CN101184500A - 球虫疫苗及其制备和使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于鸡球虫病的疫苗，该疫苗从三种减毒的艾美球虫种：堆形艾美球虫、巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫制得。该疫苗在刺激对抗球虫病的保护性免疫中与其它抗球虫药物相似或优于其它抗球虫药物。
Description
相关申请
本申请要求2006年2月6日提交的U.S.申请系列No.11/348,084的优先权，其是2005年4月15日提交的U.S.申请系列No.11/106,780的部分继续申请，后者于2006年2月14日以U.S.专利No.6,998,127颁布，是2003年12月8日提交的U.S.申请系列No.10/730,206的继续申请，No.10/730,206于2005年6月21日以U.S.专利No.6,908,620颁布，其享有2002年12月9日提交的发明名称为：“球虫疫苗及其制备和使用方法”的U.S.临时专利申请系列No.60/432,298的优先权，其公开内容在此以其整体通过参考引用并入本文。
上述申请以及其中或在处理过程中引用的所有文献(“申请引用的文献”)和申请引用文献中引用或参考的所有文献，以及在此引用或参考的所有文献(“在此引用的文献”)，和在此引用文献中引用或参考的所有文献，连同对于在此或在此通过参考引入的任何文献中提及的任何产品的任何制造商的说明书、描述、产品说明书和产品页，在此通过参考引用并入本文，并可以用于本发明的实践中。
发明领域
本发明涉及对抗由球虫引起的疾病的免疫组合物和疫苗的制备。本发明还提供了对抗球虫病的减毒疫苗。
发明背景
球虫病是由许多种球虫中的一种或多种感染而引起的疾病，球虫是原生动物门(Protozoa)的细分，是顶复动物亚门(Apicomplexa)和艾美球虫属(Eimeria)的胞内原生动物寄生虫。艾美球虫属包含在家禽中有主要经济重要性的物种，所述家禽诸如鸡、鸭、鹅、珠鸡(guinea fowl)、孔雀、雉、鸽子和火鸡。尽管球虫病发生在几乎所有种类的鸟中，该寄生虫是宿主特异性的并且每个物种发生在单一或有限组群的相关宿主中。另一方面，已知鸟类宿主容纳多于一个物种的球虫。引起鸡球虫病的艾美球虫属的物种包括堆形艾美球虫(E.acervulina)、布氏艾美球虫(E.brunetti)、哈氏艾美球虫(E.hagani)、巨型艾美球虫(E.maxima)、和缓艾美球虫(E.mitis)、变位艾美球虫(E.mivati)、毒害艾美球虫(E.necatrix)、早熟艾美球虫(E.praecox)和柔嫩艾美球虫(E.tenella)。堆形艾美球虫是童子鸡(broiler)鸡窝中发现的最常见种之一。它具有极大的繁殖潜能并被认为是致病的，因为它对体重增加、更高的饲料转化产生显著的抑制，并且它在上段小肠中产生肉眼损害。
在家禽中，鸡最易因球虫病而遭受显著经济损失，尽管在火鸡、鹅、鸭和珠鸡中也可发生损失。球虫病还已经在圈养的雉和鹌鹑中产生了严重的损失。球虫病感染的影响可以呈毁灭性群体死亡的高度可见形式，但是另一种不利影响是由感染引起的发病率和/或重量减轻。
在生命周期中，艾美球虫寄生虫经历多个阶段(对于综述，参见，例如U.S.专利No.6,100,241)。当鸡在地面喂养过程中或通过吸入尘土而摄入称为孢子化卵囊的感染阶段时，生活史开始。通过砂囊和肠道中的机械研磨作用和化学作用的组合使孢子化卵囊的壁破裂，导致四个孢子囊的释放。孢子囊进入十二指肠，在其中它们暴露于胆汁和消化酶，导致每个孢子囊两个子孢子的释放。
子孢子是可移动的并寻找合适的宿主上皮细胞以穿透并在其中繁殖。感染上皮细胞后，寄生虫进入其生活史的裂殖体期，每个裂殖体产生8至16至＞200个裂殖子。一旦从裂殖体释放出来，裂殖子自由地感染更多的上皮细胞。两至五个这样的无性生殖周期后，胞内裂殖子生长成有性形式，称为雌性或大配子母细胞和雄性或小配子母细胞。大配子母细胞通过从小配子母细胞中释放出来的小配子授精后，形成合子，其形成围绕自身的囊壁。新形成的卵囊随着粪便从感染的鸡中释放出来。
在正确的温度和湿度环境条件以及空气中充足氧的情况下，卵囊将形成孢子进入感染阶段，准备感染新的宿主并因此传播疾病。因此，不需要中间宿主用于鸟到鸟的寄生虫转移。
艾美球虫属寄生虫感染鸡消化道的结果可能是体重增加的减少、增加的饲料转化的降低，产蛋的停止，和(在一些情况中)死亡。家禽密集生产的增加已经伴随着由这种寄生虫引起的严重损失；实际上，球虫病已经成为经济上重要的寄生虫疾病。
在过去，已经尝试使用几种方法来控制球虫病。在化疗剂出现之前，使用消毒剂改进环境卫生，以及对草垫的机械清除，是使用的主要方法；但是通常仍残余足以传播疾病的卵囊。除了良好的管理，在饲料或饮用水中引入抑球虫剂，在疾病控制上获得一些成功。已经发现这样的试剂在几年内有效性下降，部分是由于球虫耐药株的产生。此外，已经发现几种化疗剂在肉中留下残余物，使其不适于食用。
U.S.专利No.4,438,097；4,639,372；4,808,404；5,055,292；5,068,104；5,387,414；5,602,033；5,614,195；5,635,181；5,637,487；5,674,484；5,677,438；5,709,862；5,780,289；5,795,741；5,814,320；5,843,722；5,846,527；5,885,568；5,932,225；6,001,363和6,100,241涉及球虫病疫苗，包括活的和重组的疫苗。然而，现有的球虫病疫苗存在一些问题，如降低的功效、与其他寄生物(例如，梭菌(Clostridium spp.))的交叉感染和差的鸟性能(bird performance)。因此，对于不会不利影响鸟性能的具有降低或不存在交叉感染的有效球虫病疫苗存在需要。
本申请中对任何文献的引用或标识不是承认该文献可作为本发明的现有技术得到。
发明概述
本发明是部分基于减毒球虫病疫苗，与其他球虫病疫苗相比较时，该疫苗面对毒力攻击是有效的、与梭菌的交叉感染降低并具有更好的鸟性能(如通过饲料转化率所定义)。
本发明涉及来自堆形艾美球虫、巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫早熟株的孢子化卵囊的混合物。从由一只或多只接种了堆形艾美球虫、巨型艾美球虫或柔嫩艾美球虫早熟株培养物的鸡收获的种子培养物分离孢子化卵囊，即，将一只或多只鸡接种堆形艾美球虫、巨型艾美球虫或柔嫩艾美球虫中任一种的早熟株，形成三组鸡，每组接种不同的艾美球虫株。合并所分离的孢子化卵囊来配制来自堆形艾美球虫、巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫早熟株的孢子化卵囊混合物。
在有利的实施方案中，鸡是2至8周龄的SPF鸡。在另一个有利的实施方案中，每只鸡接种约100至约15000个卵囊来产生种子培养物。在另一个有利的实施方案，通过离心从种子培养物分离孢子化卵囊。
本发明还证实孢子化卵囊是堆形艾美球虫、巨型艾美球虫或柔嫩艾美球虫早熟株特征性的。
本发明涉及来自堆形艾美球虫、巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫早熟株的孢子化卵囊的混合物，其中混合物是约10至约1000个堆形艾美球虫卵囊，约10至约100个巨型艾美球虫卵囊和约10至约1000个柔嫩艾美球虫卵囊。有利地，混合物是约500个堆形艾美球虫的卵囊，约50至约100个巨型艾美球虫的卵囊和约100至约500个柔嫩艾美球虫的卵囊。更有利地，混合物是合并的约500个堆形艾美球虫的卵囊，约100个巨型艾美球虫的卵囊和约100个柔嫩艾美球虫的卵囊。
本发明还涉及特定比例的从堆形艾美球虫、巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫早熟株分离的孢子化卵囊，其中堆形艾美球虫∶巨型艾美球虫∶柔嫩艾美球虫的比例为约10∶1至2∶2至10(即，对于每10个堆形艾美球虫的孢子囊，存在约1至2个巨型艾美球虫的孢子囊和约2至10个柔嫩艾美球虫的孢子囊)。有利地，堆形艾美球虫∶巨型艾美球虫∶柔嫩艾美球虫的比例为约5∶1∶1(即，10∶2∶2)。
本发明还涉及测试来自堆形艾美球虫、巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫早熟株的孢子化卵囊混合物的功效。有利地，该测试涉及将约100,000至约500,000个堆形艾美球虫的卵囊和约10,000至约1,000,000个巨型艾美球虫的卵囊或约10,000至约100,000个柔嫩艾美球虫的卵囊的攻击剂量给予动物。在更有利的实施方案中，攻击剂量为约200,000个堆形艾美球虫的卵囊和约20,000至约500,000个巨型艾美球虫的卵囊或约20,000至约50,000个柔嫩艾美球虫的卵囊。
本发明涉及免疫鸡，有利地是童子鸡。然而，在此所述疫苗的制备方法可以外推至受艾美球虫感染的其他动物，特别是鸟类，诸如但不限于，鸡、鸭、鹅、珠鸡、孔雀、雉、鸽子、鹌鹑或火鸡。
本发明包括免疫或疫苗组合物，该组合物包括来自堆形艾美球虫、巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫早熟株的孢子化卵囊的混合物。在有利的实施方案中，混合物是约10至约1000个堆形艾美球虫的卵囊，约10至约100个巨型艾美球虫的卵囊和约10至约1000个柔嫩艾美球虫的卵囊。有利地，混合物是约500个堆形艾美球虫的卵囊，约50至约100个巨型艾美球虫的卵囊和约100至约500个柔嫩艾美球虫的卵囊。更有利地，混合物是合并的约500个堆形艾美球虫的卵囊，约100个巨型艾美球虫的卵囊和约100个柔嫩艾美球虫的卵囊。
本发明还涉及免疫或疫苗组合物，该组合物包括特定比例的从堆形艾美球虫、巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫早熟株分离的孢子化卵囊，其中堆形艾美球虫∶巨型艾美球虫∶柔嫩艾美球虫的比例为约10∶1至2∶2至10(即，对于每10个堆形艾美球虫的孢子囊，存在约1至2个巨型艾美球虫的孢子囊和约2至10个柔嫩艾美球虫的孢子囊)。有利地，堆形艾美球虫∶巨型艾美球虫∶柔嫩艾美球虫的比例为约5∶1∶1(即，10∶2∶2)。
本发明还提供了引发免疫应答或诱导免疫或保护性应答，包括给予有效量的免疫或疫苗组合物来引发或诱导动物中的应答，该组合物包含从堆形艾美球虫、巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫早熟株分离的孢子化卵囊的混合物。有利地，所述动物是鸟类，诸如但不限于，鸡、鸭、鹅、珠鸡、孔雀、雉、鸽子、鹌鹑或火鸡。在最有利的实施方案中，鸟类是鸡，有利地是童子鸡。引发免疫应答或诱导免疫应答的方法还可以包括给予佐剂、细胞因子或两者。
