CN101220079A

CN101220079A - 重组蛋白的变复性方法

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Publication number: CN101220079A
Application number: CNA2008100332533A
Authority: CN
Inventors: 王小宁; 张颋; 王菊芳; 冯延叶; 沈亚领; 徐晓晶; 金维荣; 孔娟; 杨忠
Original assignee: SHANGHAI BIOCHIP CO Ltd; East China University of Science and Technology; South China University of Technology SCUT
Current assignee: SHANGHAI BIOCHIP CO Ltd; East China University of Science and Technology; South China University of Technology SCUT
Priority date: 2008-01-30
Filing date: 2008-01-30
Publication date: 2008-07-16

Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种从包涵体蛋白制备可溶性蛋白的方法。所述方法通过二次变性的过程，并且选择含精氨酸的碱性溶液作为第一次变性的变性剂，优选地以Triton辅助变性，从而最终蛋白的得率和纯度都远远高于单次变性的方法，且所获得的可溶性蛋白可良好地恢复天然态结构以及保持生物学活性。本发明的方法变性剂用量少，工作效率高，重组蛋白可以在先不经色谱纯化的条件下就达到较高的复性率，产品复性总收率在60％以上，工艺简单、产品收率高、成本低。

Description

重组蛋白的变复性方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及重组蛋白体外双变性复性工艺。

背景技术

外源蛋白在一些基因工程菌中表达量可高达细胞蛋白含量的50％，这种高表达往往会导致目标蛋白在体内形成不溶的聚集体即包涵体(Inclusion body，IB)。包涵体由于没有完全正确的天然态结构，不具有生物学活性，必须经过分离、体外复性、纯化等工艺才能变成有生物学功能的产品。因此从包涵体中提取纯化及复性重组蛋白的工艺引起高度重视，提取纯化及复性重组蛋白的工艺优劣直接影响产品的质量及效率，从而直接影响经济效益。

在重组蛋白提取纯化及复性工艺中，必须先用蛋白变性剂(溶解剂)将包涵体形式的重组蛋白变性溶解，以便进一步纯化除去杂质，这是关键技术之一。然后于适宜条件下进行复性，以重获天然活性。因此重组蛋白由变性到复性是其关键技术之二。上述两个关键技术主要影响产品的纯度及效率。目前已有技术对提取纯化蛋白存在以下问题：

1.重组蛋白在盐酸胍或尿素等变性剂中溶解度有限，在降低变性剂＜4mol/L时，重组蛋白通常不能与杂蛋白、核酸解离而被析出，严重影响产品回收率。

2.为了提高重组蛋白的纯度，采取先纯化后复性的工艺程序，然而，由于变性剂的浓度高，粘稠度大、用量也大，因而操作难度很大，成本高。

3.由于重组蛋白长时间与高浓度变性剂作用，导致变性剂及其产物对重组蛋白的共价修饰，致使重组蛋白复性率降低，产品收率随之降低。

鉴于已有技术存在上述问题。其结果是：工艺复杂操作难度大，产品的纯度及收率均低，进而导致成本高，不利于工业化生产。

因此，目前本领域还缺少一条工艺简单、产品的纯度及收率均高，而成本低的蛋白提取纯化工艺。

发明内容

本发明的目的在于提供一条工艺简单、产品的纯度及收率均高，且成本低的蛋白提取纯化方法。

因此，本发明提供一种从包涵体蛋白制备可溶性蛋白的方法，所述方法包括：

(a)用第一变性剂溶液溶解包涵体蛋白，从变性液中提取纯化出经一次变性的蛋白；其中，所述的第一变性剂溶液含精氨酸(优选的为L-精氨酸)；

(b)对(a)获得的经一次变性的蛋白进行二次变性，获得含有经二次变性的蛋白的变性液；和

(c)对(b)获得的变性液进行复性，分离获得可溶性蛋白。

在另一优选例中，步骤(a)中，所述的从变性液中提取纯化出经一次变性的蛋白的方法是：

(a1)将变性液离心，取上清液；和

(a2)采用蛋白等电点沉淀法从(a1)获得的上清液中提取纯化出经一次变性的蛋白。

在另一优选例中，步骤(a2)中，所述的蛋白等电点沉淀法包括：

(i)将(a1)获得的上清调节至比蛋白等电点PH值高0.5-3(优选的为1-2)的PH值，离心取上清液；和

(ii)将(i)获得的上清液调节至蛋白等电点PH值±0.3的PH值，离心取沉淀，该沉淀即为纯化出的经一次变性的蛋白。

在另一优选例中，(ii)中，上清液调节至蛋白等电点PH值±0.2的PH值，最优选上清液调节至蛋白等电点PH值±0.1的PH值。所述的蛋白等电点是指目的蛋白的等电点。

