JP4495586B2 - Sporozoeasp.のインビトロ培養のための方法およびそれらの使用 - Google Patents
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Description
本方法は、Sporozoea綱およびその属およびそれらの種の、スポロシスト形成原虫の連続培養のための培養系および方法に関する。本発明はまた、ワクチンの使用、アッセイおよび他の用途のために、本発明の培養系および方法によって産生された、メロゾイトおよびオーシストならびに関連したSporazoeaのライフステージ細胞に関する。
Sporozoea綱の原虫は、スポロシスト形成原虫を含み、これらの多くは、世界中の動物および人々の無数の疾患の病因である。特に民間の関心事は、Coccidia亜綱、Eucoccidiida目およびEimeriina亜目のSporozoea、ならびにCystoisospora属、Eimeria属、Isospora属、Neospora属、Sarcocystis属、Toxoplasma属、Tyzzeria属およびWenyonella属のスポロシスト形成原虫によって引き起こされた疾患である。
本発明は、発生の無性生殖期におけるSporozoea綱の偏性細胞内原虫の連続培養のための方法を提供することによって、他の問題と同様に上記で同定された問題を解決する。本発明の方法は、以下の工程を含む:Sporozoea種を増殖するのに適した不死化宿主細胞を含む細胞培養系を提供する工程、宿主細胞の感染について有効な条件下で、Sporozoea種の感染段階で宿主細胞を接触する工程、宿主細胞(ここで、この宿主細胞は、食作用によって原虫を取り込み得る)にメロゾイトの増殖をもたす工程、を包含する。
従って、本発明は、宿主細胞を含む培養系およびSporozoea綱のスポロシスト形成原虫のインビトロ連続培養のための方法を提供する。本発明の培養系によって産生される原虫細胞(例えば、Sporozoeaメロゾイトおよび/またはオーシストもしくは他の抗原物質)もまた提供する。このような物質は、例えば、ヒト、鳥類および家畜(家禽を含む)を感染するSporozoeaからの予防を必要とする動物のワクチン接種のために、抗Sporozoeaワクチンの生産に使用され得る。
本発明の範囲および本質をより一層評価するために、以下の用語が定義される。
本発明の培養系によって培養されたSporozoeaは、既知のサンプル、感染動物(例えば、血液、糞、組織)から獲得されるか、または汚染された環境物質から獲得される。サンプルに存在する集団(例えば、土壌サンプルまたは糞便サンプル)が主としてスポロシスト段階にある場合、集団のサンプルは本明細書に記載されるように簡潔に培養される。この集団が主としてオーシスト段階にある場合、この集団は環境のマネジメントのために、周知の方法で胞子形成を受けることを誘導され得るか、または集団からのサンプルは、周知の実験室的方法を使用することで胞子形成を受けることを誘導され得る。この集団またはサンプルが主として胞子形成化オーシスト段階にある場合、当該分野で周知の方法、例えば、ガラスビーズを用いた機械的な破壊によって、スポロシストは容易に獲得され得る。
オーシストは、感染動物の糞または組織;汚染した飼料もしくは水;土壌;貯蔵わらもしくは床敷き;または、他の種々の供給源、から入手可能である。スポロシストの単離方法は公知である。オーシストを分離するのに使用される正確な手段は、オーシストが獲得される物質で異なり、当業者に容易に明らかである。
当該分野で公知の方法によって、オーシストの胞子形成を誘導することが可能である。例えば、2.5%重クロム酸カリウム溶液の入った容器にオーシストを入れ、そして、開口部に綿またはフォームラバープラグをとりつけることによって、胞子形成を達成し得る。この容器を、28〜30℃で48〜72時間、250rpmの軌道振盪機上で攪拌する。あるいは、空気を溶液を介して1時間あたり約25〜75立方フィートで泡立てる間、オーシストを含む溶液を、絶えず攪拌し得る。胞子形成プロセスの間、スポロシストを含むか否かを決定するために、サンプルを、一定の間隔を置いて回収し、オーシストの顕微鏡検査によって胞子形成を試験する。
記載の便宜のために、本培養系はバッチ培養系の点で記載される。当業者は、培養系および関連方法が、バッチで与えた培養系(batch−fed culture systems)および連続培養系を包含する培養において、細胞を増殖するために、他の当該分野で公知の方法に容易に適応されることを理解する。インビトロにおいて動物細胞を増殖するための当該分野で公知の多数の方法の詳述は、例えば、R.Ian Freshney,Culture of Animal Cells,第4版,John Wiley & Sons,Inc.(著作権)2000(本明細書中においてその全体が参考として援用される)に記載される。
spについては約72時間である。
生物体は生きた動物または卵の供給源から獲得されるが、Eimeria種ワクチンは公知である。詳細は、例えば、McDonaldら,米国特許第5,055,292号によって示される(本明細書中においてその全体が参考として援用される)。
Estates,IllinoisからのIPL:5X59027)のようなカゼイン加水分解物)が挙げられる。
