CN102653551B - 变性蛋白复性装置 - Google Patents

Abstract

本发明提供了变性蛋白复性装置。具体地，本发明的变性蛋白复性装置包括：变性蛋白复性釜；超滤模块；柱复性模块；用于驱动液体流动的数控泵；用于控制液体流动的电磁阀门；以及与所述数控泵和电磁阀门的相连接并用于控制所述数控泵和电磁阀门的处理器。本发明的复性装置将稀释复性、透析复性、柱复性等方法及复性后操作(包括浓缩、纯化等)集成于一体化，具有自动化操作、省时省力等优点，非常适合用于变性蛋白的复性工艺开发与改进。

Description

变性蛋白复性装置

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及一种全自动变性蛋白复性装置，以及该装置的用途。还涉及所述装置在对重组蛋白包涵体进行变性和复性，从而获取有活性的目的蛋白方面的应用。

背景技术

大肠杆菌作为应用最为广泛的外源基因表达系统，存在的主要瓶颈问题是高表达的外源蛋白主要以无活性的包涵体形式存在，需要通过复性才能获得生物活性。

从包涵体中获取有活性的目的蛋白，主要经过两个步骤：一是加变性剂溶解包涵体；二是除去变性剂使目标蛋白复性。

为了获得正确折叠的活性蛋白质，必须做到去除变性剂或降低变性剂的浓度，并通过合适的氧化还原体系环境促成天然的二硫键，从而折叠成天然的分子构象。因而，复性技术是包涵体加工的关键。

本领域希望开发的令人满意的变性蛋白复性技术应具有以下特征：变性蛋白复性后具有活性蛋白的组分收率高，变性蛋白复性后可以得到浓度较高的蛋白质产品，复性技术易于实现，容易实现自动化，复性过程耗时少、快速等。

然而，就目前已开发的变性蛋白复性方法而言，应用最为广泛的复性方法是稀释复性(50％)、透析复性(30％)和柱复性(11％)。

为了实现变性蛋白最佳复性效率，人们开发出了各种复性工艺，比如优化变性蛋白复性溶液组分或氧化还原体系环境、添加相应的蛋白质复性分子伴侣等。一般地，这些复性工艺都建立在稀释复性、透析复性或柱复性等方法上。然而，迄今为止本领域尚缺乏令人满意的、高效、自动的变性蛋白复性装置。由于受制于变性蛋白复性装置的限制，各种复性方法不能组合使用，从而限制了变性蛋白复性工艺的延伸。

此外，对于某一未知的或尚未确定最佳复性方法的变性蛋白而言，技术人员在探索和确定其优选的复性条件时不仅耗时，而且操作步骤非常繁琐，本领域缺乏有效的辅助设备。

因此，本领域迫切需要开发高效、自动的变性蛋白复性装置，从而便捷、高效地实现变性蛋白的复性。

发明内容

本发明的目的就是提供一种高效、自动的变性蛋白复性装置，从而便捷、高效地实现变性蛋白的复性。

本发明的另一目的是提供所述变性蛋白复性装置的应用。

在本发明的第一方面，提供了一种用于使变性蛋白复性形成有活性的目的蛋白的变性蛋白复性装置，该装置包括：

变性蛋白复性釜，其中变性蛋白在所述复性釜中进行复性反应；

超滤模块，所述的超滤模块与复性釜连通构成一液体流通回路，其中所述的超滤模块用于通过透析复性使得变性蛋白复性并且通过超滤截留复性的蛋白；

柱复性模块，所述的柱复性模块与复性釜连通构成一液体流通回路，其中所述的柱复性模块用于通过柱复性使得变性蛋白复性；

用于驱动液体流动的数控泵；

用于控制液体流动的电磁阀门；和

与所述数控泵和电磁阀门的相连接并用于控制所述数控泵和电磁阀门的处理器。

在另一优选例中，所述的处理器包括(但并不限于)：单片机、平板电脑等

在另一优选例中，该装置还包括用于收集复性后的目的蛋白收集器；和/或用于收集复性过程中的废液的废液收集器。

在另一优选例中，所述的柱复性模块包括层析柱以及任选的位于层析柱出口端下游的检测器。

在另一优选例中，所述的电磁阀门包括包括：

用于控制复性液流入复性釜的第一电磁阀门V1，其中所述第一电磁阀门V1与复性液或盛装复性液的储液器(如储液瓶)和复性釜相连通；

用于控制复性釜中液体流出复性釜的第二电磁阀门V2，其中所述第二电磁阀门V2与超滤模块连通，并且可任选地与一废液排出管道相连通；

用于控制从超滤模块流出的液体流入复性釜的第三电磁阀门V3，其中所述第三电磁阀门V3与超滤模块和复性釜相连通，并且可任选地与一废液排出管道相连通；

用于控制复性釜中液体流出复性釜并流向层析柱的第四电磁阀门V4，其中所述第四电磁阀门V4与柱复性模块连通，并且所述的第四电磁阀门V4还与层析液或盛装层析液的储液器(如储液瓶)相连通，从而可将层析液导向柱复性模块；和