有利地，引发免疫应答或诱导免疫或保护性应答的有效量为约10至约1000个堆形艾美球虫的卵囊，约10至约100个巨型艾美球虫的卵囊和约10至约1000个柔嫩艾美球虫的卵囊。有利地，有效量为约500个堆形艾美球虫的卵囊，约50至约100个巨型艾美球虫的卵囊和约100至约500个柔嫩艾美球虫的卵囊。更有利地，有效量为合并的约500个堆形艾美球虫的卵囊，约100个巨型艾美球虫的卵囊和约100个柔嫩艾美球虫的卵囊。另一个实施方案中，有效量足以抵抗对动物的约100,000至约500,000个堆形艾美球虫的卵囊和约10,000至约1,000,000个巨型艾美球虫的卵囊或约10,000至约100,000个柔嫩艾美球虫的卵囊的攻击剂量。更有利地，攻击剂量为约200,000个堆形艾美球虫的卵囊和约20,000至约500,000个巨型艾美球虫的卵囊或约20,000至约50,000个柔嫩艾美球虫的卵囊。
引发免疫应答或诱导免疫或保护性应答的有效量还可以表示为来自堆形艾美球虫、巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫早熟株的孢子化卵囊的比例，其中堆形艾美球虫∶巨型艾美球虫∶柔嫩艾美球虫的比例为约10∶1至2∶2至10(即，对于每10个堆形艾美球虫的孢子囊，存在约1至2个巨型艾美球虫的孢子囊和约2至10个柔嫩艾美球虫的孢子囊)。有利地，堆形艾美球虫∶巨型艾美球虫∶柔嫩艾美球虫的比例为约5∶1∶1(即，10∶2∶2)。
鉴于各种艾美球虫种的流行率和致病性，成功的减毒球虫病疫苗应当含有足以引发免疫应答或诱导免疫或保护性应答的对疫苗接受者无致病性的最小数量的艾美球虫株。本发明涉及来自四种特定的艾美球虫早熟株的卵囊的组合，即，堆形艾美球虫、巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫，形成有效且非致病的疫苗。其他艾美球虫株如布氏艾美球虫、毒害艾美球虫和早熟艾美球虫的加入，就疫苗的功效、交叉感染或致病性而言可能是不利的。由于布氏艾美球虫、毒害艾美球虫和早熟艾美球虫对于在此公开的球虫病疫苗的功效不是必需的，因此将这些虫株排除在本发明的疫苗之外将是有利的。
注意到在本公开内容中特别是在权利要求和/或段落中，术语如“包含/包括”等可以具有U.S.专利法中归于其的含义；例如，它们可以意指“包括”等；术语如“基本上由……组成”具有U.S.专利法中归于其的含义，例如，其允许未明确引述的元素，但是排除现有技术中发现的或影响本发明的基础或新颖特征的元素。
这些和其他实施方案在以下的详述中公开或由此显而易见并且包括在以下详述中。
详述
本发明部分基于减毒球虫病疫苗，与其他球虫病疫苗相比较时该疫苗面对毒力攻击是有效的、与梭菌的交叉感染降低并具有更好的鸟性能(如通过饲料转化率所定义)。
本发明涉及来自堆形艾美球虫、巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫早熟株的孢子化卵囊的混合物。从由一只或多只接种了堆形艾美球虫、巨型艾美球虫或柔嫩艾美球虫早熟株培养物的鸡收获的种子培养物分离孢子化卵囊，即，将一只或多只鸡接种堆形艾美球虫、巨型艾美球虫或柔嫩艾美球虫中任一种的早熟株，形成三组鸡，每组接种不同的艾美球虫株。任选，还可将来自和缓艾美球虫早熟株的孢子化卵囊加入孢子化卵囊的混合物中。
有利地，艾美球虫株是早熟株。早熟株源自野外种(fieldspecies)，以正确剂量给予时不会致病。在有利的实施方案中，艾美球虫株是Avian Pathology，17：305-314，1988中所述的各微生物的早熟株，该文章题目为“Eimeria of American Chickens：Characteristics of Six Attenuated Strains Produced by Selectionfor Precocious Development”，P.L.Long和Joyce K.Johnson，其公开内容以其整体通过参考引用并入本文。可以通过选择早熟发育使微生物减毒，如Avian Pathology，17：305-314，1988中所述，题目为“Eimeria of American Chickens：Characteristics of SixAttenuated Strains Produced by Selection for PrecociousDevelopment”，P.L.Long和Joyce K.Johnson，其公开内容以其整体通过参考引用并入本文。简而言之，通过选择较早的显露前期(即卵囊第一次在粪便中出现时)，来使微生物减毒。这样的方法为本领域技术人员熟知且构成常规试验。
用于种子培养物的艾美球虫株的原种培养物包括但不限于以下。堆形艾美球虫的亲本，在1969年获自在Hess and Clark Laboratories的T.K.Jeffers，认为其是由Dr.M.M.Farr在USDA，Beltsville，MD分离的，其源自单个卵囊。巨型艾美球虫培养物源自从Georgia、Delaware、Maryland、Virginia和Texas获得的10种纯化分离物的杂交混合物。和缓艾美球虫培养物的亲本在1978年7月从Gainesville，Georgia分离并通过单卵囊分离纯化。柔嫩艾美球虫培养物的亲本从Dr.Patten自20世纪60年代早期维持于PennsylvaniaState University的培养物获得，并在1982年由University ofGeorgia获得。其他早熟的艾美球虫株包括LS100早熟堆形艾美球虫分离物809-13和LS早熟和缓艾美球虫，从Merck ResearchLaboratories获得，其从Dr.Peter Long获得。或者，已经在欧洲动物细胞培养物保藏中心(“ECACC”)作为专利保藏(参见，例如，U.S.专利No.5,055,292，其公开内容以其整体通过参考引用并入本文)以孢子囊保藏的减毒早熟艾美球虫系是有用的产生在此所述的艾美球虫种子培养物的原种培养物。具体而言，U.S.专利No.5,055,292中所述的堆形艾美球虫(保藏号ECACC 86072203)、巨型艾美球虫(保藏号ECACC 86112011和86112012)、和缓艾美球虫(保藏号ECACC86072206)和柔嫩艾美球虫(保藏号ECACC 86072201)的保藏物是有用的用于本发明的种子培养物的原种培养物。
有利地，如上所述通过选择早熟发育来使微生物减毒。在另一个有利的实施方案中，培养物是无病原体的。将上述原种培养物有利地维持于液氮的液相或气相中。这样的方法是本领域技术人员已知的。
在有利的实施方案中，鸡是两至八周龄。孢子化卵囊在鸡体内连续传代，对传代没有限制，直至卵囊的数量足以用作生产的种子。有利地，为了维持生存力/感染力，培养物不应保持长于12个月。
在有利的实施方案中，对每个艾美球虫种维持专用设备。有利地，将充足体积的孢子化卵囊(种子)与饲料混合，或者，口服给予来给每只鸡提供最小剂量。在有利的实施方案中，每只鸡接种约5,000至约15,000个卵囊来产生种子培养物。
有利地通过离心，从鸟粪便分离来自种子培养物的孢子化卵囊。在一个有利的实施方案中，如下收集。将粪便在水中以10％(w/v)的大致比例均化。通过将均质物通过筛网来除去大颗粒。通过离心、过筛或通过在5±3℃保持长达24小时来分离固体。如果通过在5±3℃静置来分离固体，则进一步通过离心将它们浓缩。丢弃上清液，将固体重悬于饱和NaCl(80％w/v)水溶液中。将所得到的溶液离心。从液体上部收集(取出)卵囊并重悬于水中。任选，用水将剩余的液体稀释至20-40％NaCl并离心。然后将沉淀重悬于饱和NaCl溶液中并再次离心，直至再没有卵囊可以回收。将卵囊洗涤不超过两次。通过重复的重悬离心循环将卵囊洗去盐，接着重悬于0.5％次氯酸钠溶液中10至15分钟。然后通过重复的(3X)离心和重悬步骤将卵囊洗去次氯酸钠溶液。最后的重悬在2.5％重铬酸钾(K2CrO7)水溶液中进行。然后将卵囊转移至孢子形成容器中。通过用空气喷射悬浮液来促进孢子形成，在27±3℃不超过72小时。孢子形成后，将卵囊保持于5±3℃直至产生终产物。
在另一个实施方案中，根据本发明的接种方法使用的卵囊可以通过本领域技术人员已知的几种方法中的任一种制得。这样的方法包括J.F.Ryley等，Parasitology 73：311-326，1976，P.L.Long等，Folia Veterinaria Latina VI#3，201-217，1976和U.S.专利No.6,627,205中描述的那些，将其公开内容以其整体通过参考引用并入本文。根据一种方法，通过经口管饲合适剂量的孢子化卵囊，用目标艾美球虫种感染大约2周大的商业童子鸡。然后遵循从感染的鸟类收集和纯化卵囊的公知程序。对于大部分艾美球虫种，感染后5-7天从感染的鸟类收集粪便，混合并过滤除去碎片，然后以足以沉淀剩余粪便物质的速度离心。将沉淀重悬于饱和盐溶液中，卵囊漂浮于其中并可以通过离心除去大部分污染碎片。然后将卵囊悬浮液稀释来降低盐浓度。重复洗涤卵囊来除去盐并重悬于重铬酸盐溶液(2.5％w/v)中。将卵囊悬浮液在29℃振荡(例如，140rpm)温育大约72小时来诱导卵囊的孢子形成。或者，可以用次氯酸钠处理卵囊，然后孢子形成。通过使用血细胞计数器或McMaster载玻片的直接计数来测定孢子化卵囊数量/ml，并将培养物冷冻存储直至需要。
为了制备孢子囊，通过重复洗涤卵囊从上述卵囊悬浮液中除去重铬酸钾，这包括通过离心收集卵囊并重悬于去离子水或蒸馏水中。通过无微黄色-橙色判断重铬酸盐已经除去时，将卵囊悬浮液灭菌。有利地，杀菌剂是β丙内酯(BPL)。在有利的实施方案中，用无菌水将97％BPL 1∶10稀释，然后每升孢子化卵囊中加入10-20ml BPL。
在可替换的实施方案中，将卵囊悬浮液与等体积的次氯酸钠(漂白剂)混合并在室温温育15分钟。然后通过重复洗涤除去漂白剂，将卵囊重悬于生理盐水或去离子水中。
可使用多种已知的技术使卵囊破裂释放孢子囊。例如，可通过将卵囊与1-4mm直径的玻璃珠混合并通过手、涡旋混合器或振荡培养器振荡或使用手持匀浆器来使卵囊破裂释放孢子囊。如Dulski等，AvianDiseases，32：235-239，1988中所述的，可以通过在50％PERCOLL(包覆聚乙烯吡咯烷酮的二氧化硅颗粒的胶体悬浮液(PharmaciaBiotech出售))或1M蔗糖中的差速离心将未破裂的卵囊和卵囊壁与释放的孢子囊分离。与未破裂的卵囊和卵囊壁混合的或与未破裂的卵囊和卵囊壁分离的孢子囊均可以用于本发明的接种方法中。有利地，将施用剂量的孢子囊与卵囊和卵囊壁分离。
