CN106267175A

CN106267175A - 一种鸡球虫病疫苗及其应用

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Publication number: CN106267175A
Application number: CN201610833488.5A
Authority: CN
Inventors: 索勋; 汤新明; 刘贤勇; 索静霞
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2016-09-19
Filing date: 2016-09-19
Publication date: 2017-01-04
Anticipated expiration: 2036-09-19
Also published as: CN106267175B

Abstract

本发明涉及生物免疫领域，具体公开了一种鸡球虫病疫苗及其应用，利用转基因技术，构建表达调节宿主免疫应答强度的相关因子(包括细胞因子、免疫受体的配体及不同虫种间能够调控免疫应答的虫体抗原)的转基因球虫，该类转基因球虫和野生型球虫相比，具备更强的免疫原性，作为新型球虫病的疫苗组分更安全、有效，能够迅速建立免疫保护力。以该类转基因球虫为疫苗组分可进一步提升现有球虫病疫苗的免疫效果，降低球虫病疫苗免疫产生的副作用，具备良好的经济效益和广阔的应用前景。

Description

一种鸡球虫病疫苗及其应用

技术领域

本发明涉及生物免疫领域，具体地说，涉及鸡球虫病疫苗。

背景技术

鸡球虫病严重危害鸡群健康，制约肉、蛋产品的产出，是限制集约化养鸡业发展的重要疫病之一。病原为7种艾美耳属球虫，寄生于肠道不同部位。防控策略依赖药物预防和疫苗接种。以活卵囊为疫苗组分的球虫病疫苗防控效果良好，是目前为止唯一批准上市的原虫类活疫苗，广泛应用于种鸡和蛋鸡的预防。肉鸡球虫病的预防则以药物防控或致弱的活卵囊为疫苗组分的球虫病疫苗接种。然而，球虫耐药性产生迅速、新药研发困难使得药物防控不能满足现代绿色养殖的需求。遗憾的是，球虫病疫苗鉴于其自身卵囊组分的特性限制了其在肉鸡球虫防控的广泛应用。

球虫的免疫学特性和生物学特性决定了以其为疫苗组分的球虫病疫苗无法适应小日龄(42日龄或更早)出栏肉鸡的球虫病防控。这是因为不同球虫种间免疫原性相差很大，免疫原性强的虫种如巨型艾美耳球虫经过一次免疫即可提供良好的免疫保护；免疫原性较弱的虫种如柔嫩艾美耳球虫需经过2-3次加强免疫，即反复摄入垫料中的卵囊进而建立良好的免疫应答，这需要4-5周时间甚至更长，小日龄肉鸡无法在出栏前代偿此类加强免疫引起的体重损失。另一方面，致病性强的虫种如毒害艾美耳球虫，其免疫原性很差，在上述的反复免疫过程中对鸡群造成的损伤严重影响其生产性能，因此，应用于肉鸡的球虫病疫苗一般不包括此组分。这无疑是肉鸡球虫病防控的最大难题，是限制肉鸡绿色健康养殖的一大瓶颈。

发明内容

为了解决现有球虫病疫苗免疫中存在的问题，本发明的目的在于提供一种新的鸡球虫病疫苗免疫方法，改变现有的球虫病疫苗免疫策略或免疫程序，缩短疫苗免疫建立保护力的时间，进而降低鸡摄入自身疫苗接种后排出的卵囊后的负作用，同时能够为鸡群提供良好的抗球虫感染的免疫保护。

为了实现本发明目的，本发明提供一种鸡球虫病疫苗及其应用。

第一方面，为了使球虫病的免疫防控更加安全、有效，本发明提供了一种改进的鸡球虫病疫苗，所述球虫病疫苗包含引起保护性免疫响应的免疫原，所述免疫原为可表达调节宿主免疫应答强度相关因子的转基因球虫。

其中，所述调节宿主免疫应答强度相关因子包括细胞因子、免疫受体的配体及不同虫种间能够调控免疫应答的虫体抗原。

所述细胞因子选自Th1类细胞因子，优选为IFN-γ。

所述免疫受体的配体选自活化T细胞的协同作用因子，即第二信号因子，优选为抗体Fc片段或CD40L。

所述不同虫种间能够调控免疫应答的虫体抗原选自与树突状细胞表面受体结合的抗原因子，优选为Profilin。

所述转基因球虫的构建方法如下：

1)构建含有上述细胞因子基因的球虫转染载体，利用球虫自身调控原件如启动子等，大量制备后利用限制性内切酶线性化；

2)利用限制性内切酶介导的核转染技术(转染仪器：NucleofectorII,AMAXA,程序U-033)将线性化载体转染至球虫子孢子；

3)转染后的子孢子经泄殖腔接种雏鸡，获得转基因球虫卵囊，经连续筛选与单克隆分选获得稳定遗传群体。

可选地，鸡IFN-γ、鸡IgY Fc、鸡CD40L、和巨型艾美耳球虫Profilin的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～4所示。

