CN112921046A - 一种可溶性人肿瘤坏死因子ⅱ型受体蛋白的制备方法 - Google Patents
一种可溶性人肿瘤坏死因子ⅱ型受体蛋白的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种可溶性人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体蛋白的制备方法；其主要包括构建shTNFR2的重组表达载体、转化大肠杆菌获得重组菌实现原核表达、菌体裂解获得包涵体沉淀、包涵体沉淀的洗涤和蛋白变性处理、稀释复性处理以及纯化处理；其中，在构建重组表达载体步骤中，采用特定的引物扩增shTNFR2全长蛋白的基因片段，面对随之带来的纯化操作中的困难，发明人做了大量的优化，发现在蛋白变性处理后，依次加入DTT和氧化型谷胱甘肽至特定浓度，对变性蛋白先后进行还原和氧化处理；在此基础之上，稀释复性步骤中，采用特定pH值和盐浓度的复性缓冲液进行复性处理，最终获得的纯化后的shTNFR2蛋白具有高纯度和较强的生物学活性。
Description
技术领域
本发明涉及一种可溶性人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体蛋白的制备方法，属于生物技术领域。
背景技术
人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体(human tumor necrosis factor receptor typeⅡ，hTNFR2)是TNF受体超家族的重要成员之一，它和hTNFR1都是TNF-α(或TNF-β)的受体。TNF-α通过与hTNFR1/hTNFR2的特异性结合参与免疫调节、炎症、凋亡和自身免疫等生理和病理过程。
hTNFR1和hTNFR2都是Ⅰ型跨膜蛋白，由胞外区、跨膜段和胞内段构成。hTNFR2的胞内段没有死亡结构域，它在与TNF结合后大多数情况下通过激活非经典的促存活NF-κB信号通路来调控细胞的存活和修复过程。
近年来研究发现，hTNFR2高表达于某些癌细胞表面并可促进其增长，如卵巢癌、结肠癌、多发性骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤和皮肤非霍奇金淋巴瘤等。同时，hTNFR2亦在肿瘤微环境中富集的CD4+FoxP3+免疫抑制调节性T细胞(Treg)表面异常表达，通过TNF刺激传递的信号增加Treg的扩张性、稳定性和功能，抑制抗肿瘤免疫反应，是肿瘤免疫逃逸的主要机制之一。因此，hTNFR2正逐渐成为许多肿瘤免疫治疗的重要靶点，针对hTNFR2+肿瘤开发靶向hTNFR2的抗体或小分子拮抗剂越来越受到人们的关注。(参考文献：H.Torrey,J.Butterworth,T.Mera,Y.Okubo,L.Wang,D.Baum,A.Defusco,S.Plager,S.Warden,D.Huang,E.Vanamee,R.Foster,D.L.Faustman.Targeting TNFR2 with antagonisticantibodies inhibits proliferation of ovarian cancer cells and tumor-associated Tregs.Science signaling.2017,10)
hTNFR的胞外区是与TNF结合的区域，研究发现，hTNFR胞外段在体内可被酶解剪切而游离分泌出去，形成可溶性的hTNFR(shTNFR，Soluble human tumor necrosis factorreceptor)，shTNFR能够中和体液中的过量TNF-α，抑制和局限TNF-α的活性，在细胞因子网络中有重要的调节作用，例如，一定浓度的shTNFR可以减轻关节炎等疾病的局部炎症(参考文献：Gatto B.Biologics targeted at TNF:design,production andchallenges.Reumatismo.2006,58:94-103)。
可以看出，无论是作为肿瘤免疫治疗的药物靶点，还是用于开发治疗TNF-α相关炎症性疾病的大分子生物制剂，在医药实验室和工业上都需要制备大量的shTNFR2蛋白。
现有技术中，shTNFR2蛋白的制备主要采用真核表达系统(如CHO细胞)，但需要耗费大量昂贵的哺乳动物细胞培养基，生长条件复杂，蛋白表达量低，生产周期也较长。由此，本领域技术人员希望能够采用成本更低、操作更为简便快捷的原核表达系统来制备shTNFR2蛋白；但具体到shTNFR2蛋白，若采用现有的原核表达系统来制备，后续的提取和纯化过程存在很大的技术困难，不仅蛋白的提取量很低，并且提取出来的蛋白的纯度和生物学活性均很低，没有实际的应用价值。