在有利的实施方案中，种子培养物的可接受收获物的说明如下。首先，测定孢子化卵囊与总卵囊的比例。只有符合或超过＞40％孢子形成的收获物被认为是可接受的。其次，每一卵囊收获物的大小、形状和外观必须是旨在产生的物种特征性的。例如，表征艾美球虫种中考虑的参数包括，但不限于，基于DNA的技术、DNA浮力密度、酶变异、宿主和部位特异性、免疫特异性、致病性、暴露前期和孢子形成时间(参见，例如，Long&Joyner，J Protozool.1984年11月；31(4)：535-41和Shirley，Acta Vet Hung.1997；45(3)：331-47，其公开内容通过参考引用并入本文)。
将从在此所述的种子培养物分离的孢子化卵囊合并来配制来自堆形艾美球虫、巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫早熟株的孢子化卵囊的混合物。通常，混合物是约10至约1000个堆形艾美球虫的卵囊，约10至约100个巨型艾美球虫的卵囊和约10至约1000个柔嫩艾美球虫的卵囊。有利地，混合物中孢子化卵囊的范围为约125至约500个堆形艾美球虫的卵囊，约25至约100个巨型艾美球虫的卵囊和约25至约500个柔嫩艾美球虫的卵囊。在一个实施方案中，低剂量为约125个堆形艾美球虫的卵囊，约25个巨型艾美球虫的卵囊和约25个柔嫩艾美球虫的卵囊。在另一个实施方案中，中剂量为约250个堆形艾美球虫的卵囊，约50个巨型艾美球虫的卵囊和约50个柔嫩艾美球虫的卵囊。再一个实施方案中，高剂量为约500个堆形艾美球虫的卵囊，约100个巨型艾美球虫的卵囊和约100个柔嫩艾美球虫的卵囊。混合物任选可包括约10至约1000个和缓艾美球虫的卵囊，有利地约125至约500个和缓艾美球虫的卵囊，低剂量中约125个和缓艾美球虫的卵囊，中剂量中约250个和缓艾美球虫的卵囊和高剂量中约500个艾美球虫的卵囊。
混合物任选可包括约10至约1000个和缓艾美球虫的卵囊，有利地约125至约500个和缓艾美球虫的卵囊，低剂量中约125个和缓艾美球虫的卵囊，中剂量中约250个和缓艾美球虫的卵囊和高剂量中约500个和缓艾美球虫的卵囊。
本发明还涉及特定比例的从堆形艾美球虫、巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫早熟株分离的孢子化卵囊，其中堆形艾美球虫∶巨型艾美球虫∶柔嫩艾美球虫的比例为约10∶1至2∶2至10(即，对于每10个堆形艾美球虫的孢子囊，存在约1至2个巨型艾美球虫的孢子囊和约2至10个柔嫩艾美球虫的孢子囊)。有利地，堆形艾美球虫∶巨型艾美球虫∶柔嫩艾美球虫的比例为约5∶1∶1(即，10∶2∶2)。
在含有和缓艾美球虫的实施方案中，堆形艾美球虫∶巨型艾美球虫∶和缓艾美球虫∶柔嫩艾美球虫的比例为约10∶1至2∶10∶2至10(即，对于每10个堆形艾美球虫的孢子囊，存在约1至2个巨型艾美球虫的孢子囊，约10个和缓艾美球虫的孢子囊和约2至10个柔嫩艾美球虫的孢子囊)。有利地，堆形艾美球虫∶巨型艾美球虫∶和缓艾美球虫∶柔嫩艾美球虫的比例为约5∶1∶5∶1(即，10∶2∶10∶2)。
有利地，混合物是约500个堆形艾美球虫的卵囊，约50至约100个巨型艾美球虫的卵囊和约100至约500个柔嫩艾美球虫的卵囊。在更有利的实施方案中，混合物是约500个堆形艾美球虫的卵囊，约100个巨型艾美球虫的卵囊和约100个柔嫩艾美球虫的卵囊。混合物可任选含有约500个和缓艾美球虫的卵囊，有利地约500个和缓艾美球虫的卵囊。
有利地，将卵囊悬浮于由含有庆大霉素的0.01M磷酸盐缓冲盐水溶液构成的保存剂中。在另一个实施方案中，将卵囊悬浮于多种保存剂或有机酸中的任一种中，所述有机酸诸如但不限于醋酸、柠檬酸、重铬酸钾或丙酸。例如，但不限于，将足量无菌的含有不超过30mcg/ml庆大霉素的0.01M磷酸盐缓冲盐水用来生产，每瓶2ml用于2000剂量规格(dose presentation)，每瓶5ml用于5000剂量规格和每瓶10ml用于10000剂量规格。有利地，将卵囊储存于无菌的硼硅酸盐玻璃瓶中。例如，但不限于，用半自动化或自动化分配器将卵囊无菌地装入疫苗瓶中，机械或人工插入塞子，放置铝封条并卷边。
在另一个实施方案中，将卵囊悬浮于含有助悬剂的无菌蒸馏水中，所述助悬剂例如多糖助悬剂，如树胶，例如黄原胶或阿拉伯胶，纤维素衍生物，例如羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或微晶纤维素，鹿角菜胶，藻酸钠，果胶或淀粉；多肽助悬剂，如明胶；合成聚合物助悬剂，如聚丙烯酸；或硅酸盐助悬剂，如硅酸铝镁(参见，例如，US专利No.5,055,292，将其公开内容以其整体通过参考引用并入本文)。
本发明还提供了验证孢子化卵囊是堆形艾美球虫、巨型艾美球虫或柔嫩艾美球虫早熟株特征性的。有利地，所有卵囊是减毒的，因为它们是早熟的。在另一个有利的实施方案中，每一卵囊收获物的大小、形状和外观必须是待产生物种特征性的。在另一个有利的实施方案中，测试孢子化卵囊混合物的纯度、外来病原体和/或测试动物例如鸡的死亡或严重损伤。Long P.L.和Reid W.M.(1982：A Guide for theDiagnosis of Coccidiosis in Chickens；University of GeorgiaResearch Report 404)和Joyner L.P.(1978：Identification andDiagnosis，Avian Coccidiosis，Poultry Science Symposium No.13，British Poultry Science Ltd)完全列出了各种艾美球虫种的特征，将其公开内容以其整体通过参考引用并入本文。
本发明还涉及测试来自堆形艾美球虫、巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫早熟株的孢子化卵囊的混合物的功效。有利地，测试涉及将约100,000至约500,000个堆形艾美球虫的卵囊和约10,000至约1,000,000个巨型艾美球虫的卵囊或约10,000至约100,000个柔嫩艾美球虫的卵囊的攻击剂量给予动物。在更有利的实施方案中，攻击剂量为约200,000个堆形艾美球虫的卵囊和约20,000至约500,000个巨型艾美球虫的卵囊或约20,000至约50,000个柔嫩艾美球虫的卵囊。
在包括和缓艾美球虫的实施方案中，可以使用约100,000至约500,000个和缓艾美球虫的卵囊，有利地约200,000个和缓艾美球虫的卵囊的攻击剂量。
本发明进一步提供了测定作为将来自堆形艾美球虫、巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫早熟株的孢子化卵囊的混合物给予鸟的结果，通过饲料转化率定义的鸟性能。将饲料转化效率定义为产生一磅肉的饲料磅数。通常的结果为约1.90或2.00。常用术语中饲料转化率的一个点为.01，其等于约0.5％(半个百分点)。如果使用公制，饲料转化率是每Kg肉的饲料Kg数，并且仍然与以上的成比例。
本发明涉及免疫鸡，有利地童子鸡。然而，在此所述疫苗的制备方法可以外推至受艾美球虫感染的其他动物，特别是鸟类，如但不限于，鸡、鸭、鹅、珠鸡、孔雀、雉、鸽子、鹌鹑或火鸡，或在不太有利的实施方案中，是兔子。
本发明包括免疫或疫苗组合物，该组合物包括从堆形艾美球虫、巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫的早熟株分离的孢子化卵囊的混合物。合并所分离的孢子化卵囊来配制来自堆形艾美球虫、巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫早熟株的孢子化卵囊的组合物。通常，混合物是约10至约1000个堆形艾美球虫的卵囊，约10至约100个巨型艾美球虫的卵囊和约10至约1000个柔嫩艾美球虫的卵囊。有利地，组合物中孢子化卵囊的范围为约125至约500个堆形艾美球虫的卵囊，约25至约100个巨型艾美球虫的卵囊和约25至约250个柔嫩艾美球虫的卵囊。在一个实施方案中，低剂量为约125个堆形艾美球虫的卵囊，约25个巨型艾美球虫的卵囊和约25个柔嫩艾美球虫的卵囊。在另一个实施方案中，中剂量为约250个堆形艾美球虫的卵囊，约50个巨型艾美球虫的卵囊和约50个柔嫩艾美球虫的卵囊。再一个实施方案中，高剂量为约500个堆形艾美球虫的卵囊，约100个巨型艾美球虫的卵囊和约100个柔嫩艾美球虫的卵囊。
有利地，组合物为约500个堆形艾美球虫的卵囊，约50至约100个巨型艾美球虫的卵囊和约100至约500个柔嫩艾美球虫的卵囊。在更有利的实施方案中，组合物为约500个堆形艾美球虫的卵囊，约100个巨型艾美球虫的卵囊和约100个柔嫩艾美球虫的卵囊。
混合物任选可包括约10至约1000个和缓艾美球虫的卵囊，有利地约125至约500个和缓艾美球虫的卵囊，低剂量中约125个和缓艾美球虫的卵囊，中剂量中约250个和缓艾美球虫的卵囊和高剂量中约500个和缓艾美球虫的卵囊。
本发明还涉及特定比例的从堆形艾美球虫、巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫的早熟株分离的孢子化卵囊，其中堆形艾美球虫∶巨型艾美球虫∶柔嫩艾美球虫的比例为约10∶1至2∶2至10(即，对于每10个堆形艾美球虫的孢子囊，存在约1至2个巨型艾美球虫的孢子囊和约2至10个柔嫩艾美球虫的孢子囊)。有利地，堆形艾美球虫∶巨型艾美球虫∶柔嫩艾美球虫的比例为约5∶1∶1(即，10∶2∶2)。
在含有和缓艾美球虫的实施方案中，堆形艾美球虫∶巨型艾美球虫∶和缓艾美球虫∶柔嫩艾美球虫的比例为约10∶1至2∶10∶2至10(即，对于每10个堆形艾美球虫的孢子囊，存在约1至2个巨型艾美球虫的孢子囊，约10个和缓艾美球虫的孢子囊和约2至10个柔嫩艾美球虫的孢子囊)。有利地，堆形艾美球虫∶巨型艾美球虫∶和缓艾美球虫∶柔嫩艾美球虫的比例为约5∶1∶5∶1(即，10∶2∶10∶2)。
术语“免疫组合物”在此涵盖一旦给予动物例如鸟能够引发对抗寄生虫或抗原或免疫原或表位的保护性免疫应答的任何组合物。术语“疫苗”在此涵盖一旦给予动物例如鸟能够诱导对抗病毒的保护性免疫应答或有效地保护动物对抗寄生虫感染的任何组合物。
根据本发明的免疫组合物或疫苗还可以包括病原体或病原体的免疫原、抗原或表位和另一种病原体、寄生虫或病毒的至少一种免疫原、抗原或表位，即，将球虫病疫苗与另一种鸟类疫苗组合。这样的免疫原、抗原或表位可以是，例如，细菌或寄生虫或病毒来源的或灭活或减毒形式的病原体、寄生虫或病毒。本发明还包括制备这些联合组合物的试剂盒，以及制备这些联合组合物的方法和这些联合组合物的组分制备联合组合物的用途。因此，本发明包括用于制备本发明的联合免疫或疫苗组合物的试剂盒；例如这样的试剂盒包括(a)生物体、病原体或病毒或其抗原或表位(有利地在此所提及的病原体)和(b)不同于(a)的生物体、病原体或病毒或其免疫原、抗原或表位(有利地病毒或其免疫原、抗原或表位，但是也考虑如在此提及的其他病原体)，在分开的容器中，任选在相同的包装中，并任选含有用于混合和/或施用的说明书。
