CN105505907B - 一种没食子酸脱羧酶的分离纯化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种没食子酸脱羧酶的分离纯化方法。以没食子酸为底物，通过底物诱导产生没食子酸酸脱羧酶，再经过粗提、盐析、透析、DEAE纤维素柱和葡聚糖凝胶柱纯化分离，得到了没食子酸脱羧酶样品；再通过PAGE聚丙烯酰氨凝胶电泳初步测定其分子量、MALDI‑TOF/TOF质谱鉴定对没食子酸脱羧酶的分子，本方法制备得到了没食子酸脱羧酶可降解没食子酸生产焦性没食子酸，与没食子酸为原料进行没食子酸脱羧酶方法比较，具有副产物少，污染小，对设备要求较低，生产工艺易实施，且制备得到的没食子酸脱羧酶纯度高，能够满足工业化生产的可能性。

Description

一种没食子酸脱羧酶的分离纯化的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及没食子酸脱羧酶的制备及其酶学性质研究的制备方法。
背景技术
焦性没食子酸别名焦倍酚、连苯三酚、焦倍酸，系统名“1，2，3-三羟基苯”，白色有光泽的结晶粉末，无气味，易溶于水、醇及醚，微溶于苯、氯仿和二硫化碳；在空气中易变成浅灰色，其水溶液易在空气中变暗，在碱性溶液中则更快，慢慢加热开始升华。焦性没食子酸具有极强的还原性，可发生苯环上的取代反应；能于锑、钼、铋、钛、铈、铁、金、钽等生成络合物沉淀或显色反应；其酚羟基，很易进行甲基化，能形成亲电的氢键，当加入到自由基比较活泼的单体中时，可使单体聚合速率降为零。焦性没食子酸一直在化工和化学行业具有广泛应用，如新型感光材料、抗肿瘤新药、心脑血管疾病治疗新药、治疗精神障碍药物、老年痴呆治疗药物、精细化工、轻工日化、纺织印染、微电子产业、食品保鲜、彩色印刷制版、气体分析、稀有金属分析、照相显影等。
18世纪末，Scheele首次通过干馏由没食子酸得到了焦性没食子酸，90年代开始人们采用催化剂脱羧、减压脱羧、常压脱羧等方法进行制备，20世纪70年代Hurd和Shipchandler首次利用化学方法合成了焦性没食子酸。与化学法相比，通过微生物转化进行的生物脱羧反应具有条件较温和、后处理较简单、成本较低、产率高、污染较少的优点。微生物转化法是利用微生物代谢过程中产生的某种或者某一系列的酶对底物的特定部位或者基团进行催化反应生成所需产物。没食子酸经过化学法脱羧反应后得焦性没食子酸，也可利用生物法在没食子酸脱羧酶(Gallic Acid Decarboxylases，GAD)的作用下发生脱羧反应生成焦性没食子酸(如图1)。没食子酸脱羧酶(Gallic acid decarboxylase，GAD)是在降解单宁鞣酸的第二步起催化作用的的酶，作用是将没食子酸降解成焦性没食子酸。但是，这种酶由于其对氧气敏感而不稳定，到目前为止，还没有将其纯化出来。
蛋白质通常是以复杂的混合物的形式存在于生物体中，但无论是什么蛋白质都可以找到一种适当的分离提纯方法来得到其高纯度的制品。在提取蛋白质前，需要以溶解的形式把它从所依附的生物载体中释放出来，同时不改变它的天然活性。在提取时，由于蛋白质在较高温度下会变性，故通常在常温搅拌下进行提取或超声提取。当获得蛋白质混合物提取液后，一般会用到盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法，将所需蛋白与其他杂质初步分离。进一步提纯一般使用离子交换层析、凝胶过滤、吸附层析以及亲和层析等层析方法，或者电泳法、膜过滤分级，因为利用膜技术可有效的避免因高温等因素造成的蛋白质这类活性生物大分子的失活。
离子交换层析的介质是一种可分为阳离子型和阴离子型的离子交换剂，最常用的为DEAE-纤维素和DEGE-纤维素，通常前者在pH＜8.6的情况下使用，而后者在pH＞4时用。离子交换葡聚糖基质纤维素为交联葡聚糖，凝胶过滤的介质是内部多孔的网状结构凝胶珠，根据不同分子量大小的蛋白质混合物在流经凝胶层析柱时会因其所经路径的不同而得到分离，从而导致大小分子量蛋白质的先后被洗脱出来。交联葡聚糖(Sephadex)、琼脂糖(Sephrose)和SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶(Polyacrylamide Gel)是目前常用的凝胶过滤介质。MALDI-TOF-MS(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱，英文名Matrix-Assisted LaserDesorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry)是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱，其无论是在理论上还是在设计上都是十分简单和高效的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种没食子酸脱羧酶(GAD)的分离纯化及其酶学性质的研究方法，本发明的技术方案是采用如下步骤来实现：
