坏至少一些艾美球虫卵囊的外膜，从而得到改良溶液；及

将所述改良溶液输送给动物。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述活的孢子囊从破裂的膜处释放。

3.如权利要求1所述的方法，其中在破坏膜时将改良溶液输送至动物。

4.如权利要求1所述的方法，其中在破坏膜得到改良溶液的5天内将改良溶液输送至动物。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述改良溶液通过喷雾输送。

6.如权利要求1所述的方法，其中所述艾美尔球虫卵囊是单一艾美尔球虫物种的艾美球虫卵囊。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述艾美尔球虫卵囊是包含两种或多种艾美尔球虫物种的艾美球虫疫苗的艾美球虫卵囊。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述艾美尔球虫卵囊的溶液是浓缩疫苗溶液。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述艾美尔球虫卵囊的溶液是稀释的疫苗溶液。

10.一种破坏艾美球虫卵囊外膜并实时将所得溶液输送给动物的系统，所述系统包括：

容器，含有艾美球虫卵囊溶液，所述卵囊具有外膜并且其中包含活的孢子囊；卵囊处理室，其中至少一些艾美球虫卵囊的外膜在该室内被破坏，从而得到改良溶液；及

输送出口，通过输送出口，将改良溶液从容器经处理室输送到输送出口，在此处将改良溶液输送至动物。

11.如权利要求10所述的系统，其中所述活的孢子囊从破裂的膜处释放。

12.如权利要求10所述的系统，其中所述卵囊处理室是由以下各项组成的组中的至少一种：高压均质机、转子定子混合器、包含硬珠及连接搅拌器的腔室容器、一对振动板、超声器、水力空化装置、高压喷雾器，或它们的组合。

13.如权利要求11所述的系统，其中所述均质机提供大约3000psi的压力。

14.如权利要求10所述的系统，其中破裂的艾美尔球虫卵囊的数量在最长尺寸小于20微米的艾美尔球虫卵囊中是约5％至50％，最长尺寸20微米至30微米的艾美尔球虫卵囊中是约15％至75％，最长尺寸大于30微米的艾美尔球虫卵囊中是约25％至90％。

15.如权利要求10所述的系统，其中所述含艾美尔球虫卵囊的溶液包括至少一种蛋白水解酶。

16.如权利要求15所述的系统，其中所述蛋白水解酶是胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶或它们的混合物。

17.如权利要求10所述的系统，其中所述含艾美尔球虫卵囊的溶液是浓缩疫苗溶液。

18.如权利要求10所述的系统，其中所述含艾美球虫卵囊的溶液还包含水性稀释剂，所述水性稀释剂包含缓冲盐；糖；蛋白质或蛋白质水解物；染料；或增稠剂。

19.一种输送给动物时破坏卵囊膜的方法，所述方法包括以下步骤：

提供容纳一定体积艾美球虫卵囊溶液的容器，所述卵囊具有外膜并且在其中包含活的孢子囊；

提供破坏卵囊外膜的系统；

提供输送装置；

将溶液从第一容器输送到所述系统；

使溶液通过处理室，从而使至少一些艾美球虫卵囊膜破裂，得到改良溶液；及

将改良溶液从所述系统输送至所述输送装置，从所述输送装置将改良溶液输送至动物。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述系统是由以下各项组成的组中的至少一种：高压均质机、超声器、转子定子混合器、其中包含硬珠及连接搅拌器的容器、一对振动板、水力空化装置、高压喷雾器，或它们的组合。

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