用于控制从柱复性模块流出的液体流入复性釜的第五电磁阀门V5，其中所述第五电磁阀门V5与柱复性模块和复性釜相连通，并且可任选地与一废液排出管道相连通。

在另一优选例中，所述的数控泵包括包括：

用于驱动复性液流入复性釜的第一数控泵P1；

用于驱动复性釜中液体流出复性釜并流向超滤模块的第二数控泵P2；和

用于驱动复性釜中液体流出复性釜并流向柱复性模块的第三数控泵P3。

在另一优选例中，所述的装置还具有位于第三数控泵P3和层析柱之间并与第三数控泵P3和层析柱相流通的第六电磁阀门V6。

在另一优选例中，在第五电磁阀门V5和第六电磁阀门V6通过一管道连通，从而用于洗涤共享管道、数控泵等。例如，层析柱的洗涤液可通过第五电磁阀门V5流向第六电磁阀门V6，进而流入层析柱。

在另一优选例中，该装置还包括与复性蛋白复性釜连通的储液瓶，其中所述储液瓶用于盛装复性液。

显然，所述的蛋白收集器和废液收集器可以使用各种常规的容器，包括瓶、杯等，因而也可以由用户自行配制。

在另一优选例中，储液通过相应的管道与第一和第四电磁阀门进料口连通；变性蛋白复性釜包括复性瓶和搅拌装置，复性瓶瓶盖设有五个进出口，可以自由调节管道插入复性瓶中的长度，其中，进出口I11、I22、I33、I44、I55、I66分别与第一、二、三、四、五、六电磁阀门V1、V2、V3、V4、V5、V6相连通；

在另一优选例中，所述的复性液包括(但并不限于)：洗脱液、洗涤用缓冲液等。

在另一优选例中，所述的蛋白收集器是自动收集器。

在另一优选例中，所述的废液收集器是废液瓶。

在另一优选例中，所述的复性釜包括复性瓶，并且该复性瓶配有封盖，且该封盖设有第一、第二、第三、第四和第五进液口。可通过手紧式接头与复性瓶螺纹瓶盖连接，其中手紧式接头可以调节第一、第二、第三、第四和第五进液口处管道进入复性瓶内的深度。

在另一优选例中，所述的第一电磁阀门V1为具有四路液体流向的四元梯度电磁阀；和/或；

第二电磁阀门V2为耐压型三通电磁阀；和/或

第四电磁阀门V4为具有四路液体流向的四元梯度电磁阀。

在另一优选例中，第三电磁阀门V3和六电磁阀门V6为夹管型三通电磁阀，第五电磁阀门V5由两个夹管型三通电磁阀门组成。

在另一优选例中，所述超滤模块具有进料口、截留口和渗透口，其中进料口与第二电磁阀门V2相连通，截留口与第三电磁阀门V3相连通，其渗透口与一废液排出管道相连通。

在另一优选例中，所述的超滤模块和/或柱复性模块是可以自由拆卸。

在另一优选例中，所述的第一数控泵P1第二数控泵P2、和/或第三数控泵P3是蠕动泵。

在另一优选例中，所述层析柱的进料口与第六电磁阀门V6相连通，层析柱出样口与第五电磁阀门V5连通。

在另一优选例中，所述层析柱出样口与第五电磁阀门V5之间的装有检测器。

在另一优选例中，所述的层析柱包括：亲和层析柱、离子交换柱(包括阴离子和阴离子交换柱)、疏水层析柱、和分子筛柱。

在本发明的第二方面，提供本发明第一方面中所述的变性蛋白复性装置的用途，它被用于使变性蛋白复性，从而形成有活性的目的蛋白。

在本发明的第三方面，提供了一种使变性蛋白复性形成有活性的目的蛋白的方法，该方法包括步骤：用本发明第一方面中所述的变性蛋白复性装置进行蛋白复性，从而形成或获得复性后的有活性的目的蛋白。

在另一优选例中，所述的步骤包括：将待复性的变性蛋白进入复性釜；然后启动本发明第一方面中所述的复性装置进行复性，从而形成或获得复性后的有活性的目的蛋白。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了本发明一个实例中的变性蛋白复性装置的结构图。