第一步，没食子酸脱羧酶(GAD)的粗提：由降解工艺的研究可知，为保证实验的可重现性以及后续工作的可持续性，将上文中最优工艺下的菌体细胞用含1～2mM二硫苏糖醇、50～100mM硫代硫酸钠的磷酸盐缓冲液(pH 6.0)清洗2～3次，4～6℃下超声粉碎30～60min(超声5s、间隔5s)，4～6℃下离心15～30min(10000～20000r·min-1)，即从10～20瓶的发酵液中提取得到50～200mL粗酶液，存于4～6℃下备用。
第二步，没食子酸脱羧酶(GAD)的盐析：硫酸铵沉淀法是根据不同蛋白质分子在不同浓度的盐溶液中具有不同溶解度来沉淀蛋白质的盐析方法，常用于从大量蛋白质的粗制剂中浓缩或部分纯化蛋白质。其原理主要是高浓度的盐离子与蛋白质溶液混合后可与蛋白质竞争水分子，破坏了蛋白质表面的水化膜，降低它的溶解度，使它从溶液中沉淀出来。考虑到粗酶液中GAD含量有限，本实验中采用硫酸铵固体进行盐析，为了达到较好的沉淀效果，分析了硫酸铵盐浓度、沉淀时间、pH等因素对盐析效果的影响。
第三步，没食子酸脱羧酶(GAD)的透析：该技术是一种利用选择透过性的薄膜，以外界化学位差为推动力，来实现双组分或者多组分分离过程的一项新技术。该分离过程中不发生相变，无化学变化，对能量要求低，选择性好且分离条件温和，故可将其应用在蛋白质这类活性生物大分子的提取分离技术上。由第二步中结果可知，粗酶液中的蛋白质的大概范围，根据已有文献中GAD的大概范围在50～70kD，故选择透过蛋白分子量分别为3500～5000kD、8000～14000kD的透析膜进行分离。
第四步，没食子酸脱羧酶(GAD)的PAGE聚丙烯酰氨凝胶电泳初步测定其分子量：以最晚跑出的蛋白条带10kD为基线零点，量出其余每个条带到它的平均距离，以此为横坐标X，它们所代表的分子量即为纵坐标Y，绘制标曲。为了证明GAD的确是胞内酶，故将发酵液通过蛋白分子透过分子量为3000～ 5000的半透膜将其中的蛋白进行收集，另外，将菌体细胞破碎后的溶液同时利用电泳检测。
第五步，没食子酸脱羧酶(GAD)的DEAE纤维素柱的初步纯化：装柱预处理：先称取20～40g DEAE-Cellulose树脂，用将近50～200倍体积的去离子水浸泡1h，去掉上层漂浮细粒，抽干(5～10层纱布，下同)，10～20倍体积的NaOH(0.5～1.0mol·L-1，下同)边浸泡边搅拌20～40min，抽干，去离子水冲洗至pH＝8～10，抽干，10～20倍体积的HCl(0.5～1.0mol·L-1，下同)边浸泡边搅拌30min，抽干，去离子水冲洗至中性，抽干，0.5～1.0mol·L-1的NaOH浸泡20～40min，柱子装好后用NaCl(5～10％) 洗至Cl-型的。柱子的再生：NaOH浸泡20～40min，同时玻璃棒搅拌，抽干，水洗至pH为8～10，抽干， HCl浸泡20～40min，同时玻璃棒搅拌，抽干，水洗至中性，抽干，NaOH浸泡20～40min使纤维素树脂转为OH-型，装柱后用5～10％NaCl洗脱使体系转为Cl-型。装柱：填料的时候首先在柱子中加入1/3的去离子水或者缓冲溶液，然后把柱料调成糊状(大概是1∶1～10或者再稀一点)，这样上柱没有气泡，柱料全部填充完毕后，加入去离子水或者缓冲溶液进行沉降，使柱子更加紧实，以便更好的分离蛋白质。
第六步，没食子酸脱羧酶(GAD)的葡聚糖凝胶柱的进一步纯化：预处理：将5～10g葡聚糖凝胶 (Sephadex)干粉置于50～200mL蒸馏水中，玻璃棒搅拌均匀后，在室温下浸泡10～20h，待其充分溶胀，除去悬浮在液面上的微粒，沸水煮2～5h排空，此法不仅能加快溶胀速率，而且能除去凝胶中污染的细菌，最后再用去离子水浸泡，静置过夜，为后续实验准备。不同葡聚糖凝胶(Sephadex)具有不同的孔径而截留不同分子量范围的蛋白质，本实验将选择Sephadex G-75和Sephadex G-100来截留在50kD～90kD之间的目的蛋白。分别装柱后(规格：200×20mm)，其填料高度为15～25cm。上样上述洗脱液(50～100mL)，去离子水洗脱(速率1mL·min-1)，每5～10mL收集一次，以280nm的吸收度值作出洗脱条件下的曲线。
