CN105602977B - 高活性人细胞因子Eotaxin-2的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高活性人细胞因子Eotaxin‑2的制备方法及应用，包括如下步骤：步骤1：根据NCBI数据库中Eotaxin‑2的氨基酸序列，对其密码子进行了优化，人工合成目的基因；步骤2：通过设计引物在其N端引入一个或多个His标签、TEV酶切位点，并在N端和C端分别引入限制性酶切位点EcoR I和Hind III；步骤3：利用PCR技术将目的片段进行扩增，再将基因片段双酶切后连接到用相同酶切割后的载体上面，而后导入大肠杆菌中进行异源表达，生产Eotaxin‑2蛋白。本发明方法提供了一种简便、快速、低成本、高产量、高纯度的细胞趋化因子Eotaxin‑2的制备方法，并对其活性进行了验证。

Description

高活性人细胞因子Eotaxin-2的制备方法及应用
技术领域
本发明涉及基因工程和食品医药技术领域，特别涉及一种高活性人细胞因子Eotaxin-2的快速、大量制备方法及用途。
背景技术
高活性细胞趋化因子Eotaxin-2属于β趋化因子或CC化学趋化因子家族的成员，是一种分子量多为8-10kDa的一种蛋白质。以近N-端处有2个相邻的半胱氨酸为特征。通过与具有7个跨膜区的G蛋白偶联受体即趋化因子受体结合，激活细胞内的信号转导通路，在细胞的迁移中发挥了重要作用。
目前越来越多的研究表明Eotaxin-2的趋化因子受体CCR3在炎症反应、过敏性哮喘等疾病中发挥着关键作用，是重要的药物靶点，通过阻断CCR3的信号传导途径将有望大大缓解或彻底治愈炎症及过敏性哮喘等相关疾病。因此，Eotaxin-2作为趋化因子的重要的组成部分，其研究受到了广泛的关注。
在1997年及1999年又分别发现了Eotaxin-2和Eotaxin-3，二者的基因都位于7q11.23，他们的生物学作用非常相似，Eotaxin-2的趋化活性与Eotaxin-1相似，但氨基酸的同源序列只有39％，而Eotaxin-3与Eotaxin-1氨基酸的同源序列只有37％，Eotaxin-3对嗜酸性粒细胞的趋化活性是Eotaxin-2和Eotaxin-1的10％(李静.趋化因子eotaxin及其受体与支气管哮喘[J].国际儿科学杂志，2006，33(3)：406-408)。
Eotaxin-2由78个氨基酸组成，其分子量为8.8×103，Eotaxin-2的结构包括一个螺旋，随后是3个反向平行的β片层和一个α螺旋。N-loop通过两个保守的二硫键将N-末端/N-loop区域与β片层连接在一起。与CCR3的N-末端区域相对的线性肽与Eotaxin-2结合，诱导许多氨基酸残基浓度依赖的化学位移改变或线性增加。这些氨基酸残基的移动表明肽与N-loop和β2-β3发卡结构之间的表面的扩展槽结合。受体肽也可能与趋化因子的N-端和α螺旋的部分相互作用。Eotaxin-2的结构与趋化因子结构的不同之处，可能对其与受体结合的特异性相关(Mayer K.L.,Stone M.J..NMR solution structure and receptor peptidebinding of the CC chemokine eotaxin-2[J].Biochemistry,2000,V39(29):8382-8395)。
目前Eotaxin-2的获得由两种主要途径：从活体中天然提取和用基因工程的方法进行基因克隆到原核细胞中进行异源表达。第一种方法产量低，成本过高，不利于大规模生产，第二种方法经常会产生过量表达，然而过量表达会产生不溶和无活性的多肽，不溶的聚集物通常形成包涵体(刘华，李敏.基因重组蛋白的表达系统与分离纯化研究进展[J].福建师范大学报，2007,23(1)：100-104；Proudfoot A.E.I.,Borlat F..Chemokine Protocols[M].Humana Press,New York,2002,7587)。
重组蛋白被包裹在包涵体中是不具有生物活性的，必须重新增溶、变性和复性以促进分子内正确二硫键和自然构象的形成，这个过程由于增加了许多色谱分离纯化步骤而比较费时且复性效果不好。因此，需要建立一个更加快速、高效的趋化因子表达系统，不仅可溶性蛋白表达量高，而且分离纯化步骤简单。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于：提供了一种简便、快速、低成本、高产量、高纯度的细胞趋化因子Eotaxin-2的制备方法，并对其活性进行了验证。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种高活性细胞因子的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：根据NCBI数据库中Eotaxin-2的氨基酸序列，对其密码子进行了优化，人工合成目的基因；
步骤2：通过设计引物在其N端引入一个或多个His标签、TEV酶切位点，并在N端和C端分别引入限制性酶切位点EcoR I和Hind III；
步骤3：利用PCR技术将目的片段进行扩增，再将基因片段双酶切后连接到用相同酶切割后的载体上面，而后导入大肠杆菌中进行异源表达，生产Eotaxin-2蛋白。