图2显示了本发明一个实例中的自控部分的原理示意图。

图3显示了本发明一个实例中的复性釜的示意图。

图4显示了本发明一个实例中的透析部分的示意图。

图5显示了本发明一个实例中的柱复性部分的示意图。

各图中，各标识含义如下：

A1、A2、A3、A4分别表示与某一储液瓶相连的管道，主要用于将复性液引入复性釜。当然，这些管道也可将待复性的变性蛋白溶液引入复性釜。

V1、V2、V3、V4、V5、和V6分别表示第一、二、三、四、五和六电磁阀门。

P1、P2和P3分别表示第一、二和三数控泵。

F1、F2、F3和F4分别表示废液排出管道。当然，这些管道也可将其他液体引入本发明的复性装置。例如通过F2可将用于洗涤超滤膜块的洗涤液可通过第二电磁阀门V2流向第三电磁阀门V3，经F3排出。

I11、I22、I33、I44、I55等分别表示管道。

图6显示了本发明一个实例中，三种不同复性方案的复性后蛋白质量得率。图中，纵坐标(refolding yield％)表示复性后蛋白质量得率百分比，横坐标分别代表三种复性方案，即简单稀释复性(simple dilution)、分步透析复性(step-wisedialysis)、连续透析复性(continuous dialysis)。

图7显示了本发明一个实例中获得的变性剂摩尔浓度-复性时间关系图。图中，纵坐标为复性釜中变性剂摩尔浓度，横坐标为复性时间，100F/V为复性液滴加速率(ml/min)与复性釜中复性起始体积V(ml)比值乘以100。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次研发出了一种全自动变性蛋白复性装置。该装置不仅可适用于稀释复性、透析复性和柱复性等多种复性方法，而且通过采纳流加多种溶液、控制流速、控制溶液浓度变化速率或模式、组合多种复性方法等方式，使得该装置的实用性大幅提供，可以适用于各种不同变性蛋白的复性，有助于高效地实现变性蛋白复性，并且对于技术人员开发新的复性工艺提供了极大的便利和设计空间。

如本文所用，术语“复性”就是通过合理设计的复性过程，从而使得无活性或活性较低的变性蛋白形成有活性的或活性更高的目的蛋白。

如本文所用，术语“本发明装置”和“本发明的变性蛋白复性装置”可互换使用。

请参阅图1-5，图中显示了本发明一种变性蛋白复性装置装置及其模块的结构示意图。

在本发明中装置中，多个储液瓶(未示出)分别通过A1、A2、A3、A4管道与第一电磁阀门V1连通；

多个储液瓶分别通过B1、B2、B3管道与第四电磁阀门V4连通；

复性釜包括复性瓶(kettle)和搅拌装置，其中复性瓶的体积没有特别限制，一般可以为50ml-5000毫升，较佳地为50-1000毫升。

复性瓶的材质没有特别限制，一般可以用玻璃、塑料、陶瓷或不锈钢。

复性瓶的一端设有盖子(如螺纹瓶盖)，其上设有第一、第二、第三、第四和第五进出口1、2、3、4、5。

搅拌装置包括磁力搅拌器和搅拌子，其中搅拌子位于复性瓶底部。

第一、二、三、四、五电磁阀门V1、V2、V3、V4、V5与第一、二、三、四、五进出口1、2、3、4、5之间的管道分别为I11、I22、I33、I44、I55；

第四、第六电磁阀门V4、V6之间的管道为I46；

第六、第五电磁阀门V6、V5之间的管道为I56；

如图4所示。本发明装置的透析部分包括超滤模块M，该模块包括一进料口(feed)、一截留口(retant)和一渗透口(pentra)，超滤模块M截留分子量一般为8～15kDa。

第二电磁阀门V2与超滤模块M进料口之间的管道为I2f；

第三电磁阀门V3与超滤模块M截留口之间的管道为I3r；

如图5所示，本发明装置的柱复性部分(或模块)包括层析柱以及任选的位于层析柱出口端下游的检测器。其中，所述的检测器包括(但并不限于)：pH、电导率和UV的检测探头或装置。