本発明の培養系はまた、抗原虫剤、特に抗Eimeria sp因子をスクリーニングして同定するのに有効で有用な方法を提供する。スクリーニングされる因子は、潜在的予防薬剤または治療薬剤(例えば、薬物または抗体)などを含む。
ワクチンの調製のためにウイルスを弱毒化する周知の方法は、高い継代レベルまで組織培養中で継代されることである。長期培養を通じて、生物体は培養条件に適応する特性を集積する傾向があり、病原力特性を失い得る。本明細書に記載される培養系は、生ワクチンとして使用されるために、非毒性株を開発する目的のために、Eimeriaの長期増殖に使用される。この技術は、50以上の継代のために、実施例2に記載されるように、メロゾイト培養の継代を使用する。
以下の特定の実施例は、例示の目的のために含まれ、別の方法で示されない限り、本発明の範囲に限定されることを意図しない。
(ワクチン接種のための連続培養系の調製)
以下のように、連続培養系を調製した。
(Eimeria種原虫の培養)
感染したニワトリの糞からのEimeria acervulinaオーシストのサンプルを、以下のように、培養のために調製した。糞のスラリーは、糞1に対して水10を添加することによって作製し、オーシストは糖浮上法の手段によって精製した(LR AshおよびTC Orihel,Parasites:A Guide to Laboratory Procedures and Identification,ASCP Press(著作権)1991,34−35頁に記載されるように、Sheatherの糖浮上法と同様(本明細書中においてその全体が参考として援用される))。オーシストを遠心分離によって濃縮し、2.5%のニクロム酸カリウムで再懸濁し、そして、胞子形成を容易にするために、24時間〜72時間、室温で空気にさらした。使用するまで、スポロシストを4℃で保存した。コンタミした細菌を傷害するために、胞子形成オーシストを、クロロヘキシジングルコン酸溶液(PerioguardTM)に、25℃で1分間、懸濁した。洗浄によって、クロロヘキシジングルコン酸を除去した。遠心(6分間、800×g)によってオーシストをペレット化し、上清を捨て(上清を捨てる場合、1回ペレットを懸濁する)、次いで、実施例1に記載された、100分量の抗生物質/静真菌性の維持培地にペレットを懸濁することによって、洗浄を実施した。遠心分離および再懸濁をさらに2回繰り返した。
(スポロシスト形成生物体の保存)
本発明はまた、インビトロ培養において、そしてトリの接種の必要がない状態で、感染力を観察することによって、保存されたEimeriaオーシスト/スポロシストの生存度を評価する方法を提供する。
(培養からのメロゾイトの収集)
培養物(実施例1および実施例2を参照のこと)が活発に複製される(例えば、一般に最後の分割(継代培養)の10日以内に)場合、メロゾイトを収集した。感染細胞および培養上清を、細胞スクレーパを用いて収集した。機械的手段(シリンジの27ゲージ針を介した吸引)によって宿主細胞を溶解した。次いで、メロゾイトを遠心分離(10分間、450×g)によって濃縮し、維持培地で再懸濁した。次いで、試験動物にワクチン接種するために、生じた懸濁液を使用した。
(培養からのオーシストの収集)
多くのオーシストを集積させるために、18日間もしくはそれ以上長い間、分割しないで実施し得る培養(実施例1および実施例2を参照のこと)から、オーシストを収集した。培養上清を収集し、そして、Sheatherの浮上方法を用いて、細胞破片からオーシストを精製した(前出で検討)。次いで、遠心分離(10分間、405×g)によって、オーシストを濃縮した。ペレットにされたオーシストを維持培地に再懸濁し、すぐに使用した。
(ニワトリのワクチン接種)
本実施例は、予防ワクチンとして(前出)、実施例2の培養方法で増殖したEimeria acervulinaオーシストおよびメロゾイトならびにEimeria tenellaオーシストおよびメロゾイトを使用する可能性を示す。
(方法)
19日間の培養物からの培養上清をデカントすることによって、培養されたウシ単球から誘導されたE.tenellaオーシストおよびE.acervulinaオーシストを収集した。オーシストを遠心分離によって濃縮し、1mlあたり100,000個のオーシストの濃度で培地に再懸濁し、すぐに使用した。
9日後に、グループ1のニワトリの糞にオーシストを観察し、そして12日後に、グループ1のニワトリおよびグループ2のニワトリの両方の糞にオーシストを観察した。これらのデータは、培養誘導性オーシストが実施可能であり、これらの種について予想される正常な検出時間で、宿主において複製されるということを確認する。
E.tenellaオーシストを与えた1羽のニワトリは、重度の下痢で死亡した。
(生物体の培養および継代)
予備実験において、上記のパートAで使用した多くのオーシストからのオーシストのアリコートを、メロゾイトの連続培養を産生するために、実施例2(前出)に記載されるように培養した。一つの150cm2フラスコ(ウシ単球細胞含有)に、100個のオーシストの種菌を用いた。実施例2に記載されるように、非脱嚢オーシストが培養中に存在しないことを確実にするために、2回継代した。
経口接種によって、初生ひな(半分Rhode Island RedもしくはBarred RockおよびAmericana)に培養したメロゾイトを接種をした。上記で調製した100,000個の培養誘導性E.acervulinaメロゾイトまたはE.tenellaメロゾイトを受けたトリは下痢を示し、一方、1000個、5000個および10,000個のメロゾイトの用量を受けた初生ひなは下痢を示さなかった。
