CN117511849A - 一种大口黑鲈脊髓组织细胞系及其构建方法与应用 - Google Patents

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CN117511849A CN202311599990.0A CN202311599990A CN117511849A CN 117511849 A CN117511849 A CN 117511849A CN 202311599990 A CN202311599990 A CN 202311599990A CN 117511849 A CN117511849 A CN 117511849A
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袁雪梅
黄雷
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彭先启
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Abstract

本发明公开了一种大口黑鲈脊髓组织细胞系及其构建方法与应用。一种大口黑鲈脊髓组织细胞系，于2023年6月10日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C202359，命名为：大口黑鲈脊髓组织细胞系MSC(Micropterus salmoides cell MSC)。本发明所建立的细胞系对蛙虹彩病毒、传染性脾肾坏死病毒、弹状病毒均敏感，可很好地进行大口黑鲈病毒分离、培养、检测及疫苗研究。本发明大口黑鲈脊髓组织细胞系的构建方法以大口黑鲈脊髓组织为对象，采用胰酶消化法成功建立。大口黑鲈脊髓组织细胞对多种病毒敏感，可为分离、鉴定鱼类病毒提供重要的工具，为研发安全、高效和价廉的病毒疫苗奠定基础。同时，本发明的方法也可以应用于其它鱼类细胞的建立。

Description

一种大口黑鲈脊髓组织细胞系及其构建方法与应用
技术领域
本发明属于动物细胞培养技术领域，尤其是涉及一种大口黑鲈脊髓组织细胞系及其构建方法与应用。
背景技术
大口黑鲈（Large-mouth bass，Micropterus salmoides）养殖产业发展现状随着养殖技术的成熟，全国大口黑鲈养殖的规模在不断扩大。虽然疫情的暴发给水产行业带来了巨大损失，但大口黑鲈年产量不减反增相比于前几年年产量仍在增长，2022年产量达70余万吨。现如今养殖区域主要分布在广东、浙江、江苏、江西、四川和福建等地，广东养殖总量最高，其次为浙江。大口黑鲈是一种常见的经济型淡水鱼类，具有较高的营养价值，已成为重要的水产养殖品种之一。大口黑鲈存在多种病毒，其中养成期以大口黑鲈虹彩病毒（Large-mouth bass virus，LMBV）为主，也有其他病毒如传染性脾肾坏死病毒（Infectioussplee and kidney necrosis virus，ISKNV）；苗期主要以弹状病毒（Micropterus salmoidesrhabdovirus，MSRV）为主。这些病毒会对大口黑鲈的养殖产生影响，需要采取相应的防控措施。为了更好地研究这些疾病的发病机制、传播途径和流行趋势，为大口黑鲈养殖提供更为准确的科学防控依据，我们以大口黑鲈的脊髓组织为材料建立了大口黑鲈脊髓组织细胞系。
