BR102020003364A2 - Sistema de duas fases aquosas acoplado à cromatografia para obtenção de enzimas - Google Patents

Abstract

A invenção refere-se ao acoplamento de um sistema de duas fases aquosas (SDFA) a uma cromatografia para purificação de enzimas, preferencialmente a frutosiltransferase (FTase), nesse caso, produzida por fungo filamentoso. Para SDFA utiliza-se preferencialmente polietileno glicol e citrato de sódio (PEG/citrato de sódio). As etapas foram acopladas utilizando colunas verticalmente posicionadas em superior e inferior, onde a coluna superior compreende ao SDFA a inferior à resina cromatográfica, e ambas conectadas por mangueira ou tubo, onde o fluxo é controlado por válvula presente na coluna superior. Apesar da implantação de diversas técnicas para o aumento da eficiência na purificação enzimática industrial, muitas dessas técnicas são demoradas, com muitas etapas e acabam resultando num menor rendimento. Assim, o acoplamento do SDFA a uma cromatografia possibilitou a redução do tempo gasto na purificação de enzimas, de forma que o SDFA foi utilizado nas etapas de extração, clarificação e concentração e a cromatografia como etapa final da purificação. Dentre as possíveis enzimas para purificação nesse modelo, a FTase apresentou 12,39 U/mL de atividade, fator de purificação 6,42 e um rendimento em atividade de 352%. Assim, os resultados sugerem que a técnica é eficaz na purificação de enzimas, podendo ser aplicada em diversos setores industriais como alimentos, farmacêutico e animal.

Description

SISTEMA DE DUAS FASES AQUOSAS ACOPLADO À CROMATOGRAFIA PARA OBTENÇÃO DE ENZIMAS Campo da invenção

[001] Essa é uma invenção do campo da biotecnologia com possíveis aplicações nas industriais biomédicas, farmacêuticas, cosméticas, de tecnologia de alimentos, bem como diversos outros segmentos que fazem uso de enzimas em seus processos ou como produto. A enzima frutosiltransferase foi utilizada como parâmetro para testes no sistema proposto, estas, por sua vez, são majoritariamente úteis na indústria para a produção de frutooligossacarídeo (FOS) em larga escala.

Fundamentos da invenção

[002] Enzimas são moléculas especializadas na catálise de reações biológicas, e assim, estão presentes em todos os organismos vivos. Na indústria, podem ser obtidas de fontes vegetais, animais e microbianas, entretanto, boa parte da produção de enzimas, atualmente, está voltada para a fermentação de micro-organismos, devido a sua facilidade de replicação, menor custo de produção, facilidade na aplicação em larga escala e por oferecerem um amplo espectro de características físico-químicas (Macedo, G. A.; Pio, T. F. A rapid screening method for cutinase producing microorganisms. Brazilian Journal of Microbiology, v. 36, n. 4, p. 388-394, 2005). A indústria possui variado interesse em enzimas, visto que podem ser utilizadas em diversos segmentos, como na produção de alimentos, bebidas, tecidos, cosméticos, medicamentos e kits laboratoriais, dentre outros (Singh, R. et al. Microbial enzymes: industrial progress in 21st century. 3 Biotech, v. 6, n. 2, p. 174, 2016) assim, o aprimoramento do processo de produção e purificação dessas moléculas deve ser constante, de forma que a necessidade industrial seja suprida.

[003] A purificação de enzimas para utilização na indústria é extremamente importante, principalmente quando se trata de segmentos farmacêuticos, alimentícios e afins, visto que contaminantes presentes nas amostras podem inibir sua ação, resultando em um produto menos eficiente, ou reagir com outros componentes do produto, provocando reações adversas não previstas. A purificação de materiais enzimáticos normalmente se dá por: Remoção do material insolúvel; Isolamento primário; Purificação e isolamento para comercialização. Estas etapas são realizadas em sequência e podem ser repetidas. Nessas etapas são utilizadas diversas técnicas, sendo as mais comuns: filtração, centrifugação, decantação ou sedimentação, precipitação e ultracentrifugação, diálise, sistema de duas fases aquosas, cromatografias (troca iônica, gel filtração, adsorção, afinidade, interação hidrofóbica, entre outros) e liofilização (Monteiro, V. N.; Silva, R. N. Aplicações industriais da biotecnologia enzimática. Revista processos químicos, v. 3, n. 5, p. 9-23, 2009).

