KR20210035087A - 오오시스트 용액을 제조 및 전달하는 방법 - Google Patents

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KR20210035087A
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제임스 허친스
라민 카림푸어
엘리자베스 터핀
스티펜 울프
조슈아 스티븐 고프
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어플라이드 라이프사이언시스 앤드 시스템스 엘엘씨
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Abstract

본 개시는 용액 중의 오오시스트의 외막을 파괴하고, 용액을 동물에게 전달하기 위한 시스템 및 방법을 제공한다. 상기 시스템은 용액 중에 미파괴 오오시스를 함유하는 용기, 오오시스트 처리 챔버 및 전달 출구를 포함한다. 미파괴 오오시스트는 용기로부터 처리 챔버를 통해 이동되고, 오오시스트막의 일부는 파괴되어 스포로시스트를 방출하고, 생성된 용액은 처리 챔버로부터, 용액이 동물에게 전달되는 전달 출구로 이동된다. 아이메리아 감염에 대한 백신 접종을 포함하는 백신 접종 방법도 제공된다.

Description

오오시스트 용액을 제조 및 전달하는 방법
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 허친스 등에 의해 2018년 7월 10일자로 출원된 미국 가출원 62/696,261의 이익을 주장하며, 이는 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 본 출원은 발명자 제임스 허친스에 의해 Atty. Dkt. 673-04-PCT의 2019년 7월 10일 출원된 동시 계류 중인 PCT 출원번호와 관련이 있다. 이 동시 계류 중인 PCT 출원은 그 전체가 참조에 의해 본원에 포함된다.
1. 분야
본 개시는 용액 중의 오오시스트의 외막을 파괴하고 상기 용액을 동물에게 전달하기 위한 시스템 및 방법을 제공한다. 상기 시스템은 용액 중에 미파괴 오오시스트를 함유하는 용기, 오오시스트 처리 챔버, 및 전달 출구를 포함한다. 미파괴 오오시스트는 용기로부터 처리 챔버를 통해 이동되고, 오오시스트막의 일부가 파열되어 스포로시스트가 방출되고, 생성된 용액은 처리 챔버로부터, 용액이 동물에게 전달되는 전달 출구로 이동된다.
2. 배경
2.1. 도입
본원에 제공된 "배경" 설명은 일반적으로 본 개시의 맥락을 제시하기 위한 것이다. 현재의 저명한 발명자들의 연구는 이 배경 섹션 및 출원 시에 선행 기술로서 적격하지 않을 수 있는 설명의 양태에 있어서 설명된 범위 내에서 본 개시에 대한 선행 기술로서 명시적으로도 묵시적으로도 인정되지 않는다.
백신은 바이러스, 박테리아, 및 기생충을 포함하는 병원성 미생물로부터 인간 및 동물을 보호하는 중요한 성분이다. 간단하게 말하면, 백신은 특정 병원체를 인식하도록 면역 체계를 자극하여 자연계에서 그 미생물과의 향후 접촉으로부터 보호하는 방어 시스템을 만든다. 백신은 몇가지 주요 클래스, 구체적으로는 불활화 또는 사멸 백신, 아단위 백신, 야생형 백신 및 약독화 또는 변형된 생백신으로 나뉠 수 있다. 야생형 및 약독화 백신은 수용체 동물에게 경미한 감염을 제공한다. 경미한 감염은 더 큰, 아마도 치명적인 감염이 향후 발생하는 것을 방지하기 위해 면역 반응을 일으키는 경우가 있다.
2.2. 아피콤플렉사, 아이메리아, 콕시디아증, 및 백신
아피콤플렉사는 복잡한 생활 사이클을 가진 단세포 및 포자 형성 기생충의 문(phylum)이다. 아피콤플렉사에 의해 유발되는 공지의 인간 질병은 바베시아증(바베시아), 크립토스포리듐증(크립토스포리듐 파븀), 말라리아(플라스모듐), 및 톡소플라스마증(톡소플라스마 곤디)를 포함한다. 아피콤플렉산 질병은 동물 및 가축에도 영향을 미친다. 크립토스포리듐 파븀 및 톡소플라스마 곤디와 같은 일부 아피콤플렉사는 인간과 동물 모두에게 영향을 미친다. 아이메리아 또는 타일레리아와 같은 그 외 아프콤플렉사는 동물에게만 영향을 미친다. 아피콤플렉사 생활 사이클은 유성 및 무성 번식 단계 모두를 가지고 있다는 점에서 복잡하다. 생활 사이클은 환경으로 배설되는 단계, 및 동물 숙주 내에서 발생하는 그 외 단계로 구성되는 경우가 있다. 많은 아피콤플렉사의 경우, 생활 사이클의 일부 단계는 하나의 숙주종에서 발생하고, 그 외 단계는 다른 숙주종에서 발생한다. 한편, 아피콤플렉산 기생충인 아이메리아는 일반적으로 숙주 특이적이며 단일 숙주성이고, 즉 생활 사이클은 단일 숙주종에 대해 특이적이다.
아이메리아는 소, 닭, 어류, 염소, 돼지, 토끼, 파층류, 양, 및 칠면조와 같은 야생 및 가축 척추동물에게 콕시디아증을 유발한다. 상이한 아이메리아종은 위장(GI)관의 선호된 섹션을 가지며, 여기서 그들이 번식하여 GI관의 상피에 손상을 입힌다.
야생형 또는 약독화 여부에 관계 없이 아이메리아 오오시스트의 생활 사이클의 일부가 도 1a 및 도 1b에 나타내어진다. 도 1a는 닭의 아이메리아 오오시스트 섭취와 함께 발생하는 외부 프로세스의 개요를 묘사한다. 부화일의 닭은 포자 형성된 오오시스트를 함유하는 백신을 먼저 접종한다(A). 그 후, 포자 형성 오오시스트는 닭의 위장관 내에서 처리되고, 이 프로세스는 도 1b에서 더욱 상세히 나타내어진다. 감염은 여러 생활 사이클을 거쳐 계속되며, 결국 닭의 분변으로 배설되는 포자 비형성 오오시스트의 형성을 야기한다(B). 새로부터의 배설 후, 포자 비형성 오오시스트는 환경에서 열, 습기 및 산소에 노출된 후, 수일에 걸쳐 포자가 형성된다(C). 오오시스트는 포자가 형성될 때까지 감염성이 없다. 이러한 포자 형성 오오시스트는 닭에 의해 섭취되고, 사이클이 반복된다.
도 1b는 닭의 아이메리아 오오시스트 섭취와 함께 발생하는 내부 프로세스의 확대도를 묘사한다. 박스 안의 영역은 오오시스트 번식 생활 사이클의 간략화된 설명을 나타내고, 여기서 4개의 스포로시스트를 함유하는 포자 형성 오오시스트가 균열되어 스포로시스트를 방출한다(D). 각각의 스포로시스트에는 2개의 스포로조이트가 있다. 새의 장 내에서의 효소 반응은 스포로시스트벽(도시되지 않음)의 엔드캡을 소화하여 스포로조이트를 방출한다. 운동성 스포로조이트는 종-특이적 방식으로 장의 다른 영역의 장세포를 찾아 감염시킨다(E). 예를 들면, 닭에게 있어서 E. 아세르불리나는 상부 장을 감염시키고, E. 막시마는 소장을 감염시키고, E. 텔레나는 맹장을 감염시킨다.
스포로조이트에 의해 장 세포의 감염 후, 기생충의 생활 사이클은 무성 번식의 여러 단계를 거쳐 계속된다. 이들 사이클은 여러 라운드의 번식 및 증폭으로 구성되어 장관의 그들의 선택 영역 내의 아이메리아 존재를 크게 증가시킨다. 무성 번식 단계에 의해 증폭된 후, 유성 번식이 일어나 오오시스트가 생성되고, 그것은 도 1a에 나타내어진 바와 같이 닭의 분변으로 발산되어 다른 닭에 의해 소비된다.
전체 프로세스는 약 7일이 소요되며, 정확한 시간은 종에 따라 다르다. 탈낭 프로세스 및 숙주 세포의 후속 침입은 0일째~3일째 사이에 발생한다. 무성 번식 사이클은 3일째~5일째 사이에 발생한다. 유성 번식 단계 및 분변으로의 오오시스트의 후속 발산은 5일째~7일째 사이에 발생한다.
콕시디아증은 가금류에게서 흔한 질병이다. 콕시디아증의 제어는 전형적으로 먹이 중의 이오노포어 또는 화학물질을 사용하여 달성된다. 대안적인 제어 수단은 현재 이오노포어 및 화학물질의 높은 비용, 이오노포어 및 다른 화학물질의 환경적 영향, 무살충제 가금류에 대한 소비자 수요, 내성 콕시디아의 개발을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 이유로 모색되고 있다. 콕시디아증에 대한 백신은 콕시디아증 제어를 위해 먹이 중의 이오노포어 또는 화학물질의 필요성을 크게 줄이거나 제거할 수 있는 잠재력을 갖고 있다. 백신은 대량 백신 적용과의 균일성이 부족하기 때문에 널리 사용되지 않는다. 현재 제공되어 있는 바와 같이 가금류에게의 아이메리아 백신은 비효율적인 1라운드 감염성 및 면역성을 초래하고, 전형적으로는 질병에 취약한 순수(naive) 개체군을 생성한다. 이후 순수 개체군은 면역성을 유도하기 위해 성장 농장에서의 재순환에 의존한다. 1라운드 감염된 새로부터의 배출물은 나머지 순수 개체군을 대량 감염시킨다. 순수성의 해결은 1라운드 감염 후의 기간에 오오시스트 배출이 높아지고, 이는 괴사성 장염과 같은 2차 박테리아 감염에 걸리기 쉬워져, 해결을 위한 항생제가 필요해진다. 부화일의 모든 새에 대한 효과적인 백신 접종은 아이메리아 감염과 관련된 이환율, 사망률 및 증체량의 부족을 피할 수 있다. PCT 공개 WO 2017/083663A1, Karimpour을 참조한다.
현재 저조한 성과, 이환율 및 사망률로 인한 콕시디아증의 전세계적인 영향은 3억 달러로 추산된다. 또한, 미국에서는 콕시디아증 제어에 연간 약 9,000만 달러이고 전세계적으로는 30억 달러가 소비된다(5m Editor, 2013, High Cost of Coccidiosis in Broilers, The Poultry Site, https ://thepoultrysite.com/news/2013/02/high-cost-of-coccidiosis-in-broilers).
오오시스트막을 균열 개방하는 프로세스는 현재 닭의 모래주머니 내의 그릿과 먹이와 접촉하여 오오시스트를 분쇄함으로써 촉진되는 것으로 생각된다. 부화장에서 백신 미접종된 또는 순수 새에게 오오시스트를 전달하는 것은 오오시스트벽을 균열시켜 스포로시스트를 방출하는 프로세스를 도울 충분한 먹이 또는 그릿이 내장에 함유되어 있지 않기 때문에 백신 접종이 비효율적이다. 이와 같이, 오오시스트벽을 파괴하여 스포로시스트를 방출하는데 도움이 되는 어떠한 그릿이나 먹이가 그들의 소화기계에 없기 때문에 1일령 부화 유생에게는 스포로시스트를 직접 전달하는 것이 바람직할 것이다. 부화장에서 순수 새에게 스포로시스트를 직접 전달하는 것은 그릿이나 먹이가 없어도 백신은 감염성이 있을 수 있기 때문에 백신 접종의 효율성을 높일 수 있다. 어린 닭은 방출된 스포로시스트를 장 내의 감염된 스프로조이트 단계까지 처리하는 능력을 갖는다. 이 스포로시스트 백신 전략은 완전한 면역력의 개선을 위한 재순환 및 2라운드 감염의 필요성을 없앨 수 있다.
이전에는 스포로시스트 백신으로서 제조되고 전달되는 백신 용액을 생성하기 위해 오오시스트벽을 균열시키려는 몇몇 시도가 이루어졌다. 예를 들면, 유리 비드로 오오시스트를 분쇄 및 진탕하는 것이 개시되어 있다. 또한, 유럽 특허 2,111, 243 B1(Hutchins 등, Embrex, Inc.)는 마이크로채널을 사용하여 오오시스트로부터 스포로시스트를 방출하는 방법을 개시하고 있다.
그러나, 오오시스트막을 파괴하려는 이전의 시도는 동결 보존, 동결, 보관, 후속 전달, 및 해동을 위한 솔루션의 마련이라는 맥락에서 행해지고 있다. 구체적으로는, 스포로시스트 기반 백신을 제조하는 이전의 방법은 생성된 스포로시스트를 동결 보존 용액에 현탁시키고 액체 질소에 장기간 보관해야 한다는 단점을 갖는다. 이러한 프로세스는 스포로시스트 형태의 마스터 시드 라인(master seed line)을 보존하기 위한 기생충학 분야에서 잘 알려져 있다. 또한, 동결 보존 후의 생존가능한 스포로시스트의 회수율이 낮으며, 어떤 경우에는 5~10%밖에 되지 않는다는 것으로 이해된다. 스포로시스트의 실시간 생성 및 전달은 동결 보존의 필요성을 없애므로, 생존가능한 유기체의 회수율이 낮다.
또 다른 과제는 스포로시스트를 손상시키는 일 없이 오오시스트막을 파괴하는 것이다. 이는 크기가 상이하고 보호벽의 내구성 및 두께가 다른 여러 아이메리아종으로 구성된 백신을 사용하면 훨씬 더 어려워진다. 따라서, E. 아세르불리나와 같은 작은 내파열성 종의 벽을 파괴하는데 필요로 되는 조건은 이전에 방출된 스포로시스트를 손상시키거나 E. 막시마와 같은 크고 보다 파열되기 쉬운 종에 대해서 매우 엄격할 수 있다.
전달 시 또는 새롭게 방출된 스포로시스트가 의도된 수용자에게 직접 또는 즉시 전달되는 인라인 프로세스에 있어서 오오시스트벽을 균열시키려는 시도는 없없다.