因此，亟待开发出新的可溶性人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体蛋白(shTNFR2蛋白)的制备方法，采用原核表达系统对shTNFR2全长蛋白进行重组表达，能够获得更高纯度和生物学活性的shTNFR2蛋白。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明一方面提供了一种可溶性人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体蛋白的制备方法，其中，
该制备方法包括以下步骤：
步骤1)：构建可溶性人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体蛋白shTNFR2的重组表达载体；
步骤2)：将步骤1)获得的所述重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，获得重组菌，并诱导所述重组菌的蛋白表达；
步骤3)：收集步骤2)获得的经诱导表达的重组菌，经菌体裂解处理后，获得包涵体沉淀；
步骤4)：对步骤3)获得的所述包涵体沉淀依次进行洗涤处理和蛋白变性处理，获得shTNFR2变性蛋白液；
步骤5)：将步骤4)获得的所述shTNFR2蛋白变性液进行稀释复性处理获得复性蛋白液；
步骤6)：对步骤5)获得的所述复性蛋白液进行纯化处理获得所述shTNFR2蛋白；
其中，所述步骤1)中，采用PCR扩增shTNFR2基因片段；所使用的PCR上游引物序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物序列如SEQ ID NO:2所示；
所述步骤4)中，所述包涵体沉淀依次进行洗涤处理和蛋白变性处理后，再加入DTT至终浓度20～30mM，充分搅拌40-60min，之后再加入氧化型谷胱甘肽至终浓度30～40mM，充分搅拌40-60min，离心收集上清液，获得所述的shTNFR2变性蛋白液；
所述步骤5)中，所述稀释复性处理所使用的复性缓冲液的pH值为10.0～10.5，盐浓度为20～50mmol/L，稀释比例为1:50～1:100。
优选的，所述步骤4)中，所述蛋白变性处理所使用的变性缓冲液的pH值为8～8.5，其含有50～100mmol/L Tris-HCl、6mol/L Gua-HCl、5-10mmol/L EDTA和1～2mmol/L PMSF。
优选的，所述复性缓冲液含有20～50mmol/L Tris-HCl、20～50mmol/L NaCl、0.5～1mmol/L GSH、1～2mmol/L PMSF和1～2mmol/L EDTA。
优选的，所述步骤4)中，对所述包涵体沉淀的洗涤处理的过程为：采用第一洗涤缓冲液洗涤3-4次，再采用第二洗涤缓冲液洗涤1次；
第一洗涤缓冲液的pH为7～8，含有20～50mmol/L Tris-HCl、150～300mmol/LNaCl、1～5mmol/L EDTA、1mmol/L DTT和0.5vol％Triton X-100；
第二洗涤缓冲液的pH为7～8，含有20～50mmol/L Tris-HCl、150～300mmol/LNaCl、1～5mmol/L EDTA和1mmol/L DTT。
优选的，所述冰浴超声采用的功率为200W，每次工作时长为5秒，间隔时长为8秒。
优选的，所述步骤1)中，构建的所述重组表达载体在shTNFR2基因片段的N端添加了His-TEV标签序列。
优选的，所述步骤6)中的纯化处理包括依次进行的镍柱亲和层析处理和凝胶过滤层析处理。
优选的，所述镍柱亲和层析处理的过程为：对所述复性蛋白液进行第一次镍柱亲和层析，收集到带有His标签的shTNFR2蛋白洗脱液；再向所述洗脱液中加入TEV蛋白酶对所述His标签进行酶切，获得酶切反应液，再进行第二次镍柱亲和层析，收集不带His标签的shTNFR2蛋白洗脱液。
优选的，所述第一次镍柱亲和层析的过程为：将通过微孔滤膜过滤后的所述复性蛋白液上样于平衡过的Ni-NTA重力层析柱，先用含有50mmol/L咪唑的镍柱层析缓冲液流过镍柱冲洗杂蛋白，再用含有500mmol/L咪唑的镍柱层析缓冲液流过镍柱，获得带有His标签的shTNFR2蛋白洗脱液；
所述第二次镍柱亲和层析的过程为：去除所述酶切反应液中的咪唑后，上样于平衡过的Ni-NTA重力层析柱，使用不含咪唑的镍柱层析缓冲液流过镍柱，获得不带His标签的shTNFR2蛋白液。
优选的，所述凝胶过滤层析处理采用分子筛层析柱Superdex 75 10/300GL。
本发明涉及一种可溶性人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体蛋白的制备方法；其主要包括构建shTNFR2的重组表达载体、转化大肠杆菌获得重组菌实现原核表达、菌体裂解获得包涵体沉淀、包涵体沉淀的洗涤和蛋白变性处理、稀释复性处理以及纯化处理六个步骤；其中，在构建重组表达载体步骤中，采用特定的引物扩增shTNFR2全长蛋白的基因片段，面对随之带来的后续纯化操作中的技术困难，发明人做了大量的优化试验，发现在包涵体沉淀洗涤和蛋白变性处理后，依次加入DTT和氧化型谷胱甘肽至特定浓度，并充分搅拌一段特定的时间，对变性蛋白先后进行还原和氧化处理；在此基础之上，稀释复性步骤中，采用特定pH值(10.0～10.5)和盐浓度(20～50mmol/L)的复性缓冲液进行复性处理，最终获得的纯化后的shTNFR2蛋白具有高纯度和较强的生物学活性。