第七步，没食子酸脱羧酶(GAD)的MALDI-TOF/TOF质谱鉴定：应用MALDI-TOF-TOF-MS对 GAD蛋白条带belt1进行肽段测序，发现该蛋白条带共100～200条肽段，对其中离子强度较大的肽段采用 MS/MS进一步的分析，对比BLAST，将这些肽段序列在NCBI数据库中分析同源性蛋白质，匹配到蛋白质。检测条件：检测器为4800Plus MALDI TOF/TOFTM Analyzer(ABI)，其MS/MS、MS的检测限分别为0.5～1.0Da、50～200ppm；以正离子、反射检测的方式进行；样品靶为384Opti-TOF(123mm×81mm ss ABI)，以CHCA为基质；同时使用分析软件为4800ExploreTM。没食子酸脱羧酶(GAD)的 MALDI-TOF/TOF质谱鉴定采用的实验步骤
第八步，没食子酸脱羧酶(GAD)的酶学性质的初步分析：酶活性的影响因素一般有温度、pH、酶浓度或者底物浓度、酶促进剂或者抑制剂。GAD是在降解单宁鞣酸的第二步起催化作用的的酶，目标是将没食子酸降解成焦性没食子酸。本发明中也将对影响GAD的各种因素进行研究，除了必要的温度、 pH、底物浓度、金属离子和添加剂外，由于接种量和发酵时间也直接影响了菌种的数量，进而影响了酶的浓度，故也在实验中作为影响因素研究，另外，磷酸盐缓冲溶液影响了金属离子的浓度，故也作为影响因素研究。酶活测定方法具体如下：即将粗酶液加入到含有没食子酸的试管中，反应一段时间后，终止反应，然后HPLC法测其中焦性没食子酸的含量。其中，终止剂为1～5％的香兰素溶于50～80％的硫酸溶液，以每20～40min生成1umol的焦性没食子酸为一个酶活力单位，计算GAD的活力。因为GAD酶活较低，为了更好的表示，将每个影响因素中酶活最大的酶活力作为100％，其余以其实际酶活相比该酶活，即相对酶活表示。
本发明中，利用硫酸盐沉淀蛋白质时，当只沉淀一次时，可选60％的硫酸铵盐，两次沉淀可选择浓度为60％～70％硫酸铵盐，才能够尽量的将蛋白质沉淀下来，20～30h为最佳盐析蛋白质的静置时间，最佳盐析pH值为6～7；由蛋白质分子量范围与含量的关系，硫酸铵盐提的蛋白质分子量主要分布在50～100 kD范围内，其中70～90kD的蛋白质含量最高，因此，采用80kD的透析膜过滤，可以截留住大分子，去除小分子的杂质，以500～1000mL料液为基准，处理的最佳时间12～16h；在利用PAGE聚丙烯酰氨凝胶电泳初步测定GAD分子量时，15～20％的分离胶的分离效果比较好，因为这个浓度的分离胶蛋白分子拖尾现象得到了改善，整个胶体背景也较为清晰；在利用DEAE-Cellulose树脂分离GAD时，pH值为 6.5缓冲溶液树脂对蛋白质的吸附量最大，NaCl溶液浓度为0.1～0.5mol·L-1时，树脂的解吸附作用在最佳；整体上，只在碱性条件下才有一定的解吸附作用；经过葡聚糖凝胶洗脱，分光光度计测得的具有最大吸光度值的洗脱液，又由考马斯亮蓝标准曲线计算，则蛋白质含量达到为50～70％；GAD纯化样品吸收波长采用全波长扫描，可以发现，纯化后的酶液在200～500nm的全波长扫描范围内，在200～280nm之间有较大的吸光度值，可见，在测定酶液浓度及降解效果时可在此范围内选择适宜的波长；应用 MALDI-TOF-TOF-MS对GAD蛋白条带进行肽段测序得出与已知蛋白质gi/334732950匹配度＞50，分子量＞45 kD，等电点＞5，可以推测GAD蛋白与已知蛋白gi/334732950具有一定的相似性，蛋白质gi/334732950可能是belt蛋白带的一个主要的肽段；在酶学性质的研究中发现，当选择5～10mg·mL-1的GAD含量，0. 3～0.7mg·mL-1的底物浓度，30～40℃的发酵温度，pH为6.0～7.0的磷酸盐缓冲溶液对没食子酸脱羧酶 (GAD)酶活力的促进作用是最强的，而金属离子对酶活力的促进作用从大到小Mg2+＞Sn2+＞Cu2+＞Zn2+＞K+＞Ca2+＞Fe2+，添加剂对酶活力的抑制作用大小为EDTA＞SDS＞Triton X-100＞Tween 20。
附图说明
附图1是焦性没食子酸制备路线图；
附图2是时间对盐析的影响图；
附图3是pH对盐析的影响图；
附图4是蛋白质含量分布图；
附图5是膜分离时间与透过液蛋白质含量的关系图；
附图6是电泳检测结果图；
附图7是缓冲液pH值对树脂吸附的影响图；
附图8是离子强度对树脂解吸附的影响图；
附图9是树脂饱和吸附量的确定图；
附图10是DEAE-Cellulose分离柱洗脱分离结果图；
附图11是DEAE-Cellulose分离柱分离结果的电泳图；
附图12是葡聚糖凝胶层析分离柱洗脱结果图；
附图13是葡聚糖凝胶层析分离柱洗脱结果的SDS-PAGE电泳图；
附图14是belt1的MALDI-TOF-MS图谱图；
附图15是A-E)belt1的肽段MS/MS图谱图；
附图16是GAD含量对酶活力的影响图；
附图17是底物浓度含量对酶活力的影响图；
附图18是温度含量对酶活力的影响图；
附图19是磷酸盐缓冲溶液含量对酶活力的影响图；
附图20是pH对酶活力的影响图；
附图21是金属离子对酶活力的影响图；
附图22是添加剂对酶活力的影响图。
具体实施方式
