DE69521533T2

DE69521533T2 - In ovo impfung gegen coccidiose

Info

Publication number: DE69521533T2
Application number: DE69521533T
Authority: DE
Inventors: A. Evans; Craig Findly; H. Weber
Original assignee: Pfizer Corp Belgium; Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Corp Belgium; Pfizer Inc
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1995-06-07
Publication date: 2001-10-04
Anticipated expiration: 2015-06-08
Also published as: DZ2049A1; FI974438A7; HUP9601553A3; MY121899A; HU223708B1; SK72796A3; TR199600479A2; EP0831896B1; SK282436B6; RU2126267C1; US6495146B1; CA2223699A1; KR970000244A; BG63034B1; GR3036324T3; AR002156A1; BG100641A; FI974438L; SI9600182A; HUP9601553A2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Impfung von domestizierten Vögeln gegen Kokzidiose. Insbesondere betrifft die Erfindung die in-ovo-Verabreichung von lebenden Bimeria spp. Sporozysten oder Oozysten oder Gemischen davon in das sich entwickelnde Ei von domestizierten Vögeln, um die geschlüpften Küken gegen Kokzidiose zu immunisieren.
Kokzidiose ist eine enterische Erkrankung von domestizierten Vögeln, infiziert mit intrazellulären Protozoenparasiten der Gattung Bimeria. Kokzidiose ist die am stärksten wirtschaftlich beeinträchtigende parasitische Erkrankung von domestizierten Vögeln. Es wird geschätzt, dass antikokzidiale Medikationen und Verluste aufgrund von Kokzidiose die Geflügelindustrie alljährlich hunderte Millionen Dollar kosten.
Seit den frühen 50er Jahren wurde über verschiedene Versuche zur Impfung domestizierter Vögel gegen Kokzidiose berichtet. Derzeitige Impfverfahren schließen die Verabreichung von lebenden Bimeria-Oozysten an Vögel über Futter oder Wasser ein. Diese Verfahren sind allerdings unzweckmäßig und ineffizient, da nicht alle Vögel die vorgesehene Oozystendosis erhalten und viele entweder vom Impfstoff ungeschützt verbleiben oder eine pathogene Infektion erfahren.
In J. M. Sharma und B. R. Burmester, Avian Dis. 26: 134-149, 1981, teilen die Autoren mit, dass in ovo mit Herpesvirus von Truthahn beimpfte Küken Immunität gegen einen anschließenden Befall mit dem Virus der Marek'schen Krankheit entwickeln. In der Europäischen Offenlegungsschrift Nr. 291173 wird ein Immunisierungsverfahren angeführt, worin ein nichtreplizierendes Immunogen in ovo verabreicht wird. Die speziell in dem Europäischen Patent angegebenen Immunogene sind ein gentechnisch hergestelltes Eimeria-Antigen und ein Eimeria-Oozystenextrakt. Das Europäische Patent schließt insbesondere lebende Parasitenstadien aus, wie jene, die in dem hierin offenbarten Impfverfahren verwendet werden.
Das vorliegende Impfverfahren bezieht die in-ovo- Verabreichung von lebenden Eimeria-Sporozysten oder Oozysten, oder einem Gemisch davon, in die sich entwickelnden Eier von domestizierten Vögeln ein. Der zur Verfügung stehenden Literatur ist zu entnehmen, dass ein solches Impfverfahren in ovo ineffizient sein würde und nach dem Schlüpfen appliziert werden sollte. In T. K. Jeffers und G. E. Wagenbach, J. Parasit. 56(4): 656-662, 1970, teilen die Autoren mit, dass eine inovo-Injektion von E. tenella-Sporozoiten am Tag 10 der Inkubation keinen wesentlichen immunologischen Schutz gegen anschließenden Befall mit E. tenella-Oozysten lieferte. Tatsächlich teilten sie mit, dass Küken, die keine Behandlung erhielten, eine größere Überlebensrate gegen anschließenden Befall mit E. tenella-Oozysten aufwiesen, als Küken, die in ovo mit Sporozoiten behandelt wurden. Bei K. L. Watkins et al., Proc. VIth. International Coccidiosis Conf., Abstract EI-2, Ontario, Kanada, 1993, beschrieben die Autoren eine inovo -Inokulation mit lebenden E. maxima-Sporozysten und sporulierten Oozysten und schlussfolgerten, dass ihre Untersuchung keinen Beweis lieferte, dass eine in-ovo-Exposition Schutz gegen anschließenden Kokzidialbefall mit E. maxima-Oozysten 10 Tage nach dem Schlüpfen lieferte. Watkins et al. schlussfolgerten außerdem, dass ein wesentlicher immunologischer Schutz bereitgestellt wird, wenn die Inokulation bald nach dem Schlupf, anstatt in ovo, erfolgt. Im Gegensatz zu dieser Lehre liefert das erfindungsgemäße in-ovo-Impfverfahren eine unerwartete Immunität, die geschlüpfte Vögel gegen anschließenden Kokzidialbefall schützt.