所述步骤1中，所得人工合成目的基因的核苷酸序列优选为：GTT GTT ATT CCGTCA CCG TGC TGT ATG TTT TTC GTT TCG AAA CGT ATT CCG GAA AAC CGC GTT GTT AGTTAT CAG CTG AGC TCT CGT TCC ACC TGC CTG AAA GGC GGC GTC ATC TTT ACC ACG AAAAAA GGC CAG CAA TTC TGT GGT GAT CCG AAA CAG GAA TGG GTG CAA CGT TAC ATG AAAAAT CTG GAC GCG AAA CAG AAA AAA GCG AGC CCG CGT GCA CGC GCA GTG GCA TAA。
所述步骤2中，所得修饰后的人工合成目的基因的核苷酸序列优选为：
EcoR I site 6×His TEV cleavage site HindⅢsite
5-TATAGTGAATTC
Figure BDA0000905331130000031
GAAAACCTGTATTTTCAGGGT-Eotaxin-2-TAAAAGCTTACT-3。
所述高活性细胞因子的制备方法，可以进一步包括：
步骤4：将诱导表达后的大肠杆菌收集、高压破碎、离心、过滤、镍柱亲和层析、凝胶过滤脱盐、酶切除去His标签后得到纯度很高的蛋白。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种人工合成目的基因，所述基因是根据NCBI数据库中Eotaxin-2的氨基酸序列，对其密码子进行了优化，人工合成目的基因；
所得人工合成目的基因的核苷酸序列为：GTT GTT ATT CCG TCA CCG TGC TGTATG TTT TTC GTT TCG AAA CGT ATT CCG GAA AAC CGC GTT GTT AGT TAT CAG CTG AGCTCT CGT TCC ACC TGC CTG AAA GGC GGC GTC ATC TTT ACC ACG AAA AAA GGC CAG CAATTC TGT GGT GAT CCG AAA CAG GAA TGG GTG CAA CGT TAC ATG AAA AAT CTG GAC GCGAAA CAG AAA AAA GCG AGC CCG CGT GCA CGC GCA GTG GCA TAA。
为解决上述技术问题，本发明另提供了一种人工合成目的基因，所述基因是根据NCBI数据库中Eotaxin-2的氨基酸序列，对其密码子进行了优化，人工合成目的基因；并通过设计引物在其N端引入一个或多个His标签、TEV酶切位点，并在N端和C端分别引入限制性酶切位点EcoR I和Hind III；
所得修饰后的人工合成目的基因的核苷酸序列为：
EcoR I site 6×His TEV cleavage site HindⅢsite
5-TATAGTGAATTC
Figure BDA0000905331130000041
GAAAACCTGTATTTTCAGGGT-Eotaxin-2-TAAAAGCTTACT-3。
为解决上述技术问题，本发明又提供了一种如前述任一项所述高活性细胞因子的制备方法在制备治疗变应性鼻炎、哮喘、结直肠肿瘤、鼻息肉、艾滋病(HIV)、过敏性疾病、寄生虫感染、系统性疾病、和/或炎症及免疫相关疾病的药物中的应用。
为解决上述技术问题，本发明再提供了一种如前述任一项所述人工合成基因在制备治疗变应性鼻炎、哮喘、结直肠肿瘤、鼻息肉、艾滋病(HIV)、过敏性疾病、寄生虫感染、系统性疾病、和/或炎症及免疫相关疾病的药物中的应用。
为解决上述技术问题，本发明另提供了一种如前述任一项所述高活性细胞因子的制备方法和/或所述人工合成基因，在治疗变应性鼻炎、哮喘、结直肠肿瘤、鼻息肉、艾滋病(HIV)、过敏性疾病、寄生虫感染、系统性疾病、和/或炎症及免疫相关疾病的药物设计方面的应用。
所述的表达载体为普通大肠杆菌表达载体，优选质粒pET28a、pET32a、pMAL-p4X，分别对应于大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)、Origami、TB1。
本发明还进一步对所用表达载体、诱导时机、诱导温度和时间进行了优化，最终优化的表达条件为：表达载体选用pET28a、OD600＝1.0～1.2、诱导时间为8h、诱导温度为25℃。
本发明方法还可以用SDS-PAGE、质谱方法对制备得到的蛋白的纯度和分子量进行了分析和验证，用表面等离子共振技术(SPR)对制备得到的Eotaxin-2的生物活性进行了表征。
本发明制备得到的Eotaxin-2纯度很高且有生物活性，在相关疾病的治疗和药物的设计方面显示了很大的应用前景。
本发明有益的技术效果在于：
1.本发明为运用基因工程技术，将Eotaxin-2基因进行了优化，并在其N端加入了能与Ni柱特异性结合的His标签以及后续可以去除标签的TEV酶切位点，在N端和C端分别加入限制性酶切位点EcoR I和Hind III，连接到表达载体上然后转入相应的大肠杆菌表达体系中，在菌体OD600＝1.0～1.2时加入IPTG诱导蛋白表达。这一生产过程生产周期为12个小时，同时大肠杆菌易于实现高密度大规模培养，从而大大缩短了培养时间，降低生产成本。
2.大肠杆菌细胞容易破碎，且含杂蛋白比较少，因为是诱导型表达，有利于目的蛋白的富集和反应过程的调控，使得下游纯化过程变得更加简单，容易获得低成本、高产量、高纯度的Eotaxin-2蛋白。