3. 발명의 내용
본원의 실시형태는 개선된 백신 접종을 위한 스포로시스트의 인시투(in situ) 방출에 관계된 시스템 및 방법에 관한 것이다. 본원에 설명된 일부 실시형태는 오오시스트의 막을 파괴하고, 그 막 및 그 내용물, 생존가능한 스포로시스트를 동물에게 전달하기 위한 시스템 및 방법에 관한 것이다.
본원에 설명된 다른 실시형태는 겔 혼합물을 생성하기 위해 2개의 부분으로 전달된 오오시스트 용액에 관한 것이다. 허친스에 의해 Atty. Dkt. No. 673-04-PCT의 2019년 7월 10일자로 출원된 PCT 출원을 참조한다.
일실시형태는 아이메리아에 대해 동물에게 백신 접종하는 것에 관한 것이다. 상기 방법은 오오시스트 기반 용액을 제공하고, 생존가능한 스포로시트가 오오시스트로부터 방출되도록 하고, 방출된 스포로시스트를 함유하는 용액을 동물에게 전달하는 스텝을 포함한다.
다른 실시형태는 오오시스트의 외막을 파열시킨 후, 그것을 동물에게 실시간으로 전달하기 위한 시스템에 관한 것이다. 상기 시스템은 용액 중에 미파괴 오오시스트를 함유하는 용기, 오오시스트 처리 챔버, 및 전달 출구를 포함한다. 미파괴 오오시스트는 용기로부터 처리 챔버를 통해 이동되고, 오오시스트막의 일부가 파열되어 스포로시트를 방출한다. 생성된 용액은 처리 챔버로부터, 용액이 동물에게 전달되는 전달 출구로 이동된다.
추가 실시형태는 동물에게 전달될 때 오오시스트를 파열시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 용액 중에 미파괴 오오시스트의 체적을 함유하는 제 1 용기, 처리 챔버, 및 전달 장치를 제공하는 스텝을 포함한다. 상기 방법은 미파괴 오오시스트의 용액을 제 1 용기로부터 처리 챔버로 이동시키고, 처리 챔버를 통해 용액을 통과시킴으로써, 스포로시스트의 적어도 일부가 용액 중으로 방출되는 스텝을 추가로 포함한다. 또한, 상기 방법은 용액을 처리 챔버로부터, 방출된 스포로시스트를 함유하는 처리된 용액이 동물에게 전달되는 용액을 이동시키는 스텝을 포함한다.
또 다른 실시형태는 오오시스트 용액을 동물에게 전달하기 위한 시스템에 관한 것이다.
본 발명의 방법에 의해 백신 접종되는 바람직한 상업용 새는 닭이다.
닭에게 투여되는 바람직한 조성물은 E. 텔레나, E. 아세르불리나, E. 막시마, E. 네카트릭스, E. 미티스, E. 프라에콕스, E. 하가니, E. 미바티, 및 E. 브루네티로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 아이메리아종의 스포로시스트, 또는 스포로시스트와 오오시스트의 혼합물을 포함한다.
본 발명의 방법에 의해 백신 접종되는 또 다른 바람직한 상업용 새는 칠면조이다. 칠면조에게 투여되는 바람직한 조성물은 E. 멜레아그리미티스, E. 아데노에이데스, E. 갈로파보니스, E. 디스페르사, E. 멜레아그리디스, E. 인노쿠아, 및 E. 수브로툰다로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 아이메리아종의 스포로시스트, 또는 스포로시스트와 오오시스트의 혼합물을 포함한다.
4. 도면의 간단한 설명
이와 같이 본 개시의 다양한 실시형태를 일반적인 용어로 설명했으며, 이제 첨부 도면을 참조할 것이고, 이는 축척대로 그려지지 않으며 시스템의 모든 성분를 포함하지는 않는다.
도 1a는 아이메리아 오오시스트와 백신의 생활 사이클의 그래픽적 표현이다.
도 1b는 닭의 아이메리아 오오시스트의 생활 사이클의 그래픽적 표현이다.
도 2는 제 1 실시형태(고압 균질기)의 개략도이다.
도 3은 제 1 실시형태의 처리 시스템의 확대도이다.
도 4는 제 2 실시형태(비드 처리)의 개략도이다.
도 5는 제 3 실시형태(소니케이션)의 개략도이다.
도 6은 제 4 실시형태(로터/스테이터 혼합기)의 개략도이다.
도 7은 제 5 실시형태(진동 플레이트)의 개략도이다.
도 8은 제 6 실시형태(유체역학적 캐비테이션)에 대한 개략도이다.
도 9는 제 7 실시형태(고압 분무)의 개략도이다.
5. 개시의 상세한 설명
본 개시의 다양한 양태는 상기 개시의 모든 양태가 아닌 일부가 도시된 첨부 도면을 참조하여 이하에서 보다 충분히 설명될 것이다. 실제로, 본 개시는 많은 상이한 형태로 구현될 수 있고, 본원에 설명된 양태에 제한되는 것으로 해석되어서는 안 되며, 오히려 이들 실시형태가 제공됨으로써 본 개시가 철저하고 완전할 것이며, 당업자에게 발명의 범위를 충분히 전달할 것이다.
전체에 걸쳐 동일 부호는 동일 요소를 나타낸다. 도면에 있어서, 특정 라인, 층, 성분, 요소 또는 특징부의 두께는 명확성을 위해 과장될 수 있다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허출원서, 특허 및 그 외 참조 문헌은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
5.1. 정의
본원에 사용된 용어는 특정 실시형태를 설명하기 위한 것이며, 본 발명을 제한하려는 의도는 아니다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 아이메리아는 E. 막시마, E. 미티스, E. 텔레나, E. 아세르불리나, E. 브루네티, E. 네카트릭스, E. 프라에콕스, E. 하가니, E. 미바티, 및 그것의 임의의 조합으로 이루어지는 닭을 감염시키는 아이메리아종을 의미하고 포함한다. 아이메리아는 E. 멜레아그리미티스, E. 아데노에이데스, E. 갈로파보니스, E. 디스페르사, E. 인노쿠아, E. 멜레아그리디스, 및 E. 수브로툰다, 및 그것의 임의의 조합과 같은 칠면조를 감염시키는 종을 포함한다. 또한, 아이메리아는 E. 주에르니, E. 보비스, E. 엘립소이달리스, 및 그것의 임의의 조합과 같은 소를 감염시키는 종을 포함한다. 또한, 아이메리아는 E. 아사타, E. 바쿠엔시스, E. 크란달리스, E. 파우레이, E. 그래눌로사, E. 인트리카타, E. 마르시카, E. 오비노이달리스, E. 팔리다, E. 파르바, E. 웨이브리드겐시스, 및 그것의 임의의 조합을 포함한다. 또한, 용어 아이메리아는 E. 인테스티날리스, E. 베즈도브스키, E. 피리포르미스, E. 코에시콜라, E. 일레시두아, E. 플라베센스, E. 엑시구아, E. 마그나, E. 페르포란스, E. 메디아, E. 스티에다에, 및 그것의 임의의 조합을 포함한다.
용어 "동물" 및 "동물 대상체"는 포유 동물 및/또는 조류 대상체를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 적합한 포유 동물 대상체는 영장류 대상체(예를 들면, 인간 대상체 및 원숭이와 같은 비인간 영장류 대상체), 돼지, 소과 동물(예를 들면, 소), 염소, 말, 고양이, 양, 개, 쥣과 동물(예를 들면, 생쥐, 쥐) 및 토끼목 대상체를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "조류" 및 "조류 대상체"(즉, "새" 및 "새 대상체")는 임의의 조류종의 수컷 및 암컷을 포함하는 것으로 의도되지만, 주로 계란, 육류 또는 애완동물로서 상업적으로 길러진 가금류를 포함하는 것으로 의도된다. 따라서, 용어 "조류" 및 "조류 대상체"는 특히 닭, 칠면조, 오리, 거위, 메추라기, 꿩, 잉꼬, 앵무새, 코카투, 왕관 앵무새, 타조, 에뮤 등을 포함하는 것으로 의도되지만 이에 한정되지 않는다. 특정 실시형태에 있어서, 조류 대상체는 닭 또는 칠면조이다.
본원에 설명된 용액의 실시간 전달은 오오시스트막이 파괴되거나 다른 방식으로 파괴되어 그 안의 내용물이 오오시스트막 내에 더 이상 함유되지 않도록 하는 시스템 또는 방법을 의미한다. 본원의 시스템 및 방법은 실온에서 약 24시간 이내에 또는 냉장 상태로 5일 이내에 전달되는 것으로 이해된다. 부화장에서, 백신은 전형적으로 4~8시간 시프트에 걸쳐 시스템을 통해 도입, 보관, 및 전달된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "오오시스트의 감소율"은 오오시스트막이 파괴되어 스포로시스트를 포함하는 내부 성분이 방출되는 것으로 정의된다. 예를 들면, 오오시스트가 90% 감소하면, 잔류 오오시스트가 10%로 되고, 오오시스트가 방출된 스포로시스트로 90% 전환된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "깃털 고르기" 또는 "깃털을 고르다"는 자신 또는 다른 동물을 깃털 손질하는 행위를 통해 오오시스트, 또는 다른 물질을 섭취하고, 그 후 깃털 고르기된 물질이 소비됨으로써 감염을 일으키는 닭, 또는 그 외 동물의 행위로서 정의된다.
본원에 사용된 바와 같이, 백신 감염성이라는 맥락에서 용어 "감염", "감염률", 또는 "%감염"은 백신 접종 후의 아이메리아를 포함하지만 이에 한정되지 않는 아피콤플렉산 감염에 대해 양성인 것으로 나타내어지는 대상체로서 정의된다.
본원에 사용된 바와 같이, 단수형 "일", "하나" 및 "상기"는 문맥이 달리 명시하지 않는 한 복수형도 포함하는 것으로 의도된다. 본 명세서에 사용된 용어 "포함하다" 및/또는 "포함하는"은 언급된 특징부, 스텝, 동작, 요소, 및/또는 성분의 존재를 명시하지만, 그 외 특징부, 스텝, 동작, 요소, 성분, 및/또는 그것의 그룹의 존재나 추가를 배제하지는 않는다는 것으로 더 이해될 것이다. 본 개시는 적합하게는 청구범위에 기재된 스텝, 요소, 및/또는 시약을 "포함", "구성" 또는 "필수적으로 구성"할 수 있다.
청구 범위는 임의의 선택적 요소를 배제하도록 작성될 수 있다는 것에 더욱 유의해야 한다. 이와 같이, 이 설명은 청구 범위 요소의 인용, 또는 "부정적" 제한의 사용과 관련하여 "단독", "단지"이라는 이러한 배타적인 용어의 사용에 대한 선행사의 역할을 하는 것으로 의도된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "및/또는"은 관련된 열거 항목 중 하나 이상의 임의의 조합 및 모든 조합을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "X와 Y 사이" 및 "약 X와 Y 사이"와 같은 문구는 X와 Y를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 본원에 사용된 바와 같이, "약 X와 Y 사이"와 같은 문구는 "약 X와 약 Y 사이"를 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이, "약 X로부터 Y"와 같은 문구는 "약 X로부터 약 Y까지"를 의미한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 용어(기술 및 과학 용어 포함)는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 통상적으로 사용되는 사전에 정의된 것과 같은 용어는 명세서 및 관련 기술의 맥락에서 그 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하며, 본원에 명시적으로 정의되지 않는 한 이상화되거나 지나치게 형식적인 의미로 해석되어서는 안 된다. 간결성 및/또는 명확성을 위해 공지의 기능 또는 구성은 상세히 설명되지 않을 수 있다. 동작(또는 스텝)의 순서는 구체적으로 달리 명시되지 않는 한 청구 범위 또는 도면에 제시된 순서에 제한되지 않는다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 용어 "약" 및/또는 "거의"는 수치 및/또는 범위와 함께 사용될 수 있다. 용어 "약"은 인용된 값에 가까운 값을 의미하는 것으로 이해된다. 예를 들면, "약 40[단위]"는 40의 ±25%(예를 들면, 30~50) 이내, ±20%, ±15%, ±10%, ±9%, ±8%, ±7%, ±6%, ±5%, ±4%, ±3%, ±2%, ±1%, ±1% 미만 이내, 또는 그 안이나 그 아래에 있는 임의의 다른 값 또는 값의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 문맥에 따라 용어 "약"은 ±1/2 표준편차, ±1 표준편차, 또는 ±2 표준편차를 의미할 수 있다. 또한, 문구 "약 [값] 미만" 또는 "약 [값] 초과"는 본원에 제공된 용어 "약"에 대한 정의의 관점에서 이해되어야 한다. 용어 "약" 및 "거의"는 호환적으로 사용될 수 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 수량에 대해 수치 범위가 제공된다. 이들 범위는 그 안의 모든 하위 범위를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 범위 "50~80"은 그 안의 모든 가능한 범위(예를 들면, 51~79, 52~78, 53~77, 54~76, 55~75, 60~70 등)를 포함한다. 또한, 주어진 범위 내의 모든 값은 그것에 의해 포함된 범위에 대한 종점일 수 있다(예를 들면, 범위 50~80은 55~80, 50~75 등과 같은 종점을 가진 범위를 포함한다).
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시가 속하는 기술 분야의 통상의 기술을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 바람직한 방법, 장치 및 물질이 설명되지만, 본원에 설명된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 개시의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있다. 본원에 인용된 모든 참조 문헌은 그 전체가 참조로 포함된다.
5.2. 구체적인 실시형태
5.2.1. 제 1 실시형태 - 고압 균질화
제 1 실시형태(10)는 도 2에 나타내어진다. 제 1 실시형태(10)는 제 1 저장소(12)를 포함한다. 제 1 저장소(12)는 용액(14)의 체적을 수용하도록 설계된다. 용액(14)은 용액에 현택된 백신(도시되지 않음)을 포함한다. 제 1 실시형태(10)의 용액(14)은 가금류, 즉 1일령 부화 유생에게 전달하기 위한 아이메리아종 오오시시트 기반 백신을 함유한다. 선택적으로, 용액(14)은 단백질 분해 효소를 포함한다. 단백질 분해 효소는 부화 유생의 소화관에서 백신의 보다 효과적인 흡수를 가능하게 하며, 이는 이하에서 보다 상세히 설명될 것이다.