[004] O número de etapas dentro de um processo de obtenção de enzimas está diretamente envolvido no tempo gasto para a aquisição do produto, na quantidade de materiais de consumo envolvidos e equipamentos utilizados, no custo do processo, bem como na quantidade de resíduos liberados no meio ambiente. Além disso, quanto maior o número de etapas, maior é a probabilidade em haver uma redução na atividade biológica da biomolécula alvo. Nesse contexto, há necessidade de novas alternativas para a obtenção de enzimas puras, com alta atividade biológica, utilizando menor número de etapas (Ferreira L. A; Parpot P.; Teixeira J. A.; Mikheeva L. M; Zaslavsky B.Y. Effect of NaCl additive on properties of aqueous PEG-sodium sulfate two-phase system. Journal of Chromatography A, v. 1220, p. 14-20, 2012).

[005] A indústria biotecnológica tem interesse em encontrar um processo que promova a redução das etapas de purificação, e que aumente o rendimento das atividades enzimáticas. Preferencialmente, estes processos incluem metodologias econômicas e sustentáveis (Nadar S.S; Pawar, R.G; Rathod, V. K. Recent advances in enzyme extraction strategies: A comprehensive review. International Journal of biological macromolecules, v. 101, p. 931-957, 2017).

[006] Ao acoplar a técnica de sistema de duas fases aquosas (SDFA) à cromatografia em coluna, o método relatado no presente invento, prevê-se o alcance da purificação de enzimas de forma rápida e eficiente, uma vez que serão necessárias menos passos e repetições para a obtenção do resultado esperado.

[007] O sistema de duas fases aquosas (SDFA) apresenta na sua composição duas soluções imiscíveis compostas por polímero e polímero ou polímero e sal. Devido a sua composição, proporciona estabilidade para a extração da enzima por apresentar um ambiente 80-90% de água. Essa técnica é promissora por extrair, clarificar e concentrar a enzima em um único passo, por não utilizar solventes orgânicos e ser fácil de modificar suas proporções uma vez que o sistema esteja definido (Iqbal M; Tao Y; Xie S, Zhu Y; Chen D; Wang X; Huang L; Peng D; Sattar A; Shabbir MA; Hussain HI; Ahmed S; Yuan Z. Aqueous two-phase system (ATPS): an overview and advances in its applications. Biol Proced Online. V. 28, 2016).

[008] Processos fermentativos baseados no SDFA oferecem a substituição de separações mecânicas complexas, e são predominantes no uso de compostos como polietileno glicol (PEG) e um sal aniônico. Além disso, como já foi descrito, fornece uma alternativa eficiente para a purificação de biomoléculas por partição entre duas fases líquidas. Uma vez que os processos de produção e separação do produto estão ocorrendo simultaneamente, a compreensão dos mecanismos é essencial para a concepção de um sistema bem-sucedido (Agarwal K; Sahu S;Shera S; Banik R. Partitioning of bromelain enzyme extracted from Ananas comosus in different PEG– salt–water aqueous two-phase system. New Biotechnol. V. 44, 2018).

[009] Diversas técnicas já foram implementadas no sentido de aumentar a eficiência das técnicas de purificação, como pode ser observado nos documentos patentários dispostos a seguir.

[0010] A patente US20120153137A1 utiliza cromatografia multidimensional para purificação de diferentes moléculas por meio de sistema acoplado e perpendicular de duas ou mais etapas de cromatografia líquida de alta performance (HPLC). Obtendo amostras purificadas a partir de múltiplos processos cromatográficos feitos sequencialmente. A presente invenção difere por utilizar o SDFA como primeira etapa de extração, clarificação e concentração da enzima e cromatografia como segunda e final etapa na purificação, reduzindo o tempo gasto na realização destes processos e obtendo como resultado uma enzima purificada.