3、本发明通过优化最终选择表达菌株pET28a/BL21(DE3)，使Eotaxin-2水溶性表达量高，包涵体形成较少，所得蛋白结构折叠正确，具有生物活性。培养1L大肠杆菌可以获得3.87mg左右的蛋白，和传统提取方法相比产量提高很多倍。
4、本发明Eotaxin-2的分离纯化过程简单，只经过镍柱亲和层析和凝胶层析两步，减少了过多的分离纯化步骤对蛋白活性和产量的影响。
5、在蛋白的纯化过程中杂蛋白组氨基酸的含量比较少，在与目的蛋白进行竞争性结合Ni柱时，由于结合力较弱非常容易就被少量的咪唑洗脱下来，而目的蛋白用500mM的咪唑洗脱，从而得到纯度很高的蛋白。
6、本发明中通过Eotaxin-2表达体系的选择、表达条件的优化和表达过程的调控，进一步提高了蛋白的产量，并且获得的蛋白中单体比较多，二聚体和寡聚体很少。
7、本发明用表面等离子共振技术(SPR)对制备得到的Eotaxin-2的生物活性进行了验证，通过活性实验可以看出本实验室制备的Eotaxin-2比商业化的Eotaxin-2与CCR3的结合亲和力高10倍左右，因此在相关疾病的治疗和药物的设计方面显示了更大的应用前景。
附图说明
图1为本发明细胞因子Eotaxin-2表达载体PET28a-Eotaxin-2基因的构建图。
图2为本发明表达藻蓝胆素重组载体pET32a-Eotaxin-2基因的构建图。
图3为本发明表达藻蓝胆素重组载体pMAL-p4X-Eotaxin-2基因的构建图。
图4为不同表达载体表达Eotaxin-2蛋白的优化图。
图5为不同诱导时机下Eotaxin-2蛋白表达量的优化图。
图6为不同诱导温度下Eotaxin-2蛋白表达量的优化图。
图7为His-Tag-Eotaxin-2融合蛋白的纯化图。
图8为Eotaxin-2蛋白的纯化图。
图9为Eotaxin-2的质谱检测图。
图10为在DDM增溶下CCR3和购买自PeproTech有生物活性配体Eotaxin-2的SPR传感图谱。
图11为在DDM增溶下CCR3和本实验室制备的配体Eotaxin-2的SPR传感图谱。
具体实施方式
以下将结合实施例来详细说明本发明的实施方式，借此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题，并达成技术效果的实现过程能充分理解并据以实施。
需要说明的是，为节省说明书撰写篇幅，避免不必要的重复和浪费，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
本发明公开了细胞因子Eotaxin-2的制备方法，包括如下步骤：根据NCBI数据库中Eotaxin-2成熟蛋白的氨基酸序列，对其密码子进行了优化，人工合成目的基因，所得核苷酸序列为：GTT GTT ATT CCG TCA CCG TGC TGT ATG TTT TTC GTT TCG AAA CGT ATT CCGGAA AAC CGC GTT GTT AGT TAT CAG CTG AGC TCT CGT TCC ACC TGC CTG AAA GGC GGCGTC ATC TTT ACC ACG AAA AAA GGC CAG CAA TTC TGT GGT GAT CCG AAA CAG GAA TGGGTG CAA CGT TAC ATG AAA AAT CTG GAC GCG AAA CAG AAA AAA GCG AGC CCG CGT GCACGC GCA GTG GCA TAA。
通过设计引物在其N端引入6个His标签、TEV酶切位点，并在N端和C端分别引入限制性酶切位点EcoR I和Hind III。最终得到含有Eotaxin-2成熟蛋白的核苷酸序列如下：
EcoR I site 6×His TEV cleavage site HindⅢsite
5-TATAGTGAATTC
Figure BDA0000905331130000071
GAAAACCTGTATTTTCAGGGT-Eotaxin-2-TAAAAGCTTACT-3。
所得基因序列碱基总数为297。利用PCR技术，将目的片段进行扩增，再将基因片段双酶切后连接到用相同酶切割后的表达载体上，而后导入大肠杆菌宿主细胞中进行异源表达，生产Eotaxin-2蛋白。将重组大肠杆菌扩大培养，诱导表达后收集菌体细胞，并进行高压破碎、高速离心、0.45μm微孔滤膜过滤、镍柱亲和层析、凝胶过滤脱盐、酶切除去His标签一系列分离纯化过程，最终得到可溶性表达量(3.87mg/l)和纯度都很高的Eotaxin-2蛋白。
本发明还对所用表达载体、诱导时机、诱导温度和时间进行了优化，最终优化的表达条件为：表达载体选用pET28a、OD600＝1.0～1.2、诱导时间为8h、诱导温度为25℃。同时用SDS-PAGE、质谱方法对制备得到的蛋白的纯度和分子量进行了分析和验证，用表面等离子共振技术(SPR)对制备得到的细胞因子Eotaxin-2的生物活性进行了表征。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种高活性细胞因子的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：根据NCBI数据库中Eotaxin-2的氨基酸序列，对其密码子进行了优化，人工合成目的基因；
步骤2：通过设计引物在其N端引入一个或多个His标签、TEV酶切位点，并在N端和C端分别引入限制性酶切位点EcoR I和Hind III；
步骤3：利用PCR技术将目的片段进行扩增，再将基因片段双酶切后连接到用相同酶切割后的载体上面，而后导入大肠杆菌中进行异源表达，生产Eotaxin-2蛋白。
