CN113683676A - 一种环保的可逆的蛋白变性工艺 - Google Patents

一种环保的可逆的蛋白变性工艺 Download PDF

Info

Publication number
CN113683676A
CN113683676A CN202110995447.7A CN202110995447A CN113683676A CN 113683676 A CN113683676 A CN 113683676A CN 202110995447 A CN202110995447 A CN 202110995447A CN 113683676 A CN113683676 A CN 113683676A
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
solution
denaturation
renaturation
denaturing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202110995447.7A
Other languages
English (en)
Inventor
范豪
黄潇
平宪卿
刘高成
杨洋
连志福
刘筱烜
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hengjing Hechuang Biomedical Shanghai Co ltd
Original Assignee
Hengjing Hechuang Biomedical Shanghai Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hengjing Hechuang Biomedical Shanghai Co ltd filed Critical Hengjing Hechuang Biomedical Shanghai Co ltd
Priority to CN202110995447.7A priority Critical patent/CN113683676A/zh
Publication of CN113683676A publication Critical patent/CN113683676A/zh
Priority to PCT/CN2022/112646 priority patent/WO2023024960A1/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种环保的可逆的蛋白变性工艺。采用不含氮的变性液溶解需变性的蛋白，得到的变性蛋白经过复性过程，仍能得到具备生物活性的蛋白。该工艺既经济又环保，可适用于工业化大生产。

