KR102061659B1 - 인공위액을 이용한 분변에서 돼지편충란의 신속 분리 정제 방법 - Google Patents

인공위액을 이용한 분변에서 돼지편충란의 신속 분리 정제 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 돼지 분변 내 돼지편충란의 분리 방법 및 돼지 분변으로부터 분리한 돼지편충란의 성숙방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 따르면, 돼지 편충 충란이 포함된 분변을 에틸 아세테이트 (Ethyl acetate), 변형된 인공 위액 (Simulated gastric fluid, SGF)을 처리하고 반응시켜 충란을 분리하면 분변 내 찌꺼기 및 세균을 제거하여 미성숙한 상태의 돼지 편충 충란을 충란의 손실 없이 대량으로 신속하게 분리할 수 있다. 또한, 인체에 유해성이 없는 에틸아세테이트를 이용한 산자극으로 미성숙한 충란을 성숙시킬 수 있어, 크론씨병과 같은 염증성 장질환 치료를 위한 감염형의 충란을 신속하게 제조 및 생산할 수 있다.

Description

인공위액을 이용한 분변에서 돼지편충란의 신속 분리 정제 방법{Rapid separation and purification of Trichuris suis eggs from feces using artificial gastric juice}
본 발명은 돼지 분변 내 돼지편충란의 분리 방법 및 돼지 분변으로부터 분리한 돼지편충란의 성숙방법에 관한 것이다.
자가 면역 질환의 일종인 염증성 장질환(Inflammatory Bowel Disease, IBD)는 많은 연구에도 불구하고 아직까지 뚜렷한 치료제가 개발되지 않았으며, 최근에는 돼지편충란을 이용한 치료가 시도되고 있다. 이러한 치료제로 사용되고 있는 돼지편충란의 대량 확보를 위해서는 돼지 편충 성충이 분변으로 배출하는 충란을 신속하고 대량으로 분리 방법의 정립이 필요하다.
이는 기존의 분리방법으로는 돼지 편충에 감염된 돼지에서 암컷 성충을 분리해 자궁 속에 존재하는 충란을 분리해도 충분한 양의 충란을 확보하기 어려우며, 자궁에서 직접적으로 추출해내는 것이기 때문에 미성숙된 충란이 많기 때문이다. 이미 정립되어 있는 분변에서 충란을 분리하는 방법은 소량의 분변을 사용하며, 주로 검시용으로 사용되기 때문에 대량의 분변을 처리하기에는 많은 시간, 노력 그리고 분리에 사용하는 시약이 필요하다. 그리고 기존에 장내 기생충 충란을 확보하기 위해 사용하고 있는 Stainless-steel meshes를 사용하는 방법이 존재하지만, mesh가 가지고 있는 분변을 처리할 수 있는 용량이 제한적이기 때문에 분변 속에 찌꺼기가 많이 존재할 경우, mesh 자체가 막히는 경우가 자주 발생한다. 그래서 막힌 상태의 mesh에 존재하는 충란을 추출하기 위해 찌꺼기 위에 증류수를 부어주게 되는데, 이때 고여 있는 증류수를 내리기 위해 들어가는 시간과 노력이 상당하다. 또한 최근에는 토양에서 기생충 충란을 확보하는 방법이 보고된 바 있지만, 실제적으로 대량의 분변을 처리하기에는 어려운 점이 있다.
이에 치료제로 사용되고 있는 돼지편충란을 신속하게 대량으로 확보하기 위한 방법에 대한 강한 필요성이 있다.
이에 본 발명자들은 돼지 편충 충란을 신속하며 대량으로 분리하는 방법에 대하여 연구하던 중, 편충 충란을 분변에서 분리 시 에틸 아세테이트 (Ethyl acetate), 변형된 인공 위액 (Simulated gastric fluid, SGF), PluriStrainer 세트를 사용하면 신속하고도 대량으로 편충 충란이 분리됨을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 돼지의 분변 내 돼지편충란을 신속하게 분리하는 방법 및 돼지 분변으로부터 분리한 돼지편충란의 성숙방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 돼지의 분변희석액을 여과하는 단계; (b) 여과물에 에틸아세테이트를 첨가하여 혼합하고 원심분리하는 단계; (c) 침전된 돼지편충란을 변형된 인공위액(Simulated gastric fluid, SGF)과 반응시키는 단계; 및 (d) 여과체를 이용해 (c) 단계의 반응물을 여과하여 돼지편충란을 얻는 단계;를 포함하는 돼지 분변 내 돼지편충란의 분리방법을 제공한다.