용액(14)에 대해서, 본원에 설명된 실시형태는 E. 막시마 오오시스트, E. 미티스 오오시스트, E. 텔레나 오오시스트, E. 아세르불리나 오오시스트, E. 브루네티 오오시스트, E. 네카트릭스 오오시스트, E. 프라에콕스 오오시스트, E. 하가니 오오시스트, E. 미바티 오오시스트, 및 그것의 임의의 조합으로 이루어지는 닭을 감염시키는 군으로부터 선택된 아이메리아 오오시스트; E. 멜레아그리미티스 오오시스트, E. 아데노이데스 오오시스트, E. 갈로파보니스 오오시스트, E. 디스페르사 오오시스트, E. 인노쿠아 오오시스트, E. 멜레아그리디스 오오시스트, 및 E. 수브로툰다 오오시스트, 및 그것의 임의의 조합으로 이루어지는 칠면조를 감염시키는 군으로부터 선택된 아이메리아 오오시스트; E. 주에르니 오오시스트, E. 보비스 오오시스트, E. 엘립소이달리스 오오시스트, 및 그것의 임의의 조합으로 이루어지는 소를 감염시키는 군으로부터 선택된 아이메리아 오오시스트; E. 아사타 오오시스트, E. 바쿠엔시스 오오시스트, E. 크란달리스 오오시스트, E. 파우레이 오오시스트, E. 그래눌로사 오오시스트, E. 인트리카타 오오시스트, E. 마르시카 오오시스트, E. 오비노이달리스 오오시스트, E. 팔리다 오오시스트, E. 파르바 오오시스트, E. 웨이브리드겐시스 오오시스트, 및 그것의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아이메리아 오오시스트; 및 E. 인테스티날리스 오오시스트, E. 베즈도브스키 오오시스트, E. 피리포르미스 오오시스트, E. 코에시콜라 오오시스트, E. 일레시두아 오오시스트, E. 플라베센스 오오시스트, E. 엑시구아 오오시스트, E. 마그나 오오시스트, E. 페르포란스 오오시스트, E. 메디아 오오시스트, E. 스티에다에 오오시스트, 및 그것의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 아이메리아 오오시스트를 포함하지만 이것에 한정되지 않는다.
본원의 실시형태는 오오시스트로부터 스포로시스트를 방출하기 위한 시스템 및 방법에 관한 것이다. 오오시스트는 포유 동물 및 조류 대상체를 포함하는 임의의 동물 대상체를 감염시키는 원충으부터 유래될 수 있다.
또한, 본원에 설명된 일부 실시형태는 원충 오오시스트로부터 스포로조이트를 방출하는 방법에 관한 것이다. 이 적용은 아이메리아에 초점을 맞추고 있는 반면, 일부 다른 원충은 "오오시스트"라고 지정된 생활 단계를 형성하지만, 오오시스트 내에 스포로조이트를 함유할 수 있으며 스포로시스트를 생성하지는 않는다. 실시형태는 오오시스트 내에 스포로조이트를 함유하는 임의의 종의 기생충의 오오시스트로부터 스포로조이트를 방출하도록 실시될 수 있고, 아프콤플렉사문의 임의의 유기체를 포함할 수 있으며, 또한 크립토스포리듐 및 플라스모듐을 포함할 수 있지만 이에 한정되지 않는다. 용어 "원충", "오오시스트", "스포로시스트", "스포로조이트" 및 "메로조이트"는 당업계에서 허용된 의미를 갖는다. 달리 명시되지 않는 한, 이들 용어는 야생형 또는 약독화된 형태를 포함하는 살아 있는(즉, 생존가능한) 원충, 오오시스트, 스포로시스트, 스포로조이트 및 메로조이트를 지칭하는 것으로 의도된다. 또한, 본원에는 유전자 변형된 원충, 오오시스트, 스포로시트트, 스포로조이트, 및 메로조이트가 포함된다.
도 2 및 제 1 실시형태(10)로 돌아가서, 제 1 저장소 입구(16)는 제 1 저장소(12)의 상부에 고정된다. 제 1 저장소 입구(16)는 용액(14)을 제 1 저장소(12)로 수용한다. 제 1 저장소 출구(18)는 제 1 저장소(12)에 고정된다. 제 1 저장소 출구(18)는 시스템 펌프(20)에 연결된다. 펌프(20)는 제 1 저장소(12)로부터 시스템을 통해 용액(14)을 이동시키도록 설계된다.
펌프 출구(22)는 펌프(20)와 처리 시스템(24) 사이에 고정된다. 제 1 실시형태(10)의 처리 시스템(24)은 고압 균질기(32)이다. 상기 균질기(32)는 도 3에 나타내어진 압력 밸브(28) 및 적어도 하나의 오리피스(34)에 의해 제어되는 고압원(26)을 포함한다. 처리 시스템(24)은 도 2에 나타내어진 처리 시스템 출구(38)를 추가로 포함한다. 처리 시스템 출구(38)는 처리 시스템 입구(36)의 대향 단부에서 처리 시스템 내에 위치된다. 처리 시스템 출구(38)는 제 2 저장소 입구(42)에 의해 제 2 저장소(40)에 연결된다. 제 2 저장소(40)는 제 2 저장소 입구(42)를 통해 수용된 용액의 체적을 수용하도록 설계된다.
또한, 제 2 저장소(40)는 제 2 저장소 출구(44)를 포함한다. 제 2 저장소 출구(44)는 전달 장치(46)에 유체 연결된다. 이 제 1 실시형태(10)에 있어서, 전달 장치(46)는 원자화 분무기이다. 전달 장치(46)는 전달 시에 분무의 플룸(plume)을 원자화하도록 전달 입구(48), 노즐(50) 및 노즐(50)의 공기 입구(54)를 갖는다. 공기 입구(54)는 공기 압력원(56)과 유체 연결되어 있다. 대안적으로, 전달 장치(46)는 유압식 분무 노즐 등일 수 있다.
사용 시, 펌프(20)가 활성화되어 용액(14)이 제 1 저장소 출구(18)를 통해 제 1 저장소(12) 밖으로 나와 처리 시스템 입구(36)를 통해 처리 시스템(24)으로 이동한다. 펌프가 용액을 이동시키는데 사용되지만, 중력, 밸브, 공기 압력, 및 그 외 방법을 포함하는 다른 방법이 임의의 실시형태에서 유체 이동을 위해 사용될 수 있다. 고압 균질기(32)에 의해 공급된 고압 공기는 적어도 하나의 오리피스(34)를 통해 용액(14)을 이동시키는데 사용된다. 고압 공기는 500psi 초과이고, 바람직하게는 500~6,000psi 범위 내이다.
용액(14)이 고압 하에서 오리피스(34)를 통해 이동함에 따라, 오오시스트는 전단력을 받아 오오시스트막이 파괴되거나 파열될 것이다. 용액(14)이 오리피스(34)를 통과한 후, 출구(38)를 통해 균질기(32)를 빠져나가 입구(42)를 통해 제 2 저장소(40)로 이동한다. 파괴되거나 파열된 막을 가진 각각의 오오시스트는 유리된 스포로시스트(free sporocyst)를 개질 용액(52)으로 방출될 것이다. 개질 용액(52)(방출된 스포로시스트와 잔류 오오시스트의 조합)은 전달 시까지 제 1 저장소(40)에 임시 저장된다.
개질 용액(52)이 전달될 준비가 되면, 개질 용액은 제 2 저장소(40)로부터 제 2 저장소 출구(44)를 통해 전달 입구(48)로 펌핑된다. 개질 용액(52)은 노즐(50)로 펌핑되고, 가압 공기원(56)으로부터의 가압 공기와 혼합된다. 가압 공기는 개질 용액(52)을 노즐(50)에서 원자화하여 동물의 특정 타깃에게 소정 분무 프로파일의 형태로 소정 체적의 개질 용액을 전달한다.
대안적인 배치에 있어서, 고압 균질기(32)는 전달 장치(46)에 직접 연결될 수 있다. 이렇게 하여, 균질기(32)에 의해 생성된 용액은 제 2 저장소(40)에 임시 보관되지 않고 전달 장치(46)를 통해 직접 전달된다.
오오시스트의 파괴와 관련하여 본원에 설명된 실시형태는 실시간으로 전달되는 것으로 의도된 것임을 유의해야 한다. 임의의 스프로시스트 기반으로 제조된 백신은 장기 보관을 위한 스포로시스트의 생존력 및 전달을 위한 액체 질소 콜드체인의 구현을 유지시키도록 동결 보호 제제를 필요로 할 것이다. 생존가능한 스포로시스트를 방출하기 위한 오오시스트막의 파괴와 관련하여 본원에 설명된 실시형태는 동결 보호 용액 또는 동결 보존과 같은 임의의 다른 특수 보관 조건을 필요로 하지 않는다.
분무 프로파일은 소정 위치에서의 동물과의 접촉에 관한 것이다. 본 시스템은 동물의 안면 점막, 특히 눈이나 입을 타깃으로 하도록 설계된다. PCT 공개 WO 2017/083663A1, Karimpour를 참조한다. 그러나, 분무 프로파일은 동물의 몸의 다른 부분을 타깃으로 하도록 설계될 수 있다는 것이 이해된다. 본원에 설명된 실시형태는 모든 동물에게 적용될 수 있다는 것이 인정되지만, 가금류, 특히 닭, 보다 구체적으로는 1일령 부화 유생에게 영향을 미치는 아이메리아의 전달에 초점이 맞추어져 있다. 개질 용액 중의 유리된 스포로시스트는 부화 유생의 소화관으로 빠르게 들어갈 수 있다. 새의 눈, 비강, 또는 입으로 분무된 스포로시스트는 소화관으로 이동한다. 깃털과 같은 새의 몸의 다른 부분으로 분무되는 스포로시스트는 자가 깃털 고르기 및 다른 새의 깃털 고르기를 포함하는 깃털 고르기를 통해 소화관으로 들어갈 수 있다.
트립신 또는 키모트립신을 포함한 장관의 단백질 분해 효소는 스포로시스트의 끝에서 스티에다(Stieda)체를 소화하여 감염성 스포로조이트의 탈낭을 일으킨다. 이는 병아리가 아이메리아에 의해 빠르게 감염되고, 따라서 면역 반응이 생길 수 있다.
고압 균질기(24)(또는 이하에서 상세히 설명된 다른 처리 시스템)은 시스템에 연결될 필요가 없어 상기 처리가 오프라인으로 수행되고 용기(40)로 전달될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 고압 균질기(24) 또는 다른 시스템으로 백신을 처리하는 것은 분무 전달 시스템 외부에서 발생할 수 있지만, 부화장에서 실시간 전달하기 위한 백신의 제조와 일치한다.
5.2.2. 제 2 실시형태 - 비드 처리
본 발명의 제 2 실시형태(60)는 도 4에 나타내어진다. 제 1 실시형태(10)와 동일 부분은 동일 부호를 붙여 나타내어질 것이다. 제 2 실시형태(60)는 입구(16)와 출구(18)를 갖고 용액(14)의 체적을 수용하는 제 1 저장소(12)를 포함한다. 또한, 제 2 실시형태(60)는 펌프(20) 및 압력원(26)을 포함한다.
제 2 실시형태(60)는 제 2 처리 시스템(62)을 추가로 포함한다. 제 2 처리 시스템(62)은 용액(14)의 체적을 수용할 수 있는 용기(64)를 포함한다. 용기(64)는 입구(36)와 출구(38)를 갖는다. 또한, 용기(64)는 유리, 세라믹 또는 금속 비즈 등과 같은 교반자(70)의 체적을 포함한다. 교반자(70)는 구형 비드, 또는 체적 내에서 교반될 때, 체적 내에 함유된 임의의 용액을 분쇄, 파쇄 또는 다른 방식으로 파괴하는 능력을 가질 수 있는 임의의 다른 형태 및 재료일 수 있다는 것에 주목해야 한다. 용기(64)는 수평, 수직 또는 어떠한 각도로 장착되어 그것의 축을 중심으로 회전할 수 있다. 용기(64)는 수평축 상에서 용기(64)를 회전시킬 수 있는 스피너(72)에 연결된다. 또한, 스피너(72)는 활성화될 때 용기를 진동시키거나 진탕시킬 수 있는 진동 특성을 갖는다. 사용 시, 용기(64) 내의 교반자에 노출된 후의 용액(14)은 이하에서 보다 상세히 설명될 제 2 개질 용액(74)을 생성한다.
제 2 처리 시스템(62)의 출구(38)는 입구(42)를 통해 제 2 저장소(40)에 연결된다. 제 1 실시형태(20)에서와 같이, 제 2 저장소 출구(44)는 전달 장치(46)에 연결되어, 최종적으로 동물에게 전달된다.
전달 장치(46)는 제 2 개질 용액(74)이 입구(48)로 흐르는 것을 제어하는 밸브를 갖는 입구(48)를 포함한다. 전달 장치(46)는 분무 프로파일을 변경하여 더 많거나 더 적은 원자화를 생성하거나, 또는 노즐(50)로부터 동물에게 직접 전달되는 유체의 안정적인 흐름을 제공하도록 변경될 수 있다는 것을 주목해야 한다.
제 2 실시형태(60)의 대안적인 배치는 제 1 실시형태(10)와 관련하여 상술한 대안적인 배치와 유사하다. 제 2 실시형태(60)는 제 2 개질 용액(74)을 노즐(50)에 직접 전달하도록 설계됨으로써 제 2 저장소(40)의 필요성을 없앨 수 있다.