Description

一种环保的可逆的蛋白变性工艺
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体为一种环保的可逆的蛋白变性工艺。
背景技术
大肠杆菌表达系统因其易于操作、遗传背景清楚、生产成本低和表达水平高等优点而在科研或生产中被广泛应用。然而，重组蛋白在大肠杆菌中的高水平表达常导致蛋白聚集而形成不溶性的、无活性的包涵体。因此，我们需要通过有效的变性和复性过程，将包涵体蛋白转变成具有生物活性的重组蛋白。
包涵体蛋白通常需要加入变性溶液，以破坏维持包涵体蛋白结构的分子内和分子间作用力，从而使多肽链伸展达到溶解包涵体的作用。一般常用的变性溶液中含有离液剂或去垢剂。常用的离液剂如6～8mol/L盐酸胍或尿素，可破坏包涵体蛋白间的氢键而使蛋白增溶。盐酸胍一般用来溶解一些附加值比较高的药物蛋白分子，不适用于工业化生产。尿素因其价格低廉而被广泛使用，但在工业化的包涵体蛋白变性过程中，尿素的大量使用会产生两个问题，首先，高浓度尿素溶解是不断吸热的过程，需持续控制设备温度，对变性罐体设计有一定的要求；其次，使用尿素或盐酸胍等含氮量很高的化合物(尿素含氮量46％，盐酸胍含氮量44％)，由于氮元素在原核包涵体蛋白变复性及后续纯化过程中均无法被利用，因此所产生的含氮废液会造成环境污染，必须进行回收处理，这对企业的环保审核及环评工作是极大的限制性因素。常用的去垢剂为SDS，其主要缺点是难于去除，从而对后续纯化和复性步骤产生干扰，一般不用于大规模生产。
发明内容概述
本发明的目的在于提供一种环保的可逆的蛋白变性工艺。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种可工业化的环保的可逆的蛋白变性方法，具体包括以下步骤：
将需变性的蛋白与变性溶液混合形成变性反应液，调节变性反应液的pH值使得蛋白变性，获得变性后的蛋白，其中所述变性溶液中没有含氮的物质，并且变性反应液的pH值被调节为至少11。
所述变形溶液包括1～30mmol/L的碳酸氢钠缓冲液或1～30mmol/L的碳酸钠缓冲液。
所述变性溶液包括0.1～10mmol/L EDTA。
所述变性溶液包括还原剂，所述还原剂选自以下组中的一种或多种：β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸、三(2-羧乙基)膦；所述还原剂中每一种的浓度为0.05～30mmol/L。
所述变性反应液中不包括表面活性剂。
向所述变性反应液中加入碱性溶液来调节pH值，所述碱性溶液选自以下组中的一种：氢氧化钠、氢氧化钾；所述碱性溶液浓度为0.2～10mol/L。
所述的变性反应体系温度为15～40℃，较优选的温度为20～25℃。
所述的变性反应时间为15分钟以上和/或24小时以内。所述变性的蛋白溶液中的蛋白浓度为0.1～15g/L。
将所述的变性后的蛋白进行复性，获得具有生物活性的复性蛋白。
将所述的变性后的蛋白与复性溶液混合形成复性反应溶液，调节复性反应溶液pH值至7～12，使蛋白复性。
所述的复性反应温度为4～30℃，反应时间为2～48小时。
所述的复性溶液包括1～30mmol/L的碳酸氢钠缓冲液或碳酸钠缓冲液、1～50mmol/L甘氨酸缓冲液。
所述的复性溶液中包括蛋白酶抑制剂，所述蛋白酶抑制剂选自以下组中的一种或多种：EDTA、PMSF、胃蛋白酶抑制剂、亮抑蛋白酶肽、胰蛋白酶抑制剂、丝蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、酸性蛋白酶抑制剂和广谱蛋白酶抑制剂。
一种可逆的包涵体蛋白变性和复性方法，其特征在于，所述方法包括：将包涵体蛋白与变性溶液混合形成变性反应液，调节变性反应液的pH值使得蛋白变性，获得变性后的蛋白，其中所述变性溶液没有含氮的物质，并且变性反应液的pH值被调整为至少11；将变性后的蛋白复性，获得复性蛋白。
所述的复性蛋白，其浓度至少为0.1g/L。
本发明涉及可逆的蛋白变性方法，变性溶液不加含氮化合物，使蛋白在高pH环境下短时间内完全溶解，该工艺对变性设备无特殊设计要求，而且简化了操作步骤，极大地降低了工业化生产成本和时间，生产过程中也不会产生含氮废液，既经济又环保，适用于工业化大生产。
附图说明
图1A为实施例1中的重组人胰岛素前体蛋白的包涵体蛋白经过变性和复性处理后，再酶切后的样品HPLC图谱。
图1B为标准重组人胰岛素(3.47mg/mL)HPLC图谱。
图2为实施例2中的重组人胰岛素前体蛋白的包涵体蛋白经过变性和复性处理后，再酶切后的样品HPLC图谱。
图3为实施例3中的重组人胰岛素前体蛋白的包涵体蛋白经过变性和复性处理后，再酶切后的样品HPLC图谱。
发明内容详述
本发明针对现有的技术缺陷，提供一种可工业化的环保的可逆的蛋白(例如原核包涵体蛋白)的变性工艺，采用不含氮的变性溶液溶解需变性的蛋白，变性设备无特殊设计要求，简化了变性操作步骤，得到的变性蛋白经过复性过程，仍能得到具备生物活性的蛋白，极大地降低工业化的成本及时间，生产过程中也不会产生含氮废液，既经济又环保。
如下将参照以示例性的方式示出本申请的某些实施方案来详细描述本申请。尽管结合列举的实施方案对本申请进行了描述，但应了解其不旨在将本申请限定为所描述的那些实施方案。相反，本申请旨在涵盖落入权利要求书所限定的范围内的所有替代方式、修改方式和等同方式。本领域技术人员将会认识到可用于实施本申请的与本文描述的方法和材料类似或等同的其他方法和材料，本申请不以任何方式局限于所描述的方法和材料。当所引用的文献和类似材料不同于本申请的描述或与本申请的描述(包括限定的术语、术语使用、技术等)矛盾时，以本申请的描述为准。
还应理解在不同实施方案中描述的某些特征也可在单个实施方案中组合提供。反之，在单个实施方案中描述的多种特征也可以单独提供或以任何适当的亚组合提供。
还应理解本文所记载的数值点旨在包括各数值点本身，以及任意两个所记载的点之间的数值范围(如同这些数值范围已经单独列出)。
根据本申请的一个方面，本申请提供一种可逆的蛋白变性方法，所述方法包括：将需变性的蛋白与变性溶液混合形成变性反应液，调整变性反应液的pH值使得蛋白变性，获得变性后的蛋白，其中所述变性溶液没有含氮的物质，并且变性反应液的pH值被调整为至少11。