所述步骤1中，所得人工合成目的基因的核苷酸序列优选为：GTT GTT ATT CCGTCA CCG TGC TGT ATG TTT TTC GTT TCG AAA CGT ATT CCG GAA AAC CGC GTT GTT AGTTAT CAG CTG AGC TCT CGT TCC ACC TGC CTG AAA GGC GGC GTC ATC TTT ACC ACG AAAAAA GGC CAG CAA TTC TGT GGT GAT CCG AAA CAG GAA TGG GTG CAA CGT TAC ATG AAAAAT CTG GAC GCG AAA CAG AAA AAA GCG AGC CCG CGT GCA CGC GCA GTG GCA TAA。
所述步骤2中，所得修饰后的人工合成目的基因的核苷酸序列优选为：
EcoR I site 6×His TEV cleavage site HindⅢsite
5-TATAGTGAATTC GAAAACCTGTATTTTCAGGGT-Eotaxin-2-TAAAAGCTTACT-3。
所述高活性细胞因子的制备方法，可以进一步包括：
步骤4：将诱导表达后的大肠杆菌收集、高压破碎、离心、过滤、镍柱亲和层析、凝胶过滤脱盐、酶切除去His标签后得到纯度很高的蛋白。
为解决上述技术问题，本发明还提供了一种人工合成目的基因，所述基因是根据NCBI数据库中Eotaxin-2的氨基酸序列，对其密码子进行了优化，人工合成目的基因；
所得人工合成目的基因的核苷酸序列为：GTT GTT ATT CCG TCA CCG TGC TGTATG TTT TTC GTT TCG AAA CGT ATT CCG GAA AAC CGC GTT GTT AGT TAT CAG CTG AGCTCT CGT TCC ACC TGC CTG AAA GGC GGC GTC ATC TTT ACC ACG AAA AAA GGC CAG CAATTC TGT GGT GAT CCG AAA CAG GAA TGG GTG CAA CGT TAC ATG AAA AAT CTG GAC GCGAAA CAG AAA AAA GCG AGC CCG CGT GCA CGC GCA GTG GCA TAA。
为解决上述技术问题，本发明另提供了一种人工合成目的基因，所述基因是根据NCBI数据库中Eotaxin-2的氨基酸序列，对其密码子进行了优化，人工合成目的基因；并通过设计引物在其N端引入一个或多个His标签、TEV酶切位点，并在N端和C端分别引入限制性酶切位点EcoR I和Hind III；
所得修饰后的人工合成目的基因的核苷酸序列为：
EcoR I site 6×His TEV cleavage site HindⅢsite
5-TATAGTGAATTC
Figure BDA0000905331130000082
GAAAACCTGTATTTTCAGGGT-Eotaxin-2-TAAAAGCTTACT-3。
为解决上述技术问题，本发明又提供了一种如前述任一项所述高活性细胞因子的制备方法在制备治疗变应性鼻炎、哮喘、结直肠肿瘤、鼻息肉、艾滋病(HIV)、过敏性疾病、寄生虫感染、系统性疾病、和/或炎症及免疫相关疾病的药物中的应用。
为解决上述技术问题，本发明再提供了一种如前述任一项所述人工合成基因在制备治疗变应性鼻炎、哮喘、结直肠肿瘤、鼻息肉、艾滋病(HIV)、过敏性疾病、寄生虫感染、系统性疾病、和/或炎症及免疫相关疾病的药物中的应用。
为解决上述技术问题，本发明另提供了一种如前述任一项所述高活性细胞因子的制备方法和/或所述人工合成基因，在治疗变应性鼻炎、哮喘、结直肠肿瘤、鼻息肉、艾滋病(HIV)、过敏性疾病、寄生虫感染、系统性疾病、和/或炎症及免疫相关疾病的药物设计方面的应用。
所述的表达载体为普通大肠杆菌表达载体，优选质粒pET28a、pET32a、pMAL-p4X，分别对应于大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)、Origami、TB1。
本发明还进一步对所用表达载体、诱导时机、诱导温度和时间进行了优化，最终优化的表达条件为：表达载体选用pET28a、OD600＝1.0～1.2、诱导时间为8h、诱导温度为25℃。
本发明方法还可以用SDS-PAGE、质谱方法对制备得到的蛋白的纯度和分子量进行了分析和验证，用表面等离子共振技术(SPR)对制备得到的Eotaxin-2的生物活性进行了表征。
本发明制备得到的Eotaxin-2有生物活性且纯度很高，在相关疾病的治疗和药物的设计方面显示了很大的应用前景。
如图1所示，为本发明细胞因子Eotaxin-2表达载体PET28a-Eotaxin-2基因的构建图。
如图2所示，为本发明表达藻蓝胆素重组载体pET32a-Eotaxin-2基因的构建图。
如图3所示，为本发明表达藻蓝胆素重组载体pMAL-p4X-Eotaxin-2基因的构建图。
如图4所示，为不同表达载体表达Eotaxin-2蛋白的优化图。(a)为DOT-Blot图，(b)为对应的柱状图，1、2、3分别为pMAL-p4X-Eotaxin-2/TB1、pET32a-Eotaxin-2/Origami、pET28a-Eotaxin-2/BL21(DE3)。
如图5所示，为不同诱导时机下Eotaxin-2蛋白表达量的优化图。(a)为DOT-Blot图，(b)为对应的柱状图。