以下实施例为本发明的一些举例，不应被看做是对本发明的限定。
实施例1没食子酸脱羧酶(GAD)的粗提
没食子酸脱羧酶(GAD)为胞内酶，即通过生物细胞产生于细胞内，为获得胞内酶，为得到粗酶液最简单有效的方法即使将细胞粉碎后离心。由降解工艺的研究可知，为保证实验的可重现性以及后续工作的可持续性，将上文中最优工艺下的菌体细胞用含1mM二硫苏糖醇、50mM硫代硫酸钠的磷酸盐缓冲液 (pH 6.0)清洗2次，4℃下超声粉碎45min(超声5s、间隔5s)，4℃下离心20min(10000r·min-1)，即从12瓶的发酵液中提取得到100mL粗酶液，存于4℃下备用。
实施例2没食子酸脱羧酶(GAD)的盐析
盐浓度对盐析的影响：取8个18×180mm试管，分别加入硫酸铵1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、 8.0g，加入10mL蒸馏水溶解，玻璃棒搅拌均匀，使其充分溶解，然后分别加入2mL GAD粗酶液，封口后静放于冰箱中过夜后估测出絮状物的量。由表1可见，硫酸铵浓度在20％～60％时絮状物的量呈持续增加的趋势，在60％～80％之间时沉淀量基本趋于平稳，当只沉淀一次时，可选60％的硫酸铵盐，两次沉淀可选择浓度为60％和70％硫酸铵盐，才能够尽量的将蛋白质沉淀下来。
沉淀时间对盐析的影响：取5个18×180mm试管，分别加入5g(NH4)2SO4，加入10mL蒸馏水溶解再充分摇匀，分别加入粗酶液2mL，分别在冰箱中静置5、8、12、18、24h后离心，称出沉淀的量。由图 2可见，蛋白质的沉淀量随着盐析时间的增加呈上升的趋势，但在时间大于24h后，沉淀量波动不大，故选24h为最佳盐析蛋白质的静置时间。
缓冲液pH对盐析的影响：取5个18×180mm试管，分别加入10mL不同pH的缓冲溶液和5g (NH4)2SO4充分摇匀，再分别加入粗酶液2mL，4℃下过夜，称出离心后沉淀的量。由图3可见，缓冲液pH 值能显著影响盐析的效果，沉淀量在pH值为6时最大，大于7时明显下降，因此，最佳盐析pH值为6。
实施例3没食子酸脱羧酶(GAD)的透析：由第二步中结果可知，粗酶液中的蛋白质的大概范围在 50～70kD，故选择透过蛋白分子量分别为3500～5000kD、8000～14000kD的透析膜进行分离。由图4可见，硫酸铵盐提的蛋白质分子量主要分布在50～100kD范围内，其中70～90kD的蛋白质含量最高。因此，采用80kD的透析膜过滤，可以截留住大分子，去除小分子的杂质。利用80kD大小的的透析膜过滤，以 500mL料液为基准考察时间的影响。由图5可见，透过液中蛋白质的含量随着时间的增加呈下降的趋势，在前6h，下降的不明显，8～16h时急剧下降，后趋于平稳。但是，样液是能够在16h内完全通过膜的，所以，膜分离500mL料液时，处理的最佳时间在12～16h的范围内选择。
实施例4没食子酸脱羧酶(GAD)的PAGE聚丙烯酰氨凝胶电泳初步测定其分子量：以最晚跑出的蛋白条带10kD为基线零点，量出其余每个条带到它的平均距离，以此为横坐标X，它们所代表的分子量即为纵坐标Y，绘制标曲。将菌体细胞破碎后的溶液同时利用电泳检测，由图6(a)可见，Marker左侧为经过半透膜的发酵液，右侧为菌体细胞破碎后的溶液，在细胞破碎液中检测到了大量的蛋白质，一部分为菌体本身的但也有一部分是GAD的疑似蛋白，因为有研究者分离到了50～70kD范围内的GAD，而本实验中未经纯化的细胞破碎液中在此范围内是有蛋白分布的，为了下一步的纯化分离效果更好，本实验中配制了两种不同浓度的分离胶进行检查，由图6(b)和(c)可见，其中图b为利用10％的分离胶进行的，其左侧4个泳道为菌体细胞破碎的粗酶液，右侧六个泳道均为牛肉血清蛋白；图6(c)为利用15％的分离胶进行的，其左侧为牛肉血清蛋白，右侧为菌体细胞破碎的粗酶液。从结果中很容易看出，15％的分离胶的分离效果比较好，因为这个浓度的分离胶蛋白分子拖尾现象得到了改善，整个胶体背景也较为清晰。
实施例5没食子酸脱羧酶(GAD)的DEAE纤维素树脂初步纯化
DEAE-Cellulose树脂静态解吸附影响因素的确定
样品缓冲液pH值的影响：分别称取0.2g的DEAE-Cellulose树脂于12个10mL的离心管与0.5mL 粗蛋白样液混合，并分别加入4.5mL不同pH的缓冲液，玻璃瓶搅拌均匀，常温下振荡2h、离心、测定上清液的吸光度值。不同pH值的缓冲溶液下，树脂对蛋白质吸附量的影响，由图7可见，离心后上清液的吸光值最低的在pH值为6.5的管中，此时树脂对蛋白质的吸附量最大。