또한 본 발명은 (a) 돼지의 분변희석액을 여과하는 단계; (b) 여과물에 에틸아세테이트를 첨가하여 혼합하고 원심분리하여 침전된 돼지편충란을 변형된 인공위액(simulated gastric fluid, SGF)과 반응시키는 단계; 및 (c) 여과체를 이용해 (b) 단계의 돼지편충란 부유물을 여과하여 돼지편충란을 얻는 단계;를 포함하는, 돼지 분변으로부터 분리한 돼지편충란의 성숙방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 따르면, 돼지 편충 충란이 포함된 분변을 에틸 아세테이트 (Ethyl acetate), 변형된 인공 위액 (Simulated gastric fluid, SGF)을 처리하고 반응시켜 충란을 분리하면 분변 내 찌꺼기 및 세균을 제거하여 미성숙한 상태의 돼지 편충 충란을 충란의 손실 없이 대량으로 신속하게 분리할 수 있다. 또한, 인체에 유해성이 없는 에틸아세테이트를 이용한 산 자극으로 미성숙한 충란을 성숙시킬 수 있어, 크론씨병과 같은 염증성 장질환 치료를 위한 감염형의 충란을 신속하게 제조 및 생산할 수 있다.
도 1은 돼지 편충 충란이 포함된 분변을 에틸아세테이트와 SGF로 처리한 후, 검경한 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 분변에서 돼지 편충 충란을 고전적인 방법(비교예 1)으로 분리하여 검경한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 충란을 Ritchie 농축법으로 분리하고 pH 2 처리한 후 충란을 분리하여(비교예 2) 검경한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 비교예 1과 본원 발명의 분리 방법 간의 차이를 간략화하여 나타낸 모식도이다.
도 5는 본원 발명의 분리 방법에 따라 분리된 충란 부유물의 검경한 결과(도 5A), 부유물을 여과하여 수득한 충란의 형태(도 5B)를 나타낸 도이다.
도 6은 분리된 충란을 25℃에서 60일간 배양한 충란을 나타낸 도이다.
도 7은 비교예 1, 비교예 2 및 본원 발명의 방법으로 분리한 충란의 성숙정도를 비교한 도이다.
본 발명은 (a) 돼지의 분변희석액을 여과하는 단계; (b) 여과물에 에틸아세테이트를 첨가하여 혼합하고 원심분리하는 단계; (c) 침전된 돼지편충란을 변형된 인공위액(Simulated gastric fluid, SGF)과 반응시키는 단계; 및 (d) 여과체를 이용해 (c)단계의 반응물을 여과하여 돼지편충란을 얻는 단계;를 포함하는 돼지 분변 내 돼지편충란의 분리방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
상기 돼지편충(Trichuris suis)은 인간 편충인 T. trichiura와 유전적으로 유사하여 돼지 편충을 이용한 염증성 장질환 치료 요법에 사용될 수 있는 돼지 편충이면 제한 없이 사용될 수 있다. 이와 같이 사용될 수 있는 돼지 편충의 특징으로는 장내에 국한되고, 숙주에서 증식하지 않으며, 직접 접촉으로 퍼질 수 없고 특별한 병원균이 없는 환경에서 자란 돼지로부터 얻은 수 있는 돼지 편충일 것으로 정의될 수 있다.
상기 “편충란”이란 돼지 편충의 생활사 중 알(egg) 상태를 말하며, 본 발명의 충란은 분변, 객담, 요중 등 충란이 존재하는 숙주의 다양한 시료에서 수득할 수 있거나 시판되는 것을 구입하여 사용할 수 있으나, 바람직한 예시로서 돼지 편충에 감염된 돼지의 분변에서 수득할 수 있다.
본 발명은 전통적인 Ritchie 농축법이 독성을 가진 것을 알려져 있는 포름알데하이드 및 에테르를 사용하는 문제점이 있는 것과 달리, 약산성의 에틸 아세테이트를 이용하여 돼지 편충 충란을 농축하여 수득하는 방법을 제공할 수 있다.