第二方面，本发明还进一步提供了所述疫苗的应用。

作为优选，所述应用为：对1日龄雏鸡经口免疫球虫病疫苗；1～3天后，再次经口免疫相同的球虫病疫苗。

所述雏鸡包括但不限于肉鸡、蛋鸡或种鸡。

所述球虫病疫苗可为市售可得的商品化疫苗，也可优选为后文提供的转基因球虫疫苗。

受免鸡在首次免疫后，排出球虫卵囊的时间约为5～14天。按照本发明所述的免疫方法，在首次免疫后的1～3天，再次经口进行二次免疫，可使受免鸡在摄入自身所排出的卵囊之前，进行二次免疫应答，避免机体在未建立免疫保护力前，摄入过量卵囊对肠道造成严重损伤。

经试验研究发现，若在首免2天后进行二免，能达到最佳的免疫保护效果，具体表现为攻虫感染后卵囊排出更少、病变更轻、体增重更优。

进一步地，所述疫苗的免疫剂量为商品化疫苗推荐剂量的1/2。例如，鸡球虫病四价活疫苗疫苗(佛山市正典生物技术有限公司，兽药生字(2008)190462139)的推荐剂量为1100±10％(275±10％卵囊/种)，将其应用于本发明中，分为两次免疫，每次剂量为550±10％。

为了避免商品化疫苗推荐剂量差异较大，本发明进一步提供更加明确的剂量标准，即两次疫苗免疫的剂量各为100～800卵囊/种/羽，优选为两次疫苗免疫的剂量相同，优选为125～175卵囊/种/羽。使用时，可同时参考商品化疫苗推荐剂量和本发明所述剂量进行。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种鸡球虫病疫苗，利用转基因技术，构建表达调节宿主免疫应答强度的相关因子(包括细胞因子、免疫受体的配体及不同虫种间能够调控免疫应答的虫体抗原)的转基因球虫，该类转基因球虫和野生型球虫相比，具备更强的免疫原性，作为新型球虫病的疫苗组分更安全、有效，能够迅速建立免疫保护力。以该类转基因球虫为疫苗组分可进一步提升现有球虫病疫苗的免疫效果，降低球虫病疫苗免疫产生的副作用，具备良好的经济效益和广阔的应用前景。

此外，本发明还提供了所述疫苗的应用方法，既可有效避免初次免疫后大量排出卵囊被鸡群食入爆发球虫病的风险，又可提高球虫病疫苗免疫的整齐度至90％以上，还可迅速建立免疫保护力，对球虫再次感染实现更好的保护，减缓因疫苗免疫引起的生产性能下降，增加养殖效益。同时，可降低或杜绝抗球虫药物的使用量，提供更加安全、绿色的禽肉和蛋产品。不仅如此，还节约了现有免疫方法的成本，经济效益巨大。

附图说明

图1为本发明实施例1的免疫策略。

图2为本发明实验例1的实验分组。

图3为本发明实验例1中的卵囊排出量比较。

图4为本发明实验例1中的平均肠道病变计分比较。

图5为本发明实验例1中的体重比较。

图6为本发明构建的表达细胞因子(Interferon-γ，IFN-γ)的转基因柔嫩艾美耳球虫(Trans 1)与传统疫苗组分即野生型球虫(WT)免疫原性及保护力的比较。其中：(A)免疫后各组鸡群的卵囊排出动态规律；(B)免疫后14天攻虫的卵囊排出量；(C)免疫后14天攻虫前后鸡群体增重；(D)免疫后14天攻虫，盲肠病变计分；(E)免疫后28天攻虫的卵囊排出量；(F)免疫后28天攻虫前后鸡群体增重；(G)免疫后28天攻虫，盲肠病变计分。