在另一优选例中，所述的蛋白选自(但不限于)：绿色荧光蛋白，日本血吸虫弹性蛋白酶(SjE)，人HSPC067蛋白(HSPC067)，或肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL))。

在另一优选例中，所述的第一变性剂溶液还含有：Triton。在优选实例中，所述的Triton是Triton-X-100。

在另一优选例中，所述的第一变性剂溶液含有：(0.5±0.2)mol/L精氨酸、(1±0.2)mmol/L EDTA，(1±0.8)％(v/v)Triton，和(50±20)mmol/L NaCl；更优选的，所述的第一变性剂溶液含有：(0.5±0.1)mol/L精氨酸、(1±0.2)mmol/L EDTA，(1±0.4)％(v/v)Triton，和(50±10)mmol/L NaCl。

在另一优选例中，所述的第一变性剂溶液还含有：β-巯基乙醇。较佳的，β-巯基乙醇的含量为(5±2)mmol/L。

在另一优选例中，所述的二次变性采用第二变性剂溶液，该溶液含有选自下组的成分：尿素，盐酸胍，十二烷基磺酸钠，或脱氧胆酸钠。

在另一优选例中，所述的第二变性剂溶液含有：尿素，EDTA，β-巯基乙醇，Tris-HCL，和NaCl。

在另一优选例中，所述的第二变性剂溶液含有：(6±2)mol/L尿素，(1±0.2)mmol/L EDTA，(100±50)mmol/L β-巯基乙醇，(20±10)mmol/L Tris-HCL，(100±50)mM NaCl；更优选的，所述的第二变性剂含有：(6±2)mol/L尿素，(1±0.2)mmol/L EDTA，(100±20)mmol/L β-巯基乙醇，(20±5)mmol/LTris-HCL，(100±20)mM NaCl。

在另一优选例中，复性所用的复性液含有：EDTA，还原型谷胱苷肽(GSH)，氧化型谷胱苷肽(GSSG)，和Tris-HCL。

在另一优选例中，复性所用的复性液含有：(1±0.5)mmol/L EDTA，(1±0.5)mmol/L还原型谷胱苷肽(GSH)，(0.1±0.05)mmol/L氧化型谷胱苷肽(GSSG)，(20±10)mmol/L Tris-HCL；更优选的，复性液含有：(1±0.2)mmol/LEDTA，(1±0.2)mmol/L还原型谷胱苷肽(GSH)，(0.1±0.02)mmol/L氧化型谷胱苷肽(GSSG)，(20±5)mmol/L Tris-HCL。

在另一优选例中，在步骤(c)中，复性后，对复性液进行超滤或透析，分离获得可溶性蛋白。

在另一优选例中，在步骤(a)之前，还包括步骤：洗涤包涵体，以去除脂质体、脂多糖、核酸或杂蛋白等杂质。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1显示了绿色荧光蛋白的包涵体(IBs)和复性后蛋白电泳检测，其中M为电泳Marker，箭头所指处分别为目标蛋白。

图2显示了血吸虫弹性蛋白酶复性前和复性后菌体或蛋白的电泳检测，其中：a为菌体的电泳结果；b为包涵体的电泳结果；c为复性后蛋白的电泳结果；d为蛋白Marker的电泳结果。

具体实施方式

本发明人经过长期的研究和试验，出乎意料地找到一种从包涵体蛋白制备可溶性蛋白的新方法，所述方法通过二次变性的过程，并且选择精氨酸作为第一次变性的变性剂主要成分，优选地以Triton辅助变性，从而蛋白的得率和纯度都远远高于单次变性的方法，且所获得的可溶性蛋白可良好地恢复天然态结构以及保持生物学活性。在此基础上完成了本发明。