细胞系提供了一种重要的实验工具，鱼类细胞系的研究主要是用于研究水生生物疾病的发病机制、传播途径和流行趋势等。通过对鱼类细胞系与病毒的互作机制进行研究，可以帮助了解水生生物疾病的传播特性和危害程度，进而制定有效的防控措施。此外，鱼类细胞系还是研制疫苗、生产重组蛋白必备的工具，是研究病毒病理学和免疫学的合适模型。此前，国内外已经建立了大口黑鲈脑细胞系（MSBr）、大口黑鲈鳍条细胞系（MsF）、大口黑鲈心脏细胞系（MSH）和大口黑鲈性腺细胞系（LMBG），但是目前大口黑鲈病害的复杂性和新型疾病的出现，建立大口黑鲈不同组织的相关细胞系变得格外重要。因此，有必要建立大口黑鲈脊髓组织细胞系，建立一种生长快，成本低且对病毒敏感的细胞系。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明以大口黑鲈脊髓组织为对象，成功构建了大口黑鲈脊髓组织细胞系，该细胞系对多种病毒敏感，可为分离、鉴定鱼类病毒提供重要的工具，为研发安全、高效和价廉的病毒疫苗奠定基础。同时，本发明的方法也可以应用于其它鱼类细胞的建立。
本发明采用的技术方案为：
第一方面，本发明提供一种大口黑鲈脊髓组织细胞系，该细胞系于2023年6月10日保藏在中国典型培养物保藏中心，邮编：430072，保藏编号为 CCTCC NO：C202359，命名为：大口黑鲈脊髓组织细胞系 MSC(Micropterus salmoidescell MSC)。
进一步地，所述大口黑鲈脊髓组织细胞系 MSC(Micropterus salmoidescellMSC)是通过大口黑鲈脊髓组织细胞构建。
第二方面，本发明提供一种大口黑鲈脊髓组织细胞系的构建方法，包括以下步骤：
步骤1，大口黑鲈脊髓组织的处理：将大口黑鲈麻醉后，通过尾部脊椎抽取鱼血液后，用75%乙醇体表消毒，无菌条件下取脊髓组织，短时间浸泡于高浓度双抗的HBSS缓冲液中，再移至胰蛋白酶-EDTA消化液剪碎并消化。
步骤2，大口黑鲈脊髓组织原代培养：取步骤1的处理后的脊髓组织，过滤离心，取沉淀，重悬于1号培养液中，置于T25细胞培养瓶；优选地是，置于28℃恒温培养箱中；
步骤3，大口黑鲈脊髓组织细胞传代培养：将步骤2获得的原代细胞经胰蛋白酶-EDTA消化液消化后使用1号培养液进行传代培养；优选地是，置于26-28℃恒温培养箱中至稳定生长状态；
优选地，所述步骤1中所述抽取的鱼的血液量为体重的1%-1.5%。这样可以在组织中获得最适宜的血清量，以影响胰酶消化活性，影响单细胞的产生，降低组织贴壁。
优选地，浸泡25-35秒，以灭活组织表面的细菌。
优选地，所述高浓度双抗的HBSS缓冲液为含有400IU/ml青霉素、400μg/ml链霉素的HBSS缓冲液。
所述步骤(1)中，所述胰蛋白酶-EDTA消化液的质量浓度为0.5%。
所述步骤2中，优选地，使用100μm细胞筛过滤，1200r/min离心5分钟；
优选地，所述1号培养液为含有100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素、20％胎牛血清的L-15培养液。
所述步骤（3）中，待原代生长单层铺满至70%以上时进行原瓶传代，这样更容易传代成功。
优选地，所述步骤（3）中，二次传代后，待单层铺满90%以上时，按两瓶传代为三瓶进行传代，这样可以加速稳定细胞系的建立。
本发明还公开了大口黑鲈脊髓组织细胞系在蛙虹彩病毒、传染性脾肾坏死病毒、弹状病毒分离、培养、检测以及疫苗制备中的应用。
与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：
1）本发明大口黑鲈脊髓组织细胞系的构建方法以大口黑鲈脊髓组织为对象，采用胰酶消化法成功建立。大口黑鲈脊髓组织细胞对多种病毒敏感，可为分离、鉴定鱼类病毒提供重要的工具，为研发安全、高效和价廉的病毒疫苗奠定基础。同时，本发明的方法也可以应用于其它鱼类细胞的建立。
2）本发明通过利用大口黑鲈脊髓组织进行原代培养，建立了细胞生长速度快且对病毒敏感的大口黑鲈脊髓组织细胞系，该细胞系可以稳定培养，连续传代，目前已传至80代。