[0011] A patente US4980065A descreve SDFA formado por dois polímeros para separação de compostos bioquímicos e isômeros ópticos. Este processo é descrito como fase precedente a outras etapas de purificação e separações em larga escala. A presente invenção difere de US4980065A por acoplar o SDFA diretamente com uma coluna cromatográfica resultando em uma única etapa.

[0012] A patente WO2019144030A1 descreve um sistema para purificação de ácidos nucleicos compostos por duas fases, sendo a primeira composta pelo SDFA e a segunda composta por material poroso catiônico. Tal documento afirma que uma vez conectadas, o ácido nucleico presente na primeira fase será capaz de ligar-se à fase sólida, havendo assim fragmentação do material e consequente purificação. A presente patente difere de WO2019144030A1 por utilizar etapa composta por coluna cromatográfica acoplada inferiormente à coluna composta pelo SDFA previamente montado, ligadas por uma mangueira ou tubo e controlados por válvula, dessa forma as fases ocorrem consecutivamente, eliminando outros processos e equipamentos, e consequentemente otimizando o trabalho.

[0013] A patente US20110257378A1 refere-se a uma metodologia para recuperação de proteínas em sistema de duas fases aquosas. Onde o SDFA é formado por uma fase rica em polímeros (polietileno glicol ou óxido de etileno-propileno), e uma fase rica em sais, onde um destes deve conter um ânion incompatível ou ânion fortemente hidratado (fosfato, citrato ou sulfato) e um mediador de partição (Cloreto de sódio ou Iodeto de potássio). Neste sistema, a recuperação da fase rica em polímero é feita pela centrifugação da mistura, seguida de aspiração da fase superior. Uma vez recuperada, é adicionada a um novo sistema de duas fases aquosas já carregado com a fase salina, onde espera-se que a proteína desejada fique retida na interfase, sendo recuperada e solubilizada em tampão para então seguir outras fases de purificação. E a patente US10052567B2 refere-se a um aparato composto por material poroso que separa em duas ou mais fases uma única coluna cromatográfica, possibilitando o uso de resinas diferentes e a reposição da resina presente da parte superior da coluna.

[0014] A patente US20130213884A1 dispõe de colunas cromatográficas acopladas para realização de purificação, onde as colunas localizadas nas extremidades são conectadas a reservatório de alimentação ou a reservatório de despejo de resíduo. Estas colunas são munidas de válvula para controle e manutenção de suas capacidades. Assim, defende-se o uso de diferentes tipos de resina cromatográfica em um processo único de purificação. A presente invenção difere de US20130213884A1, pois apesar de acoplar duas colunas perpendicularmente, faz uso de SDFA na primeira coluna. Este processo possibilita a recuperação de enzimas com alto grau de purificação, realizando menos processos.

[0015] A patente BR1020180748173 relata o sistema acoplado de fermentação em estado sólido e cromatografia para obtenção de enzima, no qual o sistema é composto por uma coluna única e membrana filtrante separando a coluna em duas camadas, a fase superior composta pela fermentação e a inferior a resina para processo cromatográfico. Entretanto o presente documento difere desse estado da arte por apresentar um processo consecutivo que alia duas formas de recuperação enzimática em um mesmo processo, bem como estabelece o uso de uma válvula para controle do fluxo da primeira para a segunda coluna. Este processo possibilita a recuperação de enzimas com alto grau de purificação, realizando menos processos.

[0016] O sistema de duas fases aquosas acoplado à cromatografia compreende um avanço na indústria biotecnológica e purificação de moléculas. Como pode ser observado nos documentos citados acima, o atual estado da técnica não oferece um processo unificado destes sistemas, assim a presente patente apresenta uma forma eficiente de purificação de enzimas, suprindo a demanda industrial por aparelhamentos mais eficientes na produção enzimática, podendo ser utilizado em diversos seguimentos industriais como têxtil, cosmético, kits laboratoriais, de alimentos e bebidas, entre outros. Para vias de teste foi utilizada a enzima frutosiltransferase como parâmetro.