如图6所示，为不同诱导温度下Eotaxin-2蛋白表达量的优化图。(a)为DOT-Blot图，(b)为对应的柱状图。
如图7所示，为His-Tagged-Eotaxin-2融合蛋白的纯化图。(a)为His-Tagged-Eotaxin-2用Ni2+亲和色谱柱纯化色谱图；(b)为SDS-PAGE和考马斯亮兰染色检测，M为蛋白电泳标准条带，1、2条带均为His-Tag-Eotaxin-2融合蛋白100％的Buffer B的洗脱液。
如图8所示，为Eotaxin-2蛋白的纯化图。(a)为His-Tagged-Eotaxin-2酶切后用Ni2+亲和色谱柱纯化色谱图；(b)为SDS-PAGE和考马斯亮兰染色检测，M为蛋白电泳标准条带，1、2、3、4、5条带分别为His-Tagged-Eotaxin-2融合蛋白的原样、酶切原样、流穿、100％的Buffer B的洗脱液、TEV酶。
如图9所示，为Eotaxin-2的质谱检测图。
如图10所示，为在DDM增溶下CCR3和购买自PeproTech有生物活性配体Eotaxin-2的SPR传感图谱。
如图11所示，为在DDM增溶下CCR3和本实验室制备的配体Eotaxin-2的SPR传感图谱。
Eotaxin-2的制备方法：根据NCBI数据库中Eotaxin-2成熟蛋白的氨基酸序列，对其密码子进行了优化，通过设计引物在其N端引入6个His标签、TEV酶切位点，并在N端和C端分别引入限制性酶切位点EcoR I和Hind III。利用PCR技术，将目的片段序列进行扩增，再将基因片段双酶切后连接到用相同酶切割后的表达载体上面，而后导入相应的大肠杆菌宿主细胞中进行异源表达。首先对表达载体、诱导时机、诱导温度和时间进行优化，选出最优表达条件。再根据最佳配比大规模培养重组大肠杆菌，诱导表达后收集菌体细胞，并进行高压破碎、高速离心、0.45μm微孔滤膜过滤、镍柱亲和层析、凝胶过滤脱盐、酶切除去His标签一系列分离纯化过程，最后得到纯度很高的蛋白，所得Eotaxin-2蛋白分子量为8.9kDa。
所述的表达载体为普通大肠杆菌表达载体，优选质粒pET28a、pET32a、pMAL-p4X，分别对应于大肠杆菌宿主细胞BL21(DE3)、Origami、TB1。
特别应指出的是在下列实施例中，使用的DNA提取、PCR扩增反应、表达载体构建和转化、大肠杆菌的培养、亲和色谱纯化以及活性分析等技术除特别说明外均是本领域普通技术人员所熟知的，并可在诸如《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年第三版)、《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯，R.E.金斯顿等著，马学军等译，科学出版社，2005年版)、《亲和色谱方法及应用》(于世林著化学工业出版社2008-08-01第一版)中整体引用。
实施例1
从NCBI数据库中获得Eotaxin-2的氨基酸序列，对其密码子进行优化后用人工合成的方法合成目的基因，所得核苷酸序列：GTT GTT ATT CCG TCA CCG TGC TGT ATG TTTTTC GTT TCG AAA CGT ATT CCG GAA AAC CGC GTT GTT AGT TAT CAG CTG AGC TCT CGTTCC ACC TGC CTG AAA GGC GGC GTC ATC TTT ACC ACG AAA AAA GGC CAG CAA TTC TGTGGT GAT CCG AAA CAG GAA TGG GTG CAA CGT TAC ATG AAA AAT CTG GAC GCG AAA CAGAAA AAA GCG AGC CCG CGT GCA CGC GCA GTG GCA TAA。
并在其N端加入6个His标签、TEV酶切位点，在N端和C端分别引入限制性酶切位点EcoR I和Hind III，最终目的基因构成为：
EcoR I site 6×His TEV cleavage site HindⅢsite
5-TATAGTGAATTC
Figure BDA0000905331130000111
GAAAACCTGTATTTTCAGGGT-Eotaxin-2-TAAAAGCTTACT-3。
再将基因片段双酶切后和用相同酶切割后的pET28a载体连接。具体操作方法如下：
(1)优化所得的Eotaxin-2的基因序列设计引物：
Eotaxin-2-fwd-EcoRⅠ：TAT AGT GAA TTC CAC CAT CAT CAC CAC CAT GAA AACCTG TAT TTT CAG GGT GTT GTT ATT CCG TCA CCG TGC TGT ATG
Eotaxin-2-rev-HindⅢ：AGT AAG CTT TTA TGC CAC TGC GCG TGC ACG CG