本发明所述的从包涵体蛋白制备可溶性蛋白的方法，包括以下步骤：

(a)用第一变性剂变性包涵体蛋白，从变性液中提取纯化出经一次变性的蛋白；其中，所述的第一变性剂含精氨酸(优选的为L-精氨酸)；

(b)对(a)获得的经一次变性的蛋白进行二次变性，获得含有经二次变性的蛋白的变性液；

(c)对(b)获得的变性液进行复性，分离获得可溶性蛋白。

本发明的方法基于对包涵体蛋白进行两次变性增溶的过程，从而增加蛋白的溶解程度，提高蛋白的得率和纯度。其中的第一变性剂以精氨酸作为发挥作用的主要成分，精氨酸属于天然氨基酸，结构稳定，可减少变性剂对天然肽链的共价修饰；此外，精氨酸存在三个pKa值明显的解离基团：-COOH、-NH₂和胍基，一个偏酸，一个偏碱，一个属于强碱范围，这样既可以保证强碱可以有效地溶解包涵体，同时还可保证后续等电点沉淀过程中溶液的PH变化不会过于剧烈，造成大量目的蛋白的共沉淀。

作为本发明的优选方式，所述的第一变性剂溶液是含有精氨酸的缓冲液，其中精氨酸作为发挥变性作用的主要活性组分，变性剂缓冲液的配制是本领域人员已知的技术。优选地，所述缓冲液中还含有Triton(如Triton-X-100)；更优选的还含有EDTA，NaCl。进一步优选地，所述的第一变性剂溶液含有：(0.5±0.2)mol/L精氨酸、(1±0.2)mmol/L EDTA，(1±0.8)％(v/v)Triton，(50±20)mmol/L NaCl。Triton作为一种本领域熟知的去垢剂，采用Triton可辅助精氨酸更好的溶解包涵体，同时在包涵体结构变换中发挥一定的作用。

作为本发明的优选方式，所述的第一变性剂溶液还含有：β-巯基乙醇。较佳的，β-巯基乙醇的含量为(5±2)mmol/L。

作为本发明的优选方式，先进行洗涤包涵体以去除脂质体、脂多糖、核酸或杂蛋白等杂质。

为了提高可溶性蛋白的得率和纯度，本发明的方法还包括二次蛋白变性的过程。二次变性可采用精氨酸以外的任何常规可用的蛋白变性剂。例如，所述的二次变性采用的变性剂含有选自下组的成分：尿素，盐酸胍，十二烷基磺酸钠，或脱氧胆酸钠。

作为本发明的优选方式，所述的第二变性剂含有：尿素，EDTA，β-巯基乙醇，Tris-HCL，NaCl。更优选的，所述的第二变性剂含有：(6±2)mol/L尿素，(1±0.2)mmol/L EDTA，(100±50)mmol/L β-巯基乙醇，(20±10)mmol/LTris-HCL，(100±50)mM NaCl。

作为本发明的优选方式，步骤(a)中，所述的从变性液中纯化出经一次变性的蛋白的方法是：将第一次变性后的变性液离心，取上清液；和采用蛋白等电点沉淀法从上清液中纯化出经一次变性的蛋白。

所述的蛋白等电点沉淀法包括：(i)将上清调节至比目的蛋白等电点PH值高0.5-3(优选的为1-2)的PH值，离心去除沉淀，取上清液；和(ii)将获得的上清液调节至目的蛋白等电点附近的PH值，离心取沉淀，该沉淀即为纯化出的经一次变性的蛋白。其中，步骤(i)将PH值调节至比目的蛋白等电点PH值高的PH值，从而可使溶液中目的蛋白以外的部分杂蛋白去除；而步骤(ii)将PH值调节至目的蛋白等电点附近的PH值，从而使得目的蛋白析出。也即，利用目的蛋白和杂蛋白变性后的表面电荷特性的不同进行分离。

在另一优选例中，所述的蛋白等电点附近的PH值是蛋白等电点PH值±0.3的PH值，更优选蛋白等电点PH值±0.2的PH值，最优选蛋白等电点PH值±0.1的PH值。

选用精氨酸作为第一次变性的主要成分，可保证不会因等电点沉淀过程中溶液的PH变化过于剧烈而造成大量目的蛋白的共沉淀。蛋白等电点沉淀过程中由于PH变化缓和，有利于基因工程菌(如大肠杆菌)内形成的包涵体结构发生有利的结构变换，从而有利于下一步的变性溶解及复性。而采用例如0.5MNaOH来溶解的包涵体等电点沉淀过程中，由于PH变化太快，从而极易造成蛋白共沉淀现象，同时影响了包涵体结构的重新塑造效果，不利于下一步的蛋白复性，复性效果很差。