洗脱液pH值的影响：分别称取0.2g的DEAE-Cellulose树脂于12个10mL的离心管与0.5mL粗蛋白样液混合，并分别量取4.5mL pH值为7.5的缓冲液加入离心管后，摇匀，放置在摇床上常温振荡2h后进行离心，去除上清液，分别取不同pH值的0.14mol·L-1的NaCl溶液加入到12个离心管中，玻璃瓶搅拌均匀，常温下振荡2h、离心、测定上清液的吸光度值。由图8可见，离子强度的增加，树脂的解吸附作用在 NaCl溶液浓度为0.4mol·L-1时最佳，可作洗脱剂。
离子强度的影响：分别称取0.2g的DEAE-Cellulose树脂于10个10mL的离心管与0.5mL粗蛋白样液混合，并分别量取4.5mL pH值为7.5的缓冲液加入离心管后，摇匀，放置在摇床上常温振荡2h后进行离心，去除上清液，分别取浓度为的0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.8、1.0mol·L-1的NaCl溶液加入到10个离心管中，玻璃瓶搅拌均匀，常温下振荡2h、离心、测定上清液的吸光度值。由表2可见，洗脱液的酸碱度并不能显著影响树脂的解吸附，但整体上，只在碱性条件下才有一定的解吸附作用。
测定树脂的饱和吸附量：分别称取0.2g的DEAE-Cellulose树脂于5个10mL的离心管与0.5、1、1.5 mL粗蛋白样液混合，并分别加入4mL不同pH的缓冲液，玻璃瓶搅拌均匀，常温下振荡2h、离心、280nm 下测定上清液的吸光度值，根据方程：Y＝4.8485X+0.4865，计算蛋白质含量。由图9可见，蛋白质的吸附量随着样品量的增加先增大后减小，但在GAD样品溶液达到1.5mL时，吸光度却达到最小，说明此时树脂对蛋白质的吸附能力已达到的最大，所以，计算得出此种树脂对GAD蛋白质的饱和吸附量是1.5mL/0.2g，即2.838mg/g。
动态解吸附曲线：根据DEAE-Cellulose树脂静态吸附的条件，装填以DEAE-cellulose 52为基质的纤维素树脂柱(规格：30×300mm)，其填料高度为15cm，上样量为10mL(约20mg)。首先用pH值为7.5的磷酸盐缓冲液淋洗至接出液的pH值达到一个较为稳定，然后用0.4mol·L-1pH值为5.5的NaCl溶液洗脱(2mL·min-1速率)，每次收集5mL，检测280nm下吸收度，并绘制洗脱曲线。结果由图10可见。其中，图(a)表示第1根DEAE-Cellulose分离柱，图示说明：样品溶液经过此分离柱后，在280nm的波长下，在洗脱到第13管(即洗脱溶液体积达到65mL，以此类推)之前，吸光度的波动不大；在第14管到第18管之间，其吸光度达到峰值，第15管与第17管时，具有较大的吸光度值，说明此时的蛋白质含量最多，因此可以将此时的溶液作为下一步纯化分离的样品溶液；在第19管之后，吸光度值急剧减小，之后的波动也不明显，说明此后的溶液中蛋白质含量较少；故此次的柱分离取用第15管和第17管。图(b)为同一样品溶液在经过第2根同样的DEAE-Cellulose分离柱后的图示，在310mL的洗脱液洗脱后，可以发现，在洗脱到第16管(即洗脱剂体积达到80mL，以此类推)之前和大于第28管之后的，溶液的吸光度值都有相对较小的波动，在第21管时达到最大的吸光度值，因此此时的溶液作为下一步分离纯化的样品溶液。综上，在经过了该分离柱后，得到了3个样品溶液，即第1根柱的第15管和第17管，以及第2根柱的第21管，其电泳分析结果如图11所示，其中，泳道1代表Marker，泳道2代表第1根柱的第15管，泳道3代表第1根柱的第17 管，泳道4代表第2根柱的第21管，3个泳道的图谱基本相同，说明其溶液成分基本相同，另外，由于泳道背景较重且较多的细线，说明溶液含有较多的杂质还需要进一步的分离纯化。
实施例6没食子酸脱羧酶(GAD)的葡聚糖凝胶柱的进一步纯化
上样上述洗脱液(50mL)，去离子水洗脱(速率1mL·min-1)，每5mL收集一次，以280nm的吸收度值作出洗脱条件下的曲线。由DEAE-Cellulose分离柱的分离结果，该部分的样品溶液为第1根柱的第15管和第17管，以及第2根柱的第21管，其经过葡聚糖凝胶层析分离后的洗脱结果分别由图12中(a)、(b)、 (c)可见，它们的洗脱结果都相对较好，图12(a)中在洗脱到第3管时，吸光度值达到最大，且相邻的样品溶液的吸光度比较小，说明在此时的蛋白质含量较高，且分离效果很好，尽管后来的样品中出现了小范围的波动，产生了另外的吸收峰，但相对来说，第3管的吸光度值仍是最大的，说明该样品可以作为进行下一步分析的样品溶液；图12(b)中在洗脱到第3管时，吸光度值达到最大，且相邻的样品溶液的吸光度比较小，说明在此时的蛋白质含量较高，且分离效果很好，尽管后来的样品中出现了小范围的波动，但整体上在峰值之后是趋于稳定的，因此此时的第3管可以作为进行下一步分析的样品溶液；图12(c)中在洗脱到第3管时，吸光度值达到最大，相邻的10mL即第2管时，其吸光度值与第3管的接近，说明两管的蛋白质含量差不多，其他管的吸光度值相对来说虽有轻微的波动，但整体上看在峰值之后也是基本趋于稳定的，因此，该样品的第2管和第3管溶液可以作为下一步分析的样品溶液。