以合成的基因组DNA作为PCR反应扩增模板，经PCR扩增得到所需基因片段。PCR产物经Cycle pure试剂盒(Omega公司)纯化。将所得基因片段与pET28a载体用EcoR I和HindIII核酸内切酶37℃分别酶切12～16h、2～3h。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳后，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(普通离心柱型)(TIANGEN)回收胶产物，分别测定目的基因片段和载体的浓度，然后将基因片段与载体浓度10：1混合，在T4DNA连接酶作用下16℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α。利用含50ug/ml卡那青霉素的LB平板筛选，挑取阳性克隆，利用菌落PCR和DNA测序进行验证，得到重组表达载体pET28a-Eotaxin-2。用碱变性法提取出构建好的表达质粒PET28a-Eotaxin-2，转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)(索莱宝科技有限公司，下同)，得到能在T7启动子驱动下高效表达活性Eotaxin-2蛋白的大肠杆菌菌株P1。上述质粒提取、连接、转化以及阳性重组子的筛选和鉴定均参考《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年第三版)介绍的方法。
(2)从LB固体(含1.5％琼脂的LB培养基)平板上挑取基因工程菌菌株P1单菌落于5mL含50μg/mL卡那青霉素的液体LB培养基中，在恒温振荡培养箱中培养(温度：37℃，转速：170r/min)。将过夜培养物以1：100的比例接种于100mL TB培养基(含卡那青霉素50μg/mL)中。再此过程中对诱导时机、诱导温度和时间进行优化，得到以下条件：在恒温振荡培养箱中在温度37℃、转速170r/min的培养条件下培养至OD600＝1.0～1.2时加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG，Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)至终浓度为0.5mmol/L进行诱导。加入诱导剂后，在温度25℃、转速170r/min的培养条件下继续培养8h后停止。
(3)将收获的菌液在6000g条件下离心10min，弃上清液。收集的菌体用1×PBS缓冲液(常用生物试验试剂)洗涤2次后，将菌体重悬于相当于原培养物1/20体积预冷的1×PBS缓冲液中，并加入溶菌酶0.3mg/mL、DNase I 100u/mL用高压破碎仪破碎，压强为1000～15000bar，破碎前加入终浓度为1mmol/L PMSF，反复破碎3～4次。破碎过程中保持破碎液低温(4℃)。破碎后10000g、4℃离心30min，上清液用0.45μm微孔滤膜过滤后，在滤液中加入约体积比为5％的Buffer B(咪唑终浓度为25mmol/L)，在4℃下用微量泵将上清液以2mL/min流速通过HiTrapTM Chelating HP柱，带有His-Tag的融合蛋白被吸附，收集流穿液，4℃保存。
(4)首先向AKTA prime plus蛋白液相仪中通入Buffer A，调节、平衡体系的pH值、离子强度等。待体系平衡后调节仪器使100％Buffer A流过HiTrapTM Chelating HP柱，洗脱未挂上的蛋白。利用蛋白对280nm紫外光的吸收，测出蛋白的吸收峰。当吸收峰趋于平稳时，改用20％的Buffer B(10％的Buffer B+90％Buffer A)洗脱杂蛋白，收集样品；吸收峰趋于平稳后，用100％的Buffer B洗脱蛋白，收集洗脱蛋白，4℃保存待用。
(5)SDS-PAGE蛋白电泳
取4℃保存的用20％和100％的Buffer B洗脱的蛋白样品，做SDS-PAGE蛋白电泳。先用恒压100V运行10min，然后改用恒压150V至电泳结束。电泳结束后取下胶，用染色液快速染色0.5h，用脱色液脱色2次，每次1h。用凝胶成像系统记录结果。
(6)脱盐
a.平衡：将脱盐柱HiTrapTM Deasating(柱床体积为15mL)连接在AKTA prime plus蛋白液相仪中，先用超纯水冲洗脱盐柱，然后用1×PBS缓冲液平衡脱盐柱，流速4mL/min，平衡4个柱体积，至UV280nm曲线呈水平，归零。
b.上样：上样体积为柱床体积的20％，用注射器将100％的Buffer B洗脱的目的蛋白样品注入15mL上样柱，上样时流速0mL/min，每次上样3mL。
c.洗脱：1×PBS缓冲液洗脱，流速4mL/min。
d.收集：洗脱下的第一个峰为蛋白峰，后出的为盐峰，待峰过后，再次平衡脱盐柱至UV280nm曲线呈水平，再次上样，至所有洗脱样品脱完盐。脱盐样品用液氮骤速冷冻后-80℃保存。
(7)酶切条件的优化
在EP管中加入15μL脱盐产物，再分别加入0.0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0μLTEV酶，总体积为30μL，不足部分用PBS代替，同时加入只含TEV酶的对照，于4℃缓慢垂直混悬14h，以便TEV酶充分发挥酶切作用。反应完成后加入上样缓冲液，95℃加热5～10min，进行SDS-PAGE蛋白电泳检测。
(8)脱盐产物的TEV酶切反应
a.根据优化的最佳酶切反应条件，在脱盐产物中加入TEV酶，4℃反应14h。反应结束后，0.45μm微孔滤膜过滤，取样20μL于4℃保存。
b.把再生过的HiTrapTM Chelating HP柱连接到AKTA prime plus蛋白液相色谱仪上，用Buffer A冲洗平衡HiTrapTM Chelating HP柱。将过滤的样品在4℃条件下用蠕动泵上样，调节泵的流速和AKTA prime plus蛋白液相色谱仪的流速基本一致，利用UV280nm曲线监测蛋白的流出情况。当上完样后，依次用100％Buffer A、5％Buffer B、100％Buffer B冲洗镍柱，根据出峰情况，收集样品，4℃暂存。将收集的样品进行SDS-PAGE蛋白电泳。