图7为本发明构建的免疫受体的配体(抗体Fc片段)的转基因柔嫩艾美耳球虫(Trans 2)与传统疫苗组分即野生型球虫(WT)免疫原性及保护力的比较。其中：(A)免疫后各组鸡群的卵囊排出动态规律；(B)免疫后14天攻虫的卵囊排出量；(C)免疫后14天攻虫前后鸡群体增重；(D)免疫后14天攻虫，盲肠病变计分；(E)免疫后28天攻虫的卵囊排出量；(F)免疫后28天攻虫前后鸡群体增重；(G)免疫后28天攻虫，盲肠病变计分。

图8为本发明构建的免疫受体的配体(CD40L)的转基因柔嫩艾美耳球虫(Trans 3)与传统疫苗组分即野生型球虫(WT)免疫原性及保护力的比较。其中：(A)免疫后各组鸡群的卵囊排出动态规律；(B)免疫后14天攻虫的卵囊排出量；(C)免疫后14天攻虫前后鸡群体增重；(D)免疫后14天攻虫，盲肠病变计分；(E)免疫后28天攻虫的卵囊排出量；(F)免疫后28天攻虫前后鸡群体增重；(G)免疫后28天攻虫，盲肠病变计分。

图9为本发明构建的不同虫种间差异的免疫调节抗原(巨型艾美耳球虫Profilin)的转基因柔嫩艾美耳球虫(Trans 4)与传统疫苗组分即野生型球虫(WT)免疫原性及保护力的比较。其中：(A)免疫后各组鸡群的卵囊排出动态规律；(B)免疫后14天攻虫的卵囊排出量；(C)免疫后14天攻虫前后鸡群体增重；(D)免疫后14天攻虫，盲肠病变计分；(E)免疫后28天攻虫的卵囊排出量；(F)免疫后28天攻虫前后鸡群体增重；(G)免疫后28天攻虫，盲肠病变计分。

图10为本发明构建的不同虫种间差异的免疫调节抗原(巨型艾美耳球虫Profilin)的转基因毒害艾美耳球虫(Trans 5)与传统疫苗组分即野生型球虫(WT)免疫原性及保护力的比较。其中：(A)免疫后各组鸡群的卵囊排出动态规律；(B)免疫后14天攻虫的卵囊排出量；(C)免疫后14天攻虫前后鸡群体增重；(D)免疫后14天攻虫，小肠病变计分；(E)免疫后28天攻虫的卵囊排出量；(F)免疫后28天攻虫前后鸡群体增重；(G)免疫后28天攻虫，小肠病变计分。

图11为本发明构建的不同虫种间差异的免疫调节抗原(巨型艾美耳球虫Profilin)的转基因堆型艾美耳球虫(Trans 6)与传统疫苗组分即野生型球虫(WT)免疫原性及保护力的比较。其中：(A)免疫后各组鸡群的卵囊排出动态规律；(B)免疫后14天攻虫的卵囊排出量；(C)免疫后14天攻虫前后鸡群体增重；(D)免疫后14天攻虫，十二指肠病变计分；(E)免疫后28天攻虫的卵囊排出量；(F)免疫后28天攻虫前后鸡群体增重；(G)免疫后28天攻虫，十二指肠病变计分。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所述的鸡球虫病四价活疫苗(以下简称球虫疫苗)购自佛山市正典生物技术有限公司。

实施例1

本实施例用于说明本发明所述的免疫方法。

如图1所示，雏鸡1日龄经口免疫球虫病疫苗(剂量550±10％卵囊/羽)，正常饲喂无抗球虫药物的饲料，自由饮水，初次免疫后2天(雏鸡3日龄)，进行同等剂量(550±10％卵囊/羽)的再次免疫。

实施例2

本实施例与实施例1的区别在于：再次免疫时间为初次免疫后1天(雏鸡2日龄)。

实施例3

本实施例与实施例1的区别在于：再次免疫时间为初次免疫后3天(雏鸡4日龄)。

实验例1

本实验例用于说明本发明所述免疫方法与现有技术中的免疫方法对鸡群抵抗球虫再次感染的不同保护效果。

试验方法如下：

1、设置分组，如图2所示：

(1)本发明免疫组：如实施例1。免疫后14天进行攻虫感染(剂量10000±10％卵囊/种/羽，共计40000±10％卵囊、羽)。

(2)现有技术免疫组：雏鸡1日龄经口免疫球虫疫苗(剂量1100±10％卵囊/羽)，正常饲喂无抗球虫药物的饲料，自由饮水。初次免疫后2天，使用PBS免疫作为对照。免疫后14天进行攻虫感染(剂量10000±10％卵囊/种/羽，共计40000±10％卵囊/羽)。