Kurzdarstellung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung, auch hierin als das "vorliegende Impfverfahren" bezeichnet, betrifft ein Verfahren (nicht beansprucht) zur Impfung eines domestizierten Vogels gegen Kokzidiose, umfassend Verabreichung einer wirksam immunisierenden Dosis lebender Eimeria-Sporozysten oder Oozysten oder eines Gemisches davon in ovo während des ersten Viertels der Inkubation.
Somit wird erfindungsgemäß die Verwendung lebender Eimeria Sporozysten oder Oozysten oder eines Gemisches davon bei der Herstellung eines Impfstoffs zum Schutz eines domestizierten Vogels gegen Kokzidiose, wobei die wirksam immunisierende Dosis des Impfstoffs während des letzten Viertels der Inkubation in ovo verabreicht wird, bereitgestellt.
Der Begriff "domestizierter Vogel bzw. domestizierte Vögel" schließt, wenn hierin verwendet, sofern nicht anders ausgewiesen, Hühner, Truthähne, Enten, Jagdvögel (einschließlich Wachtel, Fasanen und Gänse, jedoch nicht darauf beschränkt) und Ratitae (einschließlich Strauß, jedoch nicht darauf beschränkt) ein.
Der Begriff "in ovo" bedeutet, wenn hierin verwendet, sofern nicht anders ausgewiesen, in ein Ei eines domestizierten Vogels, der einen lebenden, sich entwickelnden Embryo enthält.
Der Begriff "verabreicht in ovo" oder " in-ovo-Verabreichung" bedeutet, wenn hierin verwendet, sofern nicht anders ausgewiesen, Verabreichung des hierin beschriebenen Impfstoffs an ein Ei eines domestizierten Vogels, das einen lebenden, sich entwickelnden Embryo enthält, durch eine beliebige Maßnahme der Durchdringung der Schale des Eies und der Einführung des Impfstoffs. Solche Verabreichungsmaßnahmen schließen die Injektion des Impfstoffs ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Der Begriff "letztes Viertel der Inkubation" bedeutet, wenn hierin verwendet, sofern nicht anders ausgewiesen, das letzte Viertel der Inkubation eines sich entwickelnden Eies eines domestizierten Vogels.
Der Begriff "Eimeria" bedeutet, wenn hierin verwendet, sofern nicht anders ausgewiesen, eine oder mehrere Art(en) der Gattung Eimeria, die domestizierte Vögel infiziert. Solche Ei/neria-Arten schließen jene ein, die man bei Hühnern findet, einschließlich E. tenella, E. acervulina, E. maxima, E. necatrix, E. mitis, E. praecox und E. brunetti, aber auch jene, die man bei Truthähnen findet, einschließlich E. maleagrimitis, E. adenoeides, E. gallopavonis, E. dispersa, E. maleagridis, E. innocua und E. subrotunda und auch Eimeria-Arten, die andere domestizierte Vögel als vorstehend definiert infizieren. Der Begriff "Eimeria" schließt auch alle Stämme der vorstehend genannten Arten von Eimeria ein, einschließlich precociöse Stämme und abgeschwächte Stämme, die Stämme einschließen, welche bestrahlt oder anderweitig behandelt wurden, so, dass sie zu keiner vollständigen Entwicklung führen, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Der Begriff Eimeria schließt auch alle neuerlich entdeckten Stämme oder Arten von Eimeria ein, die domestizierte Vögel, wie vorstehend definiert, infizieren.