附图说明
图1为本发明实施例1的步骤2)中shTNFR2蛋白在大肠杆菌中诱导表达的SDS-PAGE结果图；
图2为本发明实施例1的步骤3)中菌体裂解后的shTNFR2蛋白表达分布以及步骤4)中包涵体沉淀经蛋白变性后的SDS-PAGE结果图；
图3为本发明实施例1的步骤6)中镍柱亲和层析处理中各个阶段的shTNFR2蛋白洗脱液的SDS-PAGE结果图；
图4为本发明实施例1的步骤6)中凝胶过滤层析处理获得的shTNFR2蛋白洗脱液的紫外吸收峰图谱；
图5为本发明实施例1的步骤6)中凝胶过滤层析处理获得的shTNFR2蛋白洗脱液的电泳分析结果图；
图6为本发明实施例1的最终获得的shTNFR2蛋白经浓缩后的电泳分析结果图；
图7为本发明实施例1最终获得的纯化后shTNFR2与TNF-α亲和力的MST检测结果图。
具体实施方式
在本发明的一个具体实施方案中，提供了一种可溶性人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体蛋白的制备方法，其中，
该制备方法包括以下步骤：
步骤1)：构建可溶性人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体蛋白shTNFR2的重组表达载体；
步骤2)：将步骤1)获得的所述重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，获得重组菌，并诱导所述重组菌的蛋白表达；
步骤3)：收集步骤2)获得的经诱导表达的重组菌，经菌体裂解处理后，获得包涵体沉淀；
步骤4)：对步骤3)获得的所述包涵体沉淀依次进行洗涤处理和蛋白变性处理，获得shTNFR2变性蛋白液；
步骤5)：将步骤4)获得的所述shTNFR2蛋白变性液进行稀释复性处理获得复性蛋白液；
步骤6)：对步骤5)获得的所述复性蛋白液进行纯化处理获得所述shTNFR2蛋白；
其中，所述步骤1)中，采用PCR扩增shTNFR2基因片段；所使用的PCR上游引物序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物序列如SEQ ID NO:2所示；
所述步骤4)中，所述包涵体沉淀依次进行洗涤处理和蛋白变性处理后，再加入DTT至终浓度20～30mM，充分搅拌40-60min，之后再加入氧化型谷胱甘肽至终浓度30～40mM，充分搅拌40-60min，离心收集上清液，获得所述的shTNFR2变性蛋白液；
所述步骤5)中，所述稀释复性处理所使用的复性缓冲液的pH值为10.0～10.5，盐浓度为20～50mmol/L，稀释比例为1:50～1:100。
如背景技术中所阐述的，本领域技术人员希望能够采用成本更低、操作更为简便快捷的原核表达系统替代真核表达系统来制备shTNFR2蛋白；但具体到shTNFR2蛋白，若采用现有的原核表达系统来制备，后续的提取和纯化过程存在很大的技术困难，不仅蛋白的提取量很低，并且提取出来的蛋白的纯度和生物学活性均很低，没有实际的应用价值。
发明人在此基础上，进行了大量的试验后发现，特别是对shTNFR2全长蛋白进行原核表达时，后续的操作极为困难，不仅获得的包涵体不易充分溶解，更为棘手的是，即使充分溶解，获得的shTNFR2变性蛋白还会在后续的蛋白复性和纯化过程中发生较大程度的降解和沉淀，无法获得较高纯度和生物学活性的shTNFR2蛋白。
发明人一方面在构建shTNFR2的重组表达载体的阶段，采用特定的引物(上游引物序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物序列如SEQ ID NO:2所示)PCR扩增shTNFR2全长蛋白的基因片段(扩增获得的shTNFR2基因片段序列如SEQ ID NO:3所示)。另一方面，对于通过大肠杆菌BL21(DE3)原核表达的shTNFR2全长蛋白，在后续纯化操作中存在的技术困难，发明人做了大量的优化实验。
按照本领域技术人员的惯常经验，对于纯化操作中遇到的瓶颈，通常是仅聚焦于“纯化步骤”，调整这个步骤的条件和参数。
但本申请发明人意外地发现，纯化前的处理更为关键，具体的：在包涵体沉淀洗涤和蛋白变性处理后，依次加入DTT和氧化型谷胱甘肽至特定浓度，并充分搅拌一段特定的时间，对变性蛋白先后进行还原和氧化处理；在此基础之上，稀释复性步骤中，采用特定pH值(10.0～10.5)和盐浓度(20～50mmol/L)的复性缓冲液进行复性处理，最终获得的纯化后的shTNFR2蛋白具有高纯度和较强的生物学活性。