(3)不免疫攻虫组：雏鸡1日龄经口免疫PBS，正常饲喂无抗球虫药物的饲料，自由饮水。初次免疫后2天，使用PBS免疫作为对照。免疫后14天进行攻虫感染(剂量10000±10％卵囊/种/羽，共计40000±10％卵囊/羽)。

(4)不免疫不攻虫组：雏鸡1日龄经口免疫PBS，正常饲喂无抗球虫药物的饲料，自由饮水。初次免疫后2天，使用PBS免疫作为对照。免疫后14天进行口服PBS作为对照。

2、评估指标

对免疫后、攻虫后的卵囊排出进行统计及免疫前、免疫后和攻虫感染后的肠道病变、体重变化进行分析，分析不同免疫程序免疫鸡群，其保护效果的差异。

3、结果分析

如图3所示，本发明免疫组的鸡群免疫后、攻虫后的卵囊排出显著低于现有技术免疫组，说明本发明免疫程序可有效降低鸡群疫苗免疫后的卵囊排出，并且提供更好的免疫保护，表现为攻虫后的卵囊排出显著降低，说明本发明的免疫程序显著降低疫苗免疫的副作用，增强疫苗免疫的保护效果明显。

如图4所示，本发明免疫组的鸡群攻虫后的肠道病变计分显著低于现有技术免疫组，说明本发明免疫程序可提供更好的免疫保护，显著降低疫苗免疫的副作用，增强疫苗免疫的保护效果明显。

如图5所示，本发明免疫组的鸡群免疫后、攻虫后的体增重显著高于现有技术免疫组，说明本发明免疫程序可有效降低鸡群疫苗免疫引起的生产性能下降，并且提供更好的免疫保护，表现为攻虫后的体增重明显增加，说明本发明的免疫程序显著降低疫苗免疫的副作用，增强疫苗免疫的保护效果明显。

实施例4

本实施例用于说明本发明提供的改良球虫病疫苗，所述疫苗的免疫原为表达细胞因子(Interferon-γ，IFN-γ)的转基因柔嫩艾美耳球虫(Trans 1)。

所述疫苗的制备方法为：

1)利用SEQ ID NO.1所示序列，构建表达IFN-γ的球虫转染载体，系利用球虫自身调控原件如启动子等，大量制备后利用限制性内切酶线性化；

本实施例以危害养禽业最为严重的球虫虫种之一，柔嫩艾美耳球虫(Eimeriatenella)为对象，利用本发明所列表达细胞因子(Interferon-γ，IFN-γ)的转基因球虫，并通过卵囊排出、盲肠病变计分和体重变化反应其免疫效果。

200羽1周龄SPF鸡随机分为4组：不免疫不攻虫组、不免疫攻虫组、传统疫苗球虫组分即野生型球虫免疫组(WT)和转基因球虫免疫组(Trans 1)。上述各组每羽鸡分别口服接种200μl PBS、200μl PBS、200μl PBS(含200WT卵囊)和200μl PBS(含200Trans 1卵囊)，各组鸡群同等条件垫料平养，自由采食、饮水。免疫后第14天，各组25只鸡除不免疫不攻虫组外，口服感染10000卵囊/羽转移至新隔离器饲养，感染后第6天剖杀10只鸡记盲肠病变，其余统计其卵囊排出和体增重。剩余25只鸡于免疫后28天作同样处理。为了反映本发明免疫原性增强型球虫病疫苗的免疫保护效果，本案例统计了免疫及攻虫后的卵囊排出量、免疫前后和攻虫感染后鸡群体重的变化及盲肠的病变程度，详述如下：

1、免疫后粪便中卵囊的排出(图6A)显示免疫原性增强型转基因球虫免疫组显著低于野生型球虫免疫组，降低了该类新型疫苗免疫后引起球虫病爆发的风险。免疫第14天攻虫后粪便中卵囊的排出(图6B)，可以看出，Trans 1免疫组与野生型球虫免疫组相比能够提供更好的免疫保护，减少卵囊排出。免疫第28天攻虫后粪便中卵囊的排出(图6E)，可以看出，Trans 1免疫组与野生型球虫免疫组提供的免疫保护均增强，但Trans 1免疫组优于野生型球虫免疫组。