3）本发明获得的大口黑鲈脊髓组织细胞系可连续稳定传代，因此可以大规模生产大口黑鲈脊髓组织细胞，传代后有较好的生长状态，可进行冻存与复苏。
4）本发明所建立的细胞系对蛙虹彩病毒、传染性脾肾坏死病毒、弹状病毒均敏感。可很好地进行大口黑鲈病毒分离、培养、检测及疫苗研究。
当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1是本发明实施例1中MSC建立的细胞生长形态图，其中，（a）图为原代培养9d的细胞生长形态图，（b）图为15代的细胞生长形态图，（c）图为50代的细胞生长形态图；
图2 是本发明实施例2中MSC冻存前以及冻存复苏后的细胞形态比较，其中，（a）图为冻存前的细胞形态图，（b）图为冻存后的细胞形态图；
图3是本发明实施例3中MSC接种ISKNV的细胞病变结果，其中，（a）图为病变第24h的形态图，（b）图为病变第48h的细胞形态图；
图4 是本发明实施例3中MSC接种LMBV的细胞病变结果，其中，（a）图为病变第24h的形态图，（b）图为病变第48h的细胞形态图；
图5是本发明实施例3中MSC接种MSRV的细胞病变结果，其中，（a）图为病变第24h的形态图，（b）图为病变第48h的细胞形态图。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明构建的大口黑鲈脊髓组织细胞系，于2023年6月10日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C202359，命名为：大口黑鲈脊髓组织细胞系 MSC(Micropterus salmoidescell MSC)。
在本发明的具体实施方式中，所述大口黑鲈脊髓组织细胞系 MSC(Micropterus salmoidescell MSC)是通过大口黑鲈靠近头肾处的脊髓组织构建。
本发明还提供上述大口黑鲈脊髓组织细胞系的构建方法，包括以下步骤：
步骤1，大口黑鲈脊髓组织的处理：将大口黑鲈麻醉后，通过尾部脊椎抽取鱼体重1%-1.5%的血液量血液后，用75%乙醇体表消毒，无菌条件下取临近头肾部位的脊髓组织，放置于培养皿，短时间浸泡于高浓度双抗的HBSS缓冲液中，去除其它组织并清洗。再转移至装有胰蛋白酶-EDTA消化液的新培养皿中，用消毒剪刀剪成组织块并消化30分钟。所述胰蛋白酶-EDTA消化液的质量浓度为0.5%。
步骤2，大口黑鲈脊髓组织原代培养：取步骤1中消化后的大口黑鲈脊髓组织，添加1号培养液吹打，使用100μm细胞筛过滤，1200r/min离心5分钟；将沉淀重悬于1号培养液，接种到T25细胞培养瓶，置于28℃培养箱中恒温培养。
步骤3，大口黑鲈脊髓组织细胞传代培养：取步骤2生长单层铺满的原代大口黑鲈脊髓组织细胞，经过胰蛋白酶-EDTA消化液消化后悬浮在1号培养液，在原瓶中1：1传代，置于26℃-28℃恒温培养箱中至稳定生长状态；
步骤4，取步骤3生长单层铺满的原代大口黑鲈脊髓组织细胞，经过胰蛋白酶-EDTA消化液消化后悬浮在1号培养液，按照2：3传代，即2瓶细胞传至3瓶，置于26℃-28℃恒温培养箱中至稳定生长状态；观察细胞生长状况。
在本发明的实施例中，所述步骤1中，优选地，放置于培养皿，浸泡于高浓度双抗的HBSS缓冲液中25-35秒即可，更优选地，浸泡30秒即可；
优选地，尾部脊椎抽取鱼体重1.2%的血液量；
优选地，所述高浓度双抗的HBSS缓冲液为含有400IU/ml青霉素、400μg/ml链霉素的HBSS缓冲液。
优选地，所述1号培养液为含有100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素、20％胎牛血清的L-15培养液。
所述步骤3中，优选地，待原代生长单层铺满至70%以上进行传代。
