JP2017512475A - コクシジウムオーシストを動物糞便から精製するための方法、この方法を適用するのに適したシステムおよびそれにより得られるオーシスト - Google Patents

Abstract

本発明は、コクシジウムオーシストを含有する糞便を宿主動物から収集し、水性媒体中で糞便を希釈し、巨視的粒子状物質を含む粗画分を希釈糞便から分離し、該オーシストを含有する水性画分を収集する工程を含む、Ｄｍｉｎ〜Ｄｍａｘの寸法を有するコクシジウムオーシストを糞便から精製するための方法であって、該オーシストを通過させるメッシュ開口を有する第１篩デッキ上で該水性画分を篩分けして、該オーシストを含む水性濾液と、該オーシストより大きな粒子を含む第１残渣とを得、第２篩デッキを通る該オーシストの通過を妨げるメッシュ開口を有する第２篩デッキ上で該水性濾液を篩分けして、精製されたオーシストを含む第２残渣と、該オーシストより小さな粒子を含む廃棄濾液とを得ることを更に含むことを特徴とする方法に関する。本発明はまた、この方法を適用するのに適したシステム、およびそれにより得られるオーシストに関する。【選択図】図４

Description

本発明は、コクシジウムオーシストを含有する糞便を宿主動物から集め、水性媒体中で糞便を希釈し、所望により、巨視的粒子状物質を含む粗画分を希釈糞便から分離し、該オーシストを含有する水性画分（これは、水性媒体中で希釈された糞便でありうるであろう）を収集して、それから該オーシストを回収する工程を含む、Ｄｍｉｎ〜Ｄｍａｘの寸法を有するコクシジウムオーシストを糞便から精製するための方法に関する。本発明はまた、この方法を適用するのに適したシステム、およびそれにより得られるオーシストに関する。

コクシジウム症は、腸粘膜が亜綱コクシジウムの原虫により侵入され破壊される、種々の動物の疾患である。コクシジウム症の経済的影響は、鳥類の集中的な収容が該疾患の蔓延を促進する養鶏業において特に深刻でありうる。コクシジウム原虫による感染は大部分が種特異的である。しかし、多数の種が単一宿主に感染しうる。例えば、ニワトリに感染するコクシジウム原虫の幾つかの種が存在し、そのうちの６種は中等度ないし重度に病原性であるとみなされている。

コクシジウム寄生虫の生活環は複雑である。例えば、エイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）、イソスポラ（Ｉｓｏｓｐｏｒａ）、シストイソスポラ（Ｃｙｓｔｏｉｓｏｓｐｏｒａ）またはクリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）属は、典型的には、それらの生活環を完了するために単一宿主を要するに過ぎないが、シストイソスポラ（Ｃｙｓｔｏｉｓｏｓｐｏｒａ）は中間宿主を利用しうる。天然条件下、この生活環は環境からの胞子形成オーシストの摂取により開始する。オーシストは、一般に、長さ１０〜４８μｍ、幅１０〜３０μｍの卵形ないし楕円体の形状であり、極帽、卵門、残体および結晶体のような特殊な構造体を含有しうる。胞子形成オーシストが感受性動物により摂取されると、胞子形成オーシストの壁が破壊されて、内部のスポロシストが放出される。家禽においては、スポロシストの放出は砂嚢内の胞子形成オーシストの機械的破壊の結果である。スポロシスト内には、該生物の感染段階であるスポロゾイトが存在する。家禽においては、スポロシスト被膜の破壊およびスポロゾイトの放出は小腸におけるキモトリプシンおよび胆汁酸塩の作用により生化学的に達成される。一旦放出されると、スポロゾイトは腸粘膜または他の位置の上皮細胞に侵入する。感染部位は、関与する種に特徴的である。例えば、エイメリア属においては、エイメリア・テネラ（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）は盲腸に局在し、エイメリア・ネカトリクス（Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘ）は小腸の前部および中央部で見出され、エイメリア・アセルブリナ（Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）およびエイメリア・プレコクス（Ｅ．ｐｒａｅｃｏｘ）は小腸の上半分で見出され、エイメリア・ブルネッティ（Ｅ．ｂｒｕｎｅｔｔｉ）は下部小腸、直腸、盲腸および総排泄腔で見出され、エイメリア・ミティス（Ｅ．ｍｉｔｉｓ）は下部小腸で見出され、一方、エイメリア・マクシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）はこれらの生理的位置のいずれにおいても見出されうる。