2、免疫第14天攻虫前后鸡群的体增重(图6C)，可以看出，Trans1免疫组与野生型球虫免疫组相比能够提供更好的免疫保护，对体增重的影响较小。免疫第28天攻虫前后鸡群的体增重(图6F)，可以看出，Trans1免疫组与野生型球虫免疫组提供的免疫保护均增强，但Trans 1免疫组优于野生型球虫免疫组。

3、免疫第14天攻虫后6天鸡群的盲肠病变(图6D)，可以看出，Trans 1免疫组与野生型球虫免疫组相比能够提供更好的免疫保护，病变较轻。免疫第28天攻虫后6天鸡群的盲肠病变(图6G)，可以看出，Trans 1免疫组与野生型球虫免疫组提供的免疫保护均增强，但Trans 1免疫组优于野生型球虫免疫组。

实施例5

本实施例用于说明本发明提供的改良球虫病疫苗，所述疫苗的免疫原为表达免疫受体的配体(抗体Fc片段)的转基因柔嫩艾美耳球虫(Trans 2)

所述疫苗的制备方法与实施例4的区别在于IFN-γ基因替换为抗体Fc片段基因(SEQ ID NO.2所示序列)。

本实施例以危害养禽业最为严重的球虫虫种之一，柔嫩艾美耳球虫(Eimeriatenella)为对象，利用本发明所列表达免疫受体的配体(抗体Fc片段)的转基因球虫，并通过卵囊排出、盲肠病变计分和体重变化反应其免疫效果。

200羽1周龄SPF鸡随机分为4组：不免疫不攻虫组、不免疫攻虫组、传统疫苗球虫组分即野生型球虫免疫组(WT)和转基因球虫免疫组(Trans 2)。上述各组每羽鸡分别口服接种200μl PBS、200μl PBS、200μl PBS(含200WT卵囊)和200μl PBS(含200Trans 1卵囊)，各组鸡群同等条件垫料平养，自由采食、饮水。免疫后第14天，各组25只鸡除不免疫不攻虫组外，口服感染10000卵囊/羽转移至新隔离器饲养，感染后第6天剖杀10只鸡记盲肠病变，其余统计其卵囊排出和体增重。剩余25只鸡于免疫后28天作同样处理。为了反映本发明免疫原性增强型球虫病疫苗的免疫保护效果，本案例统计了免疫及攻虫后的卵囊排出量、免疫前后和攻虫感染后鸡群体重的变化及盲肠的病变程度，详述如下：

1、免疫后粪便中卵囊的排出(图7A)显示免疫原性增强型转基因球虫免疫组显著低于野生型球虫免疫组，降低了该类新型疫苗免疫后引起球虫病爆发的风险。免疫第14天攻虫后粪便中卵囊的排出(图7B)，可以看出，Trans 2免疫组与野生型球虫免疫组相比能够提供更好的免疫保护，减少卵囊排出。免疫第28天攻虫后粪便中卵囊的排出(图7E)，可以看出，Trans 2免疫组与野生型球虫免疫组提供的免疫保护均增强，但Trans 2免疫组优于野生型球虫免疫组。

2、免疫第14天攻虫前后鸡群的体增重(图7C)，可以看出，Trans 2免疫组与野生型球虫免疫组相比能够提供更好的免疫保护，对体增重的影响较小。免疫第28天攻虫前后鸡群的体增重(图7F)，可以看出，Trans 2免疫组与野生型球虫免疫组提供的免疫保护均增强，但Trans 2免疫组优于野生型球虫免疫组。

3、免疫第14天攻虫后6天鸡群的盲肠病变(图7D)，可以看出，Trans 2免疫组与野生型球虫免疫组相比能够提供更好的免疫保护，病变较轻。免疫第28天攻虫后6天鸡群的盲肠病变(图7G)，可以看出，Trans 2免疫组与野生型球虫免疫组提供的免疫保护均增强，但Trans 2免疫组优于野生型球虫免疫组。

实施例6

本实施例用于说明本发明提供的改良球虫病疫苗，所述疫苗的免疫原为表达免疫受体的配体(CD40L)的转基因柔嫩艾美耳球虫(Trans 3)。

所述疫苗的制备方法与实施例4的区别在于IFN-γ基因替换为鸡CD40L基因(SEQID NO.3所示序列)。

本实施例以危害养禽业最为严重的球虫虫种之一，柔嫩艾美耳球虫(Eimeriatenella)为对象，利用本发明所列表达免疫受体的配体(CD40L)的转基因球虫，并通过卵囊排出、盲肠病变计分和体重变化反应其免疫效果。