更为详细地来说，在现有技术中对于包涵体沉淀的处理中，也有采用DTT的，但浓度一般较低(如8～10mM)；然而在本申请方案中，发明人发现，针对shTNFR2蛋白的变性后处理，当采用特定的DTT+氧化型谷胱甘肽的先还原后氧化的组合，DTT的终浓度提高至20～30mM并使用高浓度氧化型谷胱甘肽(30～40mM)时反而能够起到更好的效果。在此基础之上，后续的稀释复性的条件，发明人也随之做了优化调整；现有技术采用的复性缓冲液的pH通常为中性，而在本申请方案中，结合上述的优化条件，发明人发现复性缓冲液的pH调整为10～10.5(碱性)、盐浓度调整为20～50mmol/L，结合一定的稀释比，后续通过镍柱亲和层析和凝胶过滤层析的组合获得的纯化后的shTNFR2蛋白具有高纯度和较强的生物学活性。
以下将结合附图所示的具体实施方式对本发明进行详细描述。但这些实施方式并不限制本发明，本领域的普通技术人员根据这些实施方式所做出的结构、方法、或功能上的变换均包含在本发明的保护范围内。
现在将参考附图更全面地描述示例实施方式。然而，示例实施方式能够以多种形式实施，且不应被理解为限于在此阐述的实施方式；相反，提供这些实施方式使得本发明将全面和完整，并将示例实施方式的构思全面地传达给本领域的技术人员。
下面实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》第三版，科学出版社)或按照产品说明书进行。
下面实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
一种可溶性人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体蛋白的制备方法，该制备方法包括以下步骤：
步骤1)：构建可溶性人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体蛋白shTNFR2的重组表达载体；
步骤2)：将步骤1)获得的所述重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，获得重组菌，并诱导所述重组菌的蛋白表达；
步骤3)：收集步骤2)获得的经诱导表达的重组菌，经菌体裂解处理后，获得包涵体沉淀；
步骤4)：对步骤3)获得的所述包涵体沉淀进行洗涤和蛋白变性处理，获得shTNFR2变性蛋白液；
步骤5)：将步骤4)获得的所述shTNFR2蛋白变性液进行稀释复性处理获得复性蛋白液；
步骤6)：对步骤5)获得的所述复性蛋白液进行纯化处理获得所述shTNFR2蛋白。
一、步骤1)：构建shTNFR2的重组表达载体
扩增shTNFR2基因片段：
以shTNFR2基因编码区序列(NCBI数据库，基因ID：NM_001066.3)为模板，在5’-端和3’-端增加NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点序列，由此完成整体的基因序列设计。
采用PCR扩增shTNFR2基因片段：
具体的，PCR所使用的上游引物序为：5’-GGAATTCCATATGGCCCCGGAGCCCGGGAGCACA-3’(SEQ ID NO:1)，下游引物序列为5’-CCCTCGAGTTAGGGGGACGTGGACGTGCA-3’(SEQ ID NO:2)。
扩增使用PrimeSTAR高保真DNA聚合酶(购自Takara公司)。
PCR反应程序设置为：a)95℃预变性5min；b)95℃变性30s；c)55℃退火15s；d)72℃延伸1min；e)72℃终末延伸10min，第b至d步循环30次。
构建重组表达载体：
使用NdeⅠ和XhoⅠ核酸内切酶(购自Takara公司)，将空载体pET-28a-His-TEV(购自上海柯雷生物科技有限公司)和上述获得的shTNFR2基因片段进行双酶切，酶切缓冲液为10×H Buffer，酶切温度为37℃，酶切时间为3h。
通过1％琼脂糖凝胶电泳回收纯化带有粘性末端的shTNFR2基因片段和空载体pET-28a-His-TEV。
使用T4 DNA连接酶(购自Novagen)连接shTNFR2基因片段和pET-28a-His-TEV载体，连接条件为16℃金属浴12h。
将获得的连接产物转化大肠杆菌DH5α菌株，在含有卡那霉素的LB固体平板培养基上培养单克隆菌落，并通过菌落PCR筛选阳性克隆。
扩增和提取质粒：将筛选获得的阳性克隆接种于含有卡那霉素的LB液体培养基中振荡培养过夜；用质粒抽提试剂盒(购自OMEGA公司)提取质粒，并进行测序鉴定。测序正确的质粒即为shTNFR2的重组表达载体(pET-28a-His-TEV-shTNFR2)。
二、步骤2)：转化获得重组菌和shTNFR2蛋白的原核表达
转化：将重组表达载体pET-28a-His-TEV-shTNFR2，体积1μL(含量不超过50ng)与大肠杆菌BL21(DE3)菌株的感受态细胞100μL混合，冰浴30分钟，42℃热激90秒，随后冰浴3～5分钟；每管加入500μL LB培养基，37℃培养45-60分钟(≤220rpm)，使细菌恢复正常生长状态；然后将获得的菌液离心并弃掉500μL上清，混匀沉淀后涂布于含抗生素(卡那霉素)的LB平板，37℃倒置培养过夜。