宿主動物の細胞内に一旦侵入すると、スポロゾイトは、シゾントとも称される多核性メロントへと成長する。メロントの各核は、メロゾイトと称される感染体へと成長し、これは新たな細胞に侵入し、該過程を反復する。様々な数の無性世代の後、メロゾイトは雄性生殖母体または雌性生殖体のいずれかへと成長する。雄性生殖母体は多数の雄性生殖体へと成長し、そしてこれは雌性生殖体を受精させる。ついで、生じた接合体の周囲に抵抗性被膜が形成する。該被包接合体はオーシストと称され、胞子未形成状態で糞便中に放出される。感染したトリは数日間または数週間にわたって糞便内にオーシストを放出しうる。温度および湿度の適切な条件下、胞子形成の過程によりオーシストは感染性となる。ついで感受性のトリは通常の突き行動または地面／くずをあさることにより胞子形成オーシストを摂取し、該周期を自ら繰返す。生存可能な胞子形成オーシストの摂取は唯一の天然の感染手段である。コクシジウム原虫による感染は免疫をもたらして、群れのメンバーが免疫状態になるにつれて疾患の頻度は経時的に減少する。コクシジウム感染のこの自己制限性はニワトリおよび他の家禽において広く公知である。しかし、付与される免疫は種特異的であり、したがって、コクシジウム原虫の別の種の導入は新たな疾患の大発生を招く。

コクシジウム原虫のオーシスト壁はオーシストの生存のための非常に有効なバリヤとなる。オーシストは宿主の外部で何週間も生存しうる。研究室においては、無傷オーシストはｐＨ、洗剤、タンパク質分解酵素、糖分解酵素、脂肪分解酵素、機械的破壊ならびに化学物質、例えば次亜塩素酸ナトリウムおよび重クロム酸塩の極端な状態に対して抵抗性である。

家禽におけるコクシジウム症を防除するためには２つの方法が現在用いられている。第１の方法は化学療法による防除を含む。家禽におけるコクシジウム症の防除のために多数の薬物が利用可能である。該疾患を引き起こす種が多数存在するため、全ての種に対して有効な薬物は非常に少数であるが、幾つかの種に対しては単一薬物が有効でありうる。例えば、現在のブロイラー鶏生産においては、コクシジウム症を防除するための薬物の投与が一般的である。コクシジウム症に対する予防薬のための費用が相当な生産コストに相当する。コクシジウム症に対するトリへのワクチン接種は、化学療法に代わる手段である。ワクチン接種の利点は、それが、抗コクシジウム薬を投与する必要性を著しく低減または排除して、養鶏業者の薬物コストを減少させ、薬物耐性株の発生を防ぎ、残留薬物に関する消費者の懸念を低減しうることである。コクシジウム原虫に対して家禽を免疫化するための多数の方法が開発されている。成功した方法は全て、完全毒性株または弱毒化株のいずれかの生きた原虫の投与に基づいている。最も一般的な投与経路は経口経路であるが、他の経路も用いられている。典型的には、ニワトリは、生存可能な胞子形成オーシストを口内に直接的に又は食餌もしくは水を介して経口投与によりワクチン接種される。

投与経路に無関係に、コクシジウムワクチンの製造方法は非常に類似している。簡潔に説明すると、コクシジウム原虫は、コクシジウム原虫の単一種を宿主動物に感染させることにより得られる。これらの「種ストック」は、関心のある種のみの存在が保証されるように、しばしば、本質的にクローン性である、すなわち、単一生物に由来する。種ストックは野生型でありうる、すなわち、野外から単離されうる。あるいは、それらは早熟性または弱毒化株でありうる。ついで該原虫を宿主内で複製させ、ついで原虫を該動物から、通常は排泄物から集める。弱毒化株の使用は、典型的には、宿主動物からの、より少数の放出オーシストを与える。精製プロセスの第１工程においては、必要に応じて、巨視的粒子状物質を含む粗画分を希釈排泄物から分離する。ついで、よく知られた技術、例えば塩浮上分離および遠心分離（オーシストの密度とは１０％以上異なる密度を有する粒子状物質が該オーシストと共に精製されることを保障するためのもの）により、原虫を希釈排泄物から分離する。収集時に、原虫は非感染性オーシスト段階の生活環にある。感染性になる、したがってワクチンに有用となるためには、オーシストは、胞子形成が生じるように誘導される必要がある。エイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）属のメンバーにおいては、胞子形成は、典型的には、重クロム酸カリウムの１％〜４％の水溶液中、１９℃〜３７℃、好ましくは約２８℃で、一定の通気下でオーシストをインキュベートすることを含む。胞子形成は、通常、用いる温度に応じて１２〜４８時間以内に完了する。胞子形成プロセスのモニタリングは原虫の顕微鏡検査により達成される。先行技術において見出される保存用組成物は典型的には重クロム酸カリウムの水溶液を含む。細菌増殖を防ぐために、胞子形成オーシストは、通常、重クロム酸カリウムの１〜４％水溶液中で保存されるが、他の保存用媒体も使用されている。