综上，经过葡聚糖凝胶层析柱洗脱分离后，取得的可以进行下一步分析的样品溶液为第1根柱的第15管的第3管即图12(a)的第3管，第1根柱的第17管的第3管即图12(b)的第3管，第2根柱的第21管的第2和第3管即图12(c)的第2和第3管。为了更清楚的说明上述样品溶液的成分，也为下一步进行氨基酸一级结构鉴定进行准备，分别将上述样品溶液在SDS-PAGE电泳上进行谱图分析，结果由图13可见，其中泳道1是第1根柱的第15管的第3管即图12(a)的第3管，泳道2是第1根柱的第17管的第3管即图图12(b)的第3管，泳道3和4分别是第2根柱的第21管的第2和第3管即图图12(c)的第2 和第3管，泳道5是Marker对照品。从图中，可以发现，除了泳道5，其余的泳道虽然样品不同，但都有一条色谱带特别明显，位于Marker中的第2和第3条带即130kD和100kD之间，其分子量约为115kD；除此之外，在泳道1中可以很明显的看出，在Marker的第3和第4条带即100kD和70kD之间也有2～3条条带，在第4和第5条带即70kD和50kD之间也有一条条带，其分子质量约为60kD，该分子量与文献中报道纯化出的GAD的分子质量为52kD十分接近。
实施例7 GAD蛋白条带belt1的质谱结构解析
应用MALDI-TOF-TOF-MS对GAD蛋白条带belt1进行肽段测序，结果由图14可见，发现该蛋白条带共102条肽段，对其中5个离子强度较大，即m/z分别为：988、1050、1206、1786、1928的肽段采用MS/MS 进一步的分析，结果由图15可见，对比BLAST，将这5条肽段序列在NCBI数据库中分析同源性蛋白质，结果匹配到蛋白质gi/334732950，物种为enolase(Enterobacter aerogenes KCTC2190)，即特异性烯醇化酶 (产气肠杆菌KCTC2190)匹配度53(大于37即成功鉴定)，分子量45.62kD，等电点5.19。因此可以推测 GAD蛋白与已知蛋白gi/334732950具有一定的相似性。但是，GAD蛋白质的全序列在MASCOT中的匹配结果由表3可见，其匹配到的序列组由下划线标出，结果表明，序列匹配仅占整个序列的3％。因此，我们认为已知蛋白质gi/334732950可能是belt1蛋白带的一个主要的肽段。由于GAD蛋白与已知蛋白 gi/334732950仍存在较大差异，可能是一种新的蛋白酶。
实施例6没食子酸脱羧酶(GAD)的酶学性质的初步分析
GAD的底物专一性考察：为了考察GAD的底物专一性，取5mg·mL-1的GAD 1mL分别加入到含有1mL 0.4mg·mL-1的没食子酸、苯甲酸、邻氨基苯甲酸、原儿茶酸、3，5-二羟基苯甲酸、龙胆酸溶液中，30℃水浴下反应2h，立即取2mL终止剂终止反应，充分震荡，待溶液混合冷却至室温，HPLC法测定其中焦性没食子酸的含量。以其中酶活最高者为100％，计算其余不同GAD含量对酶活的影响。结果由下表4可见。另外，该结果也与文献参考中GAD的酶活影响中一直采用没食子酸作为其唯一底物相对应。因此，对于GAD酶学性质的后期考察中应以没食子酸作为底物。
GAD含量对酶活力的影响：为了考察GAD含量对酶活的影响，分别取1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10mg·mL-1的GAD各1mL加入到1mL 0.4mg·mL-1的没食子酸溶液中，30℃水浴下反应2h，立即取2mL终止剂终止反应，充分震荡，待溶液混合冷却至室温，HPLC法测定其中焦性没食子酸的含量。以其中酶活最高者为100％，计算其余不同GAD含量对酶活的影响。结果由图16可见，在GAD含量为5 mg·mL-1前，随着GAD含量的增加，酶活力逐渐增加，并在5mg·mL-1时达到了最大的酶活力，而后出现了轻微的波动，最后处于较为稳定的状态。因此，该结果说明该GAD浓度与实验中的底物浓度是对应的，在后续实验中可选择5mg·mL-1的GAD含量进行后续实验。
底物浓度对酶活力的影响：为了考察底物浓度对酶活的影响，分别取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、 0.7、0.8、0.9mg·mL-1的没食子酸各1mL加入到1mL 0.2％的没食子酸溶液中，30℃水浴下反应2h后，立即取2mL终止剂终止反应，充分震荡，待溶液混合冷却至室温，HPLC法测定其中焦性没食子酸的含量。以其中酶活最高者为100％，计算其余不同GAD含量对酶活的影响。结果由图17可见，底物浓度为 0.7mg·mL-1时酶活力最大，将其酶活力定为100％。在底物浓度为0.1～0.2mg·mL-1时，酶活力随着底物浓度的增大变化不大；在0.3～0.4mg·mL-1时增长较大，可能是此时底物浓度较低，且增加的底物也部分的改变着溶液中的pH；但在0.5～0.6mg·mL-1时减小了，可能是当底物浓度增大的程度并没有达到溶液反应的最适pH且又因高浓度的底物而抑制了酶的活性；而当底物浓度达到0.7mg·mL-1时，酶活力最大，可能是由于此刻的底物浓度并没有因为高浓度而抑制了酶活力反而因其对溶液pH的改变正是其最佳降解效果时的pH而达到了最大酶活力；当底物浓度大于0.7mg·mL-1后，同上，不是最适pH且高浓度底物将酶活完全抑制，故此后的酶活力为0。因此，此后的实验中选择0.4mg·mL-1进行后续实验。