사용 시, 펌프(20) 및 압력원(26)이 활성화되면, 펌프는 용액(14)을 저장소 출구(18)를 통해 제 1 저장소(12) 밖으로 나오게 하여 제 2 처리 시스템(62)으로 이동시킨다. 제 2 처리 시스템(62)은 스피너(72)에 의해 그것의 축을 따라 회전한다. 또한, 스피너(72)는 용기(64)를 진동 및/또는 진탕시킨다. 진동 및 회전에 의해 교반자(70)가 내부 용기벽에 부딪쳐 튕겨나가 용액 중의 오오시스트막의 적어도 일부가 파괴됨으로써 그 안에 함유된 생존가능한 스포로시스트를 방출한다. 용액(14) 중의 파괴된 오오시스트막 및 생존가능한 스포로시스트는 제 2 개질 용액(74)을 생성한다. 생성된 제 2 개질 용액(74)은 용기(64)로부터 제 2 저장소(40)로 펌핑되어, 전달 시까지 임시 수용된다.
전달될 때가 되면, 제 2 개질 용액(74)은 제 2 저장소(40)로부터 전달 장 펌치(46)로 펌핑된다. 제 2 개질 용액(74)은 전달 장치 입구(48)로부터 노즐(50)로 펌핑되고, 압력원(56)으로부터의 가압 공기와 혼합된다. 가압 공기는 노즐(50)에서 제 2 개질 용액(74)을 원자화하여 소정 분무 프로파일의 형태로 소정의 체적의 개질 용액(74)을 동물의 특정 타깃(이 실시형태에 있어서는 1일령 부화 유생)에게 전달한다.
제 2 실시형태(60)의 대안적인 배치에 있어서, 제 2 개질 용액(74)은 용기(64)로부터 노즐(50) 및 1일령 부화 유생의 안면 점막으로 직접 펌핑된다. 최근에는 파괴된 오오시스트막 및 방출된 스포로시스트가 부화 유생에 의해 섭취되어 소화관을 빠르게 감염시킨다. 부화 유생은 즉시 아이메리아에 대한 면역 반응을 일으키고 양호한 건강상태를 유지할 수 있다.
5.2.3. 제 3 실시형태 - 초음파 처리
제 3 실시형태(80)는 제 3 실시형태의 처리 시스템(81)을 제외하고는 상술한 제 1 실시형태(10) 및 제 2 실시형태(60)와 유사하다. 도 5에 나타내어진 제 3 실시형태(80)는 제 1 저장소(12) 및 펌프(20)를 포함한다. 제 3 실시형태(80)는 용기(112) 내의 초음파 프로브(110)를 추가로 포함한다. 초음파 프로브(110)는 전력원(도시되지 않음)을 추가로 포함한다. 초음파 처리는 용액 내에 직접 배치된 프로브 또는 용기 외부에 배치된 간접원에 의해 발생할 수 있다. 간접원은 물이 채워진 배스에서의 소니케이션과 같은 발생원(source)일 수 있다. 용어 초음파 파쇄기는 초음파 프로브 및 용기 외부의 간접원을 포함한다.
용액(14) 내의 액상 현탁액의 오오시스트는 활성화될 때 진동하는 초음파 프로브(110)에 인접한 용기(112)를 통과한다. 바람직한 진동 범위는 18kHz~1MHz이다. 용액(14)에 전해지는 생성된 에너지는 오오시스트막의 적어도 일부를 파괴하는 캐비테이션의 사이클을 초래한다. 시스템을 통한 진동 주파수 및 유속은 오오시스트막이 파괴되고 생존가능한 스포로시스트가 온전한 상태로 용기(112)를 빠져나가도록 제어된다. 생성된 제 3 실시형태 용액(114)은 분무기와 같은 전달 장치(46)로 직접 전달되거나, 또는 제 1 실시형태(10)와 제 2 실시형태(60) 및 그것의 대안과 관련하여 상술한 바와 같은 제 2 저장소(40)로 전달된다.
제 3 실시형태의 대안적인 배치에 있어서, 제 3 개질 용액(114)은 용기(112)로부터 노즐(50) 및 1일령 부화 유생의 안면 점막으로 직접 펌핑된다. 최근에는 방출된 스포로시스트 및 잔류 오오시스트가 부화 유생에 의해 섭취되어 소화관을 빠르게 감염시킨다. 부하 유생은 즉시 아이메리아에 대한 면역 반응을 일으키고 양호한 건강상태를 유지할 수 있다.
다양한 상업적 판매사들은 상이한 구성을 가진 소니케이터를 제공한다. 판매사의 예로는 Qsonica(코네티컷주 뉴타운) 및 Hielscher Ultrasonics GMBH(독일 텔토)가 있다.
5.2.4. 제 4 실시형태 - 로터/스테이터 혼합기
제 4 실시형태(120)는 용기(122) 내의 로터/스테이터 혼합기 처리 시스템(16)을 사용하고, 도 6에 나타내어진다. 로터/스테이터 혼합기(116)는 내부에 고속으로 회전하는 분산 헤드 또는 발생기(124)를 갖는다. 또한, 제 4 실시형태(120)는 로터/스테이터 혼합기(116)와 유체 연통하는 제 1 저장소(12), 펌프(20) 및 전달 장치(46)를 포함한다.
사용 시, 로터/스테이터 혼합기(116)는 활성화되어서 분산 헤드 또는 발생기(124)가 고속으로 회전하게 한다. 상기 혼합기(116)는 제 1 저장소(12)로부터 용액(14)을 수용한다. 용액(14)은 고속으로 회전하는 분산 헤드 또는 발생기(124)에 노출된다. 이것은 혼합기(116) 내부에서 발생된 힘에 의해 오오시스트막의 적어도 일부가 전단되도록 함으로써 스포로시스트의 적어도 일부를 방출한다. 생성된 용액(118)은 전달 장치(46)로 이동되어 동물에게 전달된다. 상기에서 논의된 바와 같이, 제 4 실시형태(120)의 대안적인 배치는 후속적으로 1일령 부화 유생에게 전달되는 용액(118)을 수용하기 위한 제 2 저장소(40)를 포함할 것이다.
5.2.5. 제 5 실시형태 - 진동 플레이트
제 5 실시형태(140)는 도 7에 나타내어지고, 처리 시스템(146)을 제외하고는 상술한 제 1 실시형태(10), 제 2 실시형태(60), 제 3 실시형태(80) 및 제 4 실시형태(120)와 유사하다. 제 5 실시형태(140)는 제 1 저장소(12) 및 펌프(20)를 포함한다. 제 5 실시형태(140)는 한 쌍의 플레이트(144, 145)로 구성된 용기(147) 내에 제 5 처리 시스템(146)을 포함한다. 플레이트(144, 145)는 그 사이에 약간의 공간을 두고 포개어져서 장착된다. 제 1 플레이트(144)는 평평하고 진동 메커니즘(도시되지 않음)에 연결된다. 진동 메커니즘은 플레이트(144)가 진동하게 한다. 제 2 플레이트(145)는 플레이트(144 및 145) 사이를 통과하는 동안에 오오시스트막을 파괴하는데 필요한 다양한 평활도 및 거칠기를 가질 수 있다. 플레이트(144, 145)가 서로 포개어지면, 제 2 플레이트(145)는 제 1 플레이트(144)와 접촉한다.
사용 시, 용액(14)은 제 5 처리 시스템(146)으로 이동된다. 용액(14)의 흐름은 플레이트(144, 145) 사이로 향해진다. 진동 메커니즘이 활성화되어서 제 1 플레이트(144)가 제 2 플레이트(145)에 대해 진동하게 한다. 용액(14)이 플레이트(144, 145) 사이를 이동함에 따라, 용액(14) 중의 오오시스트막의 적어도 일부는 개질 용액(148)을 생성하는 두 플레이트 사이를 통과하면서 파괴된다. 개질 용액(148)은 전달 장치(46)로 직접 전달되거나, 또는 제 2 저장소(40)와 같은 수용 용기로 전달된다.
5.3. 제 6 실시형태 - 유체역학적 캐비테이션
제 6 실시형태(150)는 국부 압력의 감소 및 후속 증가의 결과로서 액체에서 발생하는 기화, 기포 발생 및 기포 내파의 프로세스를 설명한다. 캐비테이션(액체의 급격한 압력 변화로 인해, 증가된 압력을 받을 때 붕괴될 수 있는 증기-충전된 작은 캐비티가 형성되는 현상)은 압력이 액체의 포화 증기압 아래로 떨어지고 후속적으로 증기점 이상으로 회복되는 경우에 발생한다. 이것은 수축된 채널을 통해 액체를 통과시킴으로써 발생될 수 있다. 기포 발생, 및 캐비테이션 기포의 후속적인 발성 및 붕괴의 프로세스는 기포 표면에 높은 에너지 밀도와 압력을 발생시킨다. 초기 연구에서, 질소를 사용한 캐비테이션이 탐구되었지만, 유사한 결과를 얻기 위해서 임의의 가스가 사용될 수 있다. 이 예에 있어서, 질소는 압력 하에서 타깃 유기체(아이메리아)의 세포질에 용해된다. 환경과의 평형에 도달한 후, 타깃 현탁액은 압력 변화에 갑자기 노출되어 아이메리아의 세포질에 질소 기포가 형성된다. 세포 내 기포 형성 및 후속적인 기포 확장의 프로세스는 세포막이 늘어나 결국은 파열된다. 이들 기포는 발포(effervescence)에 의해 세포 외부를 손상시킨다(압력 강하에 의해 수용액으로부터 가스가 빠져나가 세포 용해뿐만 아니라 거품의 생성을 초래할 수 있다). 아이메리아의 다종 오오시스트 현탁액에 대해 테스트했을 때, 오오시스트 외벽의 용해 및 내부 스포로시스트의 후속적인 방출이 관찰되었다. 이 프로세스는 일반적으로 가압 용기에서 발생한다. 용기는 고압에 견딜 수 있는 두꺼운 스테인리스강 케이싱으로 구성되고, 가스 전달을 위한 입구 및 조절가능한 배출 밸브를 구비한다.
제 6 실시형태(150)는 도 8에 나타내어지고, 제 6 처리 시스템(154)을 제외하고는 상술한 제 1 실시형태(10), 제 2 실시형태(60), 제 3 실시형태(80), 제 4 실시형태(120) 및 제 5 실시형태(140)와 유사하다. 제 6 실시형태(150)는 제 1 저장소(12) 및 펌프(20)를 포함한다. 제 6 실시형태(150)는 가압된 금속 인클로저(152) 및 가스 유입 밸브(156)로 구성된 제 6 처리 시스템(154)을 포함한다. 가압된 금속 인클로저(152)는 충전 커넥터(158)를 통해 가스 탱크원(160)에 연결된다. 가스는 충전 커넥터(158)를 통해 유입 밸브(156)로 통과되고, 여기서 금속 인클로저(154) 내에 존재하는 수용액(도시되지 않음)을 포화시킨다. 용액은 이전 실시형태와 유사한 방식으로 입구(36)를 통해 인클로저로 들어간다. 조절기(도시되지 않음)는 최적의 포화를 달성하기 위해 가스 흐름으로부터의 생성된 압력을 제어하는데 사용된다.
사용 시, 용액(14)은 제 6 처리 시스템(154)으로 이동된다. 그 후, 제 6 처리 시스템(154)은 밀봉되고 가압된다. 탱크(160)가 밀봉 가압된 탱크(152)로 질소를 방출함에 따라, 질소는 가압 하에 오오시스트의 세포질에 용해된다. 환경과의 평형에 도달한 후, 탱크(160)로부터의 질소 흐름이 중단되고 인클로저(152)가 밀봉 해제된다. 오오시스트의 급격한 압력 변화로 인해 오오시스트의 세포질 내에서 유체역학적 캐비테이션이 발생하여 외막의 적어도 일부가 파괴되어 내부 내용물, 즉 스포로시스트가 방출되게 한다. 이것은 전달 장치(46)로 직접 전달되거나, 또는 제 2 저장소(40)와 같은 수용 용기로 전달되는 개질 용액(162)을 생성한다.
5.4. 제 7 실시형태 - 고압 분무
오오시스트를 전단하고 온전한 스포로시스트를 방출하는 방법은 충돌력이 오오시스트벽을 파열시켜 생존가능한 스포로시스트를 방출하도록 오오시스트의 현탁액을 고정 물체에 고속 분무하는 것을 포함할 수있다. 또한, 회전 디스크와 같은 움직이는 타깃에 대해 오오시스트의 현탁액이 분무되어, 부딪히는 힘의 결합이 오오시스트를 전단하도록 할 수 있다. 분무된 현탁액의 속도와 회전 디스크의 속도는 전단 프로세스의 최적화를 제공하도록 조정될 수 있다. 회전 디스크의 표면 특징은 오오 시스트를 전단하는데 필요한 다양한 평활도 또는 거칠기를 생성하도록 변형될 수 있다.
제 7 실시형태(170)는 도 9에 나타내어지고, 제 7 처리 시스템(172)을 제외하고는 상술한 제 1 실시형태(10), 제 2 실시형태(60), 제 3 실시형태(80), 제 4 실시형태(120), 제 5 실시형태(140) 및 제 6 실시형태(150)와 유사하다. 제 7 실시형태(170)는 제 1 저장소(12) 및 펌프(20)를 포함한다. 제 7 실시형태(170)는 고압 분무 또는 유체 흐름을 전달하기 위해 노즐(178) 또는 다른 시스템을 포함하는 제 7 처리 시스템(172)을 포함한다. 유체는 노즐로부터 방출되고 용기(174)의 벽 또는 회전 플레이트(176)와 같은 단단한 고정 표면에 충돌한다.
사용시, 용액(14)은 제 7 처리 시스템(172)으로 이동된다. 용액(14)의 흐름은 노즐(178)을 통해 전달된다. 용기(174)의 벽 또는 회전 플레이트(176)에 대해 용액(104)이 충돌하는 힘은 개질 용액(180)을 생성하는 오오시스트막의 적어도 일부를 파괴한다. 개질 용액(180)은 전달 장치(46)로 직접 전달되거나, 또는 제 2 저장소(40)와 같은 수용 용기로 전달된다.