コクシジウム症の予防のために利用可能な現在のワクチンは典型的には２．５％（重量／容量）溶液を含有し、１用量当たり約１，６００個のオーシスト（４００個の胞子形成オーシストは４個の異なる種を代表している）を含有する。胞子形成オーシストを得るための現在の方法の重大な欠点は、それらが、典型的には、精製のために塩浮上分離および遠心分離に依存していることである。これは非常に時間がかかる（特に遠心分離はバッチ式で行う必要がある）だけでなく、オーシストが濃縮塩溶液と長時間接触することにもつながる。オーシストの量に対する水の量は低く維持される必要がある。なぜなら、そうでなければ、バッチ式遠心分離工程が、経済的であるにはほど遠いものになるからである。この全ての正味の結果、特に、長いプロセス時間および濃縮塩とのオーシストの接触は、生存可能オーシストの８０％までがこの公知精製プロセス中に喪失することにつながる。また、精製オーシストは、浮上分離技術に用いられた塩の残留物を含有し、その塩は以降のプロセス工程において不利であり、あるいはその塩は最終的なワクチンに取り込まれ、ワクチン成分または宿主動物に悪影響を及ぼす可能性さえある。また、オーシストは、密度勾配を生成させるために遠心分離技術において典型的に使用される溶質で汚染される。これは先行技術方法のもう１つの欠点である。

先行技術のオーシスト精製方法の欠点を緩和する方法を案出すること、特に、オーシストの大部分が、尚も生存可能であり胞子形成可能であるままで精製される方法を案出することが、本発明の目的である。この方法を適用するためのシステムを案出すること、およびそれにより精製されるオーシスト、好ましくは、塩または他の溶質残留物が存在するという欠点を有さないオーシストも、本発明の目的である。

本発明の第１の目的を達成するために、「発明の一般的分野」の節に従う方法を案出した。該方法においては、オーシストを水性画分から回収するために、該方法は、メッシュ開口を有する第１篩デッキで水性画分を篩分けしてオーシストを通過させ、オーシストを含む水性濾液、およびオーシストより大きな粒子を含む第１残渣を得、ついで、第２篩デッキを通るオーシストの通過を遮断するメッシュ開口を有する第２篩デッキで該水性濾液を篩分けして、精製されたオーシストを含む第２残渣、およびオーシストより小さな粒子を含む廃棄用濾液を得る工程を含む。

図１は、精製のためにオーシストを収集するためのシステムを図示する。 図２は本発明のシステムの実施形態の１つを図示する。 図３は、本発明の方法またはシステムにおける使用のための篩デッキの実施形態の１つを図示する。 図４は本発明のシステムのもう１つの実施形態を図示する。 図５は、精製されたオーシストを胞子形成させるための補助手段として使用される篩デッキを図示する。

本出願人は、簡便な２工程篩分けプロセスを適用することにより、糞便の水性画分からオーシストが適度なレベルまで精製されうることを見出した。第１篩分け工程においては、オーシストより粗い粒子（典型的には砂粒、粗粒および植物の残骸）が除去可能であり、第２篩分け工程においては、オーシストより小さな粒子（典型的には細菌、ウイルス、植物の消化残骸、タンパク質塊、油滴など）が除去可能である。このようにして、汚染微生物の非常に低い負荷を有する（または更には実質的に負荷を有さない）オーシスト画分が得られうる。一方、先行技術の浮上分離方法を用いた場合には、オーシスト画分は微生物の相当な負荷を尚も含有する。篩分けは（半）連続的に適用可能であり、オーシストの量に対する水性画分中に存在する水の量はいずれの経済的最大量にも限定されず、水は最終的には第２篩デッキを通過するが、精製されたオーシストはこのデッキ上に薄層残渣として残存する。このように、水は、良好な篩分けおよび洗浄作用を得るために有効に使用されうる。先行技術においては、篩分けは、コクシジウムオーシストを糞便から精製するための方法として使用されたこともなければ、示唆されたことさえもない。篩分けは、粗画分を糞便から除去するためには使用されているが、精製されたオーシストを得るためにそれが使用されたことはない。理論に束縛されるものではないが、これには幾つかの理由があるようである。第１に、オーシストを精製するために用いられる一般的方法は全て、オーシストの特定の密度を用いることに基づいている。なぜなら、糞便においては、オーシストと同じ密度を有する（すなわち、オーシストの密度と多くとも１０％または更には多くとも９、８、７、６、５、４、３もしくは更には１％しか違わない密度範囲内の密度を有する）他の主要画分は存在しない、と理解されているからである。したがって、そのような方法は、適度に純粋なオーシストを含有する組成物を与えうる。篩分けでは、異なる密度を有する粒子を識別することはできず、異なるサイズ（異なる篩分け特性）を有する粒子を識別するに過ぎない。これは、篩分けでは、オーシストと同じサイズ範囲内にあるが異なる密度を有する他の粒子がオーシスト画分中に追加的汚染物として取り込まれることに本質的につながる。したがって、篩分けでは、オーシストは適度なレベルまでは精製され得ない、と一般に予想される。また、オーシストは完全には球状ではなく、一般には卵形ないし楕円体の形状を有する。非球状粒子の篩分けは、粒子が篩デッキに対して取る配向に篩分け作用が左右されるという本質的問題を有する。この配向は制御不能であるため、篩分けは、非球状粒子を正確に分画するための実施可能な選択肢とはみなされないことが多い。最後に、篩分けは、しばしば、篩分けされる粒子に対する高い機械負荷をもたらし、特に、メッシュサイズが粒子サイズと同じ範囲である場合にそうである。生物学的物質の場合、そのような高い機械負荷は、しばしば、それらの生存性にとって有害である（細菌を殺すために一般に用いられるフレンチプレス法を参照されたい）。出願人が驚いたことに、コクシジウムオーシストを糞便から精製し、有効なワクチンにおいてオーシストを使用するのに適した純度を得るための良好な方法に篩分けがなることを、この全てのいずれもが妨げない。