温度对酶活力的影响：为了考察温度对酶活的影响，取1mL 0.5mg·mL-1的GAD加入到1mL没食子酸含量为0.4mg·mL-1的溶液中，然后在20、25、30、35、40、45、50℃水浴下反应2h后，立即取 2mL终止剂终止反应，充分震荡，待溶液混合冷却至室温，HPLC法测定其中焦性没食子酸的含量。以其中酶活最高者为100％，计算其余不同GAD含量对酶活的影响。结果由图18可见，在温度为35℃时，达到了最大的酶活力，而在20～35℃时随着温度的升高酶活力有轻微的波动，但大致的情况还是增大的，而在40℃时酶活力下降，可能是因为此刻的温度对于对于GAD过高了，影响GAD功能集团的解离状态，影响了其与底物的亲和性，故在高于此温度之后酶活力基本为0，故此后的实验中选择35℃。
磷酸盐缓冲溶液含量对酶活力的影响：为了考察磷酸盐缓冲溶液含量对酶活的影响，取1mL 0.5 mg·mL-1的GAD加入到1mL没食子酸含量为0.4mg·mL-1的溶液中，然后，分别向其中加入30mM的磷酸盐缓冲溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL，然后在30℃水浴下反应2.0h后，立即取2mL终止剂终止反应，充分震荡，待溶液混合冷却至室温，HPLC法测定其中焦性没食子酸的含量。以其中酶活最高者为100％，计算其余不同GAD含量对酶活的影响。结果由图19可见，当磷酸盐缓冲溶液的浓度由5 mg·mL-1增加到55mg·mL-1时，酶活力在浓度为35mg·mL-1时达到最大，先逐渐增加，后逐渐减小。说明此时的磷酸盐缓冲溶液浓度与金属离子的共同作用下，对酶活的促进作用是最强的。
初始pH对酶活力的影响：为了考察初始pH对酶活的影响，取1mL0.5mg·mL-1的GAD加入到 1mL没食子酸含量为0.4mg·mL-1的溶液中，分别加入pH为5.2、5.6、6.0、6.4、6.8、7.2、7.6的磷酸盐缓冲溶液1mL，然后在30℃水浴下反应2.0h后，立即取2mL终止剂终止反应，充分震荡，待溶液混合冷却至室温，HPLC法测定其中焦性没食子酸的含量。以其中酶活最高者为100％，计算其余不同GAD 含量对酶活的影响。结果由图20可见，在所加入的磷酸盐缓冲溶液的pH为6.0时，酶活力最大，加入的磷酸盐缓冲溶液pH小于6.0时，随着pH的增大，酶活力逐渐增加；加入的磷酸盐缓冲溶液pH大于6.0 时，酶活力逐渐减小。因此，GAD的最适pH即为加入pH为6.0的磷酸盐缓冲溶液后的pH。
金属离子对酶活力的影响：为了考察金属离子对酶活的影响，取1mL 0.5mg·mL-1的GAD加入到1mL没食子酸含量为0.4mg·mL-1的溶液中，分别加入0.2mol·L-1的Mg2+、Zn2+、K2+、Fe2+、Cu2+、Sn2+、Ca2+，30℃水浴下分别反应2.0h后，立即取2mL终止剂终止反应，充分震荡，待溶液混合冷却至室温，HPLC法测定其中焦性没食子酸的含量。以其中酶活最高者为100％，计算其余不同GAD含量对酶活的影响。结果由图21可见，在所添加的金属离子中，Mg2+的酶活力最大，以其酶活为100％，则其余金属离子对酶活力的促进作用从大到小Mg2+＞Sn2 +＞Cu2+＞Zn2+＞K+＞Ca2+＞Fe2+，与文献报道中相一致。
添加剂对酶活力的影响：为了考察添加剂对酶活的影响，取1mL 0.5mg·mL-1的GAD加入到1mL 没食子酸含量为0.4mg·mL-1的溶液中，分别加入1mL Triton X-100、SDS、EDTA、Tween-20后，30℃水浴下分别反应2.0h后，立即取2mL终止剂终止反应，充分震荡，待溶液混合冷却至室温，HPLC法测定其中焦性没食子酸的含量。以其中酶活最高者为100％，计算其余不同GAD含量对酶活的影响。结果由图22可见，pure代表未加入添加剂的对照实验组，对比表明添加剂对酶活力的抑制作用大小为EDTA＞ SDS＞Triton X-100＞Tween 20，他们的加入使得GAD的失去了部分酶活力。因此，为了消除其影响，并获得最大的酶活力，需要在实际的实验中将其去除。另外，一些氧化性的化合物也会抑制酶的活性如K2CrO4、 (NH4)2S2O8、H2O2可完全的抑制酶的活性。