상기 (b) 단계의 에틸아세테이트는 100(v/v)% 의 pH 4 내지 6의 에틸아세테이트를 사용할 수 있으나, 바람직하게는 약산성의 pH 5 내지 5.9의 에틸아세테이트를 사용할 수 있다. 에틸 아세테이트 (Ethyl acetate) (MW 88.11, 31055-0380, Junsei)를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 (c) 단계의 변형된 인공위액(Simulated gastric fluid, SGF)은 1% 돼지의 위 점막으로부터 유래한 펩신 (P7000-100G, Sigma) 및 1% 염산 (HCl, 35.0-37.0% (T) 1kg, H0519, SAMCHUN)을 적절한 비율(v/v)로 섞은 용액을 말한다. 상기 변형된 인공위액은 펩신 및 염산을 1 : 5 내지 1 : 10의 비율로 혼합한 것일 수 있으며, 바람직하게는 1 : 7 내지 1 : 9.5의 비율로 혼합한 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1 : 9 (pellet 5ml:1% Pepsin + 1% HCl 45ml)의 비율(v/v)로 혼합한 것일 수 있다.
상기 (c) 단계에서 충란을 감염형 충란으로 성숙시키기에 충분한 시간동안 변형된 인공위액과 침전된 돼지편충란을 37℃에서 반응시킬 수 있으며, 바람직하게는 5분 내지 1시간 동안 처리될 수 있고, 더욱 바람직하게는 7분 내지 30분, 더더욱 바람직하게는 10분 내지 20분 동안 처리될 수 있다. 상기의 용액을 처리함으로써 충란 이외의 분변 속의 단백질 및 찌거기들이 용해되어 입자가 작아지는 효과를 볼 수 있다. 또한 분변 내에 존재하는 세균들을 제거할 수 있어 항균효과를 나타낼 수 있다.
상기 (d) 단계의 여과체는 충란의 세로 크기보다 작은 입자를 가진 (25um 이하) 그물망이면 제한 없이 사용할 수 있고, 엮어서 만들어진 그물망을 이용하여 이루어질 수 있으나, 바람직하게는 stainless-steel mesh 또는PluriStrainer 세트를 이용할 수 있다. 상기 PluriStrainer 세트는 그물망 단독으로 사용될 수 있으며, 50ml 주사기를 포함하여 세트를 제작함으로써 그물망 위에 존재하는 잔류 부유물들을 신속하게 내려줄 수 있다. 상기 PluriStrainer 세트를 이용하면 충란을 분변에서 순수하게 분리하는 정제 과정 중 충란 크기보다 작은 입자들을 걸러낼 수 있다.
또한 PluriStrainer의 mesh는 Woven mesh로 Stainless steel mesh와는 다른 재질일 수 있다. 부드러운 mesh를 사용하여 위액과 비슷한 성분으로 구성된 SGF 용액 처리 후에 약해진 충란의 벽에 손상을 주지 않고, 안전하게 분리할 수 있다.
상기 woven mesh로 사용하여 반응물의 여과 시 50 내지 56μm woven mesh로 반응물을 여과시킨 후 차례로 22 내지 28μm, 17 내지 23μm 크기의 woven mesh를 사용하여 반응물을 여과시켜 돼지편충란을 수득할 수 있다.
본 발명의 돼지 분변 내 돼지편충란의 분리방법은 (e) 돼지편충란을 수크로오스와 혼합하고 원심분리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이는 수크로오스 100% 용액에 부유시켜 크기가 비슷한 사료 덩어리를 제거하는 효과가 있으며, 수크로오스 용액 처리를 수행하게 되면 충란보다 비중이 큰 덩어리들은 아래로 가라앉고, 충란들만 수크로오스 용액과 충란 부유물 중간층에 남아 있을 수 있어 중간층에 모인 충란들만 피펫으로 수집하여 정제된 충란을 얻을 수 있다.
피펫으로 수집하여 정제된 충란 및 증류수를 1 : 8 내지 1:15의 비율(v/v)로 혼합할 수 있고, 바람직하게는 1: 10 내지 1:14.5의 비율로 혼합할 수 있으나, 가장 바람직하게는 1:14(충란 수크로오스 혼합 3ml:DD.W 42ml)로 혼합할 수 있다. 상기 혼합 용액을 25℃에서 3220g로 1 내지 10분 동안 원심분리할 수 있으며, 바람직하게는 3 내지 7분 동안 원심분리할 수 있다.