200羽1周龄SPF鸡随机分为4组：不免疫不攻虫组、不免疫攻虫组、传统疫苗球虫组分即野生型球虫免疫组(WT)和转基因球虫免疫组(Trans 3)。上述各组每羽鸡分别口服接种200μl PBS、200μl PBS、200μl PBS(含200WT卵囊)和200μl PBS(含200Trans 1卵囊)，各组鸡群同等条件垫料平养，自由采食、饮水。免疫后第14天，各组25只鸡除不免疫不攻虫组外，口服感染10000卵囊/羽转移至新隔离器饲养，感染后第6天剖杀10只鸡记盲肠病变，其余统计其卵囊排出和体增重。剩余25只鸡于免疫后28天作同样处理。为了反映本发明免疫原性增强型球虫病疫苗的免疫保护效果，本案例统计了免疫及攻虫后的卵囊排出量、免疫前后和攻虫感染后鸡群体重的变化及盲肠的病变程度，详述如下：

1、免疫后粪便中卵囊的排出(图8A)显示免疫原性增强型转基因球虫免疫组显著低于野生型球虫免疫组，降低了该类新型疫苗免疫后引起球虫病爆发的风险。免疫第14天攻虫后粪便中卵囊的排出(图8B)，可以看出，Trans 3免疫组与野生型球虫免疫组相比能够提供更好的免疫保护，减少卵囊排出。免疫第28天攻虫后粪便中卵囊的排出(图8E)，可以看出，Trans 3免疫组与野生型球虫免疫组提供的免疫保护均增强，但Trans 3免疫组优于野生型球虫免疫组。

2、免疫第14天攻虫前后鸡群的体增重(图8C)，可以看出，Trans 3免疫组与野生型球虫免疫组相比能够提供更好的免疫保护，对体增重的影响较小。免疫第28天攻虫前后鸡群的体增重(图8F)，可以看出，Trans 3免疫组与野生型球虫免疫组提供的免疫保护均增强，但Trans 3免疫组优于野生型球虫免疫组。

3、免疫第14天攻虫后6天鸡群的盲肠病变(图8D)，可以看出，Trans 3免疫组与野生型球虫免疫组相比能够提供更好的免疫保护，病变较轻。免疫第28天攻虫后6天鸡群的盲肠病变(图8G)，可以看出，Trans 3免疫组与野生型球虫免疫组提供的免疫保护均增强，但Trans 3免疫组优于野生型球虫免疫组。

实施例7

本实施例用于说明本发明提供的改良球虫病疫苗，所述疫苗的免疫原为表达不同虫种间差异的免疫调节抗原(巨型艾美耳球虫Profilin)的转基因柔嫩艾美耳球虫(Trans4)。

所述疫苗的制备方法与实施例4的区别在于IFN-γ基因替换为巨型艾美耳球虫Profilin基因(SEQ ID NO.4所示序列)。

本实施例以危害养禽业最为严重的球虫虫种之一，柔嫩艾美耳球虫(Eimeriatenella)为对象，利用本发明所列表达不同虫种间差异的免疫调节抗原(巨型艾美耳球虫Profilin)的转基因球虫，并通过卵囊排出、盲肠病变计分和体重变化反应其免疫效果。

200羽1周龄SPF鸡随机分为4组：不免疫不攻虫组、不免疫攻虫组、传统疫苗球虫组分即野生型球虫免疫组(WT)和转基因球虫免疫组(Trans 4)。上述各组每羽鸡分别口服接种200μl PBS、200μl PBS、200μl PBS(含200WT卵囊)和200μl PBS(含200Trans 1卵囊)，各组鸡群同等条件垫料平养，自由采食、饮水。免疫后第14天，各组25只鸡除不免疫不攻虫组外，口服感染10000卵囊/羽转移至新隔离器饲养，感染后第6天剖杀10只鸡记盲肠病变，其余统计其卵囊排出和体增重。剩余25只鸡于免疫后28天作同样处理。为了反映本发明免疫原性增强型球虫病疫苗的免疫保护效果，本案例统计了免疫及攻虫后的卵囊排出量、免疫前后和攻虫感染后鸡群体重的变化及盲肠的病变程度，详述如下：