本申请中所述的“变性”是指对蛋白分子进行处理，在不改变蛋白质分子一级结构的情况下，破坏其所处的二级结构和/或三级结构和/或四级结构。
本申请中所述的“复性”是指对变性后的蛋白分子进行处理，使得所述蛋白分子部分或全部恢复其二级结构和/或三级结构和/或四级结构，并使其部分或全部恢复生物活性。
本申请中所述的“可逆的蛋白变性”是指经过变性处理的蛋白分子，再经过复性处理后，仍然可以恢复部分或者全部生物活性。
在某些实施方式中，本申请的蛋白变性方法中使用的变性溶液包括碳酸氢钠缓冲液或碳酸钠缓冲液。在某些实施例中，所述变性溶液包括1～30mmol/L的碳酸氢钠缓冲液，或1～30mmol/L碳酸钠缓冲液。在某些实施例中，所述变性溶液包括1～20mmol/L的碳酸氢钠缓冲液，或1～20mmol/L碳酸钠缓冲液。在某些实施例中，所述变性溶液包括1～10mmol/L的碳酸氢钠缓冲液，或1～10mmol/L碳酸钠缓冲液。
在某些实施方式中，本申请的蛋白变性方法中使用的变性溶液进一步包括EDTA(乙二胺四乙酸),例如0.1～10mmol/L EDTA，或者0.1～8mmol/L EDTA，或者0.1～6mmol/LEDTA，或者0.1～4mmol/L EDTA，或者0.1～2mmol/L EDTA。
在某些实施例中，本申请的蛋白变性方法中使用的变性溶液进一步包括还原剂，所述还原剂选自以下组中的一种或多种：β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸、三(2-羧乙基)膦。在某些实施例中，所述还原剂中每一种的浓度为0.05～30mmol/L，0.05～25mmol/L，0.05～20mmol/L，0.05～15mmol/L，0.05～10mmol/L，0.05～8mmol/L，0.05～6mmol/L，0.05～4mmol/L，0.05～2mmol/L，0.05～1mmol/L，0.05～0.5mmol/L，0.5～30mmol/L，0.5～25mmol/L，0.5～20mmol/L，0.5～15mmol/L，0.5～10mmol/L，0.5～8mmol/L，0.5～6mmol/L，0.5～4mmol/L，0.5～2mmol/L，0.5～1mmol/L，1～30mmol/L，1～25mmol/L，1～20mmol/L，1～15mmol/L，1～10mmol/L，1～8mmol/L，1～6mmol/L，1～4mmol/L，1～2mmol/L，2～30mmol/L，2～25mmol/L，2～20mmol/L，2～15mmol/L，2～10mmol/L，2～8mmol/L，2～6mmol/L，2～4mmol/L，4～30mmol/L，4～25mmol/L，4～20mmol/L，4～15mmol/L，4～10mmol/L，4～8mmol/L，4～6mmol/L，6～30mmol/L，6～25mmol/L，6～20mmol/L，6～15mmol/L，6～10mmol/L，6～8mmol/L，8～30mmol/L，8～25mmol/L，8～20mmol/L，8～15mmol/L，8～10mmol/L，10～30mmol/L，10～25mmol/L，10～20mmol/L，或者10～15mmol/L。
在某些实施方式中，本申请的变性溶液或者变性反应液中不包括含氮物质，例如，盐酸胍、尿素。需变性的蛋白中含有氮元素不应被认为变性反应液中含氮。
在某些实施方式中，本申请的变性溶液或者变性反应液中不包括表面活性剂。表面活性剂的例子包括但不限于：非离子表面活性剂，例如聚乙二醇、多元醇类表面活性剂等；阴离子去垢剂，如：十二烷基硫酸钠和十二烷基璜酸钠等；阳离子去垢剂；生物表面活性剂，及两性表面活性剂。
需变性的蛋白可以以任何适合的方式和顺序与变性溶液进行混合。在某些实施方式中，需变性的蛋白可以先被加入到缓冲液中，然后再加入还原剂。在某些实施方式中，缓冲液可以先与还原剂混合后，将需变性的蛋白加入到混合物中。在某些实施方式中，还原剂和需变性的蛋白也可以同时加入到缓冲液中。在某些实施方式中，需变性的蛋白还可以与缓冲液、还原剂和碱性溶液同时混合或者按照其他顺序混合。
在某些实施方式中，在本申请的需变性的蛋白与缓冲液、还原剂的混合溶液中加入碱性溶液来调节混合溶液的pH值。所述碱性溶液可以按照需要的顺序与需变性的蛋白、缓冲液、还原剂进行混合。本申请的蛋白变性方法中使用的碱性溶液选自以下组中的一种：氢氧化钠、氢氧化钾。在某些实施方式中，所述碱性溶液浓度为0.2～10mol/L，0.2～8mol/L，0.2～6mol/L，0.2～4mol/L，0.2～2mol/L，0.2～1mol/L，1～10mol/L，1～8mol/L，1～6mol/L，1～4mol/L，1～2mol/L，4～10mol/L，4～8mol/L，4～6mol/L，6～10mol/L，6～8mol/L或8～10mol/L。在某些实施方式中，本申请的蛋白变性方法中，将变性反应液pH值调节为至少11、至少11.5、至少12、或者至少12.5。在某些实施方式中，将变性反应液pH值调节为11-14，11-13，11-12.5，11-12，11.5-12.5或者11.5-12。
在某些实施方式中，本申请的蛋白变性方法中，控制变性反应的温度为15～40℃，15～35℃，15～30℃，15～25℃，15～20℃，20～40℃，20～35℃，20～30℃，20～25℃，25～40℃，25～35℃，25～30℃，30～40℃，30～35℃，或者35～40℃。在某些实施方式中，控制变性反应的温度为40℃、35℃、30℃、25℃、22℃、20℃、或15℃。