Der Begriff "Sporozysten" bedeutet, wenn hierin verwendet, sofern nicht anders ausgewiesen, lebende Eimeria- Sporozysten.
Der Begriff "Oozysten" bedeutet, wenn hierin verwendet, sofern nicht anders ausgewiesen, lebende sporulierte Ei - meria-Oozysten oder ein Gemisch von sporulierten und nicht sporulierten Oozysten.
Der Begriff "wirksam immunisierende Dosis" bedeutet, wenn hierin verwendet, sofern nicht anders ausgewiesen, eine Zahl von Sporozysten oder Oozysten oder, wenn vermischt, eine Zahl von Sporozysten und Oozysten, ausreichend zur Bereitstellung eines immunologischen Schutzes bei geschlüpften Vögeln, der größer ist als die inhärente Immunität von nicht immunisierten Vögeln. Die Begriffe "Immunisieren" und "Impfen" sind, wenn hierin verwendet, synonym und werden untereinander austauschbar verwendet.
Eine bevorzugte zu verabreichende Dosis umfasst erfindungsgemäß 102 bis 10B Sporozysten oder Oozysten oder ein Gemisch davon, wobei die Gesamtzahl der Sporozysten und Oozysten im Bereich von 102 bis 108 liegt.
Eine bevorzugtere Dosis umfasst 102 bis 105 Sporozysten oder Oozysten oder ein Gemisch davon, wobei die Gesamtzahl der Sporozysten und Oozysten im Bereich von 10a bis 105 liegt.
Eine weitere bevorzugte Dosis umfasst 105 bis 107 Sporozysten oder Oozysten oder ein Gemisch davon, wobei die Gesamtzahl der Sporozysten und Oozysten im Bereich von 105 bis 107 liegt.
Eine weitere bevorzugte Dosis umfasst 104 bis 105 Sporozysten oder Oozysten oder ein Gemisch davon, wobei die Gesamtzahl der Sporozysten und Oozysten im Bereich von 104 bis 106 liegt.
Eine weitere bevorzugte Dosis umfasst 103 bis 106 Sporozysten oder Oozysten oder ein Gemisch davon, wobei die Gesamtzahl der Sporozysten und Oozysten im Bereich von 103 bis 106 liegt.
Ein bevorzugter domestizierter, zu beimpfender Vogel ist erfindungsgemäß ein Huhn.
Eine bevorzugte Dosis, die in ovo an ein Hühnerei zu verabreichen ist, umfasst Sporozysten oder Oozysten, oder ein Gemisch davon, von zwei oder mehreren Arten von Eimeria, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus E. tenella, E. acervulina, E. maxima, E. necatrix, E. mitis, E. praecox und E. brunetti.
Ein weiterer bevorzugter domestizierter Vogel, der erfindungsgemäß zu beimpfen ist, ist ein Truthahn.
Eine bevorzugte Dosis, die in ovo an Truthahneier zu verabreichen ist, umfasst Sporozysten oder Oozysten, oder ein Gemisch davon, von zwei oder mehreren Arten von Eimeria, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus E. meleagrimitis, E. adenoeides, E. gallopavonis, E. dispersa, E. meleagridis, E. innocua und E. subrotunda.
Weitere domestizierte Vögel, die erfindungsgemäß zu impfen sind, sind Jagdvögel, Enten und Ratitae.
Die Erfindung umfasst außerdem die Verwendung, wie vorstehend definiert, wobei jedoch ein Immunstimulans in ovo zu einem beliebigen Zeitpunkt während der Inkubation verabreicht wird.
Vorzugsweise wird das Immunstimulans gleichzeitig mit der in-ovo-Verabreichung einer Dosis von Sporozysten oder Oozysten oder eines Gemisches von den Sporozysten und Oozysten während des ersten Viertels der Inkubation verabreicht.