原核表达：挑取LB平板的单克隆菌落在LB液体培养基中振摇过夜，次日以1:100的体积比将过夜培养物接种于1L含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、250rpm振荡培养2.5h-3h，加入IPTG(购自Sigma-Aldrich公司)至终浓度为0.2mM，继续振摇，诱导8h，在合适的时间点取适量菌液，离心收集菌体进行SDS-PAGE检测，分析shTNFR2蛋白的表达情况。附注：shTNFR2的重组表达载体(pET-28a-His-TEV-shTNFR2)通过大肠杆菌原核表达系统，表达的蛋白是带有His标签的shTNFR2蛋白。
结果如图1所示，M为蛋白分子量标准，泳道0为诱导前对照，泳道1-5分别为诱导后1、2、4、6和8小时样品，结果可见诱导1小时后在大约20kDa分子量位置处有特异的蛋白条带出现，诱导2小时后蛋白表达量达到最大并稳定。
诱导完成后，4000rpm离心收集重组菌的菌体；用PBS缓冲液洗涤菌体沉淀；储存于-20℃。
三、步骤3)：菌体裂解
菌体裂解的过程为：使用30mL PBS缓冲液重悬上述获得的重组菌的菌体沉淀，置于冰浴中超声破碎菌体(设置超声功率200W，每次工作时长5s，间隔时长8s)，冰浴超声时间20min，之后16000rpm 4℃离心30min，获得包涵体沉淀。
取样(即包涵体沉淀)进行SDS-PAGE电泳，结果参见图2。
图2中，标注“全菌”一列表示：完整菌株的SDS-PAGE电泳结果；标注“沉淀”的一列表示：包涵体沉淀的SDS-PAGE电泳结果；标注“上清”一列表示：菌体破碎后的上清液的SDS-PAGE电泳结果；可以看出，shTNFR2蛋白(目标蛋白)，参箭头标注处，存在于破菌后的包涵体沉淀中。
四、步骤4)：包涵体沉淀的洗涤和蛋白变性处理
包涵体沉淀的洗涤处理的过程为：采用第一洗涤缓冲液洗涤2-5次，再用第二洗涤缓冲液洗涤1次；第一洗涤缓冲液的pH为7～8，含有20～50mmol/L Tris-HCl、150～300mmol/L NaCl、1～5mmol/L EDTA、1mmol/L DTT和0.5％(v/v)Triton X-100；第二洗涤缓冲液的pH为7～8，含有20～50mmol/L Tris-HCl、150～300mmol/L NaCl、1～5mmol/L EDTA和1mmol/L DTT。
在本申请的一个具体实施方案中，采用第一洗涤缓冲液重悬包涵体沉淀，冰浴超声至沉淀全部溶解，离心后，弃上清、取沉淀，并再重复该操作2-4次；然后，采用第二洗涤缓冲液重悬获得的沉淀，冰浴超声至沉淀全部溶解，离心后，弃上清、取沉淀获得经洗涤后的包涵体沉淀。
具体在本实施例中，第一洗涤缓冲液的pH为7.5，含有50mmol/L Tris-HCl、200mmol/L NaCl、5mmol/L EDTA、1mmol/L DTT和0.5％(v/v)Triton X-100；第二洗涤缓冲液的pH为7.5，含有50mmol/L Tris-HCl、200mmol/L NaCl、5mmol/L EDTA和1mmol/L DTT；即第一洗涤缓冲液是在第二洗涤缓冲液配方基础上添加了0.5％(v/v)Triton X-100。
具体在本实施例中，先使用30mL第一洗涤缓冲液重悬包涵体沉淀，冰浴超声15min(设置超声功率200W，每次工作时长5s，间隔时长8s)至沉淀全部溶解，4℃、16000rpm离心15min，弃上清，取沉淀，如此是为洗涤一次；再按上述的操作用第一洗涤缓冲液重复洗涤3次；之后，再用20ml第二洗涤缓冲液洗涤一次，4℃、16000rpm离心15min，弃上清，取沉淀，即获得经洗涤处理的包涵体沉淀。
蛋白变性处理的过程为：向上述获得的经洗涤处理的包涵体沉淀中，加入变性缓冲液(按照每1g包涵体沉淀，20ml变性缓冲液的比例)，室温搅拌2h使包涵体沉淀中的蛋白变性。
在本申请的一个具体实施方案中，变性缓冲液的pH值为8～8.5，其含有50～100mmol/L Tris-HCl、6mol/L Gua-HCl、5-10mmol/L EDTA和1～2mmol/L PMSF。
具体在本实施例中，变性缓冲液的pH值为8.5，其含有100mmol/L Tris-HCl、6mol/L Gua-HCl、10mmol/L EDTA和2mmol/L PMSF。
在本申请的一个具体实施方案中，所述包涵体沉淀依次进行洗涤处理和蛋白变性处理后，再加入DTT至终浓度20～30mM，充分搅拌40-60min，之后再加入氧化型谷胱甘肽至终浓度30～40mM，充分搅拌40-60min，离心收集上清液，获得所述的shTNFR2变性蛋白液。
具体在本实施例中，向上述经过蛋白变性处理后的产物中，加入DTT(购自AMRESCO公司)至终浓度20mM，于室温下搅拌40min使包涵体充分溶解，再加入氧化型谷胱甘肽(购自AMRESCO公司)至终浓度30mM，继续搅拌40min，于4℃16000rpm离心30min，收集上清液；
从上清液取样(即shTNFR2变性蛋白液)，进行SDS-PAGE电泳，结果参见图2中，标注“变性”的一列表示：shTNFR2变性蛋白液的SDS-PAGE电泳结果，从图2中可以看出，在标注“全菌”的一列中，20KD处的条带说明有shTNFR2蛋白的存在；菌体破碎后的上清液和包涵体沉淀的电泳结果对比来看，包涵体沉淀的20KD处条带更为明显；在对包涵体沉淀进行洗涤和变性处理后，20KD处的条带明显更宽。