在第一次变性之后进行目的蛋白的纯化，可以去除大部分来源于菌体蛋白的杂蛋白，复性后蛋白纯度就达到80％以上，大大简化了整个后续的纯化工艺。

本发明对于采用的蛋白复性方法和试剂没有特别的限制，可以采用本领域常用于蛋白复性的方法和试剂。作为本发明的优选方式，复性所用的复性液含有：EDTA，还原型谷胱苷肽(GSH)，氧化型谷胱苷肽(GSSG)，Tris-HCL。更优选的，复性所用的复性液含有：(1±0.5)mmol/L EDTA，(1±0.5)mmol/L还原型谷胱苷肽(GSH)，(0.1±0.05)mmol/L氧化型谷胱苷肽(GSSG)，(20±10)mmol/L Tris-HCL。

在经过蛋白复性后，还可对复性后的蛋白进行纯化。蛋白纯化可采用本领域常用于蛋白纯化的方法，例如超滤、透析、离子交换层析、分子筛层析等，具体的纯化手段还可根据蛋白的性质或所需蛋白的纯度等来决定。

由于采用了两次蛋白变性的过程，更佳地在两次变性之间采用了蛋白等电点沉淀富集纯化蛋白，因此复性后的蛋白更易于纯化，仅需简单的纯化手段即可获得较高纯度的蛋白。因此，作为本发明的优选方式，在复性后，对复性液进行超滤或透析，分离获得可溶性蛋白。

本发明的方法适用于从任何种类的包涵体蛋白制备可溶性蛋白，特别适合于分离复性碱性蛋白及在尿素中溶解度偏低的包涵体蛋白。例如，所述的蛋白选自(但不限于)：绿色荧光蛋白，日本血吸虫弹性蛋白酶(SjE)，人HSPC067蛋白(HSPC067)，或TRAIL蛋白。

可表达目的蛋白(包涵体)的基因工程菌的制备是本领域已知的。例如，通过将编码目的蛋白的DNA序列插入合适的表达载体中，将所述表达载体转化合适的工程菌，从而获得可表达目的蛋白的基因工程菌。本发明中，通常所述的基因工程菌主要是原核生物，如大肠杆菌。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含有编码目的蛋白的DNA序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

培养基因工程菌并使之表达目的蛋白的方法和条件是本领域人员已知的，例如可采用IPTG或者高温诱导表达。

在基因工程菌表达了包涵体蛋白后，通常需要进行破菌，从而释放出包涵体蛋白。破菌的方法没有特别的限制，例如超声破菌或高压均浆破菌。在获得包涵体后，优选地还包括洗涤包涵体的步骤，这样可以去除脂质体、脂多糖、核酸或杂蛋白等杂质，有利于后续变复性的进行。

本发明的主要优点在于：

1.采用含精氨酸的碱性溶液作为第一次变性的变性剂，可保护肽链免受强变性剂的共价修饰和改变粗包涵体结构，使其更易于在第二次变性中变性溶解。

2.相对于以往的蛋白变性方法，本发明的方法大大减少了变性剂的用量，降低粘稠度，降低成本。本发明不仅在变性剂的用量上减少了，而且变性剂的作用浓度大大降低。由于变性剂的用量和作用浓度均减少，从而更有利于保护天然的肽链。并且，包涵体的第一次变性溶解主要采用高PH策略，有效地降低变性剂的成本。

3.简化了包涵体复性前的分离纯化步骤，同时又能得到较高纯度的包涵体进行变性溶解后复性，因此提高了重组蛋白的复性率。

4.第一次变性得到的目的蛋白沉淀很容易变性溶解于第二变性剂中，因此提高了起始复性重组蛋白的溶解度和质量，整体上大大减少了变性剂的用量。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1重组绿色荧光蛋白的提取复性工艺

一.工程菌培养和表达

可表达重组绿色荧光蛋白的工程菌获自复旦大学遗传所。

将已确定可诱导表达目的蛋白的E.coli菌种于前一日接种到5ml LB培养基中(含50ug/ml的Kan)，37℃，200rpm培养过夜。次日，将培养的菌液转接到500ml的LB(含50μg/ml的Kan)培养基中，37℃，200rpm，培养至OD₆₀₀＝0.6～0.8。向培养的菌液中加入IPTG至终浓度为1mM，37℃，200rpm，继续诱导培养4小时。

二.包涵体蛋白变复性

蛋白纯化的流程如下：

1.菌体破碎

(1)取基因工程菌3.0克加30ml 20mmol/L Tris-HCL(三羟甲基氨基甲烷-盐酸，pH8.0)，搅拌洗涤细菌30min两次，于4℃离心7000rpm×10min，弃上清。