篩分けの分野の当業者の誰もが知っているとおり、「オーシストを通過させるメッシュ開口を有する」ことは「オーシストの最大寸法より大きなメッシュ開口を有すること」と単に同じではなく、また、「オーシストの通過を妨げるメッシュ開口を有する」ことは「オーシストの最小寸法より小さなメッシュ開口を有する」ことと単に同じではないことが注目される。一般に公知のとおり、特定の寸法を有する粒子が篩デッキを通過するか否か（したがって、メッシュ開口が粒子を通過させるか否か）は開口のサイズに対する粒子寸法に左右されるだけではなく、篩デッキの針金の材質、針金の厚さ、メッシュのタイプ（織られたもの、織組織のタイプ、スパッターにかけられたもの、縮充機にかけて織物の目が密にされたもの、レーザーアブレーションに付されたもの、穴が開けられたものなど）、メッシュ開口の形態、篩デッキが振動するか否か、振動の振幅、粒子が篩デッキを通過するのを助けるために追加的な流体が使用されるか否か、粒子の形状などにも左右される。例えば、デッキが振動しない状況下の１５０μｍのメッシュ開口を有する篩デッキは、５０μｍ未満の直径を有する粒子のみを通過させることが可能でありうる（なぜなら、典型的には、２〜３個の粒子の架橋がメッシュ開口上で生じうるからである）。他の状況も何らかの役割を果たしうる。例えば、１００μｍのメッシュ開口を有する篩は、使用される潤滑剤（典型的には水）の量およびデッキの振動の量に応じて、３０μｍまたは例えば６０μｍまたは更には例えば９９μｍのサイズ上限を有する粒子を通過させることが可能でありうる。同様に、これは、メッシュ開口が粒子の通過を妨げるべきものである状況にも言える。篩分けの分野の共通一般的知識を用いて、当業者は、本発明に従い用いられうる篩分けの設定を案出することが可能である。

本発明のもう１つの利点は、精製されたオーシストが、糞便に存在する（実質的に）全てのオーシストをもはや含有する必要がないことである。本方法においては、精製したいオーシストのサイズ範囲を選択することが可能である。先行技術方法においては、ある密度の全オーシストが１つの画分として精製される。本方法においては、例えば、最小オーシストを除外すること、または例えば、あるコクシジウム種に相当する画分のみを選択すること（各種はそのオーシストに関する典型的サイズ範囲を有する）が可能である。

本発明の第２の目的を達成するために、Ｄｍｉｎ〜Ｄｍａｘの寸法を有するコクシジウムオーシストまたはその微細画分を糞便から精製するのに適したシステムを案出した。該システムは、オーシストを篩デッキに通過させて濾液中へと導きオーシストより大きな粒子の通過を妨げるのに適したメッシュ開口を有する第１無端形状（ｅｎｄｌｅｓｓ ｓｈａｐｅｄ）篩デッキ、第２無端形状篩デッキの内部に該濾液を自動的にローディングするための手段を含み、ここで、該第２篩デッキは、この篩デッキを通るオーシストの通過を妨げオーシストより小さな粒子を通過させるメッシュ開口を有する。

本発明の第３の目的を達成するために、本発明は、前記方法またはシステムを使用して得られる精製されたオクシジウムオーシスト組成物を提供し、ここで、該組成物は、Ｄｍｉｎ〜Ｄｍａｘの寸法を有する、そしてオーシストの密度とは異なる密度を有する粒子を含有する。

定義
糞便から精製されたオーシスト組成物は、非オーシスト物質の少なくとも９０％、特に９１、９２、９３、９４、９５％またはそれ以上が、オーシストが排泄された糞便から除去されていることを意味する。

粒子のＤｍｉｎはその粒子の最小寸法（長さ、幅または高さ）である。

粒子のＤｍａｘはその粒子の最大寸法（長さ、幅または高さ）である。

巨視的物体：ヒトの肉眼で見られうる物体。典型的には、これは、該物体が少なくとも約０．１ｍｍの寸法を有することを意味する。

粒子は、体積および質量のような物理的特性が起因しうる局在化顕微鏡的または巨視的物体である。動物の糞便中に存在する典型的な粒子としては、砂粒、スリット粒子、粘度粒子、植物の残骸（消化されたもの及び消化されていないもの）、油滴、細菌、ウイルス、粗粒、小石などが挙げられる。

篩デッキのメッシュ開口は、該デッキ内の実際の開口にフィットする仮想円の直径に等しい。メッシュ開口は本質的に「およそ」所定のサイズである。なぜなら、複数のメッシュ開口を有する表面は全開口に関して厳密に同じ寸法では作製できず、また、機械負荷（篩デッキ上の質量、振動など）下の変動にさらされるからである。メッシュ開口は、典型的には、およそ所定のサイズの有効平均である。これに関して、メッシュサイズについての「およそ値Ｘ（約値Ｘ）」は、実際には、開口の実際のサイズがＸの０．９〜１．１倍、特に０．９５〜１．０５倍、好ましくは０．９８〜１．０２倍で変動することを意味する。