10日齢の胚を含有したニワトリ卵に、1000個のE.acervulinaおよびE.tenellaのウシ単球培養誘導性メロゾイト(実施例2により)の尿膜経路によるインオボ接種は、どのメロゾイト種においても胚死をもたらした。組織におけるオーシスト形成の証拠はなかった。これらのデータは、Eimeriaの両種が、ウシ単球の培養後に胚に対して病原性を保持したことを示す。
(抗原虫因子のスクリーニング)
Sporozoea種に対して提案された抗原虫因子の有効性は、実施例1および実施例2の系を用いて評価した。
ThermonaxTM(Nalge Nunc International,Naperville,IL)含有24ウェル組織培養プレートを使用し、ウシ単球細胞を播種し、そして実施例1の方法を用いて、維持培地に<80%コンフルエンスまで培養した。その後、各ウェルにE.acervulinaおよびE.tenellaを播種した。各10個の試験ウェルの培地の中に、抗コクシジア因子diclazurilを導入する一方で、他の10個のウェルをコントロールとして保持した。試験した薬剤の抗原虫活性を評価するために、培養24時間、48時間および72時間において、増員生殖の存在をコントロールのウェルと試験ウェルとの間で比較した。寄生虫の増殖についての観察は、顕微鏡試験およびギムザ染色したカバーガラスで行った。薬物処置を評価するために、増員生殖の存在およびコントロールウェルからの減少パーセントを使用した。
24ウェル組織培養プレートを使用し、宿主細胞に対して適切な維持培地で、温度でそして適切な雰囲気下で、宿主細胞を<80%コンフルエンスまで増殖し、次いで、目的のSporozoea種を各ウェルに播種する。試験するために、各10個の試験ウェルの培地に一つの薬剤または複数の薬剤を導入する一方で、他の10個のウェルをコントロールとして保持する。試験した薬剤の抗原虫活性を評価するために、培養約1〜10日後の増殖をコントロールのウェルと処理したウェルとの間で比較した。
(コントロール原虫のための評価方法)
家畜の原虫感染を減少させる一つの方法は、例えば、Coccidiaのような生物体を家内の動物へ感染させ得る物質を除去するために設計された、取り扱い方法(management practice)を実施することである。
Claims (8)
- 無性発生段階におけるSporozoea綱の偏性細胞内原虫の連続培養のための方法であって、該方法は、以下:
(a)不死化哺乳類宿主細胞を含む細胞培養系を提供する工程であって、ここで該宿主細胞は不死化ウシ単球細胞であり、該不死化ウシ単球細胞は、食作用によって原虫を取り込み得;
ここで、該細胞培養系は、該不死化ウシ単球細胞の増殖に適切な培地および約0.01mM〜約0.5mMにわたる濃度のβ−メルカプトエタノールを含む、工程;
(b)増殖が少なくとも80%のコンフルーエンシーに達する時はいつでも、該培養系における宿主細胞の濃度を減少させる工程;
(c)感染段階のSporozoea綱の偏性細胞内原虫と該宿主細胞とを接触させ、該宿主細胞において無性段階における連続増殖が可能であるメロゾイト集団の増殖を生じる工程であって、ここで、該接触させる工程が、該宿主細胞の感染に有効な条件下において行われる、工程;および
(d)無性生殖の分裂形態において、該メロゾイト集団を繁殖させる工程、
を包含し、ここで、該原虫が、トリ宿主に感染し得るEimeria種であり、該Eimeria種は、Eimeria tenella、Eimeria acervulina、Eimeria maxima、Eimeria necatrix、Eimeria mitis、Eimeria praecoxおよびEimeria brunetti、Eimeria meleagrimitis、Eimeria adenoeides、Eimeria gallopavonis、Eimeria dispersa、Eimeria meleagridis、Eimeria innocua、Eimeria subrotundaおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、方法。 - 前記原虫が、Eimeria acervulinaまたはEimeria tenellaである、請求項1に記載の方法。
- 前記宿主細胞における前記メロゾイト集団が、少なくとも18日間の無性発生段階の連続増殖が可能である、請求項1に記載の方法。
- 前記宿主細胞における前記メロゾイト集団が、少なくとも150日間の無性発生段階の連続増殖が可能である、請求項2に記載の方法。
- 前記Sporozoea綱の偏性細胞内原虫の前記感染段階が、オーシストである、請求項1に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法であって、
(e)オーシストおよびスポロシストが培地中に放出されるように、前記培養物の密度を増やす工程
をさらに包含する、方法。 - (f)スポロシストを回収する工程
をさらに包含する、請求項6に記載の方法。 - (e)メロゾイトを回収する工程
をさらに包含する、請求項1に記載の方法。
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