5.5. 추가 실시형태
상기 설명된 실시형태는 시스템을 통해 용액을 이동시키는 수단으로서 펌프를 언급하는 경우가 있지만, 고압 공기 및 중력 공급과 같은 다른 장치가 사용될 수 있음이 상정된다는 것이 추가로 인식된다.
이들 실시형태가 오오시스트 및 스포로시스트 기반 용액에 초점을 맞추고 있지만, 본원에 설명된 용액은 바이러스, 박테리아, 효모, 포유 동물 세포, 식물 세포 또는 임의의 유전자 변형 유기체로 구성된 것을 포함하는 그 외 생백신을 함유할 수 있다는 것이 추가로 인식된다. 임의의 이러한 바이러스, 박테리아 등을 함유하는 용액이 백신의 특정 특성에 기초하여 다른 것보다 일실시형태에 더 적합할 수 있다는 것이 당업자에게 명백해야 한다.
본원에 설명된 시스템 및 방법은 균열된 오오시스트로부터 새롭게 방출되고 분무에 의해 후속적으로 전달되어 아이메리아 감염을 일으키는 스포로시스트를 사용하여 백신 반응의 효율을 높일 수 있다는 것을 보여준다. 상술한 시스템 및 방법을 사용한 일련의 실험을 완료했다. 결과는 이하에 설명된다. 백신 접종 시에 스포로시스트를 생성하고, 오오시스트 기반 백신보다 스포로시스트 기반 백신을 전달하는 것의 이점은 예상외로 긍정적이었으며, 수용자에게서 예상보다 높은 반응이 나타났다.
본원에 설명된 용액은 아이메리아 오오시스트 기반 백신이지만, 본원에 설명 된 시스템 및 방법을 사용하여 전달될 수도 있는 다른 오오시스트 기반 백신일 수 있는 것으로 상정된다는 것이 이해되어야 한다. 바람직한 실시형태는 주로 닭 및 칠면조에 대한 아이메리아 백신에 관한 것이지만, 당업자는 소, 염소, 토끼 또는 양과 같은 포유 동물에 대한 아이메리아 백신과 관련된 다른 실시형태를 인식할 것이다. 또한, 본원에 설명된 기술은 이러한 백신이 야생형이든 약독화되었든 관계 없이 임의의 종에 대한 개량된 아피콤플렉산 백신에 유용하다.
본원에 개시된 시스템 및 방법은 수산 양식에 사용하는데 적합화될 수 있다. 어류를 감염시키는 아이메리아의 예로는 E. 아우라티, E. 바우레이, E. 레피도시레니스, E. 류시스시, E. 루틸리 및 E. 바나시가 포함되지만 이에 한정되지 않는다. 백신 접종을 위해 보다 감염성이 높은 생활 단계의 방출을 촉진하기 위해 적용 가능한 이들 종에 파열 과정이 적용될 수 있다.
또한, 본원에 설명된 모든 실시형태는 동물에게 개별적으로 또는 한꺼번에 적용될 수 있음에 유의해야 한다. 본원에 설명된 실시형태는 큰 그룹의 부화 유생 또는 다른 동물에게 적용되고, 상자 또는 다른 용기에 포함되어 수용액의 전달을 받을 수 있는 것으로 이해된다. 전달은 혼합 시에 겔을 형성하는 2성분 수용액의 형태일 수 있다. 발명자 James Hutchins에 의해 Atty. Dkt. 673-04-PCT의 2019년 7월 10일자로 출원된 PCT 출원번호를 참조한다.
5.6. 재조합 단백질을 전달하기 위한 벡터로서의 아이메리아
본원에 개시된 방법 및 시스템은 다른 항원(들)을 전달하기 위한 벡터의 역할을 하도록 재조합적으로 변형된 아이메리아와 함께 사용될 수 있다. 파괴된 세포 물질을 포함하는 새 또는 다른 동물을 위한 백신은 포유동물 세포, 식물 세포, 곰팡이 세포, 효모 세포 또는 박테리아 세포와 같은 준세포 단편(subcellular fragments) 또는 천연 단백질 또는 재조합 단백질 제품을 생산하는데 사용된 세포주로부터 유래한 백신 또는 바이러스 감염 세포로부터 유래한 백신을 포함하여 본원에 설명된 시스템 및 방법에 의해 투여될 수 있다.
최근 연구에 따르면, 아이메리아는 성공적으로 형질 감염되어 외래 항원을 발현하는데 사용될 수 있다. 이러한 항원은 항원과 조합하여 또는 단독으로 사용되는 면역 체계를 자극하도록 서열 또는 다른 단백질 또는 가금류에 영향을 미치는 질병에 대한 바이러스, 박테리아, 또는 그 외 항원을 포함하는 것으로 예상될 수 있다. 또한, 다른 종의 아이메리아로부터의 항원이 발현될 수 있으며, 이는 단일종의 아이메리아 투여로부터 발생하는 여러 종의 아이메리아에 대한 교차 방어를 가능하게 한다. 예를 들면, Clark 등 및 다른 사람들은 아이메리아 기생충이 다가 백신 벡터로서 개발될 수 있어 이들 연구의 확장을 장려할 수 있음을 보여주는 결과를 나타내고 있다. Clark 등, 2012, Eimeria species parasites as novel vaccine delivery vectors: Anti-Campylobacter jejuni protective immunity induced by Eimeria tenella-delivered CjaA, Vaccine30(16) 2683-2688; Yan 등, 2009, Stable transfection of Eimeria tenella: Constitutive expression of the YFP-YFP molecule throughout the life cycle, Int'l Journal for Parasitology, 39(1) 109-117; 및 Marugan-Hernandez 등, 2016, Viral proteins expressed in the protozoan parasite Eimeria tenella are detected by the chicken immune system, Parasites & Vectors 9:463(pub. 2016년 8월 26일, 14페이지)을 참조한다. 유사하게는, 아이메리아 또는 다른 아피콤플렉사는 특정 숙주에 다른 항원을 전달하기 위한 벡터로서 조작될 수 있다.
다음의 실시예는 본 개시를 추가로 예시하며, 범위를 한정하려는 의도가 아니다. 본 개시는 설명된 특정 실시형태에 한정되지 않으며, 물론 변경될 수 있음을 이해해야 한다. 또한, 본원에서 사용된 용어는 특정 실시형태를 설명하기 위한 것이며, 본 개시의 범위가 첨부된 청구범위에 의해서만 한정될 것이기 때문에 한정하려는 의도가 아니라는 것을 이해해야 한다.
6. 실시예
6.1. 위관 영양(오오시스트 대 스포로시스트)
오오시스트를 새에게 전달하는데 있어서 입을 통해 전달되는 경구적 위관 영양은 최적 표준으로 여겨진다. 상업용 브로일러 백신을 사용한 연구에서 경구적 위관 영양의 결과는 예상보다 더 가변적인 것으로 밝혀졌다. 구체적으로, 이하의 결과는 위관 영양에 의해 전달되는 오오시스트의 감염성은 아이메리아종 및 여러 테스트 일자에 따라 크게 달라짐을 나타낸다. 이 관찰로 인해, 우리는 양성 대조군을 위한 대안적인 전달 수단으로서 눈(점안액)에의 투여를 테스트했다. 또한, 오오시스트를 파괴하여 스포로시스트를 방출하는 것은 위관 영양을 통해 전달될 때 더욱 효과적인 것으로 밝혀졌다. 오오시스트막 파괴는 수동 프로세스에 의해 4mm 유리 비드로 다종 오오시스트 현탁액을 진탕함으로써 달성되었다. 1일령 부화 유생은 오오시스트를 균열시키기 위해 그들의 모이주머니에 먹이가 필요하다는 가설을 세울 수 있다. 실험 환경과 통상의 부화장 환경에서 부화 유생은 보관과 운송으로 인해 3~8시간 동안 먹이를 받지 못하여, 미처리된 장관을 오오시스가 통과할 수 있게 한다. 점안액을 통한 백신 접종은 장에 도달하는 오오시스트의 움직임을 느리게 할 수 있으며, 오오시스트가 다른 효소에 노출될 수 있다.
백신 접종 전의 오오시스트막의 기계적 파괴는 스포로시스트의 처리를 보다 쉽게 하여 효과적으로 백신 접종된 새의 비율이 더 높아질 뿐만 아니라, 7일째에 검출된 오오시스트 생산(배출)의 레벨이 더 높아진다. 이는 예를 들면, E. 아세르불리나와 같은 보다 작은 종보다 E. 막시마와 같은 보다 큰 종 및 E. 텔레나와 같은 중간 종에 더 중요한 것으로 생각된다. 상기 보다 작은 종은 균열이 있든 없든 똑같이 감염되는 것으로 나타난다. 연구는 큰 오오시스트에 이어 중간 오오시스트의 막 파괴에 초점을 맞췄다. 브로일러 병아리는 부화일에 1X 용량의 상용 백신으로 백신 접종되었다. 7일째에 각각의 새로부터 장 내용물을 수집하고, 오오시스트를 McMaster의 챔버를 통해 종별로 계수했다.
표 1: 오오시스트 또는 스포로시스트의 위관 영양의 감염성 비교
Figure pct00001
시간이 지남에 따라, 위관 영양 백신 접종은 7일째에서 가변적인 결과에 의해 검출된 비일관적인 감염성을 초래했다. 스포로시스트를 방출하도록 처리된 백신과 점안액에 의해 전달된 백신에서 보다 유망한 결과가 나타났다.
6.2. 위관 영양 오오시스트 대 스포로시스트
다른 실험에 있어서, 오오시스트 파괴는 수동 프로세스에 의해 4mm 유리 비드로 다종 오오시스트 현탁액을 진탕함으로써 달성되었다. 잔류 오오시스트를 계수하면, E. 막시마 오오시스트의 약 64%가 스포로시스트로, E. 텔레나 오오시스트의 51%가 스포로시스트로, E. 아세르불리나 오오시스트의 17%가 스포로시스트로 전환된 것으로 나타났다. 부화일의 병아리(처리당 15마리)는 오오시스트 또는 잔류 오오시스트를 포함하는 유리 비드 방출 스포로시스트로 경구적 위관 영양을 통해 접종되었고, 장 내용물은 7일째에 수집했다.
표 2: 오오시스트 또는 잔류 오오시스트를 포함하는 스포로시스트의 위관 영양에 따른 반응의 빈도 및 증폭의 비교
Figure pct00002
반응의 빈도에 대해 위에 나타내어진 개선은 스포로시스트 및 오오시스트 처리에 의한 감염된 새의 비율의 차이이다. 반응의 증폭에 대해 위에 나타내어진 개선은 스포로시스트 처리를 위한 새 한 마리당 오오시스트 배출량을, 오오시스트 처리를 위한 새 한 마리당 오오시스트 배출량으로 나눈 것이다.
이 특정 경우에 있어서, 오오시스트 기반 백신에 비해 잔류 오오시스트를 포함하는 스포로시스트 백신을 경구적으로 백신 접종한 병아리에게서 반응의 빈도와 반응의 증폭이 모두 증가되었다.
위관 영양 투여된 새에게서 관찰되는 가변적인 감염률은 부화장에서 투여되는 오오시스트 기반 백신의 효과에 대해 의문을 제기한다. 부화장에서의 오오시스트 기반 백신이 투여된 새는 소화관에 먹이과 그릿이 부족하여 스포로시스트 단계까지 E. 막시마 오오시스트를 처리하는데 특히 중요할 수 있다. 만약 그렇다면, 이 새들은 1라운드 감염 동안 E. 막시마 감염의 낮은 레벨의 위험에 처하게 될 것이다. 그 후, 2라운드 감염 동안 대부분의 순수 개체군이 매우 높은 감염률 및 배출률의 위험을 무릅쓰고, 손상된 장 조직에서 2차 세균 감염의 추가 위험을 추가로 발생시킬 것이다. 실제로 이러한 상황은 흔한 경우이며, 일부가 백신 접종을 피하고, 대신에 먹이에 항구균제와 화학 물질을 사용하는 주된 이유 중 하나이다. 부화장에서 아이 스프레이(eye spray)로 투여되는 스포로시스트 기반 백신의 사용은 1라운드 감염 동안 E. 막시마의 감염성이 현저히 개선될 가능성을 가지고 있으며, 따라서 성장 시설에서 2라운드 감염 동안의 심각한 콕시디아증 감염 및 2차 감염의 위험을 방지할 수 있다.
6.3. 점안액 오오시스트 대 스포로시스트
또 다른 실험에 있어서, 오오시스트막 파괴는 수동 프로세스에 의해 4mm 유리 비드로 다종 오오시스트 현탁액을 진탕하여 완료되었다. 잔류 오오시스트의 계수는 E. 막시마 오오시스트의 약 52%가 스포로시스트로, E. 텔레나 오오시스트의 26%가 스포로시스트로, E. 아세르불리나 오오시스트의 47%가 스포로시스트로 전환된 것으로 나타났다. 부화일의 병아리(처리당 15마리)는 오오시스트 또는 유리 비드 방출 스포로시스트 및 잔류 오오시스트로 점안액을 통해 접종되었고, 장 내용물은 7일째에 수집했다.
표 3: 오오시스트 또는 잔류 오오시스트를 포함하는 스포로시스트 백신의 점안액 투여에 의한 반응의 빈도 및 증폭의 비교
Figure pct00003
스포로시스트 처리군은 E. 막시마와 E. 텔레나에 대한 반응의 빈도 및 증폭 모두에서 개선된 결과가 나타나는 것으로 밝혀졌다. 미처리 대조군 새의 장 내용물에는 오오시스트가 관찰되지 않았다.