在某些实施方式中，本申请的蛋白变性方法中，控制变性反应时间为15分钟及以上，30分钟及以上，或者60分钟及以上。在某些实施方式中，控制变性反应时间为24小时及以内，12小时及以内，6小时及以内，或者3小时及以内。在某些实施方式中，控制变性反应时间为约15分钟至约24小时，约15分钟至约20小时，约15分钟至约16小时，约15分钟至约12小时，约15分钟至10小时，约15分钟至约8小时，约15分钟至约6小时，约15分钟至约4小时，约15分钟至约3小时，约15分钟至约2小时，约15分钟至约1小时，约15分钟至约40分钟，约15分钟至约30分钟，约20分钟至约24小时，约20分钟至约20小时，约20分钟至约16小时，约20分钟至约12小时，约20分钟至10小时，约20分钟至约8小时，约20分钟至约6小时，约20分钟至约4小时，约20分钟至约3小时，约20分钟至约2小时，约20分钟至约1小时，约20分钟至约40分钟，约20分钟至约30分钟，约30分钟至约24小时，约30分钟至约20小时，约30分钟至约16小时，约30分钟至约12小时，约30分钟至10小时，约30分钟至约8小时，约30分钟至约6小时，约30分钟至约4小时，约30分钟至约3小时，约30分钟至约2小时，约30分钟至约1小时，约60分钟至约24小时，约60分钟至约20小时，约60分钟至约16小时，约60分钟至约12小时，约60分钟至10小时，约60分钟至约8小时，约60分钟至约6小时，约60分钟至约4小时，约60分钟至约3小时或约60分钟至约2小时。在某些实施方式中，控制变性反应时间为约15分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约12小时、约16小时、约20小时或约24小时。
在某些实施方式中，本申请的蛋白变性方法中，将变性反应液pH值调节为11～12之间，并且控制变性反应时间为15分钟～8个小时、或者15分钟～4个小时、或者15分钟～2个小时、或者15分钟～1个小时。
在某些实施方式中，本申请的蛋白变性方法中，将变性反应液pH值调节为12～13之间，并且控制变性反应时间为15分钟～4个小时、或者15分钟～2个小时、或者15分钟～1个小时。
在某些实施方式中，本申请的蛋白变性方法中，将变性反应液pH值调节为13～14之间，并且控制变性反应时间为15分钟～2个小时、或者15分钟～1个小时、或者15分钟～30分钟。
在某些实施方式中，本申请的蛋白变性方法中，将变性反应液pH值调节为11～12之间，并且控制变性反应时间为15分钟～8个小时、或者15分钟～4个小时、或者15分钟～2个小时、或者15分钟～1个小时，并且控制变性反应温度为15～25℃、或者20～30℃，或者25～40℃。
在某些实施方式中，本申请的蛋白变性方法中，将变性反应液pH值调节为12～13之间，并且控制变性反应时间为15分钟～4个小时、或者15分钟～2个小时、或者15分钟～1个小时，并且控制变性反应温度为15～25℃、或者20～30℃，或者25～40℃。
在某些实施方式中，本申请的蛋白变性方法中，将变性反应液pH值调节为13～14之间，并且控制变性反应时间为15分钟～2个小时、或者15分钟～1个小时、或者15分钟～30分钟，并且控制变性反应温度为15～25℃、或者20～30℃，或者25～40℃。
在某些实施方式中，需变性的蛋白为原核细菌表达的包涵体蛋白，例如大肠杆菌表达的包涵体蛋白。
在某些实施方式中，所述包涵体蛋白包括重组表达的多肽或寡肽。在某些实施方式中，所述重组表达的蛋白为单纯蛋白质或结合蛋白质。单纯蛋白质的例子包括但不限于：白蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白、组蛋白或精蛋白。结合蛋白质的例子包括但不限于：磷蛋白、核蛋白、糖蛋白、色蛋白、脂蛋白、金属蛋白或融合蛋白。在某些实施方式中，需变性的蛋白为卵白蛋白、血清白蛋白、血清球蛋白、单克隆抗体、小麦中的谷蛋白、玉米胶蛋白、麦胶蛋白、角蛋白、弹性蛋白、胶原蛋白、胸腺组蛋白、酪蛋白、卵黄磷蛋白、黏蛋白、凝集素、病毒糖蛋白、红细胞生成素、血红蛋白、黄素蛋白、高密度脂蛋白胆固醇或低密度脂蛋白胆固醇。在某些实施方式中，需变性的蛋白为水解酶、氧化还原酶、转移酶、裂解酶、异构酶或连接酶。在某些实施方式中，需变性的蛋白为趋化肽、免疫调节剂、细胞因子、多肽激素、内啡肽、生物活性肽或生物活性亚单位肽。在某些实施方式中，需变性的蛋白为淋巴因子、白细胞介素、造血生长因子、垂体激素、甲状旁腺激素、胰腺激素、黑色素细胞刺激素、催产素、血管加压素、内皮素和干扰素。垂体激素的例子包括但不限于：生长激素释放因子、促体素、人类生长因素、体蛋白、卵泡刺激素、黄体生成素、人类绒毛膜促性腺激素、促甲状腺素、促皮质素和下丘脑素。胸腺激素的例子包括但不限于：胰岛素、胰高糖素、胰淀素和胰抑制素。
在某些实施方式中，本申请的蛋白变性方法中，所述变性的蛋白溶液中的蛋白最终浓度为0.1～15g/L，0.1～10g/L，0.1～8g/L，0.1～6g/L，0.1～4g/L，0.1～2g/L，0.1～1g/L，1～15g/L，1～10g/L，1～8g/L，1～6g/L，1～4g/L，1～2g/L，2～15g/L，2～10g/L，2～8g/L，2～6g/L，2～4g/L，4～15g/L，4～10g/L，4～8g/L，4～6g/L，6～15g/L，6～10g/L，6～8g/L，8～15g/L，8～10g/L，或10～15g/L。
在某些实施方式中，本申请的蛋白变性方法为可逆的蛋白变性方法。在某些实施方式中，将变性后的蛋白进行蛋白复性，获得具有生物活性的复性蛋白。可根据待复性蛋白的物理和化学特性，选择适当的复性溶液和复性条件。
在某些实施方式中，本申请的蛋白变性方法中，将变性后的蛋白加入复性溶液，形成复性反应液。调节复性反应液的pH值至7～12，7～11.5，7～11，7～10.5，7～10，7～9.5，7～9，7～8.5，7～8，8～12，8～11.5，8～11，8～10.5，8～10，8～9.5，8～9，8～8.5，9～12，9～11.5，9～11，9～10.5，9～10，9～9.5，9.5～12，9.5～11.5，9.5～11，9.5～10.5，9.5～10，10～12，10～11.5，10～11，10.5～12，10.5～11.5，10.5～11，11～12或11.5～12，使蛋白复性。在某些实施方式中，本申请的蛋白变性方法中，调节复性溶液或者复性反应液的pH值使其低于变性溶液或者变性反应液中的pH值。
在某些实施方式中，本申请的蛋白变性方法中，调节复性溶液或者复性反应液的pH值的溶液包括酸性溶液和/或碱性溶液。在某些实施方式中，调节复性溶液pH值的溶液包含盐酸、氢氧化钠。