自動的は、実施者の介入を伴わないことを意味する。自動的は、実施が実施者により開始または停止されることを除外するものではない。

実施形態
第１の実施形態においては、第１篩デッキは、Ｄｍｉｎより大きく且つＤｍａｘまでのメッシュ開口を有し、第２篩デッキはおよそＤｍｉｎのメッシュ開口を有する。第２篩デッキに関しては、メッシュ開口がおよそＤｍｉｎである場合、Ｄｍｉｎの最小寸法を有するいずれのオーシストも、該デッキを通過することが妨げられるが、Ｄｍｉｎより小さな典型的寸法を有する細菌、ウイルス、タンパク質塊および他の粒子は該デッキを通過しうることが判明した。このようにして、実質的に無菌性のオーシスト画分が得られうる。濾過されるべき水性画分が、Ｄｍｉｎより僅かに小さい寸法を有する非オーシスト粒子を余りにも多数含有する場合には、臨界的状況に達しうるであろう。なぜなら、そのような粒子は典型的には該デッキにより若干妨害され、したがってオーシスト残渣中の汚染物として残存しうるからである。しかし、そのような臨界的粒子は種々の種類の動物糞便中に（合理的に顕著には）存在しないようであり、したがって、およそＤｍｉｎのメッシュサイズを使用することは、より小さな汚染粒子がこの篩デッキを通過する一方で残渣中にオーシストを維持するのに完全に適しているようである。第１篩デッキに関しては、メッシュ開口は、好ましくは、少なくともＤｍｉｎのサイズであることが明らかである。しかし、好ましい最大サイズ自体は自明ではない。例えば、オーシストを篩デッキに通過させることを試み達成するために十分な量の追加的な水を使用する場合には、Ｄｍｉｎを超えるがＤｍａｘを実質的に下回るサイズが適当でありうるであろう。この場合、水は潤滑剤として機能して、デッキに対する（非球状）オーシストの配向を再配列させるのである。該開口の、より大きないずれかのサイズは、オーシストのより容易な通過を可能にするであろう。本出願人は、第１篩デッキの開口の好ましい最大サイズがおよそＤｍａｘであることを見出した。より一層大きな開口を有することは、余りにも多数の汚染粒子がオーシストと共に篩デッキを通過することにつながりうる。

もう１つの実施形態においては、第１篩デッキはおよそＤｍａｘのメッシュ開口を有し、第２篩デッキはおよそＤｍｉｎのメッシュ開口を有する。Ｄｍｉｎ〜Ｄｍａｘのサイズ範囲を有するいずれかの汚染粒子が残渣中で第２篩デッキ上で捕捉される可能性もあるにもかかわらず、このようにして、適度に精製されたオーシスト画分が第２篩デッキ上で得られうることを、本出願人は見出した。

更にもう１つの実施形態においては、第１篩デッキはおよそ５０μｍのメッシュ開口を有し、第２篩デッキはおよそ１０μｍのメッシュ開口を有する。例えば、精製されるオーシストが長さ２０〜３５μｍおよび幅２０〜３０μｍのサイズ範囲である場合であっても、これらのサイズのメッシュ開口は、任意のサイズの高度に精製されたオーシストの残渣を得るのに理想的に適しているようである。第１篩デッキの開口のサイズである５０μｍは、「粗い」側のあらゆる汚染粒子を除去するのに適しているようであり、第２デッキの開口のサイズである１０μｍは、「細かい」側のあらゆる汚染粒子を除去するのに適しているようである。どうやら、１０μｍ〜５０μｍの範囲では、汚染粒子の量が少なすぎるため、これらの粒子はオーシストの不適切な精製をもたらさない。

第２篩デッキがドラムの形態である１つの実施形態においては、このドラムの内部に水性濾液をローディングし、ドラムを回転させながら水性濾液を篩分けする。この実施形態においては、残渣はこのドラムの内部に薄層として生じうる。これはオーシストの更なる加工において有利である。好ましくは、ドラムの周速である１０メートル／分（ｍ／分）〜４０ｍ／分の速度で該層が移動するｒｐｍで、ドラムを回転させる。この速度未満では、特に、該ドラム内の気体環境の、低い相対湿度では、該層内のオーシストが乾燥しすぎる可能性があり、一方、４０ｍ／分を超えると、オーシストは大きすぎる機械的な力にさらされ、損傷する可能性がある。

第１篩デッキがドラムの形態であるもう１つの実施形態においては、このドラムの内部に水性画分をローディングし、ドラムを回転させながら水性画分を篩分けする。この実施形態においては、水性画分は多少なりとも連続的に第１篩デッキに加えられうる。なぜなら、それは比較的精巧な表面を有している可能性があるからであり、（オーシストを含有する）濾液が該篩デッキを連続的に通過することが可能となるように、それは連続的に回転される。