根据本发明的免疫组合物和/或疫苗可以包括艾美球虫培养物或制剂(例如，灭活的或减毒的艾美球虫，或其免疫原或抗原或表位)，和另一种鸟病原体(包括但不限于灭活或减毒形式的病原体)的至少一种免疫原、抗原或表位。对于鸟多价免疫组合物和多价疫苗，多价免疫组合物和多价疫苗中包括和/或表达的其他鸟抗原或免疫原或表位的其他鸟病原体是以下的病毒、疾病或病原体：马莱克氏病病毒(MDV)(例如，血清型1和2，有利地为1)、新城疫病毒(NDV)、新城疫以外的副粘病毒(PMV2至PMV7)、传染性支气管炎病毒(IBV)、传染性贫血病毒或鸡贫血病毒(CAV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、传染性粘液囊病病毒(IBDV)、脑脊膜炎病毒或鸟脑脊病炎病毒(AEV或禽类白细胞增生病毒ALV)、火鸡出血性肠炎病毒(HEV)、肺病毒病病毒(TRTV)、鸡瘟病毒(禽流感)、鸡积水性心包炎病毒、禽呼肠孤病毒、球虫病、鸡减蛋综合征(EDS76)、禽痘、包涵体肝炎(腺病毒)、火鸡的淋巴增生疾病、鸡的网状内皮组织增殖、火鸡的网状内皮组织增殖、轮状病毒肠炎和火鸡鼻气管炎、梭菌(Clostridiumspp.)、大肠杆菌(Escherichia coli)、鸡支原体(Mycoplasmagallinarum)、鸡败血支原体(Mycoplasma gallisepticum)、鸟嗜血杆菌(Haemophilus avium)、鸡巴斯德氏菌(Pasteurellagallinarum)、多杀鸡杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocidagallicida)及其混合物。有利地，对于MDV，免疫原有利地是gB和/或gD，例如，gB和gD，对于NDV，免疫原有利地是HN和/或F，例如HN和F；对于IBDV，免疫原有利地是VP2；对于IBV，免疫原有利地是S(更有利为S1)和/或M和/或N，例如，S(或S1)和M和/或N；对于CAV，免疫原有利地是VP1和/或VP2；对于ILTV，免疫原有利地是gB和/或gD；对于AEV，免疫原有利地是env和/或gag/pro，例如，env和gag/pro或gag/pro；对于HEV，免疫原有利地是100K蛋白质和/或六邻体(hexon)；对于TRTV，免疫原有利地是F和/或G，和对于家禽疫，免疫原有利地是HA和/或N和/或NP，例如，HA和N和/或NP。因此，本发明还涉及制备这些组合物的方法以及为此目的的试剂盒。
根据本发明的还包括这样其它免疫成分(其他的免疫原、抗原或表位)的免疫组合物或疫苗具有诱导同时对抗几种感染或疾病或其病原体的免疫应答或保护的优势。这种其他的免疫成分可以是减毒或灭活的微生物、重组构建体或亚基(例如，蛋白质、糖蛋白、多肽或表位)。表位确定方法，如，产生重叠肽文库(Hemmer等，ImmunologyToday，1998，19(4)，163-168)，Pepscan(Geysen H.M.等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，1984，81(13)，3998-4002；Geysen H.M.等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA，1985，82(1)，178-182；Van derZee R.等，Eur.J.Immunol.，1989，19(1)，43-47；Geysen H.M.，Southeast Asian J.Trop.Med.Public Health，1990，21(4)，523-533；Multipin Peptide Synthesis Kits de Chiron)和算法(DeGroot A.等，Nature Biotechnology，1999，17，533-561)，可以用于本发明的实践中，来确定免疫原、抗原、多肽、糖蛋白等的表位，不需要过度的实验。从该信息，可以构建编码这样的表位的核酸分子，并且从那些知识和本领域的知识，可以构建载体或构建体，例如，表达免疫原、表位或抗原的重组病毒或载体或质粒；所有都不需要过度的实验。
药物学上或兽医学上可接受的载体或介质或赋形剂是本领域技术人员已知的。例如，药物学上或兽医学上可接受的载体或介质或赋形剂可以是0.9％NaCl(例如，盐水)溶液或磷酸盐缓冲剂。药物学上或兽医学上可接受载体或介质或赋形剂可以是有助于载体(或从本发明的载体体外表达的蛋白质)施用的任何化合物或化合物的组合；有利地，载体、介质或赋形剂可以促进转染和/或改善载体(或蛋白质)的保存。本文在免疫和疫苗接种方法的概述中讨论剂量和剂量体积，其也可以由本领域技术人员通过阅读本公开内容结合本领域的常识来确定，不需要任何过度实验。
根据本发明的免疫组合物和疫苗可以包括一种或多种佐剂或基本上由一种或多种佐剂组成。用于本发明实践中的合适佐剂是(1)丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、马来酸酐和烯基衍生物聚合物，(2)免疫刺激序列(ISS)，如具有一个或多个非甲基化CpG单元的寡脱氧核苷酸序列(Klinman等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，1996，93，2879-2883；WO98/16247)，(3)水包油型乳剂，如SPT乳剂，描述于“Vaccine Design，The Subunit and Adjuvant Approach”的p147，M.Powell，M.Newman，Plenum Press 1995出版，和乳剂MF59，描述于相同文献的p183，(4)含有季铵盐的阳离子脂质，(5)细胞因子，(6)氢氧化铝或磷酸铝或(7)在引用并通过参考并入本申请的任何文献中讨论的其他佐剂，或(8)其任意组合或混合物。
水包油型乳剂(3)，其对于病毒载体特别合适，可以基于：轻液体石蜡油(欧洲药典类型)，类异戊二烯油，如角鲨烷、角鲨烯，从烯烃的低聚化获得的油，例如异丁烯或癸烯，具有直链烷基的酸或醇的酯，如植物油、油酸乙酯、聚乙二醇、二(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三(辛酸酯/癸酸酯)和丙二醇二油酸酯，或支链脂肪醇或酸的酯，特别是异硬脂酸酯。
油结合乳化剂使用来形成乳剂。乳化剂可以是非离子表面活性剂，如：失水山梨糖醇、二缩甘露醇(例如，脱水甘露糖醇油酸酯)、甘油、聚甘油或丙二醇与油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或羟基硬脂酸的酯，所述酯任选乙氧基化，或聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，如Pluronic，例如，L121。
类型(1)佐剂聚合物中，优选交联的丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，尤其是通过糖或多元醇的聚烯基醚交联的。这些化合物已知名称为卡波姆(Pharmeuropa，vol.8，no.2，1996年6月)。本领域技术人员还可以参考U.S.专利No.2,909,462，其提供了这样的通过具有至少三个羟基(优选不超过八个这样的基团，至少三个羟基的氢原子由不饱和的具有至少两个碳原子的脂肪族基团替代)的多羟基化合物交联的丙烯酸聚合物。优选的基团是含有2至4个碳原子的那些，例如，乙烯基、烯丙基和其他乙烯性(ethylenically)不饱和基团。不饱和基团还可以含有其他取代基，如甲基。以名称Carbopol销售的产品(BFGoodrich，Ohio，USA)是特别合适的。它们通过烯丙基蔗糖或通过烯丙基季戊四醇交联。其中，参考Carbopol 974P，934P和971P。
关于马来酸酐-烯基衍生物共聚物，优选EMA(Monsanto)，其是直链或交联乙烯-马来酸酐共聚物，并且它们是例如通过二乙烯醚交联的。还可以参考J.Fields等，Nature 186：778-780，1960年6月4日。
关于结构，丙烯酸或甲基丙烯酸聚合物和EMA优选由具有以下通式的基本单元形成：
其中：
-R1和R2，可以相同或不同，表示H或CH3
-x＝0或1，优选x＝1
-y＝1或2，且x+y＝2。
对于EMA，x＝0且y＝2，对于卡波姆，x＝y＝1。
这些聚合物可溶于水或生理盐溶液(20g/l NaCl)并可以例如通过苏打(NaOH)将pH调节至7.3至7.4，来提供可以将表达载体引入其中的佐剂溶液。最终疫苗组合物中的聚合物浓度可以为0.01至1.5％w/v，有利地0.05至1％w/v并优选0.1至0.4％w/v。
含有季铵盐的阳离子脂质(4)是有利的但不是专门适用于质粒，优选具有以下通式的那些：
其中R1是具有12至18个碳原子的饱和或不饱和直链脂肪族基团，R2是含有2或3个碳原子的另一脂肪族基团且X是胺或羟基。
在这些阳离子脂质中，优选DMRIE(N-(2-羟乙基)-N，N-二甲基-2，3-双(四癸氧基)-1-丙烷铵；WO96/34109)，优选与中性脂质相结合，所述中性脂质优选DOPE(二油酰-磷脂酰-乙醇胺；Behr J.P.，1994，Bioconjugate Chemistry，5，382-389)，来形成DMRIE-DOPE。
有利地，与佐剂的混合物临时形成并优选与制剂的施用同时或就在制剂施用前不久；例如，在施用前不久或施用前，形成质粒-佐剂混合物，有利地在施用前给予足够的时间来使混合物形成复合物，例如，施用前约10至约60分钟，如施用前大约30分钟。
当DOPE存在时，DMRIE∶DOPE摩尔比优选为约95∶约5至约5∶约95，更有利地约1∶约1，例如，1∶1。
DMRIE或DMRIE-DOPE佐剂∶质粒重量比可以为约50∶约1至约1∶约10，如约10∶约1和约1∶约5，优选约1∶约1和约1∶约2，例如，1∶1和1∶2。
细胞因子(5)在免疫或疫苗组合物中可以是蛋白质形式，或可以在宿主中与免疫原或其表位共同表达。优选细胞因子的共同表达，通过表达免疫原或其表位的相同载体，或通过为此单独分开的载体。
本发明包括制备这样的联合组合物；例如通过混合活性成分，有利地在一起并连同佐剂、载体、细胞因子和/或稀释剂。
可以用于本发明中的细胞因子包括，但不限于，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素α(IFN-α)、干扰素β(IFN-β)、干扰素γ(IFNγ)、白细胞间介素-1α(IL-1α)、白细胞间介素-1β(IL-1β)、白细胞间介素-2(IL-2)、白细胞间介素-3(IL-3)、白细胞间介素-4(IL-4)、白细胞间介素-5(IL-5)、白细胞间介素-6(IL-6)、白细胞间介素-7(IL-7)、白细胞间介素-8(IL-8)、白细胞间介素-9(IL-9)、白细胞间介素-10(IL-10)、白细胞间介素-11(IL-11)、白细胞间介素-12(IL-12)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、肿瘤坏死因子β(TNFβ)和转化生长因子β(TGFβ)。理解细胞因子可以与本发明的免疫或疫苗组合物共同施用和/或序贯施用。因此，例如，本发明的疫苗还可以含有在体内表达合适细胞因子的外源核酸分子，例如，与待接种疫苗的或其中待引发免疫应答的该宿主相匹配的细胞因子(例如，对于待施用于鸟类的制剂，鸟细胞因子)。