상기 방법을 통해 신속하게 돼지편충란의 분리가 가능하고 성숙된 충란을 얻을 수 있다.
또한 본 발명은 (a) 돼지의 분변희석액을 여과하는 단계; (b) 여과물에 에틸아세테이트를 첨가하여 혼합하고 원심분리하여 침전된 돼지편충란을 변형된 인공위액(simulated gastric fluid, SGF)과 반응시키는 단계; 및 (c) 여과체를 이용해 (b)단계의 돼지편충란 부유물을 여과하여 돼지편충란을 얻는 단계;를 포함하는, 돼지 분변으로부터 분리한 돼지편충란의 성숙방법을 제공한다.
즉, 본 발명은 돼지편충란을 감염형 충란으로 성숙시키기 위해 에틸아세테이트 및 변형된 인공위액의 pH 자극을 가해 미성숙한 상태의 충란을 감염형의 충란으로 성숙하도록 유도할 수 있다.
본 발명을 이하 실시예를 통하여 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 발명을 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
실시예 1. 에틸아세테이트와 변형된 인공위액(SGF)를 처리하여 돼지편충( Trichuris suis ) 충란 (eggs)과 이물질의 분리
돼지 편충의 충란을 분리하기 위하여 인위적으로 돼지 편충 (TSO2500, OVAMED GmbH) 을 돼지(약 23kg, 12주령, Yorkshire)에 경구 투여하여 감염을 유도하였다. 감염을 유도한 돼지로부터 분변을 검사하여 돼지 편충 충란의 존재를 광학 현미경 (Zeiss Axioskop2) 하에서 확인하였다. 충란이 분변에서 관찰되면 Egg per gram (EPG) 으로 충란의 수를 산출하였다. 충란의 존재를 분변에서 관찰할 수 없을 때까지 매일 같이 분변을 수집하여 사용하였다. 보다 구체적으로 다음과 같은 공정을 수행하였다. 돼지로부터 물변 또는 고형변 상태의 배설물을 82.5g (x2=165g) 씩 회수하고 이에 3차 증류수를 275ml 가하여 3.3배 희석시켰다. 희석된 혼합물을 물기가 있는 두 겹의 거즈를 이용하여 여과시켰으며, 원심 (3141-0500, 500ml, Nalgene™ PPCO Centrifuge Bottles with Sealing Closure) 튜브에 수집하였다.
pH 5.8의 100(v/v)% 에틸아세테이트(Ethyl acetate)(MW 88.11, 31055-0380, Junsei)를 상기 여과물의 1/3.7 부피로 첨가하였으며, 침사가 모두 부유될 때까지 흔들어 주었다. 20 내지 25℃의 실온에서 3,220g으로 5분 동안 원심분리한 후, 3차 증류수와 에틸 아세테이트 사이에 생긴 층을 분리하고 상층액을 버렸으며, 침전된 충란에 3차 증류수를 25~40ml 가하여 풀어주었다. 50ml 코니칼 튜브 (SPL, #50050)에 옮겨 담고, 5분 동안 실온(25℃)에서 3,220g으로 원심분리를 하였다. 그 후, 상층액을 버리고, 3차 증류수 30~45ml를 첨가하여 잘 섞어주고, 원심분리를 3,220g으로 5분 동안 실온(25℃)에서 하였다. 이어서 상층액을 버리고, 미리 제작된 돼지의 위 점막에서 분리한 1%의 펩신과(P7000-100G, Sigma) 및 1% 염산(HCl, 35.0-37.0% (T) 1kg, H0519, SAMCHUN)을 1:9(pellet 5ml:1% Pepsin + 1% HCl 45ml)비율로 섞어준 SGF 용액과 함께 15분 동안 37℃에서 반응시켰다. 에틸아세테이트와 SGF 방법 간에 분리된 충란의 현미경 상의 입자를 도 1에 나타내었다.