(2)湿菌加入裂菌液缓冲液(2)【50mmol/L Tris-HCL，1mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA)，pH8.0缓冲液】30ml，于超声，超声时间5s，超声间隔5s，超声次数140次，至液体变稀薄、起泡为止。镜检细菌破碎率＞98％。

2.包涵体的洗涤

(1)取菌体破碎液离心4000rpm×5min，4℃，留沉淀。

(2)将沉淀物(包涵体)分别用缓冲液(3)【20mmol/L Tris-HCl，100mM NaCl，2mmol/L EDTA，2mmol/L β-ME(β-巯基乙醇)，0.5％Triton-x-100，2mol/L尿素】和缓冲液(4)【70％异丙醇，20mmol/L Tris-HCL，pH8.0溶液】进行充分搅拌洗涤，于4℃离心12000rpm×20min，最后用裂菌液缓冲液(2)洗涤沉淀，留沉淀物(包涵体)备用。洗涤的目的在于除弃混合在包涵体的脂质体、脂多糖、核酸及杂蛋白等杂质。

3.重组蛋白变性纯化

(1)包涵体溶于变性剂：取包涵体沉淀物，加入缓冲液(5)【0.5mol/L L-精氨酸，lmmol/L EDTA，0.5％Triton-X-100，50mM NaCl，pH自然】。充分搅拌溶解1小时后，于4℃离心12000rpm×30min，取上清，得到重组蛋白粗提物。

(2)取上述重组蛋白粗提物，加入缓冲液(6)【0.2M HAc/NaAc，pH＝5.76】将PH调节到偏离目的蛋白等电点至约PH 7.5，搅拌，于4℃离心12000rpm×20min，弃沉淀物。上清液继续再加缓冲液(6)将PH调节到目的蛋白等电点附近(PH 6.0左右)，搅拌，于4℃离心12000rpm×20min，留沉淀物(此沉淀物为重组蛋白)，然后将沉淀物用缓冲液(2a)【20mmol/L Tri s-HCl，1mmol/L EDTA，pH8.0】冲洗充分，离心10000rpm×10min，冲洗数次留沉淀物。

4.重组蛋白二次变性纯化

6.0mol/L尿素，1mmol/L EDTA，100mmol/L β-ME，20mmol/L Tris-HCL，100mM NaCl，pH8.0溶解上述沉淀，离心(12000rpm×20min)弃不溶物，调整蛋白浓度为8-10毫克/毫升。

5.重组蛋白复性

在上述尿素缓冲液中缓慢加人复性液(1mmol/L EDTA，1mmol/L还原型谷胱苷肽(GSH)，0.1mmol/L氧化型谷胱苷肽(GSSG)，20mmol/L Tris-HCL，pH8.0)，稀释到0.1mol/L，4℃复性过夜。

6.超滤

常规方法将复性液超滤浓缩，调整到合适的蛋白浓度(3mg/mL)，进行活性检测。

7.结果

复性后目的蛋白总收率：82.1％。浓缩后目的蛋白收率65％。

重组绿色荧光蛋白的活力采用荧光光度计进行测定。结果如下：

可溶性表达的绿色荧光蛋白测定荧光活性：2655RFU/2ug蛋白。

包涵体复性后蛋白测定荧光活性：2245RFU/2ug蛋白。

图1显示了对包涵体(IBs)和复性后蛋白的电泳检测，其中M为电泳Marker，可见复性后即使不经过柱纯化蛋白纯度仍然可达80％以上。

实施例2重组日本血吸虫弹性蛋白酶(SjE)的提取复性工艺

一.工程菌培养和表达

可表达日本血吸虫弹性蛋白酶的工程菌获自中国疾病控制中心寄生虫病预防控制所。菌株培养和该蛋白表达过程与实施例1相同。

二.包涵体蛋白变复性

1.菌体破碎

(1)取基因工程菌3.0克加30ml 20mmol/L Tris-HCL(三羟甲基氨基甲烷—盐酸，pH8.0)，搅拌洗涤细菌30min两次，于4℃离心7000rpm×10min，弃上清。

(2)湿菌加入裂菌液缓冲液(2)【50mmol/L Tris-HCL，1mmol/L EDTA，pH8.0缓冲液】30ml，用超声破碎，超声时间5s，超声间隔5s，超声次数140次，至液体变稀薄、起泡为止。镜检细菌破碎率＞98％。