Breve descrição dos desenhos

[0017] A Figura 1 Representa o sistema acoplado de extração por sistema de duas fases aquosas e purificação por cromatografia. Os elementos que compõem o sistema estão identificados a seguir. (A): Fase rica em polímero; (B): Interfase; (C): Fase rica em sal; (D): Válvula para controle do fluxo entre a coluna A e B; (E): Mangueira ou tubo conectivo entre as duas colunas; (F): Volume morto da coluna B, para recebimento do material proveniente da coluna A; (G): Solução salina + amostra pré-purificada contendo a molécula de interesse; (H): Resina cromatográfica; (I): Fase de coleta da enzima purificada.

[0018] A Figura 2 apresenta o volume obtido em ensaio laboratorial das fases Sal (A) e PEG (B) em sistema de duas fases aquosas.

[0019] A Figura 3 compreende o cromatograma obtido por FPLC demonstrando a purificação da enzima FTase pré-purificada por sistema de duas fases PEG/citrato.

Descrição da invenção

[0020] O presente invento propõe o acoplamento do sistema de duas fases aquosas à cromatografia para extração e purificação de enzimas. Este método procura reduzir o tempo total de purificação enzimática e dessa forma otimizar sua obtenção na indústria. Apresenta vantagens em relação ao presente estado da técnica por utilizar metodologias relativamente simples e já conhecidas e não fazer uso de equipamentos sofisticados.

[0021] O sistema acoplado é formado por duas colunas ligadas por mangueira ou tubo de material resistente, posicionadas verticalmente uma sobre a outra. A coluna superior (A) é constituída pelo sistema de duas fases aquosas formado por duas fases. A fase superior é composta majoritariamente por um polímero e a fase inferior por solução salina. A composição específica das fases deve variar de acordo com a molécula desejada e suas características. Geralmente são utilizadas combinações de óxido de etileno propileno copolímero de óxido (EOPO) ou polietileno glicol (PEG) com sais como fosfato, citrato e sulfato. Ligada à coluna superior encontra-se a coluna inferior (B), ou cromatográfica. A coluna inferior é formada por resina cromatográfica apoiada em suporte de lã de vidro, algodão hidrofílico ou similar. A resina deve variar de acordo com as especificações da molécula de interesse.

[0022] A preparação do sistema de duas fases aquosas e adição da amostra a ser purificada devem ser feitas previamente na coluna superior. Na presente invenção compreende as etapas de separação do Polímero/Sal na primeira coluna e encaminhamento da solução salina com a molécula de interesse para a segunda coluna.

[0023] Estas colunas devem ser dispostas sequencialmente em um aparato rígido de vidro, plástico, ou qualquer outro material resistente e transparente. Assim como a extremidade inferior da coluna A, deve estar ligada a extremidade superior da coluna B por mangueira ou tubo de borracha ou do mesmo material constituinte da coluna, desde que o fluxo entre as colunas possa ser regulado.

[0024] A parte inferior das colunas devem ser equipadas com válvulas para controle do fluxo, sendo a válvula presente na coluna A responsável pelo controle de saída da enzima recuperada no sistema de duas fases aquosas e a válvula presente na coluna B responsável pelo controle do fluxo de coleta da enzima purificada.

Exemplos de concretizações da invenção

[0025] A presente invenção é mais bem descrita de acordo com os exemplos a seguir:

Exemplo 1: Produção de Frutosiltranferase

[0026] A produção foi realizada em fermentação estado sólido (FES) pelo fungo Aspergillus tamarii Kita UCP 1279 cultivado em frascos de Erlenmeyer de 125 mL contendo 3g de farelo de trigo, 106 esporos, 70% de umidade em sacarose a 2%. O fungo foi incubado a 30ºC, na presença de luz, durante 48 horas. Nas condições postuladas acima foram produzidos 54,80 U/ml e 1.629,03 U/g e de atividade da transfrutosilação no caldo fermentado.