도 1에 확인한 바와 같이, 에틸아세테이트와 SGF로 충란을 분리하면 큰 잔류 부유물 없이 높은 정제도로 분리될 수 있고, 분변 속의 크기가 큰 잔류 입자들을 효율적으로 용해시킬 수 있음과 실제로 이 과정 속에서 분변 속의 꽃가루들이 용해된 것을 확인하였다. 에틸아세테이트와 SGF를 사용하면 분변 내에서 이물질인 단백질을 소화시키는 작용을 할뿐만 아니라 분변 내의 찌꺼기를 제거시켜 충란의 순도를 높이기 위한 기능을 수행함을 확인하였고, 이 후 수크로오스 부유과정에서도 순도 높은 충란을 회수할 수 있도록 하도록 함을 확인하였다. 또한, SGF를 사용할 경우, 산으로 인해 미성숙한 충란을 자극하여 성숙한 충란으로 유도할 수 있으며, 세균을 없애는 항균효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
비교예 : 분리 방법에 따른 돼지편충란 분리 효과 비교
본 발명의 방법과 종래기술인 화학 약품을 처리하지 않고 체를 이용하여 충란을 분리하는 고전적 방법(비교예 1) 및 이전에 공개된 특허(공개번호 10-2016-0104182 A)에서 소개된 산성 용액만 처리하는 방법(비교예 2)으로 각각 분변에서 충란을 비교하였다. 이전에 공개된 특허에서 사용된 방법은 시트릭산 및 에틸아세테이트를 사용해 pH 2의 산성용액을 맞춰 사용하였다. 비교예 1 및 2에 따른 방법으로 분리된 충란의 현미경 관찰의 결과를 도 2 및 3에 나타내었다.
도 2 및 3에 나타낸 바와 같이, 비교예 1로 분리한 충란(도 2)이 포함된 잔류 부유물의 입자는 에틸아세테이트와 SGF 방법으로 분리한 충란의 잔류 부유물 입자(도 1) 보다 입자의 크기가 큰 것이 확인되었다. 또한, 도 3처럼 비교예 2에 따라 산성 용액만 처리하는 방법을 사용할 경우에는 부유물등의 굵은 입자들이 작아지는 것은 확인할 수 없었다. 따라서, 본 발명의 에틸아세테이트 및 SGF를 사용하는 분리방법을 이용하면 분변 내의 찌꺼기들을 제거할 수 있어 계속되는 분리 과정 중 충란의 회수율을 높일 수 있음을 확인하였다.
실시예 2. Stainless-steel mesh, PluriStrainer 세트와 수크로오스를 이용한 충란의 순수 분리
고전적인 방법으로 화학 약품이 처리되지 않은 실험군으로부터 분리된 충란 분리방법 및 에틸아세테이트만 처리한 분리방법을 대조군으로 삼고, 상기 실시예 1의 과정 이후에 53㎛, 25㎛ (Ø 200mm x 45mm, CHUNG GYE SANG GONG SA, KOREA)가 결합된 Stainless-steel meshes에 충란 부유물을 부어 걸러내었다. 3차 증류수 1L을 사용하여 Stainless-steel meshes를 씻어주었다. 큰 입자들이 용해된 상태의 분변 부유물을 53㎛, 25㎛ Stainless-steel meshes를 사용하여 분리하였고, 위쪽에 결합된 53㎛ Stainless-steel mesh를 분리한 뒤, 25㎛ (Stainless-steel mesh)를 3차 증류수 50ml~500ml로 씻어준 후, 씻어준 25㎛ Stainless-steel mesh를 60도 각도로 뒤집어 50ml 코니칼 튜브 (SPL, #50050)에 살짝 걸쳐서 올려놓았다. 씻어준 면의 반대편 방향에서 증류수를 뿌려 충란들을 Stainless-steel mesh 아래쪽으로 모아주었고, 용해가 적게 되어 잔류하는 입자들 중에서 충란보다 크기가 큰 것들을 걸러내었으며, 53㎛ stainless-steel meshes에서 대부분의 큰 입자들은 걸러지고 충란은 빠져나가 아래에 있는 25㎛ stainless-steel meshes에 정치하게 되어졌다.
Stainless-steel mesh 아래쪽에 모인 충란들을 50ml 코니칼 튜브에 옮겨 담은 다음, PluriStrainer 세트인 Connector Ring (41-50000-03), 20μm Woven mesh (PluriStrainer®, 43-50020-03, green), Funnel (42-50000-03, 24ml)을 새로운 50ml 코니칼 튜브를 결합시킨 후 Funnel에 Stainless-steel mesh에서 모은 충란들을 60도 각도로 더 기울여 충란 부유물들이 Funnel 입구를 통해서 흘러 들어가도록 20ml씩 부어주었다. 부유물은 20μm Woven mesh를 통과하지 못하였다.