2.包涵体的洗涤

(1)取菌体破碎液离心4000rpm×5min，4℃，留沉淀。

(2)将沉淀物(包涵体)分别用缓冲液(3)【20mmol/L Tris-HCl，100mM NaCl，2mmol/L EDTA，2mmol/L β-ME(β-巯基乙醇)，0.5％Triton-x-100，2mol/L尿素】和缓冲液(4)【70％异丙醇，20mmol/L Tris-HCL，pH8.0溶液】进行充分搅拌洗涤，于4℃离心12000rpm×20min，最后用裂菌液洗涤沉淀，留沉淀物(包涵体)备用。

3.重组蛋白变性纯化

(1)包涵体溶于变性剂：取包涵体沉淀物，加入缓冲液(5a)【0.6mol/L L-精氨酸，0.8mmol/L EDTA，1.2％TritonX-100，60mM NaCl，5mM β-巯基乙醇，pH自然】。充分搅拌溶解1.3小时后，于4℃离心11000rpm×35min，取上清，得到重组蛋白粗提物。

(2)取上述重组蛋白粗提物，加入缓冲液(6a)【0.2M Tris-HCl，pH＝7】将PH调节到偏离目的蛋白等电点至PH 8，搅拌，于4℃离心11000rpm×25min，弃沉淀物。上清液继续再加缓冲液(6a)将PH调节到7，搅拌，于4℃离心11000rpm×25min，留沉淀物(此沉淀物为重组蛋白)，然后将沉淀物用缓冲液(2a)【20mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH8.0】冲洗充分，离心12000rpm×8min，冲洗数次留沉淀物。

4.重组蛋白二次变性纯化

5.5mol/L尿素，0.8mmol/L EDTA，120mmol/L β-ME，15mmol/L Tris-HCL，80mM NaCl，pH8.0溶解上述沉淀，离心(10000rpm×25min)弃不溶物，调整蛋白浓度为8毫克/毫升。

5.重组蛋白复性

在上述的尿素缓冲液中缓慢加人复性液(1.3mmol/L还原型谷胱苷肽(GSH)，0.13mmol/L氧化型谷胱苷肽(GSSG)，25mmol/L Tris-HCL，pH8.0)，稀释到0.1mol/L，4℃复性过夜。

6.超滤

将复性液超滤浓缩，调整到合适的蛋白浓度，进行活性检测。

图2显示了复性前和复性后菌体或蛋白的电泳检测，其中：a为菌体的电泳结果；b为包涵体的电泳结果；c为复性后蛋白的电泳结果；d为蛋白Marker的电泳结果。

采用常规方法测定日本血吸虫弹性蛋白酶的酶活，结果测得，复性后蛋白的酶活为：1.244nMol/min/ug蛋白(90％纯度)。

实施例3人HSPC067蛋白(HSPC067)的提取复性工艺

一.工程菌培养和表达

可表达人HSPC067蛋白(HSPC067)的基因工程菌与包涵体获自上海华冠生物芯片有限公司。菌株培养和该蛋白表达过程基本与实施例1相同。

二.包涵体蛋白变复性

1.菌体破碎

(1)取基因工程菌3.0克加30ml 20mmol/L Tris-HCL，搅拌洗涤细菌30min两次，于4℃离心7000rpm×10min，弃上清。

(2)湿菌加入裂菌液缓冲液(2)【50mmol/L Tris-HCL，1mmol/L EDTA，pH8.0缓冲液】30ml，于超声，超声时间5s，超声间隔5s，超声次数140次，至液体变稀薄、起泡为止。镜检细菌破碎率＞98％。

2.包涵体的洗涤

(1)取菌体破碎液离心4000rpm×5min，4℃，留沉淀。

(2)将沉淀物(包涵体)分别用缓冲液(3)【20mmol/L Tris-HCl，100mM NaCl，2mmol/L EDTA，2mmol/L β-ME，0.5％Triton-x-100，2mol/L尿素】和缓冲液(4)【70％异丙醇，20mmol/L Tris-HCL，pH8.0溶液】进行充分搅拌洗涤，于4℃离心12000rpm×20min，最后用缓冲液(2)洗涤沉淀，留沉淀物(包涵体)备用。洗涤的目的在于除弃混合在包涵体的脂质体、脂多糖、核酸及杂蛋白等杂质。