6.4. 분무에 의한 스포로시스트의 전달
다음의 실험 세트에 있어서, 스포로시스트의 방출은 4mm 유리 비드로 다종 오오시스트 현탁액을 손으로 진탕하여 달성되었다. 잔류 오오시스트의 계수는 라지 오오시스트(E. 막시마종)의 최소 66%가 스포로시스트로, 미듐 오오시스트(E. 텔레 나종)의 75%가 스포로시스트로, 스몰 오오시스트(E. 아세르불리나 및 그 외의 스몰 종)의 13%가 스포로시스트로 전환된 것으로 계산되었다. 부화일의 병아리(처리 당 15마리)는 고정된 위치에 두고, 앞서 상기에서 설명한 바와 같이 미처리 오오시스트 또는 유리 비드 방출 스포로시스트 처리로 장치로부터 분무되었다. 분무는 병아리의 안면 점막을 겨냥한 액체 및 공기 압력 모두를 사용하여 공기 원자화 노즐을 통해 투여되었다. 그 후, 새에게 먹이와 물을 제공하고 7일간 성장시킨 후 각각의 새의 장 내용물을 수집하기 위해 희생시켰다. 이하는 이들 각각의 분무식 백신 접종 실험과 관련된 데이터 표이다.
표 4: 연구 A에서 오오시스트 또는 스포로시스를 분무한 새에 대한 반응의 빈도 및 증폭
Figure pct00004
표 5: 연구 B에서 오오시스트 또는 스포로시스트를 분무한 새에 대한 반응의 빈도 및 증폭
Figure pct00005
표 6: 연구 C에서 오오시스트 또는 스포로시스트를 분무한 새에 대한 반응의 빈도 및 증폭
Figure pct00006
오오시스트 계수에 의해 반응의 감염 빈도 및 증폭이 스포로시스트 처리로 모두 개선되었다는 것이 밝혀졌다.
3개의 실험 모두에서, 미처리 대조군 새의 장 내용물에서 오오시스트가 관찰되지 않았고, 점안액을 통해 접종된 양성 대조군은 실험적 분무 처리군보다 감염 빈도 및 증폭이 더 높았다.
표 4, 표 5 및 표 6에 제시된 결과는 예상치 못한 것으로 이해되어야 한다. 그 결과는 스포로시스트 백신 접종을 통한 백신의 흡수율이 예상보다 높게 병아리에서 발생했음을 나타낸다. 이것은 부분적으로 병아리의 소화관 내의 미파괴 오오시스트를 적절하게 처리하지 못한 것에 기인하는 것으로 여겨진다. 병아리의 스포로시스트에 의한 감염은 상당수의 병아리가 스포로시스트에 의해 처리되고 감염될 수 있지만 오오시스트는 그렇지 않다는 것을 나타낸다. 그 효과는 E. 아세르불리나보다 E. 막시마와 E. 텔레나에서 더 많이 나타난다. 따라서, 병아리의 상부 소화기계에는 모이주머니와 모래주머니를 포함한 연마 물질이 없기 때문에 E. 막시마와 E. 텔레나 오오시스트는 쉽게 파괴되지 않는 것으로 여겨진다. 스포로시스트는 스포로조이트의 탈낭을 위해 병아리의 소화기계에는 연마 물질을 필요로 하지 않는다. 스포로시스트는 소화관에서 프로테아제와 같은 효소에 의해 감염성 스포로조이트 생활 단계까지 쉽게 처리된다.
고정된 환경에서 새에게 백신 접종하고, 성장시키고, 장 내용물을 수집하기 위해 7일째에 희생시킨 또 다른 실험에 있어서, 스포로시스트 대 오오시스트 접종의 효과가 나타났다. 그러나, 이 경우 병아리에게는 액체 및 공기 압력 모두가 아닌 액체 압력만을 사용하는 노즐을 사용하여 분무되었다. 공기 압력의 부족은 백신의 원뿔형 원자화와 비교했을 때, 스트림과 같은 유체 분배를 생성했다. 이 실험의 결과는 아래 표에서 볼 수 있다.
표 7: 공기 압력 없이 오오시스트 또는 스포로시스트를 분무한 새에 대한 반응의 빈도 및 증폭
Figure pct00007
미처리 대조군 새의 장 내용물에서 오오시스트가 관찰되지 않았고, 점안액을 통해 접종된 양성 대조군은 실험적 분무 처리군보다 감염 빈도 및 증폭이 더 높았다. E. 막시마의 경우, 반응의 빈도 및 반응의 증폭이 수치적으로 더 컸고. E. 텔레나와 E. 아세르불리나의 경우는 정도가 적었다. 이들 결과는 노즐의 분무 패턴에 관계 없이 잔류 오오시스트 용액을 포함하는 스포로시스트의 투여가 오오시스트 용액과 비교했을 때, 개선된 결과를 초래하는 것을 나타낸다.
오오시스트의 수동 프로세스에 추가하여, 스포로시스트를 방출하는 것 외에도 유리 비드를 이용한 IKA Ultra Turrax 장치(IKA®-Werke GmbH & Co., 독일 스타우펜)를 사용하는 자동화 프로세스가 있다. 유리 비드를 백신 부피(붕규산 유리 볼, 크기 1~6mm)에 첨가하고 4,000~8,000rpm으로 20~240초간 처리했다. 오오시스트 전단의 결과는 개선된 반복성을 갖는 수동 프로세스와 동일하다. IKA UTTD 장치에 의해 처리된 후의 잔류 오오시스트의 계수는 E. 막시마 오오시스트의 약 76%가 스포로시스트로, E. 텔레나 오오시스트의 70% 및 E. 아세르불리나의 46%가 스포로시스트로 전환된 것으로 나타난다. 앞서 언급한 것과 동일한 방법론으로 브로일러 병아리를 사용한 실험에서 다음과 같은 결과를 초래했다.
표 8: IKA UTTD 장치에 의해 처리되는 오오시스트 또는 잔류 오오시스트를 포함하는 스포로시스트를 분무한 새에 대한 반응의 빈도 및 증폭
Figure pct00008
미처리 대조군 새의 장 내용물에서 오오시스트가 관찰되지 않았고, 점안액을 통해 접종된 양성 대조군은 실험적 분무 처리군보다 감염 빈도 및 증폭이 더 높았다. E. 막시마와 E. 텔레나의 경우, 반응의 빈도 및 반응의 증폭이 수치적으로 더 컸고, E. 아세르불리나의 경우는 정도가 더 적었다. 이 데이터는 IKA UTTD 장치가 오오시스트를 전단하여 스포로시스트/잔류 오오시스트 용액을 생성하고, 손으로 진탕하는 프로세스와 유사한 결과를 제공할 수 있음을 시사한다. 또 다른 실험에 있어서, 스포로시스트를 이용한 백신 접종 대 오오시스트를 이용한 백신 접종 간의 차이를 알 수 있다. 이 실험에 있어서, 스포로시스트의 방출은 4mm 유리 비드로 다종 오오시스트 현탁액을 손으로 진탕함으로써 달성되었다. 이 스포로시스트/잔류 오오시스트 용액 및 오오시스트 단독 용액은 안면 점막을 겨냥하여 부화일에 투여되었다. 2세트의 노즐이 채용되었으며, 제 1 세트는 2% 알긴산나트륨 용액을 투여하고, 제 2 세트는 3.0% 염화칼슘 용액 중의 백신을 투여했다. 이들 두 용액이 새의 피부에 닿으면 겔이 형성된다. 겔의 생성은 전형적인 수성 분무와 비교했을 때 오오시스트/스포로시스트 백신의 수화를 더 오래 유지시켜 새의 잠재적인 깃털 고르기 시간을 연장시키는 것으로 가정된다. Hutchins에 의해 Atty. Dkt. 673-04-PCT의 2019년 7월 10일자로 출원된 PCT 번호를 참조한다. 이 실험의 결과는 아래 표에서 볼 수 있다.
표 9: 오오시스트 또는 잔류 오오시스트를 포함하는 스포로시스트를 겔로 분무한 새에 대한 반응의 빈도 및 증폭
Figure pct00009
미처리 대조군 새의 장 내용물에서 오오시스트가 관찰되지 않았고, 점안액을 통해 접종된 양성 대조군은 실험적 분무 처리군보다 감염 빈도 및 증폭이 더 높았다. 이들 결과는 겔 제형 스포로시스트가 반응의 빈도 및 증폭 모두에서만 오오시스트보다 우수하다는 것을 나타낸다. 스포로시스트가 아니라 오오시스트로서 투여되는 경우이어도 보다 작은 E. 아세르불리나종의 감염성은 비교적 높은 것으로 알려졌다. 감염성 데이터는 E. 아세르불리나 오오시스트가 먹이와 그릿의 유무에 관계 없이 닭의 소화관에서 스포로시스트 생활 단계에 이어 스포로조이트 생활 단계까지 효율적으로 처리될 수 있음을 나타낸다.
위관 영양의 감염성 증거는 E. 막시마가 특히 소화관에 먹이 또는 그릿이 존재하지 않으면 스포로시스트 단계까지 인비보(in vivo) 처리되지 않을 수 있음을 나타낸 것이다. E. 막시마로부터의 감염성 및 다소 덜한 정도의 E. 텔레나는 투여 전에 스포로시스트 생활 단계까지 오오시스트 생활 단계를 사전 처리함으로써 촉진된다. 그러나, 인비트로(in vitro)에서 보다 큰 E. 막시마 오오시스트를 균열시키는데 필요한 전단력은 보다 작은 E. 아세르불리나 오오시스트를 균열시키는데 필요한 전단력보다 훨씬 작다(유럽 특허 2,111,243 B1(Hutchins 등, Embrex, Inc.)). 따라서, 사용 시점에서 스포로시스트를 생산하기 위한 시스템은 보다 큰 오오시스트종을 균열시키는 인비트로 효율과, 보다 작은 오오시스트종을 처리하는 인비보 효율을 결합하여 보다 강력한 백신 효능을 내는 보완적인 작용을 제공한다.
6.5. 고압 균질기의 결과
6.5.1. 오오시스트 감소 카운트 - 인비트로
혼합된 아이메리아종의 오오시스트를 함유하는 액상 현탁액은 다양한 압력에서 고압 균질기(HPH) IKA 모델 2000-4를 통해 처리되었다. 세포 현탁액은 HPH의 입구로 적재되고 압력 범위(200~1500bar)에서 처리한 다음 출구로부터 분배되었다. 액상 제제에 함유된 온전한 오오시스트는 HPH에의 노출 전후에 McMaster의 부유 챔버를 사용하여 계수되었다. 결과는 이하의 표에 나타내어진다.
표 10: 고압 균질기(HPH)를 이용하여 상이한 압력에서 처리된 잔류 오오시스트의 비교
Figure pct00010
결과는 압력이 높을수록 오오시스트 감소율이 높고, 따라서 스포로시스트 방출률이 높았다.
오오시스트 또는 스포로시스트를 분무한 새에 대한 반응의 빈도 및 증폭 - 인비보
이 실험에서 새는 IKA HPH 2000-4 장치에 의해 처리되는 잔류 오오시스트를 포함하는 스포로시스트 용액 또는 오오시스트 용액으로 구성된 노즐 분무에 노출되었다. 그 후, 새에게 먹이와 물을 제공하고, 성장시키고, 개체의 장 내용물을 수집하기 위해 7일째 희생시켰다. 이 실험의 결과는 이하의 표에 나타내어진다.
표 11: 미처리 오오시스트 대 200bar에서 IKA HPH 2000-4에 의해 처리된 오오시스트의 감염성 비교
Figure pct00011
표 12: 미처리 오오시스트 대 500bar에서 IKA HPH 2000-4에 의해 처리된 오오시스트의 감염성 비교
Figure pct00012
15마리의 미처리 대조군 새의 장 내용물에서 어떠한 종의 오오시스트도 관찰되지 않았다. 점안액을 통해 접종된 양성 대조군은 실험적 치료군과 비교했을 때, 100%(모든 종에 걸쳐)의 감염 빈도 및 더 높은 증폭(모든 종에 걸쳐)을 초래했다. IKA HPH에 대한 오오시스트 감소율은 인비트로 데이터로부터 만족스러워 보였지만, 균질화 프로세스로부터 생성된 스포로시스트도 손상되어 인비보 데이터에서는 반응의 빈도 및 증폭이 양호하지 못한 것으로 가정된다.
6.6. 로터/스테이터형 장치의 결과
6.6.1. 오오시스트 감소 카운트 - 인비트로
혼합된 아이메리아종을 함유하는 액상 오오시스트 현탁액은 단일 패스, 인라인, 로터/스테이터형 장치인 IKA Magic Lab을 통해 다양한 속도로 처리되었다. 세포 현탁액은 Magic Lab의 호퍼에 적재하고, 1~3개의 로터/스터이터 발생기를 통해 다양한 속도(3,000~26,000rpm)로 처리한 다음 출구로부터 분배되었다. 이 실험에 사용된 발생기는 6F 모델이었다. Magic Lab 장치에 의한 처리 전후에 McMaster의 부유 챔버를 사용하여 액상 제제 중의 온전한 오오시스트를 계수했다. 결과는 이하의 표에 나타내어진다.
표 13: 로터/스테이터를 사용하여 상이한 속도로 처리된 잔류 오오시스트의 비교
Figure pct00013
오오시스트 감소는 E. 막시마에서 일관되게 관찰되었으며, E. 텔레나에서는 변동이 심한 감소가 관찰되었으며, E. 아세르불리나에서는 최소 감소가 관찰되었다.
오오시스트 또는 스포로시스트를 분무한 새에 대한 반응의 빈도 및 증폭 - 인비보
이 실험에 있어서, 부화일의 브로일러 병아리는 IKA Magic Lab 장치에 의해 처리된 잔류 오오시스트를 포함하는 스포로시스트 용액 또는 오오시스트 용액으로 구성된 노즐 분무에 노출되었다. 그 후, 새에게 먹이와 물을 제공하고, 성장시키고, 개체의 장 내용물을 수집하기 위해 7일째에 희생시켰다. 이 실험의 결과는 이하의 표에 나타내어진다.