이 후, Connector Ring에 50ml Syringe를 결합시킨 후 공기를 빨아들여 진공 상태를 만들면 Funnel에 존재하는 용액을 전부 내릴 수 있는데, 이런 방식으로 50ml 코니칼 튜브에 있는 나머지 용액을 20μm Woven mesh에 충란만 남게 될 때까지 부어 반복해 주었다. 이렇게 모아진 충란들이 있는 20μm Woven mesh를 새로운 50ml 코니칼 튜브 위에 뒤집어 올려놓고, mesh에 존재하는 충란들을 분리하기 위해 3차 증류수 1~5ml로 씻어주었다. 이 때 미리 50ml 코니칼 튜브에 수크로오스 (Saccharose, Junsei, C12H22O11, M.W: 342.30, 500g) 100% 용액을 20ml 채워주었다.
채워진 수크로오스(100%) 용액에 1:4 (v/v)(충란부유물 5ml : 수크로오스 20ml)비율로 상층에 충란 부유물을 올려주고, 5분 동안 25℃에서 3,220g로 원심분리 하였다. 플로팅된 충란이 섞인 용액 (약 25ml) 중에 수크로오스 경계층에 존재하는 충란들을 1ml 피펫으로 수크로오스와 함께 빨아 올려주었다. 이 혼합물을 50ml 코니칼 튜브에 옮겨 담고, 3차 증류수를 1:14 (충란 혼합 수크로오스 3ml : DD.W 42ml)비율로 희석한 후 5분 동안 25℃에서 3,220g로 원심분리한 후, 상층액을 버리고, 1ml 내지 5ml의 PBS에 충란을 부유 시켜 15ml 코니칼 튜브 (SPL, #50015)에 담고 25℃에서 보관하였다. 에틸아세테이트가 반응된 분변의 충란들을 상기 처리 시간 이후, 25℃의 실온에서 5분간 3,220g로 원심 분리하였으며, 증류수를 이용하여 3회 세척을 수행하였다. 전반적인 실험 과정을 모식화하여 도 4에 나타내었으며, 본원 발명의 방법에 따라 수득된 충란의 형태 및 시간에 따른 분리 형태를 도 5에 나타내고, 충란의 회수율을 표 1에 나타내었다.
돼지편충란 분리 방법의 차이에 따른 회수 비율과 처리 시간의 차이 비교
Method EPG (Stool, g) EPG
(Recovered eggs, %)		 Times (min)
Classical 641 (153) 365 (56.9) 120-240
Ethyl acetate 5,023 (74) 2,513 (50) 30
Ethyl acetate & SGF 3,286 (165) 3,003 (91.4) 60
도 5A에서 확인한 바와 같이, 에틸아세테이트와 SGF를 이용하고, Stainless-steel mesh, PluriStrainer 세트와 수크로오스를 이용한 충란의 순수 분리 후에는 분변의 찌꺼기 없이 순수한 충란만 분리되었다. 도 5B에서 확인한 바와 같이, 본 발명의 방법으로 분리하였을 때, 분리 직 후(도 5B)에 충란의 손상 없이 분리할 수 있음을 확인하였다.
표 1에 확인한 바와 같이, 대조군인 고전적인 방법에서는 충란의 회수율이 56.9%로 낮으며, 이후에 수크로오스 100% 단계를 진행한다고 해도 회수율의 변화는 거의 없으며, 120 ~ 240 분이 넘는 작업 시간이 필요함을 확인하였다. 또한 에틸아세테이트 처리한 충란 분리 방법은 잔류 찌꺼기가 많기 때문에 SGF 적용 없이 바로 수크로오스 100%에 부유 시, 충란의 회수율이 50%로 떨어지는 것을 확인하였다. 따라서 SGF를 처리하는 중간 단계는 다른 미생물의 성장을 억제하는 역할을 하는 것을 확인하였다. 반면, 본 발명의 분리 방법인 에틸아세테이트와 SGF을 가하여 분리하는 충란분리 방법은 60분 정도의 짧은 처리시간으로도 91.4%의 높은 회수율을 확인하여 분변에서 충란을 분리하는 방법으로는 최적임을 확인하였다.