表1盐浓度对盐析的影响
表2洗脱液pH值对树脂解吸附的影响
表3 belt1的蛋白全序列
表4 GAD的底物专一性

Claims (4)

1.一种没食子酸脱羧酶的分离纯化方法，其步骤如下：
第一步，没食子酸脱羧酶(GAD)提取：将菌体细胞用含1～2mM二硫苏糖醇、50～100mM硫代硫酸钠且pH为6.0的磷酸盐缓冲液清洗2～3次，4～6℃下超声粉碎30～60min，超声5s，间隔5s，4～6℃下离心15～30min，转速10000～20000r·min-1，即从10～20瓶的发酵液中提取得到50～200mL酶液，存于4～6℃下备用；
第二步，没食子酸脱羧酶的盐析：将固体硫酸铵盐加入到酶液中，第一次沉淀时硫酸铵盐浓度为60％，第二次沉淀时硫酸铵盐浓度为70％，盐析蛋白质的静置时间为20～30h，盐析pH值为6；
第三步，没食子酸脱羧酶的透析：加去离子水使蛋白质分子脱离到溶液中，采用80kD的透析膜过滤，截留住大分子，去除小分子的杂质，以500～1000mL料液为基准，处理的时间12～16h；
第四步，没食子酸脱羧酶的PAGE聚丙烯酰氨凝胶电泳初步测定其分子量：将菌体细胞破碎后的溶液同时利用PAGE聚丙烯酰氨凝胶电泳初步测定GAD分子量时，采用15％的分离胶分离蛋白质，比对标准品，蛋白质分子量大小在50kD以上；
第五步，没食子酸脱羧酶的DEAE纤维素柱的初步纯化：将样品缓冲液pH调节至6.5后上样，然后用pH为7.5的磷酸盐缓冲液淋洗至接出液的pH值达到较为稳定的状态，接着用0.4mol·L-1pH值为8的NaCl溶液洗脱，以2mL·min-1的速率洗脱，每5mL收集一次，在280nm波长下检测其吸光度，并绘制洗脱曲线；
第六步，没食子酸脱羧酶的葡聚糖凝胶柱纯化：葡聚糖凝胶柱选择SephadexG-75和SephadexG-100来截留在50～90kD之间的目的蛋白，柱子规格：200×20mm，分别填料，其填料高度为15～25cm，使用第五步获得的洗脱液上样，上样量为50～100mL，去离子水洗脱，以1mL·min-1的速率洗脱，每5mL收集一次，在280nm波长下检测其吸光度，并绘制洗脱曲线；
第七步，没食子酸脱羧酶的MALDI-TOF/TOF-MS鉴定：应用MALDI-TOF/TOF-MS对GAD蛋白条带belt1进行肽段测序，得到102条肽段，对其中m/z分别为：988、1050、1206、1786、1928的5个离子强度较大的肽段，采用MS/MS进一步的分析，比对BLAST，将这些肽段序列在NCBI数据库中分析同源性蛋白质，匹配到蛋白质；
第八步，没食子酸脱羧酶的活性测定：将粗酶液加入到含有没食子酸的试管中，反应一段时间后，终止反应，然后HPLC法测其中焦性没食子酸的含量，其中，终止剂为1～5％的香兰素溶于50～80％的硫酸溶液，以每20～40min生成1μmol的焦性没食子酸为一个酶活力单位，计算GAD的活力。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，第一步中菌体细胞是在发酵温度为32℃，发酵液初始pH为6，底物浓度为0.4％，接种量为5％，磷酸盐缓冲溶液含量为25％且pH为6.6的条件下获得的。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，第五步中DEAE纤维素柱树脂静态吸附的条件为：装填以DEAE-cellulose52为基质的纤维素树脂柱，柱子规格：30×300mm，其填料高度为15～20cm，上样量为10～20mL，共20～30mg。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，第七步中检测条件：检测器为4800PlusMALDI TOF/TOFTMAnalyzer，其中MS/MS、MS的检测限分别为0.5～1.0Da、50～200ppm；以正离子、反射检测的方式进行；样品靶为384Opti-TOF，以CHCA为基质；同时使用的分析软件为4800ExploreTM。
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"Purification and Characterization of Gallic Acid Decarboxylase from Pantoea agglomerans T71";mitsuhiro zeida et al;《applied and environmental microbiology》;19981231;第64卷(第12期);第4743-4747页，尤其是第4743页右栏第1-13行、34-40行，，
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