3.重组蛋白变性纯化

(1)包涵体溶于变性剂：取包涵体沉淀物，加入缓冲液(5b)【0.5mol/L L-精氨酸，1mmol/L EDTA，0.5％Triton-X-100，50mM NaCl，5mM β-巯基乙醇，pH自然】。充分搅拌溶解1-2小时后，于4℃离心12000rpm×30min，取上清，得到重组蛋白粗提物。

(2)取上述重组蛋白粗提物，加入缓冲液(6b)【0.2M HAc/NaAc，pH＝5.89】将PH调节到偏离目的蛋白等电点至约PH 6.8，搅拌，于4℃离心12000rpm×20min，弃沉淀物。上清液继续再加缓冲液(6b)将PH调节到目的蛋白等电点附近(PH 6.0左右)，搅拌，于4℃离心12000rpm×20min，留沉淀物(此沉淀物为重组蛋白)，然后将沉淀物用缓冲液(2a)【20mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH8.0】冲洗充分，离心10000rpm×10min，冲洗数次留沉淀物。

4.重组蛋白二次变性纯化

5mol/L盐酸胍，1.2mmol/L EDTA，90mmol/Lβ-ME，25mmol/L Tris-HCL，120mM NaCl，pH8.0溶解上述沉淀，离心(14000rpm×15min)弃不溶物，调整蛋白浓度为9毫克/毫升。

5.重组蛋白复性

在前述获得的盐酸胍缓冲液中缓慢加人复性液(0.8mmol/L EDTA，0.9mmol/L还原型谷胱苷肽(GSH)，0.09mmol/L氧化型谷胱苷肽(GSSG)，18mmol/L Tris-HCL，pH8.0)，稀释到0.1mol/L，4℃复性过夜。

6.超滤浓缩

常规方法超滤浓缩。

实施例4TRAIL蛋白的提取复性工艺

一.工程菌培养和表达

可表达TRAIL蛋白的基因工程菌及包涵体获自上海恰尔生物技术有限公司。菌株培养和该蛋白表达过程基本与实施例1相同。

二.包涵体蛋白变复性1

1.菌体破碎

(1)取基因工程菌3.0克加30ml 20mmol/L Tris-HCL(pH8.0)，搅拌洗涤细菌30min两次，于4℃离心7000rpm×10min，弃上清。

2.包涵体的洗涤

(1)取菌体破碎液离心4000rpm×5min，4℃，留沉淀。

(2)将沉淀物(包涵体)分别用缓冲液(3a)【20mmol/L Tris-HCl，100mMNaCl，2mmol/L EDTA，2mmol/L β-ME，0.5％Triton-x-100，4mol/L尿素】和缓冲液(4)【70％异丙醇，20mmol/L Tris-HCL，pH8.0溶液】进行充分搅拌洗涤，于4℃离心12000rpm×20min，最后用裂菌液缓冲液(2)洗涤沉淀，留沉淀物(包涵体)备用。洗涤的目的在于除弃混合在包涵体的脂质体、脂多糖、核酸及杂蛋白等杂质。

3.重组蛋白变性纯化

(1)包涵体溶于变性剂：取包涵体沉淀物，加入缓冲液(5b)【0.5mol/L L-精氨酸，1mmol/L EDTA，0.5％Triton-X-100，50mM NaCl，5mM β-巯基乙醇，pH自然】。充分搅拌溶解2小时左右后，于4℃离心12000rpm×30min，取上清，得到重组蛋白粗提物。

(2)取上述重组蛋白粗提物，加入缓冲液(6c)【0.2M磷酸缓冲液，pH≈7.63】将PH调节到偏离目的蛋白等电点至PH 8.0左右，搅拌，于4℃离心12000rpm×20min，弃沉淀物。上清液继续再加缓冲液(6c)将PH调节到目的蛋白等电点附近(PH约7.5)，同时使用了0.5M盐酸溶解辅助析出蛋白)，搅拌，于4℃离心12000rpm×20min，留沉淀物(此沉淀物为重组蛋白)，然后将沉淀物用缓冲液(2a)【20mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH8.0】冲洗充分，离心10000rpm×10min，冲洗数次留沉淀物。

4.重组蛋白二次变性纯化

8.0mol/L尿素，1mmol/L EDTA，100mmol/L β-ME，20mmol/L Tris-HCL，100mM NaCl，pH9.0左右溶解上述沉淀，离心(12000rpm×20min)弃不溶物，调整蛋白浓度为4毫克/毫升左右。