표 14: 미처리 오오시스트 대 16,000rpm으로 IKA Magic Lab에 의해 처리된 오오시스트의 감염성 비교
Figure pct00014
표 15: 미처리 오오시스트 대 26,000rpm으로 IKA Magic Lab에 의해 처리된 오오시스트의 감염성 비교
Figure pct00015
15마리의 미처리 대조군 새의 장 내용물에서 어떠한 종의 오오시스트도 관찰되지 않았다. 점안액을 통해 접종된 양성 대조군은 실험적 치료군과 비교했을 때, 100%의 감염 빈도(모든 종에 걸쳐) 및 더 높은 증폭(모든 종에 걸쳐)을 초래했다. 두 Magic Lab 치료군에 있어서 E. 막시마에 대한 반응의 빈도가 증가했지만, 각각의 치료군에 대한 반응의 증폭은 오오시스트 치료군에 속한 것보다 적었으나 여전히 허용가능한 범위 내이었다. 반응의 빈도 및 증폭은 E. 텔레나에서 가장 두드러지게 증가했다. 이들 결과는 사용된 조건 하에서 E. 막시마 오오시스트가 과잉 처리되었음을 나타낼 수 있다.
6.7. 유체역학적 캐비테이션 실험
6.7.1. 유체역학적 캐비테이션을 이용한 인비트로 연구
초기 테스트를 위해, 질소 충전기 및 출구의 부착물을 구비한 저비용의 비누출 강화 알루미늄 휘핑 크림 디스펜서(EurKitchen EK-WHIP-18)가 사용되었다. 혼합된 아이메리아 제제를 함유하는 액체를 캐니스터에 적재하고, 질소 가스 카트리지를 추가한 다음 캐니스터를 여러 번 뒤집어 가스가 액체를 포화시킬 수 있도록 했다. 캐니스터를 거꾸로 뒤집고 밸브를 열어 압력 강하를 생성하고 액체를 방출했다. 액체 제제는 종에 따른 오오시스트의 파괴율을 결정하기 위해 유체역학적 캐비테이션에의 노출 전후에 카운트되었다. 일부 경우에 있어서는 초기 시스템 테스트에서 가스의 압력과 양을 제어할 수 없었기 때문에 액체는 처리되어 시스템으로부터 방출되고, 시스템에 다시 적재된 다음 두세 번 더 유체역학적 캐비테이션에 다시 노출되어 더 많은 세포를 파괴했다.
본 개시의 목적을 위해, 이미 유체역학적 캐비테이션을 거친 액체를 방출한 다음 동일 액체를 동일 용기에 다시 적재하여 유체역학적 캐비테이션에 다시 노출시키는 행위를 "패스(pass)"라고 할 것이다. 따라서, 이 시점부터 "패스 1", "패스 2" 또는 "패스 3"이라는 용어는 액체를 유체역학 캐비테이션의 프로세스에 정해진횟수만큼 노출시키는 행위를 나타내는데 사용된다. 횟수는 "패스" 다음에 나오는 숫자로 정의된다.
표 16: 휘핑 크림 디스펜서 유체역학적 캐비테이션의 여러 사이클에 의해 처리된 잔류 오오시스트의 비교
Figure pct00016
새로운 세포 파괴 기술을 따르는 유용성을 측정하기 위해 실험 1(표 16 참조)이 수행되었고, 기술을 추가로 탐구하기 위해 실험 2가 수행되었다. 궁극적으로 실험 1은 유리 비드로 진탕하기와 같은 이전에 탐구된 오오시스트 전단 기술을 사용하여 초기 테스트와 유사하게 수행된 모든 종에 걸쳐 오오시스트로부터 스포로시스트로의 유사한 전환을 보여주었다. 실험 2에서 "패스 2"는 "패스 1"로의 우수한 전환을 보여 주었고, "패스 3"은 "패스 2"와 유사한 결과를 보여주었고, 이는 질소 캐비테이션에의 노출 증가가 반드시 전환을 더욱 개선하지는 않았음을 나타낸다.
이전에 확립된 EurKitchen 접근법의 제한된 파라미터 하에서 유체역학적 캐비테이션의 성공에 따라, 프로토콜은 상용 등급의 유체역학적 세포 파괴자를 통합하도록 추가로 개량되었고, 이에 대한 프로세스는 제 6 실시형태에서 보다 상세히 탐구된다.
다양한 압력(1000psi 및 1500psi)으로 질소 충전 연결(ParrTM 1831)을 통해 공급된 질소 가스와 함께 세포 파괴 용기(ParrTM 4639)를 사용함으로써 추가 조사가 수행된 다음 질소 가스를 희석된 백신에 5분간 용해시켰다.
압력과 시간에 대한 상세가 제공되지만, 프로세스의 상세는 더 넓은 범위에 걸쳐 발생할 수 있음이 명시되어야 한다. 이 범위는 500~5000psi 범위의 압력, 1~30분간 지속되는 노출 시간 및 다양한 조성의 희석제로 구성될 수 있다. 이들 조성물은 증류수, 인산염 완충 식염수(PBS) 및 이 둘의 다른 변형으로 구성 될 수 있다.
표 17: 세포 파괴 용기 유체역학적 캐비테이션의 여러 압력에 의해 처리된 잔류 오오시스트의 인비트로 비교
Figure pct00017
액체 제제는 유체역학적 캐비테이션에 의해 처리되기 전후에 McMaster의 부유 챔버 방법을 통해 계수되었다. 결과는 테스트된 압력 모두에 있어서 각각 라지 및 스몰 종에서 오오시스트의 약 50% 및 25%가 스포로시스트로 전환될 수 있는 것으로 나타났다. 더 높은 테스트된 압력에서는 미듐 종의 전환이 증가했다.
6.7.2. 인비보 유체역학적 캐비테이션 연구(1 st 방법)
이러한 일련의 실험에 있어서, 오오시스트막 파괴는 유체역학적 캐비테이션을 이용하여 완료되었으며, 오오시스트 배출 모델을 통해 감염성을 평가했다. 잔류 오오시스트의 계수를 계산하여 이하에 나타내어진다. 부화일의 병아리(처리당 15마리)에게 분무식 백신 접종을 통해 오오시스트 또는 잔류 오오시스트를 포함하는 유체역학적 캐비테이션 방출된 스포로시트를 접종하고, 7일째에 장 내용물을 수집했다.
이하의 표 18 및 표 19의 데이터는 EurKitchen 유체역학적 캐비테이션 방출 스포로시스트의 인비보 전달의 효과를 입증한다. 표 19의 데이터는 표 18의 데이터와 별개의 실험에서 수집되었다.
표 18: 아르티장(artisan) 휘핑 크림 디스펜서 유체역학적 캐비테이션의 여러 사이클의 인비보 감염성 비교
Figure pct00018
표 19: 아르티장 휘핑 크림 디스펜서 유체역학적 캐비테이션의 인비보 감염성 비교
Figure pct00019
미처리 대조군 새의 장 내용물에는 오오시스트가 관찰되지 않았다. 이 실험d의 점안액 제어는 실험적 처리군과 비교했을 때 반응의 빈도 및 증폭이 더 높았다. 표 18은 상이한 "패스" 횟수의 비교 효과를 보여주고, 표 19는 오오시스트 아이 스프레이의 전달과 비교했을 때 가장 우수한 "패스 2"의 효과를 보여주었다.
6.7.3. 인비보 유체역학적 캐비테이션 연구(2nd 방법)
이하의 표 20 및 표 21의 데이터는 세포 파괴 용기 유체역학적 캐비테이션을 통한 세포 파괴 프로세스의 효과를 보여준다. 표 20 및 표 21의 데이터는 동일 실험으로부터 수집되었다.
표 20: 세포 파괴 용기 유체역학적 캐비테이션(1000psi)의 인비보 감염성 비교
Figure pct00020
표 21: 세포 파괴 용기 유체역학적 캐비테이션(1500psi)의 인비보 감염성 비교
Figure pct00021
미처리 대조군 새의 장 내용물에는 오오시스트가 관찰되지 않았다. 이 실험의 점안액 제어는 실험적 처리군과 비교했을 때 반응의 빈도 및 증폭이 더 높았다. 1000psi 처리는 E. 막시마와 E. 텔레나에 대해 반응의 빈도가 개선되었고, 모든 종에 대해 반응의 증폭이 개선된 것으로 나타났다. 1500psi 처리는 E. 막시마와 E. 텔레나에 대해 반응의 빈도가 개선된 것으로 나타났지만, E. 막시마와 E. 아세르불리나에 대해 증폭에의 영향은 없었으나 E. 텔레나에 대해 반응의 증폭은 크게 증가했다.
예상한 바와 같이, 세포 파괴 용기에 의해 입증된 정제된 유체역학적 캐비테이션 기술은 제어하기 어려운 휘핑 크림 디스펜서 접근법을 능가했다. E. 아세르 불리나를 제외한 모든 종은 개선된 감염성을 나타냈고, E. 텔레나 오오시스트 배출의 관점에서, 두 세포 파괴 용기 압력 파라미터는 뚜렷한 증가를 보였다.
6.8. 추가 백신을 사용한 인비트로 실험
이전 섹션에서, 백신 성능을 개선하기 위해 오오시스트막을 파괴하여 스포로시스트를 방출하는 방법이 설명되었다. 초기 테스트는 수동 및 자동 프로세스 모두에서 1st 브로일러 닭 콕시디아 백신을 사용하여 수행되었다. 여기서, 2nd 브로일러 닭 콕시디아 백신, 1st 및 2nd 산란용 닭 콕시디아 백신 및 1st 칠면조 콕시디아 백신에서 오오시스트막을 파괴하는 프로세스를 설명한다.
수동 프로세스의 경우, 백신을 유리 비드에 첨가하여 격렬하게 진탕했다. 라지, 미듐, 및 스몰 오오시스트의 수를 카운트하여 수동 처리의 전후를 비교했다. 또한, 백신의 분취량을 비드 밀에 첨가하여 샘플을 처리하는 자동화 시스템을 사용했다. 이 경우, 일회용 분산기 시스템(IKA ULTRA-TURRAX Tube Drive 시스템)이 사용되었지만, 임의의 유사한 시스템에서도 유사한 결과를 초래할 것으로 예상된다.
카운트하기 위해, 테스트된 백신에 포함된 오오시스트는 Conway와 McKenzie에 설명된 대로 크기에 따라 라지, 미듐 및 스몰로 분류되었다(Poultry Coccidiosis: Diagnostic and Testing Procedures, 3rd Edition, 2007년 6월, Wiley-Blackwell). 테스트된 세트에는 다양한 상업원으로부터 E. 아세르불리나, E. 아데노에이데스, E.브루네티, E. 하가니, E. 멜레아그리미티스 E. 미바티, E. 막시마, E. 네카트릭스, E. 프라에콕스, 및 E. 텔레나와 같은 아이메리아종들이 포함되었다. 이 세트에는 비약독화 및 약독화(조숙) 균주의 적어도 한 종이 포함되었다. 각각의 샘플은 3회 카운트되었으며 평균은 이하에 기재된다.
표 22: 1st 산란용 닭 콕시디아 백신을 사용한 오오시스트 감소
Figure pct00022
표 23: 2nd 산란용 닭 콕시디아 백신을 사용한 오오시스트 감소
Figure pct00023
표 24: 2nd 브로일러 닭 콕시디아 백신을 사용한 오오시스트 감소
Figure pct00024
표 25: 1st 칠면조 콕시디아 백신을 사용한 오오시스트 감소
Figure pct00025
* 백신에 라지 또는 스몰 오오시스트가 존재하지 않음
결과는 테스트된 매우 다양한 백신에 대한 오오시스트의 전단의 일반적인 민감성을 나타내며, 설명된 시스템과 처리는 광범위하게 적용가능함을 나타낸다.
7. 개시의 일반적인 진술
다음의 번호가 매겨진 진술은 개시의 일반적인 설명을 제공하며, 첨부된 청구범위를 제한하려는 의도가 아니다.
진술 1: 아이메리아에 대해 동물에게 백신 접종하는 방법에 있어서, 아이메리아 오오시스트의 용액을 제공하는 스텝으로서, 오오시스트는 외막을 가지며 내부에 생존가능한 스포로시스트를 함유하는, 스텝; 개질 용액을 생성하는 아이메리아 오오시스트 외막의 적어도 일부를 파괴하는 스텝; 및 개질 용액을 동물에게 전달하는 스텝을 포함하는 방법.
진술 2: 아피콤플렉산 질병으로부터 동물을 보호하는 방법에 있어서, 아피콤플렉사 오오시스트의 용액을 제공하는 스텝으로서, 오오시스트는 외막을 가지며 내부에 생존가능한 스포로시스트를 함유하는, 스텝; 개질 용액을 생성하는 아피콤플렉사 오오시스트 외막의 적어도 일부를 파괴하는 스텝; 및 개질 용액을 동물에게 전달하는 스텝을 포함하는 방법.
진술 3: 진술 1 또는 진술 2에 있어서, 생존가능한 스포로시스트는 파괴된 막으로부터 방출되는 방법.
진술 4: 진술 1 내지 진술 3 중 어느 하나에 있어서, 개질 용액은 막이 파괴될 때 동물에게 전달되는 방법.
진술 5: 진술 1 내지 진술 3에 있어서, 개질 용액을 생성하는 파괴 후 5일 이내에 개질 용액이 동물에게 전달되는 방법.
진술 6: 진술 1 내지 진술 5 중 어느 하나에 있어서, 개질 용액은 분무에 의해 전달되는 방법.
진술 7: 진술 1 내지 진술 6 중 어느 하나에 있어서, 아이메리아 또는 아피콤플렉사 오오시스트는 단일 아이메리아종의 아이메리아 오오시스트 또는 단일 아피콤플렉사종으로부터의 아피콤플렉사 오오시스트인 방법.
진술 8: 진술 1 내지 진술 6 중 어느 하나에 있어서, 아이메리아 또는 아피콤플렉사 오오시스트는 둘 이상의 아이메리아종을 함유하는 아이메리아 백신으로부터의 아이메리아 오오시스트 또는 둘 이상의 아피콤플렉사종으로부터의 아피콤플렉사 오오시스트인 방법.