所述步骤4中，优选地，待原代生长单层铺满至90%以上进行传代优选地，二次传代后，待单层铺满90%以上进行传代。
本发明还公开了大口黑鲈脊髓组织细胞系在蛙虹彩病毒、传染性脾肾坏死病毒、弹状病毒分离、培养、检测以及疫苗制备中的应用。
进一步地，在本发明的描述中，细胞传代培养至稳定生长状态的定义为：细胞适应相应的温度生长，且在传代时间内可以单层长满，不脱落。
以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
本发明具体实施例中涉及的材料及试剂：
1、实验鱼与毒株：
健康大口黑鲈购自浙江湖州某大口黑鲈省级良种场，体重15克左右，经检测LMBV、MSRV、ISKNV都为阴性。
本实施例采用的病毒液有LMBV、MSRV、ISKNV，这些病毒均为目前国内爆发的现有病毒，经采集后都为本实验室保存。
实施例1
本实施例提供一种大口黑鲈脊髓组织细胞系的构建方法，具体包括如下步骤：
（1）大口黑鲈脊髓组织的处理：取健康的鱼麻醉后，尾部脊椎抽取鱼体重1.2%的血液量后,用75%的乙醇喷洒体表。无菌收集脊髓组织，放置于培养皿中，脊髓组织的体积不超过培养皿体积的5%。培养皿中添加了20 mL HBSS缓冲液，浸泡30秒，去除其它组织并清洗，转移至新的装有20 mL HBSS缓冲液的培养皿浸泡30秒，再转移至新的装有20 mL HBSS缓冲液的培养皿中，用消毒剪刀剪成1mm3大小的组织块，添加在37℃预温的20mL 质量浓度为0.5%的胰蛋白酶-EDTA消化液中消化30分钟。所述HBSS缓冲液是含有400IU/ml青霉素、400μg/ml链霉素的高浓度双抗的HBSS缓冲液。
（2）大口黑鲈脊髓组织原代培养：取步骤1中0.5克消化后的大口黑鲈脊髓组织，添加4ml的1号培养液吹打，100μm细胞筛过滤，滤去粗颗粒组织，滤穿液1200r/min离心5分钟；将沉淀重悬于4ml的1号培养液，接种到T25细胞培养瓶，28℃培养箱中恒温培养。所述1号培养液为含有100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素、体积百分比为20％胎牛血清的L-15培养液。
（3）大口黑鲈脊髓组织细胞传代培养：取步骤2生长单层铺满（密度＞70%）的原代大口黑鲈脊髓组织细胞，经过1ml胰蛋白酶-EDTA消化液消化后悬浮在4ml的1号培养液，按照1：1在原瓶中传代，放入28℃培养箱培养至稳定生长状态；观察细胞生长状况。
（4）大口黑鲈脊髓组织细胞传代培养：取步骤（3）中生长单层铺满（密度＞90%）的传代大口黑鲈脊髓组织细胞，经过1ml胰蛋白酶-EDTA消化液消化后悬浮在4ml 的1号培养液，按照2：3两瓶传为三瓶，放入28℃培养箱培养至稳定生长状态；观察细胞生长状况。
培养结果，原代细胞贴壁率60%左右，原代细胞培养时间7—10日，培养成功率100%。
图1给出MSC建立的细胞生长形态图，其中，（a）图为原代培养9d的细胞生长形态图，（b）图为15代的细胞生长形态图，（c）图为50代的细胞生长形态图。
从图1可以看出：高代次比低代次细胞生长速度更快、细胞密度更高，随着代次增加，细胞形态更整齐。
本发明构建的大口黑鲈脊髓组织细胞系，于2023年6月10日保藏在中国典型培养物保藏中心（中国武汉），保藏编号为 CCTCC NO：C202359，命名为：大口黑鲈脊髓组织细胞系 MSC(Micropterus salmoidescell MSC)。
对比例1
本对比例提供一种大口黑鲈脊髓组织细胞系的构建方法，本对比例与实施例1的区别仅仅在于：步骤1未进行脊椎的抽血，其余同实施例1。
培养结果，原代细胞贴壁率30%左右，原代细胞培养时间7—10日，培养成功率60%。
对比例2