1、免疫后粪便中卵囊的排出(图9A)显示免疫原性增强型转基因球虫免疫组显著低于野生型球虫免疫组，降低了该类新型疫苗免疫后引起球虫病爆发的风险。免疫第14天攻虫后粪便中卵囊的排出(图9B)，可以看出，Trans 4免疫组与野生型球虫免疫组相比能够提供更好的免疫保护，减少卵囊排出。免疫第28天攻虫后粪便中卵囊的排出(图9E)，可以看出，Trans 4免疫组与野生型球虫免疫组提供的免疫保护均增强，但Trans 4免疫组优于野生型球虫免疫组。

2、免疫第14天攻虫前后鸡群的体增重(图9C)，可以看出，Trans 4免疫组与野生型球虫免疫组相比能够提供更好的免疫保护，对体增重的影响较小。免疫第28天攻虫前后鸡群的体增重(图9F)，可以看出，Trans 4免疫组与野生型球虫免疫组提供的免疫保护均增强，但Trans 4免疫组优于野生型球虫免疫组。

3、免疫第14天攻虫后6天鸡群的盲肠病变(图9D)，可以看出，Trans 4免疫组与野生型球虫免疫组相比能够提供更好的免疫保护，病变较轻。免疫第28天攻虫后6天鸡群的盲肠病变(图9G)，可以看出，Trans 4免疫组与野生型球虫免疫组提供的免疫保护均增强，但Trans 4免疫组优于野生型球虫免疫组。

实施例8

本实施例用于说明本发明提供的改良球虫病疫苗，所述疫苗的免疫原为表达不同虫种间差异的免疫调节抗原(巨型艾美耳球虫Profilin)的转基因毒害艾美耳球虫(Trans5)。

本实施例以危害养禽业最为严重的另一球虫虫种，毒害艾美耳球虫(Eimerianecatrix)为对象，利用本发明所列表达不同虫种间差异的免疫调节抗原(巨型艾美耳球虫Profilin)的转基因球虫，并通过卵囊排出、盲肠病变计分和体重变化反应其免疫效果。

200羽1周龄SPF鸡随机分为4组：不免疫不攻虫组、不免疫攻虫组、传统疫苗球虫组分即野生型球虫免疫组(WT)和转基因球虫免疫组(Trans 5)。上述各组每羽鸡分别口服接种200μl PBS、200μl PBS、200μl PBS(含200WT卵囊)和200μl PBS(含200Trans 1卵囊)，各组鸡群同等条件垫料平养，自由采食、饮水。免疫后第14天，各组25只鸡除不免疫不攻虫组外，口服感染10000卵囊/羽转移至新隔离器饲养，感染后第6天剖杀10只鸡记盲肠病变，其余统计其卵囊排出和体增重。剩余25只鸡于免疫后28天作同样处理。为了反映本发明免疫原性增强型球虫病疫苗的免疫保护效果，本案例统计了免疫及攻虫后的卵囊排出量、免疫前后和攻虫感染后鸡群体重的变化及小肠的病变程度，详述如下：

1、免疫后粪便中卵囊的排出(图10A)显示免疫原性增强型转基因球虫免疫组显著低于野生型球虫免疫组，降低了该类新型疫苗免疫后引起球虫病爆发的风险。免疫第14天攻虫后粪便中卵囊的排出(图10B)，可以看出，Trans 5免疫组与野生型球虫免疫组相比能够提供更好的免疫保护，减少卵囊排出。免疫第28天攻虫后粪便中卵囊的排出(图10E)，可以看出，Trans 5免疫组与野生型球虫免疫组提供的免疫保护均增强，但Trans 5免疫组优于野生型球虫免疫组。

2、免疫第14天攻虫前后鸡群的体增重(图10C)，可以看出，Trans 5免疫组与野生型球虫免疫组相比能够提供更好的免疫保护，对体增重的影响较小。免疫第28天攻虫前后鸡群的体增重(图10F)，可以看出，Trans 5免疫组与野生型球虫免疫组提供的免疫保护均增强，但Trans 5免疫组优于野生型球虫免疫组。

3、免疫第14天攻虫后6天鸡群的小肠病变(图10D)，可以看出，Trans 5免疫组与野生型球虫免疫组相比能够提供更好的免疫保护，病变较轻。免疫第28天攻虫后6天鸡群的小肠病变(图10G)，可以看出，Trans 5免疫组与野生型球虫免疫组提供的免疫保护均增强，但Trans 5免疫组优于野生型球虫免疫组。