Beschreibung der Erfindung im Einzelnen

Das vorliegende Impfverfahren bezieht die in-ovo- Verabreichung während des ersten Viertels der Inkubation von lebenden Eimeria-Sporozysten oder Oozysten oder eines Gemisches davon in die Eier domestizierter Vögel ein. Im Fall von Hühnern erfolgt eine in-ovo-Verabreichung vorzugsweise an Tagen 15-20 der Inkubation und bevorzugter am Tag 18 der Inkubation. Im Fall von Truthähnen erfolgt die in-ovo-Verabreichung vorzugsweise an den Tagen 21-26 der Inkubation.
Das vorliegende Impfverfahren kann unter Verwendung eines beliebigen geeigneten in-ovo-Verabreichungsverfahrens ausgeführt werden. Der vorliegende Impfstoff wird vorzugsweise über Injektion verabreicht. Gemäß einem Verfahren der Injektion wird ein Loch in eine Eierschale am langen Ende des Eies unter Verwendung einer Nadel Kaliber 18 zur Freilegung des Luftsacks des Eies hergestellt. Eine Nadel Kaliber 22, 2,54-3,81 cm (1,0-1,5 inch), befestigt an einer Spritze mit einer geeigneten Größe (1-3 ml), kann durch das Loch und durch die Membran des Luftsacks eingesetzt werden. Eine geeignete Zahl an Sporozysten oder Oozysten oder, wenn gemischt, eine geeignete Zahl an Sporozysten und Oozysten, werden in einem geeigneten flüssigen Träger suspendiert, beispielsweise 10-500 ul Phosphat-gepufferter Salzlösung, und dann in das Ei injiziert. Das geeignete Volumen hängt von der Größe des zu behandelnden Eies ab, wobei Straußen-Eier sicher in der Lage sind, ein größeres Volumen aufzunehmen als Hühnereier. Die Injektionsstelle kann innerhalb eines beliebigen Bereichs des Eies oder Embryos liegen. Vorzugsweise erfolgt die Injektion axial durch die Mitte des längeren Endes des Eies in das Amnion.
Alternativ kann ein automatisiertes Ei-Injektionssystem in dem vorliegenden Impfverfahren verwendet werden. Solche Systeme werden in den US-Patenten Nrn. 4 681 063, 4 040 388, 4 469 047 und 4 593 646 beschrieben. Weitere geeignete Verfahren zur Injektion sind dem Fachmann bekannt.
Gemäß dem vorliegenden Impfverfahren zu verwendende Oozysten werden durch ein beliebiges der verschiedenen, auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren zubereitet. Solche Verfahren schließen jene ein, die in J. F. Ryley et al., Parasitology 73 : 311-326, 1976, und P. L. Long et al., Folia Veterinaria Latina VI Nr. 3, 201-217, 1976, beschrieben sind. Gemäß einem Verfahren werden handelsübliche Brathähnchen, etwa 2 Wochen alt, mit den jeweiligen Eimeria-Arten durch orale Gabe einer geeigneten Dosis an sporulierten Oozysten infiziert. Beispielsweise ist eine typische Dosis, die für E. tenella verwendet wird, 200 000 sporulierte Oozysten/Vogel. Bekannte Verfahren zur Sammlung und Reinigung von Oozysten von infizierten Vögeln folgen dann. Für die meisten Arten von Eimeria werden Fäkalien von infizierten Vögeln 5-7 Tage nach der Infektion gesammelt, vermischt und zur Entfernung der Debris filtriert, dann bei einer ausreichenden Geschwindigkeit zur Pelletierung des verbleibenden fäkalen Materials zentrifugiert. Für E. tenella wird ein ähnliches Verfahren verwendet, mit der Abweichung, dass zökale Kerne 6 Tage nach der Infektion genommen werden. Das Pellet wird in einer gesättigten Salzlösung resuspendiert, wobei die Oozysten schwimmen und das meiste der kontaminierenden Debris durch Zentrifugation entfernt werden kann. Die Oozystensuspension wird dann verdünnt, um die Salzkonzentration zu senken. Die Oozysten werden wiederholt gewaschen, um das Salz zu entfernen und in Kaliumdichromatlösung (2,5% Gewicht/Volumen) resuspendiert. Die Oozystensuspension wird bei 29ºC unter Schütteln (beispielsweise 140 U/min) für etwa 72 Stunden inkubiert, um Sporulation der Oozysten zu induzieren. Alternativ können die Oozysten mit Natriumhypochlorit behandelt werden und dann sporuliert werden. Die Zahl der sporulierten Oozysten/ml wird durch direktes Zählen unter Verwendung eines Hämozytometers ermittelt und die Kultur wird bis zum Bedarf, vorzugsweise unter Gefrierbedingungen, gelagert. Die Oozysten können nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden, vorzugsweise in einer Dosis, die 102 bis 108 Oozysten pro Ei umfasst. Insbesondere umfasst die Dosis 102 bis 105 Oozysten pro Ei.