五、步骤5)：稀释复性处理
在本申请的一个具体实施方案中，所述稀释复性处理所使用的复性缓冲液的pH值为10.0～10.5，盐浓度为20～50mmol/L，稀释比例为1:50～1:100。
在本申请的一个具体实施方案中，所述复性缓冲液含有20～50mmol/L Tris-HCl、20～50mmol/L NaCl、0.5～1mmol/L GSH、1～2mmol/L PMSF和1～2mmol/L EDTA。
具体在本实施例中，复性缓冲液的pH值为10.0～10.5，稀释比例为1:100，其含有20mmol/L Tris-HCl、25mmol/L NaCl、1mmol/L GSH、1mmol/L PMSF和1mmol/L EDTA。
稀释复性处理的过程：配制1L复性缓冲液加入烧杯，置于磁力搅拌器上，调节转速50rpm。取10ml一次性注射器针筒接上1ml规格的针头，固定在烧杯口上。将5ml上述步骤4)获得的上清液(shTNFR2变性蛋白液)加入注射器内，用活塞施以适当的压力使溶液缓慢滴入到下方的复性缓冲液里，缓慢搅拌2h。按照此法分3-4次滴加shTNFR2变性蛋白液，每次5mL，间隔2h，1L复性缓冲液内滴加的蛋白总量不超过20mg；整个稀释复性过程在4℃进行，总时间12-16h(优选16h)；最终，获得复性蛋白液。
六、步骤6)：纯化处理
参上述步骤1)和步骤2)，步骤1)构建的shTNFR2的重组表达载体(pET-28a-His-TEV-shTNFR2)通过大肠杆菌原核表达系统，表达的蛋白是带有His标签的shTNFR2蛋白；即，步骤5)获得的复性蛋白液中含有的是带有His标签的shTNFR2蛋白。
在本申请的一个具体实施方案中，所述步骤6)中的纯化处理包括依次进行的镍柱亲和层析处理和凝胶过滤层析处理。
在本申请的一个优选实施方案中，所述镍柱亲和层析处理的过程为：对所述复性蛋白液进行第一次镍柱亲和层析，收集到带有His标签的shTNFR2蛋白洗脱液；再向所述洗脱液中加入TEV蛋白酶对所述His标签进行酶切，获得酶切反应液，再进行第二次镍柱亲和层析，收集不带His标签的shTNFR2蛋白洗脱液。
在本申请的一个更优选的实施方案中，所述第一次镍柱亲和层析的过程为：将通过微孔滤膜过滤后的所述复性蛋白液上样于平衡过的Ni-NTA重力层析柱，先用含有50mmol/L咪唑的镍柱层析缓冲液流过镍柱冲洗杂蛋白，再用含有500mmol/L咪唑的镍柱层析缓冲液流过镍柱，获得带有His标签的shTNFR2蛋白洗脱液；
所述第二次镍柱亲和层析的过程为：去除所述酶切反应液中的咪唑后，上样于平衡过的Ni-NTA重力层析柱，依次使用不含咪唑和含有20mM咪唑的镍柱层析缓冲液流过镍柱，获得不带His标签的shTNFR2蛋白洗脱液。
具体在本实施例中，
镍柱亲和层析处理的过程如下：
第一次镍柱亲和层析的过程：在4℃环境下依次使用0.8μm和0.45μm微孔滤膜(购自上海兴亚进化材料厂)过滤上述步骤5)获得的复性蛋白液，去除沉淀后，上样于经镍柱层析缓冲液(pH8.0，50mmol/L Tris-HCl，500mmol/L NaCl，5％甘油)平衡过的Ni-NTA重力层析柱(购自GE公司)；再配制30ml含有50mmol/L咪唑的镍柱层析缓冲液流过镍柱冲洗杂蛋白；再配制10ml含有500mmol/L咪唑的镍柱层析缓冲液洗脱目的蛋白(带有His标签的shTNFR2蛋白)。取洗脱液样品进行SDS-PAGE分析，结果见图3；图3中标注“酶切前”的一列为第一次镍柱亲和层析获得的“带有His标签的shTNFR2蛋白”洗脱液的SDS-PAGE结果。
酶切：向第一次镍柱亲和层析获得的“带有His标签的shTNFR2蛋白”洗脱液中，加入100U的TEV蛋白酶(购自生工生物)，于4℃酶切反应12h以切除His标签；获得酶切反应液；
第二次镍柱亲和层析的过程：使用分子截留量为5kDa的超滤离心管对上述获得的酶切反应液进行缓冲液置换，去除高浓度咪唑后，上样于新的Ni-NTA重力层析柱。依次使用不含咪唑、含有20mM、含有200mM咪唑的镍柱层析缓冲液流过镍柱，取流穿液、不含咪唑的洗涤液、20mM咪唑洗脱液、200mM咪唑洗脱液的样品进行SDS-PAGE分析，结果见图3。从图3可以看出，切除标签后的shTNFR2蛋白分子量大约在18～19kDa，位于流穿液和洗涤液中。
凝胶过滤层析处理的过程：配制凝胶过滤层析缓冲液(pH 7.5，20mmol/L Tris-HCl，150mmol/L NaCl)，0.22μm滤膜过滤后超声脱气。使用分子截留量为5kD的超滤离心管，将上述获得的不带His标签的shTNFR2蛋白溶液(第二次镍柱亲和层析获得的流穿液和洗涤液)置换为凝胶过滤层析缓冲液，并浓缩至1ml以下体积。以去离子水和凝胶过滤层析缓冲液依次冲洗平衡分子筛层析柱Superdex 75 10/300GL(购自GE公司)，设置流速1ml/min，收集洗脱液。