在某些实施方式中，本申请的蛋白变性方法中，控制复性反应温度为4～30℃，4～25℃，4～20℃，4～15℃，4～10℃，10～30℃，10～25℃，10～20℃，10～15℃，15～30℃，15～25℃，15～20℃，20～30℃，20～25℃或25～30℃。在某些实施方式中，控制复性反应温度为30℃、25℃、22℃、20℃、15℃、10℃或4℃。
在某些实施方式中，本申请的蛋白变性方法中，控制复性反应时间为约2小时至约48小时，约2小时至约44小时，约2小时至约40小时，约2小时至约36小时，约2小时至约32小时，约2小时至约28小时，约2小时至约24小时，约2小时至约20小时，约2小时至约16小时，约2小时至约12小时，约2小时至约10小时，约2小时至约8小时，约2小时至约6小时，约2小时至约4小时。
在某些实施方式中，本申请的蛋白变性方法中，通过添加复性溶液来稀释变性后的蛋白，降低蛋白浓度，辅助蛋白复性的进行。
在某些实施方式中，本申请的蛋白变性方法中，所述的复性溶液包括碳酸钠、碳酸氢钠或甘氨酸。
在某些实施方式中，本申请的蛋白变性方法中，所述复性溶液包括蛋白酶抑制剂，所述蛋白酶抑制剂选自以下组中的一种或多种：EDTA、PMSF、胃蛋白酶抑制剂、亮抑蛋白酶肽、胰蛋白酶抑制剂、丝蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、酸性蛋白酶抑制剂和广谱蛋白酶抑制剂。
在某些实施方式中，本申请的蛋白变性方法中，所述复性溶液还包含氧化-还原体系和/或复性添加剂，以减少复性过程中，中间体和多聚体的形成，辅助蛋白折叠。在某些实施方式中，所述氧化-还原体系选自以下组中的一种或多种：还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽、二硫苏糖醇/氧化型谷胱甘肽、或者二硫赤糖醇/氧化型谷胱甘肽。在某些实施例中，所述氧化-还原体系中每一种的浓度为0.1～10mmol/L，0.1～8mmol/L，0.1～6mmol/L，0.1～4mmol/L，0.1～2mmol/L，0.1～1mmol/L，0.1～0.5mmol/L，0.5～10mmol/L，0.5～8mmol/L，0.5～6mmol/L，0.5～4mmol/L，0.5～2mmol/L，0.5～1mmol/L，1～10mmol/L，1～8mmol/L，1～6mmol/L，1～4mmol/L，1～2mmol/L，2～10mmol/L，2～8mmol/L，2～6mmol/L，2～4mmol/L，4～10mmol/L，4～8mmol/L，4～6mmol/L，6～10mmol/L，6～8mmol/L，或8～10mmol/L。
在某些实施方式中，所述复性添加剂包含分子伴侣，例如：伴侣素10、小热休克蛋白、Hsp40、Hsp60、Hsp70、Hsp90、Hsp100、Hsp110等。在某些实施方式中，所述复性添加剂包含L-精氨酸、甘油、聚乙二醇(PEG)、Cu2+、Zn2+。在某些实施方式中，复性溶液中L-精氨酸的含量为0.5-1.0mol/L。在某些实施方式中，复性溶液中甘油的含量为5％-30％。在某些实施方式中，复性溶液中聚乙二醇(PEG)的含量为0.1-2g/L。在某些实施方式中，复性溶液中Cu2+或Zn2+的含量为0.01-0.3mmol/L。
在某些实施方式中，本申请的蛋白变性方法中，所述复性溶液包括1～30mmol/L的碳酸氢钠缓冲液或碳酸钠缓冲液、1～50mmol/L甘氨酸缓冲液，和0.1～10mmol/L EDTA。在某些实施方式中，所述复性溶液包括1～25mmol/L的碳酸氢钠缓冲液或碳酸钠缓冲液、1～40mmol/L甘氨酸缓冲液，和0.1～8mmol/L EDTA。在某些实施方式中，所述复性溶液包括1～20mmol/L的碳酸氢钠缓冲液或碳酸钠缓冲液、1～20mmol/L甘氨酸缓冲液，和0.1～6mmol/LEDTA。在某些实施方式中，所述复性溶液包括1～15mmol/L的碳酸氢钠缓冲液或碳酸钠缓冲液、1～15mmol/L甘氨酸缓冲液，和0.1～4mmol/L EDTA。在某些实施方式中，所述复性溶液包括1～10mmol/L的碳酸氢钠缓冲液或碳酸钠缓冲液、1～10mmol/L甘氨酸缓冲液，和0.1～2mmol/L EDTA。
在某些实施方式中，本申请的蛋白变性方法中，将变性后的蛋白和复性溶液混合，变性后的蛋白可以以任何适合的方式与复性溶液进行混合，在某些实施方式中，变性后的蛋白或蛋白溶液可以先被加入到复性溶液中，然后再加入复性氧化-还原体系和/或复性添加剂。在某些实施方式中，复性溶液可以先与复性氧化-还原体系和/或复性添加剂混合后，再将变性后蛋白加入到混合物中。在某些实施方式中，变性后蛋白、复性溶液与复性氧化-还原体系和/或复性添加剂混合后，逐渐加入酸性溶液和/或碱性溶液调节混合物pH值。
在某些实施方式中，本申请的蛋白变性方法中，复性蛋白恢复了至少50％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％或至少95％的生物活性。在某些实施方式中，复性蛋白的生物活性是其原始天然生物活性的50％以上，或者60％以上，或者70％以上，或者80％以上，或者90％以上，或者95％以上。在某些实施方式中，复性蛋白的生物活性比蛋白复性前提高了1倍、2倍、3倍、5倍或者10倍。
可以使用常规的检测方法，对获得的复性蛋白进行结构和生物活性的检测。可以使用的检测方法包括高效液相色谱法和紫外分光光度法等。复性蛋白的生物活性可根据蛋白的活性和功能特征使用合适的活性检测办法。
在某些实施方式中，对根据本申请的蛋白变性方法获得的复性蛋白进行高效液相色谱分析(HPLC)，检测获得的复性蛋白及其浓度。在某些实施方式中，复性蛋白的浓度至少为0.1g/L。
在某些实施方式中，对根据本申请的蛋白变性方法获得的复性蛋白进行紫外分光光度分析，检测获得的复性蛋白的活力。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1.重组人胰岛素前体的变复性
1)将2克重组人胰岛素前体蛋白在大肠杆菌中表达的包涵体蛋白悬浮于998mL10mmol/L碳酸氢钠和0.2mmol/L EDTA的基础缓冲液中，再加入0.1mmol/Lβ-巯基乙醇，用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH为11.9；控制反应体系的温度为20℃，搅拌20分钟，使包涵体蛋白完全溶解，得到2g/L的变性蛋白溶液。