Exemplo 2: Montagem das colunas

[0027] A coluna A é formada por sistema de duas fases aquosas e constituída preferencialmente por polietileno glicol 400 (g/mol) na concentração de 24%, citrato de sódio a 20% (m/m) no pH 8 e a Coluna B é formada preferencialmente pela resina cromatográfica DEAE – Superdex de gel filtração. Após a montagem das colunas, foi adicionado extrato bruto na parte superior (coluna A) e após 1 hora ocorreu a partição da enzima. Uma vez particionada, foi feita a transição da fase salina da coluna A para a coluna B, onde foi realizada a cromatografia, a fase móvel constituída preferencialmente em tampão fosfato de sódio pH 6,5 com NaCl (0,15M). A transição entre as colunas foi feita via mangueira de borracha e controlada por válvula presente na base da coluna A.

Exemplo 3: Caracterização da frutosiltransferase produzida por A. tamarii Kita UCP 1279

[0028] A atividade frutosiltransferase foi realizada segundo método descrito por Sangeetha e colaboradores (Appl. Microbiol. Biotecnhol. 530-537, 2004). A determinação do conteúdo de proteínas no extrato enzimático foi realizada pelo método de Smith e colaboradores (Anal. Biochem. 76-85, 1985). A temperatura (20-80ºC) e pH (3-11) ótimos da enzima foram determinadas ao realizar a atividade diferentes temperaturas e faixas de pH.

[0029] A frutosiltransferase purificada obteve como ótimo o pH 5,0, onde também demonstrou maior, variando a atividade residual de 71%. Em relação a temperatura, apresentou 55°C como temperatura ótima, mantendo sua estabilidade até os 45°C.

[0030] O processo descrito no presente invento pode ser adaptado para a purificação de diversas enzimas, podendo ser utilizado em diversos seguimentos industriais uma vez que o sistema de duas fases aquosas deve ser estabelecido antes de ser adicionado a coluna A e a resina cromatográfica também pode ser estabelecida de acordo com as propriedades da enzima de interesse, desta forma o presente invento apresenta grande vantagem na purificação de enzimas.

Claims (6)

1. SISTEMA DE DUAS FASES AQUOSAS ACOPLADO À CROMATOGRAFIA PARA OBTENÇÃO DE ENZIMAS, caracterizado por compreender um processo de purificação de enzimas em sistema de colunas acopladas em sistema sequencial, conforme descrito no relatório descritivo.
2. SISTEMA DE DUAS FASES AQUOSAS ACOPLADO À CROMATOGRAFIA PARA OBTENÇÃO DE ENZIMAS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por utilizar como aparato duas colunas em sequência vertical de forma onde a primeira abriga o sistema de duas fases aquosas (SDFA) e a segunda um sistema cromatográfico.
3. SISTEMA DE DUAS FASES AQUOSAS ACOPLADO À CROMATOGRAFIA PARA OBTENÇÃO DE ENZIMAS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por utilizar fases polímero/sal no SDFA, onde somente a fase salina deve fluir para a coluna inferior.
4. SISTEMA DE DUAS FASES AQUOSAS ACOPLADO À CROMATOGRAFIA PARA OBTENÇÃO DE ENZIMAS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por realizar etapa de purificação em resina cromatográfica, preferencialmente em resina de troca iônica.
5. SISTEMA DE DUAS FASES AQUOSAS ACOPLADO À CROMATOGRAFIA PARA OBTENÇÃO DE ENZIMAS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por um acoplamento entre as colunas através de tubo de borracha ou material constituinte da coluna, cujo fluxo é controlado por válvulas.
6. SISTEMA DE DUAS FASES AQUOSAS ACOPLADO À CROMATOGRAFIA PARA OBTENÇÃO DE ENZIMAS, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por resultar na obtenção de enzimas com alta atividade e alto grau de pureza, preferencialmente da enzima frutosiltransferase.

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