(9)蛋白的质谱检测
a.用脱盐柱将酶切后的流穿液交换到超纯水中，将收集的样品在液氮下迅速冷冻，放入-80℃下冷冻2h，放入真空干燥箱进行冷冻干燥。冻干后的样品于-80℃保存。
b.取部分样品进行MALDI-TOF型质谱检测，确定所获得的蛋白为所需目的蛋白。
实施例2
(1)CCR3结合配体的生物活性研究方法
CCR3的生物活性是通过CCR3能否与其配体Eotaxin-2的相互作用来验证。在哺乳动物细胞中制备的CCR3的C末端有组氨酸标签，借助该标签使目的蛋白结合在芯片上，因而选择使用NTA芯片(GE Healthcare)，使用仪器是表面等离子共振仪器Biacore T100。
首先将NTA芯片活化，0.5mM的NiCl2以10μl/min流速流过NTA芯片，Ni2+结合在NTA芯片上，然后将带有组氨酸标签的CCR3流过芯片，该蛋白通过组氨酸标签特异性地结合Ni2+从而特异性地吸附在芯片上，当有配体Eotaxin-2(没有组氨酸标签)流过时，如果出现特异性结合曲线，就说明CCR3有结合配体的生物学活性，如果没有出现特异性结合曲线，就说明CCR3没有结合配体的生物学活性。考虑到NTA芯片本身可能会非特异性吸附配体Eotaxin-2，为排除非特异性吸附的干扰，实验中使用2个通道，其中一个是空白通道，另一个是实验通道，只有实验通道流过带组氨酸标签的CCR3，CCR3会特异性吸附在实验通道上，然后购买的有生物活性的配体Eotaxin-2流过串联的空白通道和实验通道，首先流过的是空白通道然后流过实验通道，用实验通道的吸附值减去空白通道的吸附值，如果是正值，说明该蛋白和配体有特异性相互作用，表明该蛋白有生物活性；如果是负值，说明该蛋白和配体没有特异性相互作用，表明该蛋白没有生物活性。实验中用的流动相是HEPES buffer(10mMHepes、0.15M NaCl、0.1％(wt/vol)表面活性剂，pH 7.4，0.45μm滤膜过滤)，流速是30μl/min，实验温度是25℃，CCR3和配体的相互作用可以实时地进行监测。为提高数据的可靠性，每个实验都设置5个浓度梯度，其中一个浓度梯度进行重复。此外，CXCL12作为阴性对照，CXCL12是CXCR4和CXCR7的特异配体，不是CCR3的配体，理论上不会和CCR3结合。
实验室制备的配Eotaxin-2也进行了一系列实验，实验过程和上面相同，都是使用两个通道，其中一个通道作为空白通道，每个实验都设置5个浓度梯度，其中一个浓度梯度进行重复。
(2)制备的CCR3生物活性验证
CCR3通过与细胞外配体和细胞内G蛋白的相互作用实现其生物学功能。为进一步确认提取的CCR3是否具有生物学活性，通过使用表面等离子共振技术(SPR)测定CCR3能否与其配体存在相互作用来分析CCR3是否具有生物活性。使用PeproTech公司已经验证活性的配体Eotaxin-2和CXCL12，Eotaxin-2是CCR3的配体，而CXCL12是CXCR4和CXCR7的特异性配体。实验中把已验证活性的Eotaxin-2作为阳性对照，CXCL12作为阴性对照。
SPR图谱结果(图10)说明实验室纯化的CCR3能与Eotaxin-2发生特异性结合，而无法与CXCL12特异性结合，这表明实验室利用哺乳动物细胞制备的CCR3是具有结合配体的生物学活性。该SPR实验是在DDM作为表面活性剂增溶的条件下进行的，CCR3结合Eotaxin-2的KD值是2.1×10-7M。
(3)实验室制备的Eotaxin-2生物活性验证
我们用验证有生物活性的CCR3和我们纯化的Eotaxin-2在与上述实验相同的实验条件下进行了SPR分析(图11)，二者结合的KD值为6.2×10-8，表明我们提取的Eotaxin-2也是有生物活性的。由以上结果：在DDM作为表面活性剂增溶的条件下，商业化已经验证活性的的Eotaxin-2与其受体CCR3作用的KD值为2.1×10-7M。而本实验室提取的Eotaxin-2与CCR3结合的KD值是6.2×10-8M，比商业化的Eotaxin-2与CCR3的结合亲和力高10倍左右，因此在相关疾病的治疗和药物的设计方面显示了更大的应用前景。
所有上述的首要实施这一知识产权，并没有设定限制其他形式的实施这种新产品和/或新方法。本领域技术人员将利用这一重要信息，上述内容修改，以实现类似的执行情况。但是，所有修改或改造基于本发明新产品属于保留的权利。
Figure BDA0000905331130000181
Figure IDA0000905331230000011
Figure IDA0000905331230000021

Claims (6)

1.一种高活性人细胞因子Eotaxin-2的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：根据NCBI数据库中Eotaxin-2的氨基酸序列，对其密码子进行了优化，人工合成目的基因；所得人工合成目的基因的核苷酸序列为：GTT GTT ATT CCGTCA CCG TGC TGTATG TTT TTC GTT TCG AAA CGT ATT CCG GAAAAC CGC GTT GTT AGT TAT CAG CTG AGCTCT CGT TCC ACC TGCCTG AAA GGC GGC GTC ATC TTT ACC ACG AAA AAA GGC CAG CAATTCTGT GGT GAT CCG AAA CAG GAA TGG GTG CAA CGT TAC ATGAAA AAT CTG GAC GCG AAACAG AAA AAA GCG AGC CCG CGT GCACGC GCA GTG GCA TAA；