2)将变性蛋白溶液加入含10mmol/L碳酸氢钠和0.2mmol/L EDTA的稀释缓冲液中形成复性反应液，使复性反应液中的重组人胰岛素前体蛋白浓度为1g/L，然后通过添加盐酸溶液调节溶液pH至11，控制复性体系温度为4℃，反应24小时，使蛋白复性。在复性反应之后的溶液中加入羧肽酶B和胰蛋白酶，将人胰岛素前体蛋白酶切激活，取酶切液5μL经HPLC分析检测，样品图谱见图1A，所得图谱与标准重组人胰岛素的HPLC图谱(图1B)相对应，证实所得产物为重组人胰岛素。重组人胰岛素HPLC图谱的保留时间为23.6分钟，根据重组人胰岛素的峰面积归一化法计算实际得到的重组人胰岛素的浓度为0.15g/L
实施例2.重组人胰岛素前体蛋白的变复性
1)将6克重组人胰岛素前体蛋白在大肠杆菌中表达的包涵体蛋白悬浮于994mL2mmol/L碳酸钠和0.2mmol/L EDTA的基础缓冲液中，再加入0.2mmol/Lβ-巯基乙醇，用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH为12.1；控制反应体系的温度为22℃，搅拌20分钟，使包涵体蛋白完全溶解，得到6g/L的变性蛋白溶液。
2)将变性蛋白溶液加入含2mmol/L碳酸氢钠和0.2mmol/L EDTA的稀释缓冲液中形成复性反应液，使复性反应液中的重组人胰岛素前体蛋白浓度为1g/L，然后通过添加盐酸溶液调节溶液pH至11.5，控制复性体系温度为4℃，反应24小时，使蛋白复性。在复性反应之后的溶液中加入羧肽酶B和胰蛋白酶，将人胰岛素前体蛋白酶切激活，取酶切液5μL经HPLC分析检测，样品图谱见图2，所得图谱与标准重组人胰岛素的HPLC图谱(图1B)相对应，证实所得产物为重组人胰岛素。重组人胰岛素HPLC图谱的保留时间为23.6分钟，根据重组人胰岛素的峰面积归一化法计算实际得到的重组人胰岛素的浓度为0.19g/L。
实施例3.重组人胰岛素前体蛋白的变复性
1)将12克重组人胰岛素前体蛋白在大肠杆菌中表达的包涵体蛋白悬浮于988mL2mmol/L碳酸钠和0.2mmol/L EDTA的基础缓冲液中，再加入0.2mmol/Lβ-巯基乙醇，用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH为12.5；控制反应体系的温度为22℃，搅拌20分钟，使包涵体蛋白完全溶解，得到12g/L的变性蛋白溶液。
2)将变性蛋白溶液加入含2mmol/L碳酸氢钠和0.2mmol/L EDTA的稀释缓冲液中形成复性反应液，使复性反应液的重组人胰岛素前体蛋白浓度为1g/L，然后通过添加盐酸溶液调节溶液pH至11.5，控制复性体系温度为4℃，反应24小时，使蛋白复性。在复性反应之后的溶液中加入羧肽酶B和胰蛋白酶，将人胰岛素前体蛋白酶切激活，取酶切液5μL经HPLC分析检测，样品图谱见图3，所得图谱与标准重组人胰岛素的HPLC图谱(图1B)相对应，证实所得产物为重组人胰岛素。重组人胰岛素HPLC图谱的保留时间为23.6分钟，根据重组人胰岛素的峰面积归一化法计算实际得到的重组人胰岛素的浓度为0.18g/L。
实施例4.重组猪羧肽酶B前体蛋白的变复性
1)将6克重组猪羧肽酶B前体蛋白在大肠杆菌中表达的包涵体蛋白悬浮于994mL5mmol/L碳酸钠缓冲液中，再加入10mmol/Lβ-巯基乙醇#,用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH值为11.5；控制反应体系的温度为25℃，搅拌30分钟，直至包涵体蛋白完全溶解，得到6g/L的变性蛋白溶液。
2)将变性蛋白溶液加入含5mmol/L甘氨酸的稀释缓冲液中形成复性液，使复性液的重组羧肽酶B前体蛋白浓度为0.2g/L，然后通过添加盐酸溶液调节溶液pH至9.5，控制复性体系温度为20℃，反应24小时。在复性反应之后的溶液中加入胰蛋白酶，将羧肽酶B前体蛋白酶切激活，取酶切液100μL，用紫外分光光度计测定羧肽酶B活性。测定方法如下：
将100μL酶切液稀释3倍，取干净的石英比色皿，加入100μL稀释液和2.9mL底物溶液(0.1mol/L马脲酰-L-精氨酸溶液)，立即混匀，在254nm波长下，立即将吸光值调零。保持环境温度为25℃左右，每隔1分钟记录吸光值。连续测定5-10分钟，测定结果如下表所示。取1-6min的测定值计算酶活力。经计算，每1L复性液经酶切获得的重组羧肽酶B的活力为4250IU。
Figure BDA0003233940680000131
Figure BDA0003233940680000141
实施例5.重组猪胰蛋白酶前体蛋白的变复性
1)将8克重组猪胰蛋白酶前体蛋白在大肠杆菌中表达的包涵体蛋白悬浮992mL2mmol/L碳酸钠和0.2mmol/L EDTA的基础缓冲液中，再加入4mmol/Lβ-巯基乙醇,用2mol/L氢氧化钠溶液调节pH值为12.0；控制反应体系的温度为25℃，搅拌35分钟，直至包涵体蛋白完全溶解，得到8g/L的变性蛋白溶液。
2)将变性蛋白溶液加入含5mmol/L甘氨酸的稀释缓冲液中形成复性液，使复性液的重组猪胰蛋白酶前体蛋白浓度为0.4g/L，然后通过添加盐酸溶液调节溶液pH至10.5，控制复性体系温度为15℃，反应24小时。在复性反应之后的溶液中加入胰蛋白酶，将胰蛋白酶前体蛋白酶切激活，取酶切液100μL，用紫外分光光度计测定胰蛋白酶的活性。测定方法如下：
将100μL酶切液稀释50倍，取干净的石英比色皿，加入200μL稀释液和3mL底物溶液(0.025mmol/L N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯盐酸盐)，立即混匀，在253nm波长下，立即置吸光值为零。保持环境温度为25℃左右，每隔30秒记录吸光值。连续测定3分钟，测定结果如下表所示。经计算，每1L复性液经酶切获得的重组胰蛋白酶的活力为3583000IU。
时间 0s 30s 60s 90s 120s 150s 180s
A<sub>253nm</sub> 0.002 0.024 0.045 0.067 0.088 0.114 0.131