5.重组蛋白复性

在上述获得的尿素缓冲液中缓慢加人复性液(1mmol/L EDTA，1mmol/L还原型谷胱苷肽(GSH)，0.1mmol/L氧化型谷胱苷肽(GSSG)，20mmol/L Tris-HCL，pH8.0)，稀释到0.1mol/L，4℃复性过夜。

6.超滤浓缩

常规方法超滤浓缩。

三.包涵体蛋白变复性2

采用包涵体蛋白变复性1基本相同的条件，不同点在于，采用盐酸胍作为第一次变性的变性剂，也即在步骤3.中，具体采用如下试剂和方法：

(1)包涵体溶于变性剂：取包涵体沉淀物溶解于第一变性剂中(6M盐酸胍，50mM PH8.0 Tris-HCl，100mM NaCl，5mM β-巯基乙醇)。充分搅拌溶解后，于4℃离心12000rpm×30min，取上清，得到重组蛋白粗提物。

(2)将盐酸胍溶解的包涵体溶液通过梯度稀释的方法进行部分纯化：向离心上清液中加入梯度稀释液(5mM β-巯基乙醇，50mM PH8.0Tris-HCl，100mMNaCl)至盐酸胍浓度4M左右后离心收集上清；再至盐酸胍2M左右离心收集沉淀。

四.包涵体蛋白变复性3(一次变性)

采用包涵体蛋白变复性2基本相同的条件，不同点在于，在步骤3.之后，不进行第二次变性，直接进行蛋白复性和超滤。

采用包涵体蛋白变复性1，2，3的方法的变性剂用量，作用时间，重组蛋白纯度以及蛋白得率如表1。

表1

	变性剂用量(ml)	变性剂作用时间(小时)	重组蛋白纯度(％)	复性后蛋白得率(％)
	变性剂用量(ml)	变性剂作用时间(小时)	重组蛋白纯度(％)	复性后蛋白得率(％)	蛋白纯化1	100	2～3	＞80	90
蛋白纯化2	150	2	＞60	40	蛋白纯化1	100	2～3	＞80	90
蛋白纯化2	150	2	＞60	40	蛋白纯化3	1500	85	60	20

由表1可见，与包涵体蛋白变复性2的方法相比，包涵体蛋白变复性1的方法变性剂用量降低，重组蛋白纯度显著提高，复性后蛋白得率显著提高。与包涵体蛋白变复性3的方法相比，包涵体蛋白变复性1的方法变性剂用量显著降低，变性剂作用时间明显减少，重组蛋白纯度显著提高，复性后蛋白得率显著提高。

并且，在试验中还发现，采用包涵体蛋白变复性2的方法，TRAIL蛋白包涵体不能大部分溶解于第二变性液中；而采用包涵体蛋白变复性1的方法，TRAIL蛋白包涵体基本可溶解于第二变性液，同时更有利于蛋白包涵体的复性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims

1.一种从包涵体蛋白制备可溶性蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：

(a)用第一变性剂溶液溶解包涵体蛋白，从变性液中提取纯化出经一次变性的蛋白；其中，所述的第一变性剂溶液含精氨酸；

(c)对(b)获得的变性液进行复性，分离获得可溶性蛋白。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(a)中，所述的从变性液中提取纯化出经一次变性的蛋白的方法是：

(a1)将变性液离心，取上清液；和

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(a2)中，所述的蛋白等电点沉淀法包括：

(i)将(a1)获得的上清调节至比蛋白等电点PH值高0.5-3的PH值，离心取上清液；和

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的蛋白选自：绿色荧光蛋白，日本血吸虫弹性蛋白酶，人HSPC067蛋白，或肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第一变性剂溶液还含有：Triton。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的第一变性剂溶液含有：0.5±0.2mol/L精氨酸、1±0.2mmol/L EDTA，1±0.8％(v/v)Triton，和50±20mmol/L NaCl。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的二次变性采用第二变性剂溶液，该溶液含有选自下组的成分：尿素，盐酸胍，十二烷基磺酸钠，或脱氧胆酸钠。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的第二变性剂溶液含有：尿素，EDTA，β-巯基乙醇，Tris-HCL，和NaCl。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，复性所用的复性液含有：EDTA，还原型谷胱苷肽，氧化型谷胱苷肽，和Tris-HCL。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(c)中，复性后，对复性液进行超滤或透析，分离获得可溶性蛋白。