本发明还提供了引发免疫应答或诱导免疫或保护性应答，包括给予有效量的免疫或疫苗组合物来引发或诱导动物体内的应答，该组合物包括从堆形艾美球虫、巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫的早熟株分离的孢子化卵囊的混合物。有利地，动物是鸟类，如但不限于，鸡、鸭、鹅、珠鸡、孔雀、雉、鸽子、鹌鹑或火鸡。在最有利的实施方案中，鸟类是鸡，有利地是童子鸡。引发免疫应答或诱导免疫应答的方法还可以包括给予佐剂、细胞因子或两者。
引发免疫应答或诱导免疫或保护性应答的有效量是约10至约1000个堆形艾美球虫的卵囊，约10至约100个巨型艾美球虫的卵囊和约10至约1000个柔嫩艾美球虫的卵囊。有利地，引发免疫应答或诱导免疫或保护性应答的有效量是约500个堆形艾美球虫的卵囊，约50至约100个巨型艾美球虫的卵囊和约100至约500个柔嫩艾美球虫的卵囊。更有利地，有效量是约500个堆形艾美球虫的卵囊，约100个巨型艾美球虫的卵囊和约100个柔嫩艾美球虫的卵囊。另一个实施方案中，有效量足以抵抗对动物的约100,000至约500,000个堆形艾美球虫的卵囊和约10,000至约1,000,000个巨型艾美球虫的卵囊或约10,000至约100,000个柔嫩艾美球虫的卵囊的攻击剂量。更有利地，攻击剂量是约200,000个堆形艾美球虫的卵囊和约20,000至约500,000个巨型艾美球虫的卵囊或约20,000至约50,000个柔嫩艾美球虫的卵囊。
混合物任选可含有约10至约1000个和缓艾美球虫的卵囊，有利地约125至约500个和缓艾美球虫的卵囊，低剂量中约125个和缓艾美球虫的卵囊，中剂量中约250个和缓艾美球虫的卵囊，和高剂量中约500个和缓艾美球虫的卵囊。
引发免疫应答或诱导免疫或保护性应答的有效量还与从堆形艾美球虫、巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫早熟株分离的孢子化卵囊的特定比例相关，其中堆形艾美球虫∶巨型艾美球虫∶柔嫩艾美球虫的比例为约10∶1至2∶2至10(即，对于每10个堆形艾美球虫的孢子囊，存在约1至2个巨型艾美球虫的孢子囊和约2至10个柔嫩艾美球虫的孢子囊)。有利地，堆形艾美球虫∶巨型艾美球虫∶柔嫩艾美球虫的比例为约5∶1∶1(即，10∶2∶2)。
在含有和缓艾美球虫的实施方案中，堆形艾美球虫∶巨型艾美球虫∶和缓艾美球虫∶柔嫩艾美球虫的比例为约10∶1至2∶10∶2至10(即，对于每10个堆形艾美球虫的孢子囊，存在约1至2个巨型艾美球虫的孢子囊，约10个和缓艾美球虫的孢子囊和约2至10个柔嫩艾美球虫的孢子囊)。有利地，堆形艾美球虫∶巨型艾美球虫∶和缓艾美球虫∶柔嫩艾美球虫的比例为约5∶1∶5∶1(即，10∶2∶10∶2)。
本发明的另一方面是分别使用根据本发明的免疫组合物或疫苗组合物的免疫方法或疫苗接种方法。
该方法包括至少一次给予动物有效量的根据本发明的免疫组合物或疫苗。动物可以是雄性或磁性。特别地，可以通过肌内(IM)、皮内(ID)或皮下(SC)注射或通过鼻内或经口施用进行该施用，其中经口施用包括但不限于在饲料或饮用水、凝胶或喷雾中给予。可以通过注射器或无针装置(象例如Pigjet或Biojector(Bioject，Oregon，USA))来给予根据本发明的免疫组合物或疫苗。在有利的实施方案中，施用是经口施用。
根据本发明的组合物还可以给予其他哺乳动物，例如，小鼠或实验室动物，例如，来产生多克隆抗体，或制备杂交瘤以产生单克隆抗体。
本发明提供了对动物的免疫，有利地动物是鸟类。给予球虫病疫苗的方法描述于US专利4,438,097；4,639,372；4,808,404；5,055,292；5,068,104；5,387,414；5,602,033；5,614,195；5,635,181；5,637,487；5,674,484；5,677,438；5,709,862；5,780,289；5,795,741；5,814,320；5,843,722；5,846,527；5,885,568；5,932,225；6,001,363和6,100,241中，将其公开内容以其整体通过参考引用并入本文。该方法包括将有效免疫剂量的本发明的疫苗给予动物。可以通过本领域技术人员公知的任一种方法给予疫苗，例如，通过肌内、皮下、腹膜内、静脉内、鼻内、经口、皮内、粘液囊内(intrabursal)(就在鸡肛门以上)、卵内(inovo)或通过眼给予。施用的方法是本领域技术人员已知的。例如，U.S.专利No.5,693,622；5,589,466；5,580,859；和5,566,064，在此以其整体通过参考引用并入本文。还可以在喷雾室(spray cabinet)中对鸟施用疫苗。还可以在卵内对鸟施用疫苗，如描述于U.S.专利No.4,458,630和6,627,205中，将其公开内容通过参考引用并入本文。
有利地，在喷雾室中对鸟施用疫苗，喷雾室即其中将鸟放置并暴露于含有疫苗的蒸汽或通过流动(course)喷雾的室。在另一个有利的实施方案中，经口施用免疫或疫苗组合物。或者，可在饮用水或饲料中施用免疫或疫苗组合物。
本发明包括免疫或疫苗组合物，该组合物包括来自堆形艾美球虫、巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫早熟株的孢子化卵囊的混合物。从在此所述的种子培养物分离来自堆形艾美球虫、巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫早熟株的孢子化卵囊。通常，组合物中孢子化卵囊的剂量范围为约10至约1000个堆形艾美球虫的卵囊，约10至约100个巨型艾美球虫的卵囊和约10至约1000个柔嫩艾美球虫的卵囊。有利地，组合物中孢子化卵囊的剂量范围为约125至约500个堆形艾美球虫的卵囊，约25至约100个巨型艾美球虫的卵囊和约25至约500个柔嫩艾美球虫的卵囊。在一个实施方案中，低剂量为约125个堆形艾美球虫的卵囊，约25个巨型艾美球虫的卵囊和约25个柔嫩艾美球虫的卵囊。在另一个实施方案中，中剂量为约250个堆形艾美球虫的卵囊，约50个巨型艾美球虫的卵囊和约50个柔嫩艾美球虫的卵囊。在另一个实施方案中，高剂量为约500个堆形艾美球虫的卵囊，约100个巨型艾美球虫的卵囊和约100个柔嫩艾美球虫的卵囊。
有利地，免疫或疫苗组合物的剂量为约500个堆形艾美球虫的卵囊、约50至约100个巨型艾美球虫的卵囊和约100至约500个柔嫩艾美球虫的卵囊。在更有利的实施方案中，剂量为约500个堆形艾美球虫的卵囊、约100个巨型艾美球虫的卵囊和约100个柔嫩艾美球虫的卵囊。
混合物任选可包括约10至约1000个和缓艾美球虫的卵囊，有利地约125至约500个和缓艾美球虫的卵囊，低剂量中约125个和缓艾美球虫的卵囊，中剂量中约250个和缓艾美球虫的卵囊和高剂量中约500个和缓艾美球虫的卵囊。
本发明还涉及在免疫或疫苗组合物剂量中特定比例的从堆形艾美球虫、巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫的早熟株分离的孢子化卵囊，其中堆形艾美球虫∶巨型艾美球虫∶柔嫩艾美球虫的比例为约10∶1至2∶2至10(即，对于每10个堆形艾美球虫的孢子囊，存在约1至2个巨型艾美球虫的孢子囊和约2至10个柔嫩艾美球虫的孢子囊)。有利地，堆形艾美球虫∶巨型艾美球虫∶柔嫩艾美球虫的比例为约5∶1∶1(即，10∶2∶2)。
在含有和缓艾美球虫的实施方案中，堆形艾美球虫∶巨型艾美球虫∶和缓艾美球虫∶柔嫩艾美球虫的比例为约10∶1至2∶10∶2至10(即，对于每10个堆形艾美球虫的孢子囊，存在约1至2个巨型艾美球虫的孢子囊，约10个和缓艾美球虫的孢子囊和约2至10个柔嫩艾美球虫的孢子囊)。有利地，堆形艾美球虫∶巨型艾美球虫∶和缓艾美球虫∶柔嫩艾美球虫的比例为约5∶1∶5∶1(即，10∶2∶10∶2)。
有利地，将卵囊悬浮于由含有庆大霉素的0.01M磷酸盐缓冲盐水溶液构成的保存剂中。在另一个实施方案中，将卵囊悬浮于多种保存剂或有机酸中的任一种中，所述有机酸诸如但不限于醋酸、柠檬酸、重铬酸钾或丙酸。例如，但不限于，将足量无菌的含有不超过30mcg/ml庆大霉素的0.01M磷酸盐缓冲盐水用来生产，每瓶2ml用于2000剂量规格，每瓶5ml用于5000剂量规格和每瓶10ml用于10000剂量规格。有利地，将卵囊储存于无菌的硼硅酸盐玻璃瓶中。例如，但不限于，用半自动化或自动化分配器将卵囊无菌地装入疫苗瓶中，机械或人工插入塞子，放置铝封条并卷边。
将疫苗作为含有多剂量的2000剂量小瓶，5000剂量小瓶，010,000剂量小瓶或20,000剂量小瓶销售。产品的有效期从功效测试开始日期起应当不超过13个月。
动物，有利地为鸟类，可以在任何合适的年龄接种疫苗，通常在第一次接种疫苗前为约一至三天大。有利地，给动物接种一次疫苗。任选，使用两个剂量的疫苗时，第一次通常在动物3天至一周大时给予，随后再过1-10周后给予，取决于所接种动物的类型。
在有利的实施方案中，对于每种动物物种的应用、剂量和施用途径如下。本发明的免疫或疫苗组合物用于接种一天大或更大的健康鸡，辅助预防由于球虫病引起的疾病。有利地，剂量为每只鸡一剂，通过每100只鸡20ml的粗水滴(coarse water)喷雾。
现在通过以下非限制性实施例来进一步描述本发明。
实施例
实施例1：球虫产生
产品的组成.可以使用的微生物是堆形艾美球虫、巨型艾美球虫、和缓艾美球虫和柔嫩艾美球虫。微生物原种培养物的来源如下。堆形艾美球虫的亲本在1969年获自Hess and Clark Laboratories的T.K.Jeffers，并认为由Dr.M.Farr在USDA，Beltsville，MD分离，其源自单个卵囊。巨型艾美球虫培养物源自从Georgia、Delaware、Maryland、Virginia和Texas获得的10种纯化分离物的杂交混合物。和缓艾美球虫培养物的亲本在1978年7月从Gainesville，Georgia分离并通过单卵囊分离纯化。柔嫩艾美球虫培养物的亲本从Dr.Patten自20世纪60年代早期维持于Pennsylvania State University的培养物获得并在1982年由University of Georgia获得。