更にもう１つの実施形態においては、篩分け中に、追加的な水性媒体を篩デッキに加える。この追加的な水は潤滑剤として有利に働きうる。そして場合によっては、開口の寸法がＤｍｉｎに近い場合であっても、容易な篩分けを可能にするために、篩デッキに対してオーシストが有する配向を再配列させるための媒体として、追加的な水は有利に働きうる。もう１つの実施形態においては、追加的な水性媒体は１９℃〜３７℃の温度を有する。このようにして、オーシストは、本篩分け方法を用いて糞便から精製される一方で、胞子形成過程を既に開始可能である。これは該方法の最終的な収率にとって有利でありうる。好ましくは、該追加的水性媒体は約２８℃の温度を有する。

本発明のシステムは、本発明の方法のこれらの実施形態の１以上が適用されることを可能にする特徴を包含しうる。特許請求の範囲におけるシステムの従属項はそのような特徴を挙げている。

次に、以下の図面および実施例を用いて、本発明をより詳しく説明することとする。

実施例
実施例１は本発明の方法に関するプロセスデータを記載する。

図１
図１は、コクシジウムオーシストを含有する動物糞便を宿主動物から収集し、巨視的粒子状物質を含む粗画分を該糞便から分離し、該オーシストを含有する画分を更なる精製のために収集するためのシステムを図示する。一般に、更なる精製のためにオーシストを調製する多数の異なる方法が当技術分野で公知である。そのような方法のいずれか１つ又は組合せが更なる精製の前に用いられうる。好ましい方法を以下に記載する。

最初に、宿主動物（典型的にはニワトリ）が該生物の放出を開始したら、オーシストを収集することが可能である。最も一般的には、ニワトリを籠（１）内に維持し、固体飼料（２）および水（３）を供給する。籠から糞便５を集め、他の物質（羽毛、藁など）を含有する廃棄流を廃棄する。糞便を集めたら、それをスラリータンク６に送り、添加水（７）と混合する。生じた希釈糞便物を、糞便中の粗物質、例えば石、木くず、格子の残骸、動物飼料の残骸などの除去のために、篩９に供給する。このために、篩は２つの連続的板篩を含み、上流篩は２ｍｍのメッシュ開口を有し、下流篩は１２５μｍのメッシュ開口を有する。生じた残渣（１１）を廃棄し、オーシストを含有する水性画分１０として濾液を集める。

図２
図２は本発明のシステム２０の実施形態の１つを図示する。この実施形態においては、該システムは、２つの内部篩デッキ、すなわち、上流篩デッキ２１および下流篩デッキ２２を有する縦方向のチューブ状ハウジング２３を含む。この実施形態においては、該篩デッキは平織パターンによるステンレス鋼金網から構成される。水性画分１０（図１を参照されたい）を、この画分を篩分けするために、篩デッキ２１の上部に供給する。このデッキはメッシュ開口を有していてオーシストを通過させて、オーシストを含む水性濾液３２、およびオーシストより大きな粒子を含む第１残渣３１を与える。水性濾液３２を第２篩デッキ２２の上部に供給し、該篩デッキは、この篩デッキを通るオーシストの通過を妨げるメッシュ開口を有する。このようにして、精製されたオーシストを含む第２残渣４０、およびオーシストより小さな粒子を含む廃棄濾液４２を得る。

メッシュ開口のサイズは、所望の形状のオーシストが有効に収集されるように選択されるべきである。例えば、１５〜２５μｍのサイズ範囲のオーシストを収集するためには、第１篩デッキは２５μｍのメッシュ開口を有することが可能であり、第２篩デッキは約１４μｍのメッシュ開口を有することが可能である。この場合、メッシュ開口はオーシストのサイズとほぼ厳密に一致するため、オーシストを第１篩デッキに実際に通過させるためには、多くの追加的な水（篩デッキ２１の上部に別供給物として供給される）が必要とされうる。もう１つの設定においては、例えば、２０〜３０μｍのサイズ範囲のオーシストを収集するためには、第１篩デッキは４０μｍのメッシュ開口を有することが可能であり、第２篩デッキは約１５μｍのメッシュ開口を有することが可能である。更にもう１つの設定においては、例えば、１０〜４０μｍのサイズ範囲のオーシストを収集するためには、第１篩デッキは４２μｍのメッシュ開口を有することが可能であり、第２篩デッキは約１０μｍのメッシュ開口を有することが可能である。更にもう１つの設定においては、例えば、１２〜４８μｍのサイズ範囲のオーシストを収集するためには、第１篩デッキは５０μｍのメッシュ開口を有することが可能であり、第２篩デッキは約１０μｍのメッシュ開口を有することが可能である。