本对比例提供一种大口黑鲈脊髓组织细胞系的构建方法，本对比例与实施例1的区别仅仅在于：步骤1在质量浓度为0.5%的胰蛋白酶-EDTA消化液中只消化了20分钟。其余同实施例1。
培养结果，原代细胞贴壁率50%左右，原代细胞培养时间7—10日，培养成功率90%。
对比例3
本对比例提供一种大口黑鲈脊髓组织细胞系的构建方法，本对比例与实施例1的区别仅仅在于：步骤1中采用质量浓度为0.25%的胰蛋白酶-EDTA消化液，其余同实施例1。
培养结果，原代细胞贴壁率45%左右，原代细胞培养时间7—10日，培养成功率80%。
对比例4
本对比例提供一种大口黑鲈脊髓组织细胞系的构建方法，本对比例与实施例1的区别仅仅在于：步骤1中两次在 HBSS缓冲液中的浸泡时间均为2分钟，其余同实施例1。
培养结果，原代细胞贴壁率55%左右，原代细胞培养时间7—10日，培养成功率90%。
实施例2
MSC细胞系的生物学特性：
（1）生长特性
将MSC经过胰蛋白酶-EDTA消化后悬浮在1号培养液中，以4.865×104/mL的浓度接种1ml到24孔细胞培养板，置于28℃恒温培养箱。每隔1天取3孔，用1ml胰蛋白酶-EDTA消化，使用细胞计数器计算细胞浓度。结果显示，MSC在0~1 d细胞贴壁、生长迟缓，处于延迟期，1~7 d处于指数生长阶段（对数期），7-8d细胞生长趋于静止，处于平台期（静止期）。到达平台期，MSC的平台浓度为1.58105cell/ml，表明该细胞在1号培养液中可以快速生长，6-7天既可达到平台期。
（2）细胞的冻存和复苏活力
1) 将实施例1获得的MSC进一步培养，取处于对数生长期的MSC，经胰蛋白酶-EDTA消化液消化后，收集细胞悬液，200g 离心5min，弃掉上清。加入1ml的细胞冻存液，重悬，转移至1.8ml无菌冻存管中；将冻存管放入程序降温盒中，-80℃冰箱过夜，隔天放入液氮中长期保存；
2) 对1）中冻存180天的细胞进行复苏，从液氮中取出冻存管，置入37℃水中，短暂时间内摇晃至融化，添加6ml 1号培养液，转移至T25细胞瓶，28℃培养箱中培养，隔天换液。培养3天后，细胞形态见图2（b），细胞生长速度为出现减缓。
如图2（a）所示，冻存前的细胞形态纤维状，如图2（b）所示，冻存后的细胞形态纤维状；冻存前后细胞形态没有受到影响。本发明MSC细胞系细胞的复苏活力为80％-90％，复苏细胞能够正常贴壁并生长，可以稳定传代培养。
实施例3
实施例1获得的MSC对不同病毒敏感性实验
1）LMBV、MSRV、ISKNV病毒由本实验室保存在液氮中。
2) 取采用实施例1方法获得的第40代细胞MSC；
3) 细胞病变效应观察：将第40代MSC传代至T25细胞瓶后，待长至90%以上，吸出原有培养液，用PBS冲洗细胞，将病毒浓度为2×104TCID50/ml的病毒液ISKNV、LMBV、MSRV各800μL分别接种至不同细胞瓶中，24℃孵育50min，吸出病毒液，添加5ml含100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2％新生牛血清的L-15培养液，置于24℃培养箱中培养，逐日用倒置显微镜观察。以未接种病毒液的40代MSC为对照细胞。
如图3-5所示，细胞变圆为病毒感染后的光镜观察的一个描述，病毒感染后导致细胞变圆、死亡。经过观察，接种LMBV的细胞（图3）和接种MSRV的细胞（图4）第24小时细胞出现大量死亡；接种ISKNV的细胞（图5）在第48小时有明显的病变效应，第五天开始大量死亡。
将ISKNV、LMBV和MSRV的稀释液接种在96孔细胞培养板中，观察8天。基于Reed-Muench方法的计算表明，采用MSC细胞培养的ISKNV、LMBV和MSRV病毒液的病毒滴度分别为107.2、108.3和109.4TCID50/ml。可见，LMBV和MSRV在MSC表现出较高的复制效率，表明该细胞系可用于以上三种病毒分离、增殖和疫苗制备。