실시예 3. 분리한 충란의 산성 자극으로 인한 성숙
상기 실시예 2의 분리를 거친 모든 처리가 완료된 충란을 인산완충식염수 (PBS)에서 2 내지 3개월 동안 25℃ 온도에서 보관하였으며 1달 간격으로 보관 중인 충란을 꺼내어 충란의 성숙도를 광학현미경을 이용하여 확인하였다. 충란의 성숙도에 따른 형태학적인 양상은 도 6에 나타내었고, 본원 발명의 분리방법, 비교예 1 및 2로 수득한 충란의 성숙 정도의 비교를 도 7에 나타내었다.
도 6에서 확인한 바와 같이, 60일 간 배양으로 충란이 효과적으로 성숙됨을 확인하였다. 또한, 도 7에서 확인한 바와 같이, 에틸아세테이트와 SGF 방법을 통해 자극을 준 돼지 편충의 충란들은 고전적인 방법(비교예 1)으로 분리한 대조군과 비교하여 60일 경과부터 성숙한 충란이 22.46%가 관찰되었으며, 90일째에는 42.29% 충란의 성숙유도가 확인되었다(* p < 0.0332). 또한 에틸아세테이트와 SGF 실험군에서 사멸한 충체는 관찰되지 않았다. 이와 같은 결과에 따르면 체외로 배출되어 장기간 노출되어도 적절한 외부 자극을 주지 않으면 감염형으로 성숙되지 않음을 확인할 수 있었다. 즉, 돼지 편충 충란의 성숙 유도에 있어서 pH 자극은 매우 중요한 유도 인자가 될 수 있으며, 산성 자극이 적절한 자극원으로 성숙을 유도할 수 있음을 확인하였고, 본 발명의 방법을 이용하면, 높은 회수율로 충란을 분리하며 동시에, 미성숙한 충란을 성숙시켜 성숙한 충란까지 회수할 수 있음을 확인하였다. 다만, 산성 자극인 비교예 2와 본원 발명의 분리방법인 아세테이트 및 SGF를 가한 처리 군은 60일 경과 후에도 2%정도 성숙의 차이가 발생하나, 90일 이후에는 약 10%넘게 성숙의 차이가 발생한다는 점에서, 본원 발명의 분리방법을 이용할 때, 미성숙한 충란을 성숙한 충란으로 효과적으로 수득할 수 있는 방법임을 확인할 수 있었다.
따라서, 돼지 편충의 충란을 염증성 장질환 연구 등에 이용함에 있어서, 미성숙 돼지 편충 충란에 에틸 아세테이트와 SGF 같은 산성 자극을 처리하면 감염형의 충란으로 단기간에 성숙을 유도시킬 수 있어 시간 및 비용의 단축 효과가 있음을 확인하였다.

Claims (7)

  1. (a) 돼지의 분변희석액을 여과하는 단계;
    (b) 여과물에 에틸아세테이트를 첨가하여 혼합하고 원심분리하는 단계;
    (c) 침전된 돼지편충란을, 1% 펩신 및 1% 염산을 1:9의 비율(v/v)로 혼합한 인공위액(Simulated astric fluid, SGF)으로 반응시켜 성숙시키는 단계; 및
    (d) 여과체를 이용해 (c)단계의 반응물을 여과하여 성숙된 돼지편충란을 얻는 단계;를 포함하는 돼지 분변 내 돼지편충란의 분리방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 (c)단계의 1% 펩신은 돼지 위 점막으로부터 유래된 것을 특징으로 하는, 돼지 분변 내 돼지편충란의 분리방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 (c)단계의 반응은 5분 내지 60분 동안 실시되는 것을 특징으로 하는, 돼지 분변 내 돼지편충란의 분리방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 (d) 단계는 (d-1) 50 내지 56μm 크기의 여과체로 (c)단계의 반응물을 여과하는 단계; (d-2) 22 내지 28μm 크기의 여과체로 (c)단계의 반응물을 여과하는 단계; 및 (d-3) 17 내지 23μm의 여과체로 (c)단계의 반응물을 여과하여 돼지편충란을 얻는 단계를 포함하는, 돼지 분변 내 돼지편충란의 분리방법.
  5. 제1항에 있어서,
    (e) 돼지편충란을 수크로오스와 혼합하고 원심분리하는 단계;를 더 포함하는 돼지 분변 내 돼지편충란의 분리방법.
  6. 삭제
  7. 삭제
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