Zur Zubereitung von Sporozysten wird das Kaliumdichromat aus der Oozystensuspension, wie vorstehend beschrieben, durch wiederholtes Waschen der Oozysten entfernt, was die Sammlung der Oozysten durch Zentrifugieren und Resuspendieren in desionisiertem oder destilliertem Wasser einbezieht. Wenn das Dichromat entfernt wurde, wie durch fehlende gelblich-orange Färbung beurteilt, wird die Oozystensuspension mit einem gleichen Volumen an Natriumhypochlorit (Bleichmittel) vermischt und bei Raumtemperatur 15 Minuten inkubiert. Das Bleichmittel wird dann durch wiederholtes Waschen entfernt und die Oozysten werden in physiologischer Salzlösung oder in desionisiertem Wasser resuspendiert. Oozysten können unter Freisetzen von Sporozysten durch Verwendung einer Vielzahl an bekannten Verfahren aufgebrochen werden. Beispielsweise können Oozysten aufgebrochen werden, um durch Vermischen der Oozysten mit Glaskügelchen, die einen Durchmesser von 1-4 mm auf weisen und Schütteln per Hand, Vortex- Mischer oder Schüttelinkubator oder unter Verwendung eines Hand-Homogenisators, Sporozysten freizusetzen. Nicht aufgebrochene Oozysten und Oozystenwände können von den freigesetzten Sporozysten durch Differentialzentrifugieren in 50% Percoll (von Pharmacia Biotech) oder IM Saccharose, wie von Dulski et al., Avian Diseases, 32 : 235-239, 1988, beschrieben, abgetrennt werden. Die Sporozysten können in dem vorliegenden Impfverfahren entweder mit den nicht aufgebrochenen Oozysten und Oozystenwänden vermischt oder davon getrennt eingesetzt werden. Vorzugsweise wird die Dosis an Sporozysten von den Oozysten und Oozystenwänden abgetrennt. Eine bevorzugte Dosis von Sporozysten umfasst 102 bis 108 Sporozysten pro Ei. Bevorzugter umfasst die Dosis 102 bis 105 Sporozysten pro Ei.
Die Sporozysten oder Oozysten oder das Gemisch davon können in einem beliebigen physiologisch geeigneten Medium in ovo injiziert werden. Vorzugsweise werden sie in physiologisch ausgewogener Salzlösung, wie Phosphat-gepufferter Salzlösung, suspendiert. Das ausgewählte Medium kann gegebenenfalls eines oder mehrere suspendierende Mittel einschließen, einschließlich physiologisch geeigneter Gele, Gelatine, Hydrosole, Cellulose oder Polysaccharidgummen.
Vorzugsweise werden in dem vorliegenden Impfverfahren, Sporozysten oder Oozysten, oder ein Gemisch davon, von zwei oder mehr Eimeria-Arten in ovo gleichzeitig injiziert. Gemäß dem vorliegenden Impfverfahren können Sporozysten oder Oozysten, oder ein Gemisch davon, von allen identifizierten Arten von Eimeria, die einen speziellen domestizierten Vogel, wie ein Huhn, infizieren, in ovo bei geeigneten Dosen zur Bereitstellung des immunologischen Schutzes gegen alle Arten gleichzeitig oder nacheinander injiziert werden.
Immunstimulantien können im Zusammenhang mit dem vorliegenden Impfverfahren eingesetzt werden. Geeignete Immunstimulantien schließen Zytokine, Wachstumsfaktoren, Chemokine, Überstände von Zellkulturen von Lymphozyten, Monozyten oder Zellen von lymphoiden Organen, Zellpräparate oder Zellextrakte (beispielsweise fixierte Staphylococcus aureus oder Lipopolysaccharid-Präparate), Mitogene oder Adjuvantien, einschließlich Pharmazeutika niederen Molekulargewichts, ein, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Ein Immunstimulans kann in ovo zu beliebiger Zeit während der Inkubation verabreicht werden. Vorzugsweise werden Immunstimulantien in ovo in dem die Dosis an Eimeria-Sporozysten oder Oozysten enthaltenden Medium oder einem Gemisch davon verabreicht.