步骤2：通过设计引物在其N端引入一个或多个His标签、TEV酶切位点，并在N端和C端分别引入限制性酶切位点EcoR I和Hind III；
步骤3：利用PCR技术将目的片段进行扩增，再将基因片段双酶切后连接到用相同酶切割后的载体上面，而后导入大肠杆菌中进行异源表达，生产Eotaxin-2蛋白；
步骤4：将诱导表达后的大肠杆菌收集、高压破碎、离心、过滤、镍柱亲和层析、凝胶过滤脱盐、酶切除去His标签后得到纯度很高的蛋白。
2.根据权利要求1所述高活性细胞因子的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，所得修饰后的人工合成目的基因的核苷酸序列为：
5-TATAGTGAATTCCACCATCATCACCACCATGAAAACCTGTATTTTCA GGGT GTT GTT ATT CCGTCACCG TGC TGT ATG TTT TTC GTT TCG AAA CGT ATT CCG GAAAAC CGC GTT GTT AGT TATCAG CTG AGC TCT CGT TCC ACC TGCCTG AAA GGC GGC GTC ATC TTT ACC ACG AAA AAAGGC CAG CAATTC TGT GGT GAT CCG AAA CAG GAA TGG GTG CAA CGT TAC ATGAAA AAT CTGGAC GCG AAA CAG AAA AAA GCG AGC CCG CGT GCACGC GCA GTG GCA TAA TAAAAGCTTACT-3。
3.一种人工合成目的基因，其特征在于，所述基因是根据NCBI数据库中Eotaxin-2的氨基酸序列，对其密码子进行了优化，人工合成目的基因；
所得人工合成目的基因的核苷酸序列为：GTT GTT ATT CCG TCA CCGTGC TGT ATG TTTTTC GTT TCG AAA CGT ATT CCG GAA AAC CGCGTT GTT AGT TAT CAG CTG AGC TCT CGTTCC ACC TGC CTG AAAGGC GGC GTC ATC TTT ACC ACG AAA AAA GGC CAG CAA TTC TGTGGTGAT CCG AAA CAG GAA TGG GTG CAA CGT TAC ATG AAA AATCTG GAC GCG AAA CAG AAAAAAGCG AGC CCG CGT GCA CGC GCAGTG GCA TAA。
4.一种修饰后的人工合成目的基因，其特征在于，所述基因是根据NCBI数据库中Eotaxin-2的氨基酸序列，对其密码子进行了优化，人工合成目的基因；所得人工合成目的基因的核苷酸序列为：GTT GTT ATT CCGTCA CCG TGC TGT ATG TTT TTC GTT TCG AAA CGTATT CCG GAAAAC CGC GTT GTT AGT TAT CAG CTG AGC TCT CGT TCC ACC TGCCTG AAA GGCGGC GTC ATC TTT ACC ACG AAA AAA GGC CAG CAATTC TGT GGT GAT CCG AAA CAG GAATGG GTG CAA CGT TAC ATGAAA AAT CTG GAC GCG AAA CAG AAAAAA GCG AGC CCG CGTGCACGC GCA GTG GCA TAA；
并通过设计引物在其N端引入一个或多个His标签、TEV酶切位点，并在N端和C端分别引入限制性酶切位点EcoR I和Hind III；
所得修饰后的人工合成目的基因的核苷酸序列为：
5-TATAGTGAATTCCACCATCATCACCACCATGAAAACCTGTATTTTCA GGGT GTT GTT ATT CCGTCACCG TGC TGT ATG TTT TTC GTT TCG AAA CGT ATT CCG GAAAAC CGC GTT GTT AGT TATCAG CTG AGC TCT CGT TCC ACC TGCCTG AAA GGC GGC GTC ATC TTT ACC ACG AAA AAAGGC CAG CAATTC TGT GGT GAT CCG AAA CAG GAA TGG GTG CAA CGT TAC ATGAAA AAT CTGGAC GCG AAA CAG AAA AAA GCG AGC CCG CGT GCACGC GCA GTG GCA TAA TAAAAGCTTACT-3。
5.一种如权利要求1～2中任一项所述高活性细胞因子的制备方法在制备治疗变应性鼻炎、哮喘、结直肠肿瘤、鼻息肉、艾滋病、过敏性疾病、寄生虫感染、系统性疾病、和/或炎症及免疫相关疾病的药物中的应用。
6.一种如权利要求3所述人工合成目的基因或权利要求4所述修饰后的人工合成目的基因在制备治疗变应性鼻炎、哮喘、结直肠肿瘤、鼻息肉、艾滋病、过敏性疾病、寄生虫感染、系统性疾病、和/或炎症及免疫相关疾病的药物中的应用。
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