所用的每个艾美球虫株是各微生物的早熟株，如AvianPathology，17：305-314，1988，题目为“Eimeria of AmericanChickens：Characteristics of Six Attenuated Strains Producedby Selection for Precocious Development”，P.L.Long和JoyceK.Johnson中所述的，将其公开内容以其整体通过参考引用并入本文。根据该方法通过选择早熟发育来使微生物减毒。
培养物.通过它们独特的显微外观、大小和形状、以及受感染的鸡肠或盲肠的区域来鉴定产品中所用的每个艾美球虫种，如Long，P.L.和W.M.Reid，A guide for the diagnosis of cocciodiosis inchickens，Re.Report 404(修订的Report 355)，Athens，GA：College of Agriculture Experiment Station，Univ.of Georgia；1982中所述的，将其公开内容以其整体通过参考引用并入本文。
如上所述通过选择早熟发育来使微生物减毒。通过使用9 CFR113.37中所述的方法测试，每个培养物是无病原体的。将上述原种培养物维持于液氮的液相或气相中。
将2至8周龄的鸡用于产生种子培养物。施用途径是经口(即，口服)。所有种子是孢子化卵囊并在2至8周龄的SPF鸡中产生。维持专用设备用于每个艾美球虫种。将足量体积的孢子化卵囊(种子)与无抗球虫药的饲料混合，或通过经口管饲给予，给每只鸡提供表1中所示的最小剂量。孢子化卵囊在2至8周龄的SPF鸡中连续传代，对传代没有限制，直至卵囊的数量足以用作生产的种子。为了维持生存力/感染力，培养物不能保持长于12个月。
表1：孢子化卵囊(种子)的最小剂量
| 种 | 每只鸡的卵囊 |
| 堆形艾美球虫 | 100至15,000 |
| 巨型艾美球虫 | 100至15,000 |
| 和缓艾美球虫 | 100至15,000 |
| 柔嫩艾美球虫 | 100至15,000 |
从接种后第三至第八天起每天收集粪便。将随机的鸡处死并观察每个种的特征性感染，除了和缓艾美球虫外。如果存在任何无关疾病的迹象，则不进行收集。
将用作参照的原种培养物维持于液氮中。将生产培养物维持于5±3℃，并在二至八周龄的SPF鸡中传代。
用于播种或接种的悬浮液的制备包括种子培养物在二至八周龄的SPF鸡中的连续传代，直至产生足量卵囊用于生产。
将足量体积的孢子化卵囊(种子)与无抗球虫药的饲料混合并施用以给每只鸡提供表1中所示的最小剂量。从接种后第三至第八天起收集粪便作为一批。将随机的鸡处死并观察每个种的特征性感染，除了和缓艾美球虫外。如果存在任何无关疾病的迹象，则不进行收集。如上所述通过选择早熟发育来使微生物减毒。
收获.在取微生物之前，为了生产目的，将鸡圈养在指定生产各个种的房间里。用无抗球虫药的饮食喂养鸡，并使它们自由饮水。从接种后第三至第八天起每日收集粪便，并保持于5±3℃直至处理。
为了生产目的收获微生物的技术如下。将粪便在水中以大约10％(w/v)的比例均化。通过将均化物通过筛网来除去大颗粒。通过离心、过筛或通过在5±3℃保持长达24小时来分离固体。如果通过在5±3℃静置来分离固体，则进一步通过离心将它们浓缩。丢弃上清液，将固体重悬于饱和NaCl(80％w/v)水溶液中。将所得到的溶液离心。从液体上部收集(取出)卵囊并重悬于水中。理想的是，用水将剩余的液体稀释至20-40％NaCl并离心。然后将沉淀重悬于饱和NaCl溶液中并再次离心，直至再没有其他卵囊可回收。将卵囊洗涤不超过两次。通过重复的重悬离心循环将卵囊洗去盐，接着重悬于0.5％次氯酸钠溶液中10至15分钟。然后通过重复的(3X)离心和重悬步骤将卵囊洗去次氯酸钠溶液。最后的重悬在2.5％重铬酸钾(K2CrO7)水溶液中进行。然后将卵囊转移至孢子形成容器中。通过用空气喷射悬浮液来促进孢子形成，在27±3℃不超过72小时。孢子形成后，将卵囊保持于5±3℃直至产生终产物。
在有利的实施方案中，对于可接受的收获物的说明如下。首先，测定孢子化卵囊对总卵囊的比例。只有符合或超过＞40％孢子形成的收获物才认为是可接受的。其次，每一卵囊收获物的大小、形状和外观必须是待生产物种特征性的。
不用于生产中的丢弃材料以符合9 CFR 114.15的方式处置。
产品的制备 使用大量收获物液体组装成系列或子系列的终产品。所有卵囊是减毒的，因为它们是早熟的，如上所述。将卵囊悬浮于由含有不超过30.0mcg庆大霉素的0.01M磷酸盐缓冲盐水溶液构成的保存剂中。将产品标准化来产生至少如表2中所示的每个种的孢子化卵囊的最终数量。
表2：孢子化卵囊的标准化剂量
| 种 | 每剂的卵囊 |
| 堆形艾美球虫 | 500 |
| 巨型艾美球虫 | 50 |
| 和缓艾美球虫 | 500 |
| 柔嫩艾美球虫 | 500 |
如下组装一个系列。从5±3℃贮存取出四个艾美球虫种中每一种的大体积悬浮液批次，边搅拌边使其温热至室温。无菌地取出每批中的足量体积并混合，来产生不低于以上表2中所示的每剂的卵囊，如通过基于对每一整体悬浮液的计数的计算而确定的。如果需要，合并每一艾美球虫种的多个批次来提供所需数量的孢子化卵囊。将足量无菌的含有不超过30mcg/ml庆大霉素的0.01M磷酸盐缓冲盐水用来生产，每瓶2ml用于2000剂量规格，每瓶5ml用于5000剂量规格和每瓶10ml用于10,000剂量规格。将散装系列维持于恒定搅拌下。
表3：系列体积的实施例
(基于10,000剂量产品的10,000,000剂量批次)
| 体积 | |
| 堆形艾美球虫 | 500ml@1.0×107卵囊/ml |
| 巨型艾美球虫 | 300ml@1.67×106卵囊/ml |
| 和缓艾美球虫 | 750ml@6.7×106卵囊/ml |
| 柔嫩艾美球虫 | 1050ml@2.4×106卵囊/ml |
| 0.01M PBS/庆大霉素 | 17,400ml |
| 总体积 | 20,000ml |
平均10,000-剂量系列从20L至40L。填充体积为每1000剂量1.0ml。疫苗瓶是无菌的硼硅酸盐玻璃瓶。
填充并密封最终容器的方法和技术如下。使用半自动化或自动化分配器将疫苗无菌地装入疫苗瓶中。机械或手工插入塞子。放置铝封条并卷边。
每个剂量含有不低于表2所示剂量的孢子化卵囊，如从整体计数计算的。将序号分配给单次操作中分批并填充的每一批量。
测试 使用9 CFR 113.2 7(e)中所述的测试方法测试每个系列的纯度。任一温育条件的平均计数应当不超过每剂1个菌落。如果在最初的测试中任一温育条件的平均计数超过每剂1个菌落，任选使用20个未开封的最终容器进行一次再测试。如果最终测试中任一温育条件的平均计数超过每剂1个菌落，该系列是不合要求的。
显示沙门氏菌(Salmonella)被次氯酸钠和重铬酸钾有效杀灭，因此，没有进行另外的测试。显示支原体(Mycoplasma)被次氯酸钠有效杀灭，因此，没有进行另外的测试。
根据9 CFR 113.37测试每个系列的外来病原体。
为了测试疫苗的安全性，通过用10剂疫苗喷雾接种对至少25只一天大的无特异性病原体的鸡中的每一只接种疫苗。每天观察鸡，持续21天。检查在此期间死亡的鸡并确定死亡原因。如果至少20只鸡没有活过观察期，测试是无结果的。如果任何疾病或死亡直接归因于疫苗，该系列是不合要求的。疫苗特征性的轻微肠损伤被认为是正常的，并在安全性评价中不予考虑。如果少于20只鸡活过观察期且没有可归于疫苗的死亡或严重损伤，任选将测试重复一次。如果不重复测试，则声明该系列是不合要求的。
测试从每批新生产种子中产生的第一系列终产物的功效。在1至14天大的SPF或童子鸡中测试产品。使用以上所述的配制前计数和从接种的鸟类回收的卵囊来评价从该生产种子产生的随后系列的功效。使用不超过70只鸡。用一个田间剂量(field dose)的疫苗经口接种不超过35只鸡。初次接种后二十六至三十天，将所有的鸡单独鉴定并记录重量。经口攻击来自以下所示每组的不超过10只接种鸡和10只对照鸡，使用1.0ml表4中所示的每个攻击剂量。
表4：攻击剂量
| 种 | 攻击剂量 | |
| 1组攻击 | 堆形艾美球虫 | 100,000至500,000个卵囊 |
| 巨型艾美球虫 | 10,000至1,000,000个卵囊 | |
| 2组攻击 | 和缓艾美球虫 | 100,000至500,000个卵囊 |
| 3组攻击 | 柔嫩艾美球虫 | 10,000至100,000个卵囊 |
还基于致病性选择攻击剂量，使得选定的水平将给出至少2的最小分数。
攻击后六天，将来自表4中每组的接种者和对照处死，称重并检查肠和盲肠以及将损伤评分。根据Johnson和Reid球虫病评分系统来评分，如Experimental Parisitology，Vol 28，p30-36，1970中所述的，将其公开内容以其整体通过参考引用并入本文，如表5中所示。
表5：损伤的评分
| 分数 | 损伤 |
| 0 | 无 |
| +1 | 轻微损伤 |
| +2 | 中度 |
| +3 | 严重 |
| +4 | 极严重的损伤或死亡 |
制备后步骤.作为含有多剂量的2000剂量小瓶、5000剂量小瓶、010,000剂量小瓶或20,000剂量小瓶来销售疫苗。代表性样品的收集、存储和提交按照9 CFR 113.3。从功效测试开始日期起产品的有效期不超过13个月，并根据9 CFR 114.13证实。
每个动物物种的使用、剂量和施用途径如下。该产品用于对1天大或更大的健康鸡的接种，帮助预防由于球虫病引起的疾病。剂量为每只鸡一剂，通过粗水滴喷雾(每100只鸡20ml)。
实施例2：含有鸟球虫减毒株的试验疫苗的功效，与市售活球虫病疫苗和盐霉素(一种商业鸟类的抗球虫药物)相比较
该实施例的目的是测定减毒艾美球虫卵囊疫苗保护童子鸡类型的鸡免受毒力艾美球虫种攻击的功效，与USDA批准的活卵囊疫苗(Coccivac-B)相比较，并比较减毒疫苗的使用与常规抗球虫药物盐霉素。
目标变量如下。主要变量是肠损伤分数。接受标准为与未接种疫苗的受攻击的对照鸟类相比较时较低的攻击后肠球虫损伤。次要变量是(1)7周生长(grow-out)期过程中的重量增加和饲料转化以及(2)死亡率。接受标准包括接种疫苗的鸟类与接种Coccivac B或用抗球虫药物医治的鸟类相比相等或较高的重量增加和饲料转化，以及接种疫苗的鸟类与未接种疫苗的对照鸟类、接种Coccivac B的鸟类和抗球虫药治疗的鸟类相比的低死亡率。
材料.疫苗描述于表6中。
表6：疫苗
| 试验疫苗 | Coccivac | |
| 学名 | 堆形艾美球虫、柔嫩艾美球虫、巨型艾美球虫、和缓艾美球虫 | 堆形艾美球虫、巨型艾美球虫、柔嫩艾美球虫、变位艾美球虫 |
| 制造商 | 从Long的减毒株开发 | Schering Plough |
| 制剂 | 冷藏悬浮液 | |
| 制备 | 通过口接种易感鸡，从粪便收集卵囊，孢子形成，计数并稀释至合适的接种剂量，来制备卵囊 | 所有者信息 |
| 有效期 | 大约一年 | 大约一年 |