Claims

1. Verwendung lebender Eimeria Sporozysten oder Oozysten oder eines Gemisches davon bei der Herstellung eines Impfstoffs zum Schutz eines domestizierten Vogels gegen Kokzidiose, wobei eine wirksam immunisierende Dosis des Impfstoffs während des letzten Viertels der Inkubation in ovo verabreicht wird.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Dosis 102 bis 108 Sporozysten oder Oozysten oder eines Gemisches davon umfasst, wobei die Gesamtzahl der Sporozysten und Oozysten im Bereich von 102 bis 108 liegt.

3. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Dosis 102 bis 105 Sporozysten oder Oozysten oder eines Gemisches davon umfasst, wobei die Gesamtzahl der Sporozysten und Oozysten im Bereich von 102 bis 105 liegt.

4. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Dosis 105 bis 107 Sporozysten oder Oozysten oder eines Gemisches davon umfasst, wobei die Gesamtzahl der Sporozysten und Oozysten im Bereich von 105 bis 107 liegt.

5. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Dosis 104 bis 106 Sporozysten oder Oozysten oder eines Gemisches davon umfasst, wobei die Gesamtzahl der Sporozysten und Oozysten im Bereich von 104 bis 106 liegt.

6. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Dosis 103 bis 106 Sporozysten oder Oozysten oder eines Gemisches davon umfasst, wobei die Gesamtzahl der Sporozysten und Oozysten im Bereich von 103 bis 106 liegt.

7. Verwendung nach Anspruch 2, wobei der domestizierte Vogel ein Huhn ist.

8. Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Dosis Sporozysten oder Oozysten, oder ein Gemisch davon, von zwei oder mehreren Arten von Eimeria, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus E, tenella, E. acervulina, E. maxima, E. necatrix, E. mitis, E. praecox und E. Jbrunetti, umfasst.

9. Verwendung nach Anspruch 8, wobei die Dosis durch Injektion in ovo verabreicht wird.

10. Verwendung nach Anspruch 2, wobei ein Immunstimulans zu einem beliebigen Zeitpunkt während der Inkubation in ovo verabreicht wird.

11. Verwendung nach Anspruch 10, wobei das Immunstimulans gleichzeitig mit der Dosis Sporozysten oder Oozysten oder eines Gemisches der Sporozysten und Oozysten in ovo verabreicht wird.

12. Verwendung nach Anspruch 2, wobei die Dosis Oozysten umfasst.

13. Verwendung nach Anspruch 2, wobei die Dosis Sporozysten umfasst.

14. Verwendung nach Anspruch 13, wobei die Sporozysten zur Entfernung von Oozysten gereinigt wurden.

15. Verwendung nach Anspruch 2, wobei der domestizierte Vogel ein Truthahn ist.

16. Verwendung nach Anspruch 15, wobei die Dosis Sporozysten oder Oozysten, oder ein Gemisch davon, von zwei oder mehreren Arten von Eimeria, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus E. meleagrimitis, E. adenoeides, E. gallopavonis, E. dispersa, E. meleagridis, E. innocua und E. subrotunda, umfasst.

17. Verwendung nach Anspruch 16, wobei die Dosis durch Injektion in ovo verabreicht wird.

18. Verwendung nach Anspruch 2, wobei der domestizierte Vogel ein Jagdvogel, eine Ente oder Ratite ist.