实施例9

本实施例用于说明本发明提供的改良球虫病疫苗，所述疫苗的免疫原为表达不同虫种间差异的免疫调节抗原(巨型艾美耳球虫Profilin)的转基因堆型艾美耳球虫(Trans6)。

本实施例以危害养禽业最为严重的另一球虫虫种，堆型艾美耳球虫(Eimeriaacervulina)为对象，利用本发明所列表达不同虫种间差异的免疫调节抗原(巨型艾美耳球虫Profilin)的转基因球虫，并通过卵囊排出、盲肠病变计分和体重变化反应其免疫效果。

200羽1周龄SPF鸡随机分为4组：不免疫不攻虫组、不免疫攻虫组、传统疫苗球虫组分即野生型球虫免疫组(WT)和转基因球虫免疫组(Trans 6)。上述各组每羽鸡分别口服接种200μl PBS、200μl PBS、200μl PBS(含200WT卵囊)和200μl PBS(含200Trans 1卵囊)，各组鸡群同等条件垫料平养，自由采食、饮水。免疫后第14天，各组25只鸡除不免疫不攻虫组外，口服感染10000卵囊/羽转移至新隔离器饲养，感染后第5天剖杀10只鸡记盲肠病变，其余统计其卵囊排出和体增重。剩余25只鸡于免疫后28天作同样处理。为了反映本发明免疫原性增强型球虫病疫苗的免疫保护效果，本案例统计了免疫及攻虫后的卵囊排出量、免疫前后和攻虫感染后鸡群体重的变化及小肠的病变程度，详述如下：

1、免疫后粪便中卵囊的排出(图11A)显示免疫原性增强型转基因球虫免疫组显著低于野生型球虫免疫组，降低了该类新型疫苗免疫后引起球虫病爆发的风险。免疫第14天攻虫后粪便中卵囊的排出(图11B)，可以看出，Trans 6免疫组与野生型球虫免疫组相比能够提供更好的免疫保护，减少卵囊排出。免疫第28天攻虫后粪便中卵囊的排出(图11E)，可以看出，Trans 6免疫组与野生型球虫免疫组提供的免疫保护均增强，但Trans 6免疫组优于野生型球虫免疫组。

2、免疫第14天攻虫前后鸡群的体增重(图11C)，可以看出，Trans 6免疫组与野生型球虫免疫组相比能够提供更好的免疫保护，对体增重的影响较小。免疫第28天攻虫前后鸡群的体增重(图11F)，可以看出，Trans 6免疫组与野生型球虫免疫组提供的免疫保护均增强，但Trans 6免疫组优于野生型球虫免疫组。

3、免疫第14天攻虫后5天鸡群的十二指肠病变(图11D)，可以看出，Trans 6免疫组与野生型球虫免疫组相比能够提供更好的免疫保护，病变较轻。免疫第28天攻虫后5天鸡群的十二指肠病变(图11G)，可以看出，Trans 6免疫组与野生型球虫免疫组提供的免疫保护均增强，但Trans 6免疫组优于野生型球虫免疫组。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种鸡球虫病疫苗，其特征在于，所述疫苗包含引起保护性免疫响应的免疫原，所述免疫原为可表达调节宿主免疫应答强度相关因子的转基因球虫。

2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述调节宿主免疫应答强度相关因子包括细胞因子、免疫受体的配体及不同虫种间能够调控免疫应答的虫体抗原。

3.根据权利要求2所述的疫苗，其特征在于，所述细胞因子选自Th1类细胞因子。

4.根据权利要求2或3所述的疫苗，其特征在于，所述免疫受体的配体选自活化T细胞的协同作用因子。

5.根据权利要求2或3所述的疫苗，其特征在于，所述不同虫种间能够调控免疫应答的虫体抗原选自与树突状细胞表面受体结合的抗原因子。

6.权利要求1～5任一项所述的疫苗在鸡球虫病免疫中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，对1日龄雏鸡经口免疫球虫病疫苗；1～3天后，再次经口免疫相同的球虫病疫苗。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，2天后，再次经口免疫球虫病疫苗。

9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于，两次疫苗免疫的剂量各为100～800卵囊/种/羽。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，两次疫苗免疫的剂量相同，为125～175卵囊/种/羽。