| 存储要求 | 4°-10℃-存储于1.5％的重铬酸钾中，大约9个月 | 4°-10℃-存储于1.5％的重铬酸钾中，大约9个月 |
| 剂量 | 用1x疫苗多价接种，其中1x定义为柔嫩艾美球虫100个卵囊/鸟+堆形艾美球虫500个卵囊/鸟+和缓艾美球虫500个卵囊/鸟+巨型艾美球虫100个卵囊/鸟 | 所有者信息 |
| 施用途径 | Spra-Vac用于经口施用 | 经口施用 |
表7：毒力/攻击生物体
| 学名 | 堆形艾美球虫、和缓艾美球虫、柔嫩艾美球虫、巨型艾美球虫 |
| 来源 | 野外分离物或毒力株 |
| 制备 | 参见表6 |
| 存储要求 | 参见表6 |
| 剂量 | 用20,000至50,000个柔嫩艾美球虫和巨型艾美球虫的卵囊以及200,000个和缓艾美球虫和堆形艾美球虫的卵囊多价经口接种易感鸡 |
| 途径 | 经口 |
表8：动物
| 物种 | 家鸡(Gallus domesticus)(鸡) |
| 品系/品种 | 商业鸟类 |
| 性别 | F/M |
| 年龄 | 一天 |
| 数量 | 大约4000只 |
| 条件/适应环境 | 接种疫苗后立即将鸡置于动物房内 |
动物管理相似并适当关心它们的健康状况。遵照所有适用的规章处理动物。
实验设计 实验设计如下。
表9 实验处理组
| 组 | 年龄 | 鸟/Rep | Reps/组 | 总鸟数 | 施用途径 | 接种物 | 处理 |
| 1 | 1天 | 650 | 2 | 1300 | 喷雾* | 实验疫苗 | 一次 |
| 2 | 1天 | 650 | 2 | 1300 | 喷雾* | Coccivac-B | 一次 |
| 3 | 1天 | 650 | 2 | 1300 | N/A | 盐霉素 | 饲料中60g/吨，每天，直至第42天(对于取出用于攻击的鸟，在第28天停止) |
| 4 | 1天 | TBD | 1 | TBD | N/A | 未接种疫苗 | N/A |
*每100只鸡递送20ml
时间线如下。第0天，按围栏将鸟称重。如表9中所述的对组1和组2的鸟接种疫苗，使用每种疫苗1300只鸟的方案，分成2个围栏，一半屋一栏。组3的鸟开始饲喂盐霉素，60g/吨，如对组1和2所述分栏。在栏中养鸡。另外的孵化配对鸡(hatchmetes)留在金属丝笼子里，作为未接种疫苗的鸡。
在第21天，对于所有的鸟，将饲料从起始饲料改成生长饲料，组3继续盐霉素。
在第28天，将待攻击的鸟转移至金属丝笼中，组3中待攻击的鸟中断使用盐霉素。将所有的鸟和饲料称重。从大围栏各组垃圾中收集新鲜粪便样品，每个围栏20个样品。按物种定量卵囊。
在第29天，使用表7中所述数量的卵囊攻击笼子中的鸟。
在第35天，处死攻击鸟，将损伤评分，并测得重量增加。
在第42天，将所有组改变为未加药物的增肥(finisher)饲料并称重留下的饲料(feed back)。
在第49天，所有鸟和饲料称重，并终止试验。
实验程序
接种疫苗/用药。在半数屋子里重复表9中确定为组1-3的鸟的三种处理，每个屋子三个围栏，每个围栏650只鸟，每种处理总共1300只鸟。如表9中所述的将组1至3中的鸟接种疫苗。另外的处理组(4)分开饲养在干净的笼子里，作为未接种疫苗的、未处理的对照，只用于攻击测试。
对处理组1、2和4给予没加药物的饲料。处理组3在第1天开始至第42天给予盐霉素(60g/吨)。在转移至攻击笼之后，对组3中待攻击的鸟给予没加药物的饲料。给予起始饲料直至21天，生长饲料直至42天和增肥饲料直至49天。记录配给的饲料，并且将任何剩余的未消耗的饲料在改变饲料时和终止时称回重量。
观察。在第0和28天，按围栏将鸟称重。在49天按围栏和性别称重。每天两次收集死鸟并进行尸检来确定死亡原因。观察第28天收集的粪便样品中的活卵囊并根据种来定量。
攻击。在第28天，将来自每个围栏的3reps×10只鸟(每种处理总共60只)称重，并转移至层架式鸡笼里，用于用艾美球虫的野外株(对应于疫苗中所用的种)攻击。对笼子中的所有鸟给予没加药物的饲料。在第29天，攻击组1-4的鸟，然后在第35天处死。记录损伤分数和重量。
通过在接种疫苗之前从鸡盒里随机挑选，将动物随机分配至每个处理组中。科学家知道所述处理组，因为在组之间要维持严格的安全措施来防止交叉污染。
不良事件的伴随用药和处理。接种Coccivac的鸟在进入试验14天时开始生病。诊断为坏死性肠炎。致病因子鉴定为索氏梭状芽孢杆菌(Clostridium sordelli)。对试验中所有的鸟施用青霉素G来减少围栏之间的污染及其影响，并消除组间可歪曲球虫病结果的任何处理上的差异。
数据分析
测量标准。地面围栏阶段的主要变量是第28和49天的活体重量和第49天的饲料转化。对于攻击阶段，主要变量为攻击后六天的重量增加，以及也是在攻击后六天的上、中以及盲肠肠节段的损伤分数。
统计学分析。使用SAS、Cary、NC(8.2版本)进行所有的统计学分析。统计学显著性是基于对该研究中接受检查的无效假设的二尾检验，获得0.05或更低的p-值。
肠损伤分数。使用包含处理组和批(block)因素的对数模型和/或包含处理组和批因素的存活分析模型(根据数据的性质)来分析攻击后肠球虫损伤的发生率和严重程度(分类损伤分数)。
死亡率。如果与毒力艾美球虫种攻击相关的死亡发生，进行含有处理组和批因素的ANOVA(即，方差分析)来确定每个处理组的总体死亡率平均值之间是否存在显著差异(与发生的天数无关)。
重量增加和饲料转化
地面围栏阶段。在处理组内，进行配对t-检验(按批和作为整个组，不考虑批效应)来确定每个处理组内是否存在平均活体重量的显著差异。配对比较包括第0天vs.第28天重量(攻击前)和第28天vs.第49天重量(攻击后)。
进行配对t-检验(按批和作为整个组，不考虑批效应)来确定每个处理组内平均饲料转化重量是否存在显著差异。配对比较包括第28天vs.第49天饲料转化重量(攻击后)和第42天vs.第49天饲料转化重量(未加药的增肥饲料效应)。
在处理组之间，在所有记录重量的天数，将包含处理组、天数、批和组-天数相互作用因素的重复测量值ANOVA用于确定组之间的平均活体重量是否存在显著差异。
攻击阶段。在处理组内，进行配对t-检验(按批和作为整个组，不考虑批效应)来确定每个处理组内平均活体重量是否存在显著差异。配对比较包括第28天vs.第35天重量(攻击后6天)。
在处理组之间，使用地面围栏阶段处理组之间分析的结果对攻击后处理组之间的平均活体重量进行了分析，集中于第28天和第35天的比较。
结果
表10：第28天小结
| 处理 | 平均活体重量 | ％死亡率(NE)* | ％所有死亡率 | 饲料转化 |
| 实验疫苗 | 1.41 | 0.23 | 2.69 | 1.429 |
| COCCIVAC | 1.39 | 11.77 | 15.69 | 1.453 |
| 盐霉素 | 1.45 | 0.46 | 3.76 | 1.383 |
*表示按分组的统计学差异
表11：第49天小结
| 处理 | 雄性平均活体重量 | 雌性平均活体重量 | 总体平均活体重量 | 饲料转化 | ％死亡率NE | ％总体死亡率 |
| 实验疫苗 | 3.21 | 2.62 | 2.90 | 1.84 | 0.23 | 4.69 |
| COCCIVAC | 3.11 | 2.55 | 2.82 | 1.92 | 11.76 | 17 |
| 盐霉素 | 3.17 | 2.63 | 2.90 | 1.86 | 0.53 | 5.38 |
表12.攻击结果
| 处理 | 最初重量 | 最终重量 | 6天重量增加 | 上段损伤分数 | 中段损伤分数 | 盲肠损伤分数 | TLs1 | ATLS2 | ％由于球虫病的死亡率 |
| 阴性对照 | 1425.55ab* | 1849.72a | 424.17a | 0.00c | 0.00d | 0.00d | 0.00d | 0.00d | 0 |
| 攻击对照 | 1396.95b | 1538.75b | 141.80c | 2.48a | 3.43a | 2.38b | 8.30a | 2.77a | 6.67 |
| 实验疫苗 | 1459.60ab | 1777.53a | 317.93b | 0.78b | 1.30c | 2.17b | 5.25b | 1.42b | 0 |
| COCCIVAC | 1469.68a | 1851.53a | 381.85a | 0.85b | 0.93c | 0.55c | 2.33c | 0.78c | 0 |
| 盐霉素 | 1435.47ab | 1488.97b | 53.50d | 2.50a | 2.90b | 3.25a | 8.65a | 2.88a | 0 |
每一处理攻击60只鸟。
*表示按分组的统计学差异
a、b、c和d是平均值的Duncan’s分离。(Duncan检验是用来分离平均值的统计学hoc检验)。
1是总体损伤分数
2是平均总体损伤分数
讨论.对于巨型艾美球虫、堆形艾美球虫和和缓艾美球虫攻击，实验疫苗和Coccivac的损伤分数不存在显著差异。对于柔嫩艾美球虫，与实验株相比较，Coccivac具有较低的损伤分数。
重要的是注意到接种Coccivac的鸟感染了索氏梭状芽孢杆菌。在野外梭菌疾病与球虫病感染相关。即使感染播散至其它处理中，接种Coccivac的鸟仍受到最大的影响，显示出11.77％的死亡率。
结论.实验艾美球虫株面对毒力攻击时显示出有效。与Coccivac和盐霉素处理的鸟相比较，用实验株接种疫苗的鸟在49天具有更好的鸟性能(如通过饲料转化率所定义)，其对应于家禽生产者的经济优势。
实施例3：鸡来源的活卵囊球虫病疫苗的体内功效测试
该实施例呈现了证明来自每个新的艾美球虫生产种子的收获材料(配制成终产品)的功效的程序。
用于该实施例的材料包括无抗球虫药的鸡饲料、1-14天大的SPF或童子鸡类型的鸡和鸡圈。
测试使用新一批生产种子产生的第一系列终产品和每个随后系列的功效。用每个种攻击产生的第一个系列，其含有所有新的生产种子。对于随后的系列，其含有一个或多个新的生产种子，只测试那些代表新种子的抗原的功效，如下所述。在1-14天大的SPF或童子鸡类型的鸡中测试终产品。评价从生产种子产生的随后系列的功效，使用以下所述的配制前计数。
在相同组的动物中单独或联合评价堆形艾美球虫、巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫的功效。对于每个测试株，使用不超过24只鸡。至少10只且不超过12只鸡各自经口接种一个田间剂量的疫苗。保留10至12只鸡作为对照。初次接种后二十六至30天，单独鉴定所有鸡。
功效测试中使用的每个攻击株必须具有至少10只鸡的对照组。
对以下所示应用组的至少10只接种疫苗的鸡和10只对照鸡各自经口攻击，使用1.0ml表13中所示剂量的同源攻击。
表13.攻击
| 种 | 攻击剂量 | |
| 用……攻击 | 堆形艾美球虫 | 100,000至500,000个卵囊 |
| 和/或 | 巨型艾美球虫 | 10,000至1,000,000个卵囊 |