Claims (24)

1.一种可逆的蛋白变性方法，其特征在于，所述方法包括：将需变性的蛋白与变性溶液混合形成变性反应液，调节变性反应液的pH值使得蛋白变性，获得变性后的蛋白，其中所述变性溶液中没有含氮的物质，并且变性反应液的pH值被调节为至少11。
2.根据权利要求1所述的蛋白变性方法，其特征在于，所述变性溶液包括1～30mmol/L的碳酸氢钠缓冲液或1～30mmol/L碳酸钠缓冲液。
3.根据权利要求2所述的蛋白变性方法，其特征在于，所述变性溶液进一步包括0.1～10mmol/L EDTA。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的蛋白变性方法，其特征在于，所述变性溶液包括还原剂，所述还原剂选自以下组中的一种或多种：β-巯基乙醇、二硫苏糖醇、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸、三(2-羧乙基)膦；所述还原剂中每一种的浓度为0.05～30mmol/L。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的蛋白变性方法，其特征在于，所述变性反应液中不包括表面活性剂。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的蛋白变性方法，其特征在于，向所述变性反应液中加入碱性溶液来调节pH值，所述碱性溶液选自以下组中的一种：氢氧化钠、氢氧化钾；所述碱性溶液浓度为0.2～10mol/L。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的蛋白变性方法，其特征在于，所述方法包括将pH值调节为至少11.5、至少12、或者至少12.5。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的蛋白变性方法，其特征在于，控制变性反应的温度为15～40℃或15～25℃。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的蛋白变性方法，其特征在于，控制变性反应时间为15分钟以上，30分钟以上，或者60分钟以上。
10.根据权利要求9所述的蛋白变性方法，其特征在于，控制变性反应时间为24小时以内，12小时以内，6小时以内，或者3小时以内。
11.根据权利要求1-6中任一项所述的蛋白变性方法，其特征在于，所述方法包括将pH值调节为11～14之间，并且控制变性反应时间为15分钟～8个小时。
12.根据权利要求11中所述的蛋白变性方法，其特征在于，所述方法控制变性反应温度为15～40℃。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的蛋白变性方法，其特征在于，所述需变性的蛋白为包涵体蛋白。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的蛋白变性方法，其特征在于，所述变性的蛋白溶液中的蛋白浓度为0.1～15g/L。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的蛋白变性方法，其特征在于，将变性后的蛋白进行复性，获得具有生物活性的复性蛋白。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的蛋白变性方法，其特征在于，将变性后的蛋白与复性溶液混合形成复性反应溶液，调节复性反应溶液pH值至7～12，使蛋白复性。
17.根据权利要求16所述的蛋白变性方法，其特征在于，控制复性反应温度为4～30℃，反应时间为2～48小时。
18.根据权利要求16所述的蛋白变性方法，其特征在于，所述的复性溶液为碳酸钠、碳酸氢钠或甘氨酸。
19.根据权利要求15-18中任一项所述的蛋白变性方法，其特征在于，所述复性溶液中包括蛋白酶抑制剂。
20.根据权利要求19中所述的蛋白变性方法，其特征在于，所述蛋白酶抑制剂选自以下组中的一种或多种：EDTA、PMSF、胃蛋白酶抑制剂、亮抑蛋白酶肽、胰蛋白酶抑制剂、丝蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、酸性蛋白酶抑制剂和广谱蛋白酶抑制剂。
21.根据权利要求20中所述的蛋白变性方法，其特征在于，所述复性溶液包括1～30mmol/L的碳酸氢钠缓冲液或碳酸钠缓冲液、1～50mmol/L甘氨酸缓冲液，和0.1～10mmol/L EDTA。
22.一种可逆的包涵体蛋白变性和复性方法，其特征在于，所述方法包括：将包涵体蛋白与变性溶液混合形成变性反应液，调节变性反应液的pH值使得蛋白变性，获得变性后的蛋白，其中所述变性溶液没有含氮的物质，并且变性反应液的pH值被调整为至少11；将变性后的蛋白复性，获得复性蛋白。
23.根据权利要求22所述的方法获得的复性蛋白。
24.根据权利要求23所述的复性蛋白，其浓度至少为0.1g/L。
CN202110995447.7A 2021-08-27 2021-08-27 一种环保的可逆的蛋白变性工艺 Pending CN113683676A (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110995447.7A CN113683676A (zh) 2021-08-27 2021-08-27 一种环保的可逆的蛋白变性工艺
PCT/CN2022/112646 WO2023024960A1 (zh) 2021-08-27 2022-08-16 一种环保的可逆的蛋白变性工艺