図３
図３は、本発明の方法またはシステムにおいて使用される篩デッキ２１（メッシュ開口５０μｍ）の実施形態の１つを図示する。この実施形態においては、篩デッキはドラム形態の無端デッキである。該ドラムは回転可能様態で軸２５上に支持されており、内部に定置容器２６が設けられている。使用においては、このドラムの内部の容器２６の下方に水性画分をローディングし、ドラムを回転させながら水性画分を篩分けする。また、この篩分け操作中に、約２８℃の温度を有する追加的な水性媒体をドラム２１の内部に加える。該水性濾液を容器２７内に収集する。ドラムの上方にはスプレーヘッド２８の列が配置されている。これらのヘッドは、ドラムに水を加えるために使用可能であり、この水は篩分け中に潤滑剤として働き、あるいは篩分けが終了した後、残渣をドラムから放出させ、それを容器２６内に収集するために使用される。この容器は、それを軸２５上でスライドさせることにより取り外されうる。

図４
図４は本発明のシステム２０のもう１つの実施形態を図示する。この実施形態においては、本発明の方法を適用するための半連続的プロセスが実施されうる。このシステムは回転篩９１（１５０μｍのメッシュ開口を有する）を含み、これはハウジング９により包囲されている。この篩およびハウジングは図１における物品９に対応する。この篩９１に、希釈ニワトリ糞便を含む水性画分８（図１を参照されたい；ただし、この画分は、所望により、２ｍｍの篩で前篩分けされる）を供給して、巨視的粒子状物質を含む粗画分を該希釈糞便から分離する。オーシストを含有する水性画分１０を収集し、ハウジング２３’内に存在するドラム型回転篩２１’（図３も参照されたい）に供給する。図３に関して記載されているとおり、この篩デッキは５０μｍのメッシュ開口を有し、オーシストを含む水性濾液１１中の水性画分、およびオーシストより大きな粒子を含む第１残渣（示されていない）を分離する。この残渣は前記のとおりに除去されうる。水性濾液１１を回転篩２２’に供給する。該篩はハウジング２３’’内に収容されている。この篩２２’は、この篩デッキを通るオーシストの通過を妨げるための１０μｍのメッシュ開口を有していて、精製されたオーシストを含む残渣がこのドラム型篩デッキ２２’の内側に生じる。廃棄濾液１２は、オーシストより小さな粒子、例えば任意の細菌を含む。

図５
図５は、精製されたオーシストを胞子形成させるための補助手段として使用される篩デッキを図示する。この実施形態においては、残渣４０は篩デッキ２２（１０μｍのメッシュ開口を有する）の内側に２．５〜３．５ｍｍの層として生じる。ドラム型篩デッキ２２は、その一部は或る体積の水（５０；２８℃の温度に維持される）中に浸かるように、そして一部は気体環境６０中に配置され、ドラムの全周囲の約２０％が水位より下となるようにされている。ドラムは、この水の表面に平行に伸長するその縦軸２５で取り付けられている。胞子形成中は、酸素含有気体環境６０内に断続的に層４０を維持するために、ドラムを回転させる。ドラムは水５０’を通って１０〜１２ｒｐｍで回転される。ドラム内の気体環境の相対湿度は１００％である。このようにして、オーシストは４８時間以内に（ほぼ全てが）胞子形成しうることが判明した。

実施例１
実施例１は、図４のシステムを使用する本発明の方法に関するプロセスデータを記載する。このシステムにおいては、４０ｃｍの長さおよび８０ｃｍのドラム直径を有する小さなドラム型デッキを使用する（２．８０メートルまでの長さおよび２．０メートルまでの直径を有するドラムが図４の設定において有利に使用されうる）。該デッキは、平織によって織られたステンレス鋼針金のメッシュを有し、メッシュ開口は図４に関して記載されているとおりである。ドラムは毎分１０〜１２回転で回転する。２６〜３１日齢の６０羽の白色レグホンニワトリ（エイメリアに感染している）の糞便を収集し（１日当たりニワトリ１羽当たり糞便約２５グラム）、２００リットルの水と混合し、２ｍｍの篩を使用して粗画分を分離した。約５０リットルのこの混合物（約２，２５ｋｇの糞便を含有する）を該システム内にローディングし、この場合、篩分け中に、毎分約５〜１０リットルの水を篩デッキ２１および２２に加えた。これは、３５分間の篩分けの後、エイメリア・アセルブリナ（Ｅｉｍｅｒｉａ ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）に関しては約８１％、そしてエイメリア・マクシマ（Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ）に関しては約１００％の計算収率で、約１２０グラムの精製オーシスト（約８５グラムの推定量の非オーシスト糞便粒子、典型的には砂細粒、シルトおよび粘土粒子と約３５グラムのオーシストとを含有する組成物）を篩デッキ２２上に与えた。通常の浮上分離および遠心分離の方法を用いた場合には、これは約６時間を要し、典型的な収率はどちらの種に関しても約５０〜６０％である。

所望により、尚も存在する汚染物の量に応じて、６％ 次亜塩素酸塩（抗感染）溶液中で残渣を混合し、それをドラム２２内にローディングすることにより、追加的な洗浄工程が行われうる。次亜塩素酸塩を除去するために約５〜１０リットル／分で水を連続的に加え、１５分後、残渣は更なる加工にそのまま使用されうる。