总的来说，我们建立的MSC细胞系是分离、鉴定和增殖大口黑鲈相关病毒可靠的工具之一，可以用于分离未知新发病。该细胞系还具有生长快、对大口黑鲈病毒敏感等优点，可用于大口黑鲈等相关病毒的培养研究，因此对于后续大规模生产病毒类疫苗具有重要的现实意义和价值。
上面结合附图对本申请的实施例进行了描述，但是本申请并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本申请的启示下，在不脱离本申请宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，均属于本申请的保护之内。

Claims (10)

1.一种大口黑鲈脊髓组织细胞系，其特征在于：于2023年6月10日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C202359，命名为：大口黑鲈脊髓组织细胞系 MSC(Micropterus salmoides cell MSC)。
2.根据权利要求1所述的一种大口黑鲈脊髓组织细胞系，其特征在于：所述大口黑鲈脊髓组织细胞系是通过大口黑鲈脊髓组织细胞构建。
3.权利要求1或2所述的一种大口黑鲈脊髓组织细胞系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）大口黑鲈脊髓组织的处理：将大口黑鲈麻醉后，通过尾部脊椎抽取鱼血液后，用75%乙醇体表消毒，无菌条件下取脊髓组织，短时间浸泡于高浓度双抗的HBSS缓冲液中，再移至胰蛋白酶-EDTA消化液剪碎并消化；
（2）大口黑鲈脊髓组织原代培养：取步骤（1）的处理后的脊髓组织，过滤离心，取沉淀，重悬于1号培养液中，置于T25细胞培养瓶；优选地是：置于28℃恒温培养箱中；
（3）大口黑鲈脊髓组织细胞传代培养：将步骤（2）获得的原代细胞经胰蛋白酶-EDTA消化液消化后使用1号培养液进行传代培养；优选地是：置于26℃-28℃恒温培养箱中至稳定生长状态。
4.根据权利要求3所述的一种大口黑鲈脊髓组织细胞系的构建方法，其特征在于：
所述步骤(1)中，所述抽取的血液量为鱼体重的1%-1.5%；所述浸泡时间为25-35秒。
5.根据权利要求3所述的一种大口黑鲈脊髓组织细胞系的构建方法，其特征在于：
所述步骤(1)中，所述高浓度双抗的HBSS缓冲液为含有400IU/ml青霉素、400μg/ml链霉素的HBSS缓冲液；
所述步骤(1)中，所述胰蛋白酶-EDTA消化液的质量浓度为0.5%。
6.根据权利要求3所述的一种大口黑鲈脊髓组织细胞系的构建方法，其特征在于：所述步骤（2）中使用100μm细胞筛过滤，1200r/min离心5分钟。
7.根据权利要求3所述的一种大口黑鲈脊髓组织细胞系的构建方法，其特征在于：所述步骤（2）中所述1号培养液为含有100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素、20％胎牛血清的L-15培养液。
8.根据权利要求3所述的一种大口黑鲈脊髓组织细胞系的构建方法，其特征在于：所述步骤（3）中，待原代生长单层铺满至70%以上时进行原瓶传代。
9.根据权利要求3所述的一种大口黑鲈脊髓组织细胞系的构建方法，其特征在于：所述步骤（3）中，二次传代后，待单层铺满90%以上时，按两瓶传代为三瓶进行传代。
10.权利要求1或2所述的大口黑鲈脊髓组织细胞系在蛙虹彩病毒、传染性脾肾坏死病毒、弹状病毒分离、培养、检测以及疫苗制备中的应用。
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