| 和/或 | 柔嫩艾美球虫 | 10,000至1,000,000个卵囊 |
还基于艾美球虫致病性来选择攻击剂量，使得选定的水平将引起至少50％的未接种疫苗的攻击对照具有二或更高的损伤分数。
接种疫苗组或对照组都不能少于八只动物。
根据Johnson和Reid球虫评分系统来进行评分，如ExperimentalParisitology，Vol.28，p30-36，1970中所述的。
表14.评分
| 0 | 无 |
| +1 | 轻微损伤 |
| +2 | 中度 |
| +3 | 严重 |
| +4 | 非常严重的损伤或死亡 |
攻击后六天，将接种疫苗者和对照处死，并根据每个艾美球虫种和感染相关的相应肠段，即，堆形艾美球虫感染上段肠，巨型艾美球虫感染肠道的中段，而柔嫩艾美球虫感染盲肠，来检查肠和盲肠并对各损伤评分。
分析数据，使得可以在0.05的显著性水平确定接种疫苗者和对照之间的显著差异(使用Mann-Whitney U检验)。
对于为功效攻击的每个艾美球虫种，对于每个接种疫苗者和对照，合计各单独损伤分数。每只鸟收到巨型艾美球虫的分数、堆形艾美球虫的分数和柔嫩艾美球虫的分数。
将所有动物的分数从最小至最大排列。对于相同等级，给每个动物指定平均值，例如，如果第5只和第6只动物具有相同的分数，给每只动物分配5.5的等级。至于其是接种疫苗者或是对照，则保留等级的鉴定。
合计对照组的等级数。将这称为“∑Rc.dd”。
合计接种疫苗组的等级数。将这称为“∑Rv.”。
确定对照组的等级总和后，使用以下等式计算对照的Mann-Whitney U统计(Uc)：
其中nc表示对照组的动物数而nv表示接种疫苗者的数目。
确定接种疫苗组的等级总和后，使用以下等式计算对照的Mann-Whitney U统计(Uv)：
其中nc表示对照组的动物数而nv表示接种疫苗者的数目。
如果Uc低于Uv且Uc低于或等于表15中对于合适的组大小所示的临界值，则检验在0.05水平是显著的。
表15.用于Mann-Whitney U统计的临界值的表(二尾0.05值)
| Uc | 对照(nc) | 接种疫苗者(nv) |
| ≤23 | 10 | 10 |
| ≤20 | 9 | 10 |
| ≤17 | 8 | 10 |
| ≤20 | 10 | 9 |
| ≤17 | 9 | 9 |
| ≤15 | 8 | 9 |
| ≤17 | 10 | 8 |
| ≤15 | 9 | 8 |
| ≤13 | 8 | 8 |
有效性标准 对于有效的测试，至少50％的未接种疫苗的攻击对照必须具有二或更高的损伤分数。接种疫苗组或对照组都不能少于八只动物。如果动物符合有效性要求并且计算的Mann-Whitney U统计在0.05水平有显著差异，则该系列是合乎要求的。
再测试要求 如果接种疫苗组不能显示出与对照组的显著差异(计算的Uc统计高于表15中所示的临界值)，测试结果是不确定的，可以对该系列再次测试。
为了确定该系列是否由于过度攻击而不合乎要求，分析第一次测试和第二次测试接种疫苗者的损伤分数来确定是否可以使用Mann-Whitney U检验在0.05的显著性水平确定测试之间的显著性差异。
将两次测试中接种疫苗者每株的单独损伤分数总和。将所有动物的分数从最小至最大排列。对于相同的等级，给每个动物指定平均数，例如，如果第5只和第6只动物具有相同分数，给每只动物指定5.5的等级。至于其是来自第一次或是第二次测试，保留等级的鉴定。
合计第一次测试的等级数。将这称为“∑R1.”
合计第二次测试的等级数。将这称为“∑R2.”
确定来自第一次测试的接种疫苗者的等级总和后，使用以下等式计算第一次测试的Mann-Whitney U统计(U1)：
确定第二次测试的接种疫苗组的等级总和后，使用以下等式计算对照的Mann-Whitney U统计(Uv)：
其中n1表示第一次测试中接种疫苗的动物数而n2表示第二次测试中接种疫苗的动物数。
测试结果的解释.如果U1低于U2且U2低于或等于表16中对于合适的组大小所示的临界值，则检验在0.05的水平是显著的。
表16.用于Mann-Whitney U统计的临界值表(二尾0.05值)
| U1 | 第1次(n1) | 第2次(n2) |
| ≤23 | 10 | 10 |
| ≤20 | 9 | 10 |
| ≤17 | 8 | 10 |
| ≤20 | 10 | 9 |
| ≤17 | 9 | 9 |
| ≤15 | 8 | 9 |
| ≤17 | 10 | 8 |
| ≤15 | 9 | 8 |
| ≤13 | 8 | 8 |
如果第一和第二次测试的比较结果在0.05水平是显著的，最初的结果可以认为是由于过度攻击而“无测试”(No-test)，并且使用第二次测试产生的数据比较接种疫苗者和对照。如之前所述的进行数据分析。
如果两次测试的比较在0.05水平未能显示出显著性，将合并来自两次测试的数据，并如前所述的分析数据。
如果Uc小于Uv并且Uc小于或等于表17中对于合适的组大小列出的临界值，则检验在0.05水平是显著的。
表17.Mann-Whitney U统计的临界值表(对系列的再测试)
| U1 | 对照(n1) | 接种疫苗者(n2) |
| 127 | 20 | 20 |
| 119 | 19 | 20 |
| 112 | 18 | 20 |
| 105 | 17 | 20 |
| 98 | 16 | 20 |
| 119 | 20 | 19 |
| 113 | 19 | 19 |
| 106 | 18 | 19 |
| 99 | 17 | 19 |
| 92 | 16 | 19 |
| 112 | 20 | 18 |
| 106 | 19 | 18 |
| 99 | 18 | 18 |
| 93 | 17 | 18 |
| 86 | 16 | 18 |
| 105 | 20 | 17 |
| 99 | 19 | 17 |
| 93 | 18 | 17 |
| 87 | 17 | 17 |
| 81 | 16 | 17 |
| 98 | 20 | 16 |
| 92 | 19 | 16 |
| 86 | 18 | 16 |
| 81 | 17 | 16 |
| 75 | 16 | 16 |
参考文献：Sheskin，David J.Handbook of Parametric andNonparametric Statistical Procedures，第3版，2003；423-428，1151。
* * *
由此已经详细描述了本发明的有利实施方案，要理解本发明不限于以上描述中所列的特定细节，因为许多明显的改变是可能的而没有脱离本发明的精神或范围。
Claims (19)
1.用于保护对抗堆形艾美球虫、巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫的免疫或疫苗组合物，该组合物包括药物学上可接受的赋形剂和从堆形艾美球虫、巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫的早熟株分离的孢子化卵囊的混合物，其中混合物基本上由约500个堆形艾美球虫的卵囊，约50至约100个巨型艾美球虫的卵囊和约100至约250个柔嫩艾美球虫的卵囊组成。
2.权利要求1的组合物，其中混合物基本上由约500个堆形艾美球虫的卵囊，约100个巨型艾美球虫的卵囊和约100个柔嫩艾美球虫的卵囊组成。
3.权利要求1的组合物，其中混合物基本上由约500个堆形艾美球虫的卵囊，约50个巨型艾美球虫的卵囊和约250个柔嫩艾美球虫的卵囊组成。
4.用于保护对抗堆形艾美球虫、巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫的免疫或疫苗组合物，该组合物包括药物学上可接受的赋形剂和孢子化卵囊混合物，其中孢子化卵囊混合物由从堆形艾美球虫、巨型艾美球虫和柔嫩艾美球虫的早熟株分离的孢子化卵囊组成，其中对于每10个堆形艾美球虫的孢子囊，存在约1至2个巨型艾美球虫的孢子囊和约2至10个柔嫩艾美球虫的孢子囊。
5.权利要求4的组合物，其中对于每10个堆形艾美球虫的孢子囊，存在约2个巨型艾美球虫的孢子囊和约2个柔嫩艾美球虫的孢子囊。
6.引发免疫应答的方法，包括给予有效量的权利要求1的免疫或疫苗组合物来诱导鸡的应答。
7.诱导免疫或保护性应答的方法，包括给予有效量的权利要求1的免疫或疫苗组合物来诱导鸡的应答。
8.引发免疫应答的方法，包括给予有效量的权利要求4的免疫或疫苗组合物来诱导鸡的应答。
9.诱导免疫或保护性应答的方法，包括给予有效量的权利要求4的免疫或疫苗组合物来诱导鸡的应答。
10.权利要求6的方法，其中有效量为约500个堆形艾美球虫的卵囊，约50至约100个巨型艾美球虫的卵囊和约100至约250个柔嫩艾美球虫的卵囊。
11.权利要求7的方法，其中有效量为约500个堆形艾美球虫的卵囊，约50至约100个巨型艾美球虫的卵囊和约100至约250个柔嫩艾美球虫的卵囊。
12.权利要求6的方法，其中有效量为约500个堆形艾美球虫的卵囊，约100个巨型艾美球虫的卵囊和约100个柔嫩艾美球虫的卵囊。
13.权利要求7的方法，其中有效量为约500个堆形艾美球虫的卵囊，约100个巨型艾美球虫的卵囊和约100个柔嫩艾美球虫的卵囊。
14.权利要求8的方法，其中孢子化卵囊混合物的有效量，其中对于每10个堆形艾美球虫的孢子囊，混合物中存在约2个巨型艾美球虫的孢子囊和约2个柔嫩艾美球虫的孢子囊。
15.权利要求9的方法，其中孢子化卵囊混合物的有效量，其中对于每10个堆形艾美球虫的孢子囊，混合物中存在约2个巨型艾美球虫的孢子囊和约2个柔嫩艾美球虫的孢子囊。
16.权利要求6的方法，其中有效量足以抵抗对动物的约100,000至约500,000个堆形艾美球虫的卵囊和约10,000至约1,000,000个巨型艾美球虫的卵囊或约10,000至约100,000个柔嫩艾美球虫的卵囊的攻击剂量。
17.权利要求7的方法，其中有效量足以抵抗对动物的约100,000至约500,000个堆形艾美球虫的卵囊和约10,000至约100,000个巨型艾美球虫的卵囊或约10,000至约100,000个柔嫩艾美球虫的卵囊的攻击剂量。
18.权利要求8的方法，其中有效量足以抵抗对动物的约100,000至约500,000个堆形艾美球虫的卵囊和约10,000至约1,000,000个巨型艾美球虫的卵囊或约10,000至约100,000个柔嫩艾美球虫的卵囊的攻击剂量。
19.权利要求9的方法，其中有效量足以抵抗对动物的约100,000至约500,000个堆形艾美球虫的卵囊和约10,000至约1,000,000个巨型艾美球虫的卵囊或约10,000至约100,000个柔嫩艾美球虫的卵囊的攻击剂量。
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-
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