図５に関して記載されている胞子形成の後、典型的な胞子形成率はエイメリア・アセルブリナ（Ｅｉｍｅｒｉａ ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）に関しては８５％、そしてエイメリア・マクシマ（Ｅｉｍｅｒｉａ ｍａｘｉｍａ）に関しては９０％である（重クロム酸カリウムを使用する通常方法では典型値４０％〜最大８０％であることと比較されたい）。これらの胞子形成オーシストは、先行技術において公知のとおり、コクシジウム症ワクチンにおける抗原として働きうる。

Claims (16)

1. コクシジウムオーシストを含有する糞便（５）を宿主動物から収集し、水性媒体（７）中で糞便を希釈し、所望により、巨視的粒子状物質を含む粗画分（１１）を希釈糞便から分離し、該オーシストを含有する水性画分（１０）を収集する工程を含む、Ｄｍｉｎ〜Ｄｍａｘの寸法を有するコクシジウムオーシストを糞便から精製するための方法であって、
   ・該オーシストを通過させるメッシュ開口を有する第１篩デッキ（２１）上で該水性画分を篩分けして、該オーシストを含む水性濾液（１１，３２）と、該オーシストより大きな粒子を含む第１残渣（３１）とを得、
   ・第２篩デッキ（２２）を通る該オーシストの通過を妨げるメッシュ開口を有する第２篩デッキ（２２）上で該水性濾液を篩分けして、精製されたオーシストを含む第２残渣（４０）と、該オーシストより小さな粒子を含む廃棄濾液（１２，４２）とを得ることを更に含むことを特徴とする方法。
2. 第１篩デッキが、Ｄｍｉｎより大きく且つＤｍａｘまでのメッシュ開口を有し、第２篩デッキがおよそＤｍｉｎのメッシュ開口を有する、請求項１記載の方法。
3. 第１篩デッキがおよそＤｍａｘのメッシュ開口を有し、第２篩デッキがおよそＤｍｉｎのメッシュ開口を有する、前記請求項のいずれか１項記載の方法。
4. 第１篩デッキがおよそ５０μｍのメッシュ開口を有し、第２篩デッキがおよそ１０μｍのメッシュ開口を有する、前記請求項のいずれか１項記載の方法。
5. 第２篩デッキがドラムの形態であり、このドラムの内部に該水性濾液をローディングし、ドラムを回転させながら該水性濾液を篩分けする、前記請求項のいずれか１項記載の方法。
6. 第１篩デッキがドラムの形態であり、このドラムの内部に該水性画分をローディングし、ドラムを回転させながら該水性画分を篩分けする、前記請求項のいずれか１項記載の方法。
7. 篩分け中に、篩デッキに追加的な水性媒体を加える、前記請求項のいずれか１項記載の方法。
8. 追加的な水性媒体が１９℃〜３７℃の温度を有する、請求項７記載の方法。
9. 追加的な水性媒体がおよそ２８℃の温度を有する、請求項８記載の方法。
10. Ｄｍｉｎ〜Ｄｍａｘの寸法を有するコクシジウムオーシストまたはその微細画分を糞便から精製するのに適したシステム（２０）であって、前記システムが、
    ・該オーシストを第１無端形状篩デッキ（２１’）に通過させて濾液（１１）中へと導くメッシュ開口であって、該オーシストより大きな粒子の通過を妨げるのに適したメッシュ開口を有する第１無端形状篩デッキ（２１’）、
    ・第２無端形状篩デッキ（２２’）の内部に該濾液を自動的にローディングするための手段を含み、
    ・該第２篩デッキが、この篩デッキを通る該オーシストの通過を妨げ該オーシストより小さな粒子を通過させるメッシュ開口を有する、システム。
11. 篩デッキがドラム型である、請求項１０記載のシステム。
12. 第１篩デッキが、Ｄｍｉｎより大きく且つＤｍａｘまでのメッシュ開口を有し、第２篩デッキがおよそＤｍｉｎのメッシュ開口を有する、請求項１０および１１のいずれか１項記載のシステム。
13. 第１篩デッキがおよそＤｍａｘのメッシュ開口を有し、第２篩デッキがおよそＤｍｉｎのメッシュ開口を有する、請求項１０〜１２のいずれか１項記載のシステム。
14. 第１篩デッキがおよそ５０μｍのメッシュ開口を有し、第２篩デッキがおよそ１０μｍのメッシュ開口を有する、請求項１０〜１３のいずれか１項記載のシステム。
15. 請求項１〜９のいずれか１項記載の方法により入手可能な精製されたコクシジウムオーシスト組成物であって、該コクシジウムオーシストがＤｍｉｎ〜Ｄｍａｘの寸法を有し、該組成物が、Ｄｍｉｎ〜Ｄｍａｘの寸法を有する粒子を含有し、該粒子が、該オーシストの密度とは異なる密度を有する、精製されたコクシジウムオーシスト組成物。
16. 該粒子が１０μｍ〜５０μｍの寸法を有する、請求項１５記載の精製されたコクシジウムオーシスト組成物。

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