진술 9: 진술 1 내지 진술 8 중 어느 하나에 있어서, 아이메리아 또는 아피콤플렉사 오오시스트의 용액은 농축된 백신 용액인 방법.
진술 10: 진술 1 내지 진술 8 중 어느 하나에 있어서, 아이메리아 또는 아피콤플렉사 오오시스트의 용액은 희석된 백신 용액인 방법.
진술 11: 아이메리아 오오시스트의 외막을 파괴하고, 생성된 용액을 실시간으로 동물에게 전달하는 시스템에 있어서, 상기 시스템은,
용액 중에 아이메리아 오오시스트를 함유하는 용기로서, 오오시스트가 외막을 가지며 내부에 생존가능한 스포로시스트를 함유하는, 용기; 개질 용액을 생성하는 아이메리아 오오시스트의 적어도 일부의 외막이 파괴되는 오오시스트 처리 챔버; 및 전달 출구를 포함하고, 이것에 의해 개질 용액은 용기로부터 처리 챔버를 통해, 생성된 용액이 동물에게 전달되는 상기 전달 출구로 이동되는 시스템.
진술 12: 아피콤플렉사 오오시스트의 외막을 파괴하고, 생성된 용액을 실시간으로 동물에게 전달하는 시스템에 있어서, 용액 중에 아피콤플렉사 오오시스트를 함유하는 용기로서, 오오시스트는 외막을 가지며 내부에 생존가능한 스포로시스트 함유하는 용기; 개질 용액을 생성하는 아피콤플렉사 오오시스트의 적어도 일부의 외막이 파괴되는 오오시스트 처리 챔버; 및 전달 출구를 포함하고, 이것에 의해 개질 용액은 용기로부터 처리 챔버를 통해, 개질 용액이 동물에게 전달되는 전달 출구로 이동되는 시스템.
진술 13: 진술 11 또는 진술 12에 있어서, 생존가능한 스포로시스트는 파괴된 막으로부터 방출되는 시스템.
진술 14: 진술 11 내지 진술 13 중 어느 하나에 있어서, 오오시스트 처리 챔버는 고압 균질기, 로터 스테이터 혼합기, 그것에 부착된 교반자 및 경질 비드를 포함하는 챔버 용기, 한 쌍의 진동 플레이트, 초음파 파쇄기, 유체역학적 캐비테이션 장치, 고압 분무기, 또는 그것의 조합으로 이루어지는 군 중 적어도 하나인 시스템.
진술 15: 진술 11 내지 진술 14 중 어느 하나에 있어서, 균질기는 약 3000psi의 압력을 제공하는 시스템.
진술 16: 진술 11 내지 진술 15 중 어느 하나에 있어서, 파열된 아이메리아 또는 아피콤플렉사 오오시스트의 수는 최장 치수가 20미크론보다 작은 오오시스트의 경우 약 5~50%이고, 최장 치수가 20미크론~30미크론의 범위인 오오시스트의 경우 약 15~75%이고, 최장 치수가 30미크론보다 큰 오오시스트의 경우 25~90%인 시스템.
진술 17: 진술 11 내지 진술 16 중 어느 하나에 있어서, 아이메리아 또는 아피콤플렉사 오오시스트를 함유하는 용액은 적어도 하나의 단백질 분해 효소를 포함하는 시스템.
진술 18: 진술 17에 있어서, 단백질 분해 효소는 트립신, 키모트립신 또는 그것의 혼합물인 시스템.
진술 19: 진술 11 내지 진술 18 중 어느 하나에 있어서, 아이메리아 또는 아피콤플렉사 오오시스트를 함유하는 용액은 농축된 백신 용액인 시스템.
진술 20: 진술 11 내지 진술 18 중 어느 하나에 있어서, 아이메리아 또는 아피콤플렉사 오오시스트를 함유하는 용액은 완충염, 당류, 단백질 또는 단백질 가수분해물; 염료; 또는 증점제를 추가로 포함하는 시스템.
진술 21: 동물에게의 전달 시에 오오시스트막을 파괴하는 방법에 있어서, 용액 중에 아이메리아 오오시스트의 체적을 함유하는 용기를 제공하는 스텝으로서, 오오시스트는 외막을 가지며 내부에 생존가능한 스포로시스트를 함유하는, 스텝; 오오시스트의 외막을 파괴하기 위한 시스템을 제공하는 스텝; 전달 장치를 제공하는 스텝; 용액을 제 1 용기로부터 시스템으로 이동시키는 스텝; 처리 챔버를 통해 용액을 통과시킴으로써, 아이메리아 개질 용액을 생성하는 오오시스트막의 적어도 일부가 파괴되는 스텝; 및 상기 시스템으로부터, 개질 용액이 동물에게 전달되는 전달 장치로 상기 개질 용액을 이동시키는 스텝을 포함하는 방법.
진술 22: 동물에게의 전달 시에 오오시스트막을 파괴하는 방법에 있어서, 용액 중에 아피콤플렉사 오오시스트의 체적을 함유하는 용기를 제공하는 스텝으로서, 오오시스트는 외막을 가지며 내부에 생존가능한 스포로시스트를 함유하는, 스텝; 오오시스트의 외막을 파괴하는 시스템을 제공하는 스텝; 전달 장치를 제공하는 스텝; 용액을 제 1 용기로부터 시스템으로 이동시키는 스텝; 처리 챔버를 통해 용액을 통과시킴으로써, 개질 용액을 생성하는 아피콤플렉사 오오시스트막의 적어도 일부가 파괴되는 스텝; 및 상기 시스템으로부터, 개질 용액이 동물에게 전달되는 전달 장치로 개질 용액을 이동시키는 스텝을 포함하는 방법.
진술 23: 진술 21 또는 진술 22에 있어서, 시스템은 고압 균질기, 초음파 파쇄기, 로터 스테이터 혼합기, 부착된 교반자 및 내부에 경질 비드를 함유하는 용기, 한 쌍의 진동 플레이트, 유체역학적 캐비테이션 장치, 고압 분무기, 또는 그것의 조합으로 이루어진 군으로부터 적어도 하나를 포함하는 방법.
진술 24: 진술 21 내지 진술 23 중 어느 하나에 있어서, 균질기는 약 3000psi 초과의 압력을 제공하는 방법.
진술 25: 진술 21 내지 진술 24 중 어느 하나에 있어서, 파열된 오오시스트의 수는 최장 치수가 20미크론보다 작은 오오시스트의 경우 적어도 약 5%이고, 최장 치수가 20미크론~30미크론의 크기 범위인 오오시스트의 경우 적어도 약 15%이고, 최장 치수가 30미크론보다 큰 오오시스트의 경우 적어도 약 25%인 방법.
진술 26: 진술 21 내지 진술 25 중 어느 하나에 있어서, 아이메리아 오오시스트 또는 아피콤플렉사의 용액은 농축된 백신 용액인 방법.
상기 설명은 예시적인 실시형태 및 실시예를 대표할 뿐이라는 것으로 이해되어야 한다. 독자의 편의를 위해, 상기 설명은 모든 가능한 실시형태의 대표예, 본 개시의 원리를 교시하는 예에 제한적으로 초점을 맞추었다. 상기 설명은 모든 가능한 변형 또는 심지어 설명된 그들 변형의 조합까지 철저히 열거하려고 시도하지 않았다. 대안적인 실시형태가 본 개시의 특정 부분에 대해 제시되지 않을 수 있거나, 추가로 설명되지 않은 대안적인 실시형태는 일부에 대해 이용가능할 수 있으며, 그러한 대안적인 실시형태에 대한 부인으로 간주되지 않는다. 당업자는 설명되지 않은 실시형태의 많은 부분이 본 개시의 원리의 적용에 있어서의 차이보다는 기술 및 물질의 차이를 수반한다는 것으로 이해할 것이다. 따라서, 본 개시는 다음의 청구범위 및 균등물에 기재된 범위 미만으로 제한되도록 의도되지 않는다.
참조에 의한 포함
본원에 인용된 모든 참조 문헌, 기사, 간행물, 특허, 특허 간행물 및 특허출원서는 모든 목적을 위해 그 전체가 참조로 포함된다. 그러나, 본원에 인용된 참조 문헌, 기사, 간행물, 특허, 특허 간행물 및 특허출원서에 대한 언급은 유효한 선행 기술을 구성하거나 전세계 어느 나라에서나 공통적인 일반 지식의 일부를 형성한다는 인정이나 임의의 형태의 제안으로 받아들여지지 않으며, 받아들여져서는 안 된다. 본 개시가 상세한 설명과 함께 설명되었지만, 상술한 설명은 범위를 제한하는 것이 아니라 예시하기 위한 것으로 이해되어야 한다. 다른 측면, 장점 및 변경은 아래에 설명된 청구범위 내에 있다. 본원에 인용된 모든 간행물, 특허 및 특허출원서는 각각의 개별 간행물 또는 특허출원서가 참조에 의해 포함되도록 구체적이고 개별적으로 나타내어진 것처럼 본원에 참조로 포함된다.

Claims (20)

  1. 아이메리아에 대해 동물에게 백신 접종하는 방법에 있어서,
    아이메리아 오오시스트의 용액을 제공하는 스텝으로서, 상기 오오시스트는 외막을 가지며 내부에 생존가능한 스포로시스트를 함유하는, 스텝;
    개질 용액을 생성하는 상기 아이메리아 오오시스트 외막의 적어도 일부를 파괴하는 스텝; 및
    상기 개질 용액을 동물에게 전달하는 스텝을 포함하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 생존가능한 스포로시스트는 파괴된 막으로부터 방출되는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 개질 용액은 막의 파괴 시에 동물에게 전달되는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 개질 용액은 상기 개질 용액을 생성하는 상기 파괴 후 5일 이내에 동물에게 전달되는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 개질 용액은 분무에 의해 전달되는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 아이메리아 오오시스트는 개별 아이메리아종의 아이메리아 오오시스트인 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 아이메리아 오오시스트는 둘 이상의 아이메리아종을 함유하는 아이메리아 백신으로부터의 아이메리아 오오시스트인 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 아이메리아 오오시스트의 용액은 농축된 백신 용액인 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 아이메리아 오오시스트의 용액은 희석된 백신 용액인 방법.
  10. 아이메리아 오오시스트의 외막을 파괴하고, 생성된 용액을 동물에게 실시간으로 전달하기 위한 시스템에 있어서, 상기 시스템은,
    용액 중에 아이메리아 오오시스트를 함유하는 용기로서, 상기 오오시스트는 외막을 가지며 내부에 생존가능한 스포로시스트를 함유하는, 용기;
    개질 용액을 생성하는 상기 아이메리아 오오시스트의 적어도 일부의 외막이 파괴되는 오오시스트 처리 챔버; 및
    전달 출구를 포함하고,
    이것에 의해 개질 용액은 상기 용기로부터 상기 처리 챔버를 통해, 상기 생성된 용액이 동물에게 전달되는 상기 전달 출구로 이동되는 시스템.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 생존가능한 스포로시스트는 파괴된 막으로부터 방출되는 시스템.
  12. 제 10 항에 있어서,
    상기 오오시스트 처리 챔버는 고압 균질기, 로터 스테이터 혼합기, 그것에 부착된 교반자 및 경질 비드를 포함하는 챔버 용기, 한 쌍의 진동 플레이트, 초음파 파쇄기, 유체역학적 캐비테이션 장치, 고압 분무기, 또는 그것의 조합으로 이루어지는 군 중 적어도 하나인 시스템.
  13. 제 11 항에 있어서,
    상기 균질기는 약 3000psi의 압력을 제공하는 시스템.
  14. 제 10 항에 있어서,
    파괴된 아이메리아 오오시스트의 수는 최장 치수가 20미크론보다 작은 아이메리아 오오시스트의 경우 약 5~50%이고, 최종 치수가 20미크론~30미크론의 크기 범위인 아이메리아 오오시스트의 경우 약 15~75%이고, 최장 치수가 30미크론보다 큰 아이메리아 오오시스트의 경우 25~90%인 시스템.
  15. 제 10 항에 있어서,
    상기 아이메리아 오오시스트를 함유하는 용액은 적어도 하나의 단백질 분해 효소를 포함하는 시스템.
  16. 제 15 항에 있어서,
    상기 단백질 분해 효소는 트립신, 키모트립신 또는 그것의 혼합물인 시스템.
  17. 제 10 항에 있어서,
    상기 아이메리아 오오시스트를 함유하는 용액은 농축된 백신 용액인 시스템.
  18. 제 10 항에 있어서,
    상기 아이메리아 오오시스트를 함유하는 용액은 완충염; 당류; 단백질 또는 단백질 가수분해물; 염료; 또는 증점제를 포함하는 수성 희석제를 추가로 포함하는 시스템.
  19. 동물에게의 전달 시에 오오시스트막을 파괴하는 방법에 있어서,
    상기 방법은,
    용액 중에 아이메리아 오오시스트의 체적을 함유하는 용기를 제공하는 스텝으로서, 상기 오오시스트는 외막을 가지며 내부에 생존가능한 스포로시스트를 함유하는, 스텝;
    상기 오오시스트의 외막을 파괴하는 시스템을 제공하는 스텝;
    전달 장치를 제공하는 스텝;
    상기 용액을 제 1 용기로부터 상기 시스템으로 이동시키는 스텝;
    상기 용액을 처리 챔버를 통해 통과시킴으로써, 개질 용액을 생성하는 상기 아이메리아 오오시스트막의 적어도 일부가 파괴되는 스텝; 및
    상기 시스템으로부터, 상기 개질 용액이 동물에게 전달되는 상기 전달 장치로 상기 개질 용액을 이동시키는 스텝을 포함하는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서,
    상기 시스템은 고압 균질기, 초음파 파쇄기, 로터 스테이터 혼합기, 그것에 부착된 교반자 및 내부에 경질 비드를 포함하는 용기, 한 쌍의 진동 플레이트, 유체역학적 캐비테이션 장치, 고압 분무기, 또는 그것의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 적어도 하나를 포함하는 방법.
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