将收集到的洗脱液4℃13000rpm离心30min去除沉淀后上样，监测280nm紫外吸收峰，收集出峰样品，并进行进行SDS-PAGE电泳，检测shTNFR2蛋白的位置；结果参见图4和图5，从图4的结果可以看出，shTNFR2蛋白在13-15ml洗脱体积位置有明显的单体峰(P2)；图5是两个出峰样品(P1和P2)的电泳结果。
将纯度高的组分合并用超滤管浓缩，SDS-PAGE分析最终的纯度，如图6所示，纯化后的shTNFR2蛋白显示为单一条带；通过Image J软件分析，纯化后的shTNFR2蛋白的纯度大于95％。
证明本申请实施例1的制备方法获得的纯化后的shTNFR2蛋白的纯度较高。
七、MST鉴定shTNFR2蛋白的体外生物学活性
使用Monolith RED-NHS试剂盒(购自NanoTemper公司)对上述步骤6)纯化获得的shTNFR2蛋白进行荧光标记。
荧光标记的具体操作过程：a)使用超滤管将上述纯化获得的shTNFR2蛋白更换至Labeling Buffer中并稀释至20μM；b)向10μg固体荧光染料NT-647-NHS中加入30μl DMSO，旋涡充分混匀，得到母液浓度约470μM，再以Labeling Buffer稀释至60μM；c)再将步骤a)获得的蛋白溶液与步骤c)的染料溶液等体积混合，避光孵育30min，获得蛋白标记反应液；d)以3～5个柱体积的PBS平衡纯化柱Column B；向柱床中央加入500μl上述步骤c)获得的蛋白标记反应液，弃掉流出液；e)加入600μl PBS，弃掉最开始流出的100μl，收集洗脱液即为荧光标记的shTNFR2蛋白；收集的洗脱液中的荧光标记shTNFR2蛋白浓度约为2μM。
用检测缓冲液(pH 7.4，50mM Tris-HCl、150mM NaCl、10mM MgCl2、0.05vol％Tween-20)稀释一定浓度的荧光标记shTNFR2蛋白。用标准型毛细管吸取蛋白(荧光标记shTNFR2蛋白)在Monolith NT.115仪器(NanoTemper公司)上进行荧光信号初始化扫描。根据荧光信号值调整蛋白浓度和激发功率(LED Power)，使荧光值在200～1500之间。
用检测缓冲液溶解TNF-α蛋白冻干粉(购自PeproTech公司)并采用倍比稀释(1:1)的方法配制0.12nM～4μM系列浓度的TNF-α蛋白，将每个浓度的未标记TNF-α与固定浓度的荧光标记shTNFR2蛋白等体积混合。常温下避光静置反应20分钟后毛细管上样进行MST检测。
使用软件NTAffinityAnalysis进行分析处理，拟合热泳动的剂量-响应曲线，计算出两者结合的亲和力。结果参见图7，纯化后的shTNFR2蛋白与TNF-α的结合能力为80.7nM，显示出较强的生物学活性。
证明本申请实施例1的制备方法获得的纯化后的shTNFR2蛋白具有较强的生物学活性。
应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施方式中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施方式的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施方式或变更均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 上海市第十人民医院
<120> 一种可溶性人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体蛋白的制备方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggaattccat atggccccgg agcccgggag caca 34
<210> 2
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccctcgagtt agggggacgt ggacgtgca 29
Claims (10)
1.一种可溶性人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体蛋白的制备方法，其特征在于：
该制备方法包括以下步骤：
步骤1)：构建可溶性人肿瘤坏死因子Ⅱ型受体蛋白shTNFR2的重组表达载体；
步骤2)：将步骤1)获得的所述重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株，获得重组菌，并诱导所述重组菌的蛋白表达；
步骤3)：收集步骤2)获得的经诱导表达的重组菌，经菌体裂解处理后，获得包涵体沉淀；
步骤4)：对步骤3)获得的所述包涵体沉淀依次进行洗涤处理和蛋白变性处理，获得shTNFR2变性蛋白液；
步骤5)：将步骤4)获得的所述shTNFR2蛋白变性液进行稀释复性处理获得复性蛋白液；
步骤6)：对步骤5)获得的所述复性蛋白液进行纯化处理获得所述shTNFR2蛋白；