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110995447.7A CN113683676A (zh) 2021-08-27 2021-08-27 一种环保的可逆的蛋白变性工艺

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN113683676A true CN113683676A (zh) 2021-11-23

Family

ID=78583367

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110995447.7A Pending CN113683676A (zh) 2021-08-27 2021-08-27 一种环保的可逆的蛋白变性工艺

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN113683676A (zh)
WO (1) WO2023024960A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023024960A1 (zh) * 2021-08-27 2023-03-02 恒敬合创生物医药（浙江）有限公司 一种环保的可逆的蛋白变性工艺

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020137157A1 (en) * 1998-07-09 2002-09-26 Theodore W. Randolph High pressure refolding of protein aggregates and inclusion bodies
AU2007202306A1 (en) * 1999-08-12 2007-06-14 Barofold, Inc. Improved protein disaggregation and refolding using high pressure
CN101220079A (zh) * 2008-01-30 2008-07-16 华东理工大学 重组蛋白的变复性方法
WO2011131491A1 (en) * 2010-04-22 2011-10-27 Scil Proteins Gmbh Method of producing soluble recombinant protein
CN103275195A (zh) * 2013-06-04 2013-09-04 郑州中道生物技术有限公司 一种大肠杆菌表达包涵体蛋白纯化复性方法
WO2014126884A1 (en) * 2013-02-12 2014-08-21 Bristol-Myers Squibb Company High ph protein refolding methods
CN112921046A (zh) * 2021-02-24 2021-06-08 上海市第十人民医院 一种可溶性人肿瘤坏死因子ⅱ型受体蛋白的制备方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113683676A (zh) * 2021-08-27 2021-11-23 恒敬合创生物医药(上海)有限公司 一种环保的可逆的蛋白变性工艺

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020137157A1 (en) * 1998-07-09 2002-09-26 Theodore W. Randolph High pressure refolding of protein aggregates and inclusion bodies
AU2007202306A1 (en) * 1999-08-12 2007-06-14 Barofold, Inc. Improved protein disaggregation and refolding using high pressure
CN101220079A (zh) * 2008-01-30 2008-07-16 华东理工大学 重组蛋白的变复性方法
WO2011131491A1 (en) * 2010-04-22 2011-10-27 Scil Proteins Gmbh Method of producing soluble recombinant protein
WO2014126884A1 (en) * 2013-02-12 2014-08-21 Bristol-Myers Squibb Company High ph protein refolding methods
CN103275195A (zh) * 2013-06-04 2013-09-04 郑州中道生物技术有限公司 一种大肠杆菌表达包涵体蛋白纯化复性方法
CN112921046A (zh) * 2021-02-24 2021-06-08 上海市第十人民医院 一种可溶性人肿瘤坏死因子ⅱ型受体蛋白的制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PRAJAPATI S等: "Alkaline unfolding and salt-induced folding of bovine liver catalase at high pH", EUR J BIOCHEM, vol. 255, no. 01, pages 178 - 184 *
朱东宏: "pH值调节诱导罗非鱼肌球蛋白分子去折叠/重折叠行为的研究", 中国优秀硕士学位论文全文数据库工程科技Ⅰ辑, no. 01, pages 024 - 915 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023024960A1 (zh) * 2021-08-27 2023-03-02 恒敬合创生物医药（浙江）有限公司 一种环保的可逆的蛋白变性工艺

Also Published As

Publication number Publication date
WO2023024960A1 (zh) 2023-03-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wetlaufer et al. Control of aggregation in protein refolding: a variety of surfactants promote renaturation of carbonic anhydrase II
Fischer et al. Isolation, renaturation, and formation of disulfide bonds of eukaryotic proteins expressed in Escherichia coli as inclusion bodies
KR101741859B1 (ko) 화학적으로 조절된 산화환원 상태를 사용한 단백질의 재폴딩
DE69934585D1 (de) Rückfaltung von protein-aggregaten und einschlussteilchen durch hohen druck
ATE490968T1 (de) Schnell spaltbares sumofusionsprotein- expressionssystem für schwer zu exprimierende proteine
US20050176932A1 (en) Method for refolding of proteins
SI2907521T1 (en) New proNGF mutants and their uses in the production of beta-NGF
US5728804A (en) Use of cyclodextrins for protein renaturation
CA2443365A1 (en) Methods for the recombinant production of antifusogenic peptides
CN113683676A (zh) 一种环保的可逆的蛋白变性工艺
Simpson Fragmentation of protein using trypsin
US20050020814A1 (en) Method for renaturating proteins
Wei et al. Oxidative refolding of recombinant prochymosin
Singhvi et al. Solubilization and refolding of inclusion body proteins
Chura-Chambi et al. Refolding of endostatin from inclusion bodies using high hydrostatic pressure
Ribela et al. HPLC analysis of human pituitary hormones for pharmaceutical applications
Falconer et al. Chemical treatment of Escherichia coli. II. Direct extraction of recombinant protein from cytoplasmic inclusion bodies in intact cells
Hohenblum et al. Bacterial expression and refolding of human trypsinogen
Kurimoto et al. In vitro refolding of porcine pepsin immobilized on agarose beads
US20110034678A1 (en) Methods of renaturation of recombinant proteins
NO320175B1 (no) Fremgangsmate for fremstilling av korrekt foldet, biologisk aktivt rekombinant protein eller polypeptid.
Gao et al. Refolding of lysozyme at high concentration in batch and fedbatch operation
Son et al. Effects of β-mercaptoethanol and hydrogen peroxide on enzymatic conversion of human proinsulin to insulin
Zhang et al. Mechanism of enhancement of prochymosin renaturation by solubilization of inclusion bodies at alkaline pH
CN112321692A (zh) 一种大豆11s球蛋白盐酸胍变性处理后稀释复性的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information

Address after: Room 218-11, Building 8, No. 3339 Linggongtang Road (Jiaxing Science and Technology City), Daqiao Town, Nanhu District, Jiaxing City, Zhejiang Province, 314006

Applicant after: Hengjing Hechuang Biomedicine (Zhejiang) Co.,Ltd.

Address before: No.66210, 3rd floor, Pudong Free Trade Zone, Shanghai, China

Applicant before: Hengjing hechuang biomedical (Shanghai) Co.,Ltd.

CB02 Change of applicant information