其中，所述步骤1)中，采用PCR扩增shTNFR2基因片段；所使用的PCR上游引物序列如SEQID NO:1所示，下游引物序列如SEQ ID NO:2所示；
所述步骤4)中，所述包涵体沉淀依次进行洗涤处理和蛋白变性处理后，再加入DTT至终浓度20～30mM，充分搅拌40-60min，之后再加入氧化型谷胱甘肽至终浓度30～40mM，充分搅拌40-60min，离心收集上清液，获得所述的shTNFR2变性蛋白液；
所述步骤5)中，所述稀释复性处理所使用的复性缓冲液的pH值为10.0～10.5，盐浓度为20～50mmol/L，稀释比例为1:50～1:100。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
所述步骤4)中，所述蛋白变性处理所使用的变性缓冲液的pH值为8～8.5，其含有50～100mmol/L Tris-HCl、6mol/L Gua-HCl、5-10mmol/L EDTA和1～2mmol/L PMSF。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：
所述复性缓冲液含有20～50mmol/L Tris-HCl、20～50mmol/L NaCl、0.5～1mmol/LGSH、1～2mmol/L PMSF和1～2mmol/L EDTA。
4.如权利要求1至3中任意一项所述的制备方法，其特征在于：
所述步骤4)中，对所述包涵体沉淀的洗涤处理的过程为：采用第一洗涤缓冲液洗涤3-4次，再采用第二洗涤缓冲液洗涤1次；
第一洗涤缓冲液的pH为7～8，含有20～50mmol/L Tris-HCl、150～300mmol/L NaCl、1～5mmol/L EDTA、1mmol/L DTT和0.5vol％Triton X-100；
第二洗涤缓冲液的pH为7～8，含有20～50mmol/L Tris-HCl、150～300mmol/L NaCl、1～5mmol/L EDTA和1mmol/L DTT。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：
所述冰浴超声采用的功率为200W，每次工作时长为5秒，间隔时长为8秒。
6.如权利要求1至3中任意一项所述的制备方法，其特征在于：
所述步骤1)中，构建的所述重组表达载体在shTNFR2基因片段的N端添加了His-TEV标签序列。
7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于：
所述步骤6)中的纯化处理包括依次进行的镍柱亲和层析处理和凝胶过滤层析处理。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于：
所述镍柱亲和层析处理的过程为：对所述复性蛋白液进行第一次镍柱亲和层析，收集到带有His标签的shTNFR2蛋白洗脱液；再向所述洗脱液中加入TEV蛋白酶对所述His标签进行酶切，获得酶切反应液，再进行第二次镍柱亲和层析，收集不带His标签的shTNFR2蛋白洗脱液。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于：
所述第一次镍柱亲和层析的过程为：将通过微孔滤膜过滤后的所述复性蛋白液上样于平衡过的Ni-NTA重力层析柱，先用含有50mmol/L咪唑的镍柱层析缓冲液流过镍柱冲洗杂蛋白，再用含有500mmol/L咪唑的镍柱层析缓冲液流过镍柱，获得带有His标签的shTNFR2蛋白洗脱液；
所述第二次镍柱亲和层析的过程为：去除所述酶切反应液中的咪唑后，上样于平衡过的Ni-NTA重力层析柱，使用不含咪唑的镍柱层析缓冲液流过镍柱，获得不带His标签的shTNFR2蛋白液。
10.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于：
所述凝胶过滤层析处理采用分子筛层析柱Superdex 75 10/300GL。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN113683676A (zh) * | 2021-08-27 | 2021-11-23 | 恒敬合创生物医药(上海)有限公司 | 一种环保的可逆的蛋白变性工艺 |
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| WO2008051306A1 (en) * | 2006-10-20 | 2008-05-02 | Ercole Biotech, Inc. | Soluble tnf receptors and their use in treatment of disease |
| CN108707196A (zh) * | 2018-04-24 | 2018-10-26 | 中国人民解放军第二军医大学 | 一种人肿瘤坏死因子ⅰ型受体胞外区蛋白的制备方法 |
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