第六电磁阀门V6与层析柱进料口之间的管道为I6f，第五电磁阀门V5与层析柱出样口之间的管道为I5r；

层析柱底部出样口与第五阀门V5之间的管道上装有检测器UV，其中检测器包括紫外检测器、PH检测器和电导率检测器；

所述超滤模块渗透口pentra、第二、第三和第五阀门与废液瓶之间各有一条管道连通，分别命名为F1、F2、F3、F4；

第一电磁阀门V1与第一进料口1之间的管道I11上装有蠕动泵(数控泵)P1；

第二电磁阀门V2与超滤模块的进料口feed之间的管道I2f上装有蠕动泵(数控泵)P2；

第四电磁阀门V4与第六阀门V6之间的管道I46上装有蠕动泵(数控泵)P3；

第一电磁阀门V1，调节管线A1、A2、A3、A4等与管线I11的连通；

第二电磁阀门V2，调节管线I22与管线I2f或管线F2的连通；

第三电磁阀门V3，调节管线I3r与管线I55或管线F3的连通；

第四电磁阀门V4，调节管线B1、B2、B3等与管线I46的连通；

第五电磁阀门V5，调节管线I56、管线I5r与管线I55或管线F4的连通；

第六电磁阀门V6，调节管线I46与管线I56或管线I6f的连通；

在所述管道A1、A2、A3、A4，管道B1、B2、B3，管道I11、I22、I33、I44、I55，管道F1、F2、F3、F4，管道I46、I56、管道I2f、I3r，管道I6f、I5r等各管道的材质和内径没有特别限制。一般各管道的内经为1-50毫米，更佳地为1-5mm。材质一般可选用半透明聚丙烯管。

第一、第四电磁阀门V1、V4为四进一出四元梯度电磁阀。

第二、第三、第六电磁阀门V2、V3、V6为一进两出电磁阀。

第五电磁阀门V5由两个一进两出电磁阀组成。

在一具体实施例，上述蠕动泵(数控泵)P1控制管线I11流向复性瓶的流速，为0～50ml/min，用蠕动泵(数控泵)P1上样时，流速视情况而定，一般为100ul～1000ul/min，用蠕动泵(数控泵)P1输送其他溶液(如复性液、ddH₂O等)进行复性操作或混合时，流速为0.5ml～2.0ml/min，用蠕动泵(数控泵)P1清洗时，需要满量程流速清洗管线，蠕动泵(数控泵)P1的设定流速视使用者的要求或操作情况而定。

在上所述有蠕动泵(数控泵)P2控制I2f管线溶液流速，流速范围较大，0.1～170ml/min，具有正向、反向转动功能，蠕动泵(数控泵)P1的设定流速视使用者的要求或操作情况而定。

在上所述蠕动泵(数控泵)P3控制管线I46溶液流速，0-10ml/min用蠕动泵(数控泵)P3上样时，流速视情况而定，一般为100ul～1000ul/min，用蠕动泵(数控泵)P3输送其他溶液(如复性液、ddH20等)进行复性操作或混合时，流速为0.5ml～2.0ml/min，用蠕动泵(数控泵)P3清洗时，需要满量程流速清洗管线，蠕动泵(数控泵)P1的设定流速视使用者的要求或操作情况而定；

本发明装置的自控部分原理示意图如图2所示。其中，虚线部分为电缆线的布线与本发明其他装置有关部分的连接。本发明装置的控制中枢是处理器(优选平板电脑)，其直接控制第一、二、三、四、五、六电磁阀门V1、V2、V3、V4、V5、V6，蠕动泵(数控泵)P1、P2、P3，和在线收集检测器信号。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明装置适合目前多种常用的复性方法。

(b)集成多种复性方法及复性后续操作于一体化。

(c)变性蛋白复性工艺的改进与开发。

(d)变性蛋白复性过程多参数监控。

(e)独立操作单元按时序方式自动化完成。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

变性蛋白的复性

采用图1所示的装置进行变性蛋白的复性。

待复性的变性蛋白是牛血清白蛋白，Fv(BSA)。

复性工艺：包涵体溶解液(50mM TrisHCl，8M Urea，13mMbeta-mercaptoethanol，pH8.0)溶解包涵体后，挂Q-FF离子交换柱，然后再经过非线性梯度，即起始缓冲液为包涵体溶解液和最终缓冲液为复性液(50mMTrisHCl，1mM GSH，0.1mM GSSG，1mM EDTA，pH8.0)过夜复性。最后通过洗脱液(50mM TrisHCl，1M NaCl，pH8.0)线性洗脱收集到复性后的目的蛋白。

具体操作说明：准备好包涵体溶解液300ml，复性液1000ml，洗脱液100ml；用包涵体溶解液溶解洗涤好的包涵体，并充分变性4小时。

A1、B1进包涵体溶解液，A2进复性液，A3、B2进超纯水，B3进洗脱液。

装好Q-FF柱，然后调节第四、第五、第六电磁阀门V4、V5、V6使得管道B2-I46-I6f-colμmn-I5r-F4连通，启动蠕动泵P3，流速1.0ml/min，洗涤5个柱体积。

调节第四、第五、第六电磁阀门V4、V5、V6使得管道B1-I46-I6f-colμmn-I5r-F4连通，平衡5个柱体积。

然后通过B1上样，B1-I46-I6f-column-I5r-UV-F4连通，流速为1.0ml/min。

开启磁力搅拌器开关，设定合适的转速；开启蠕动泵P1，流速10ml/min，调节第一电磁阀门V1连通A3-I11管道至复性瓶，注入超纯水；同时开启蠕动泵P3，流速10ml/min，调节第四、五、六电磁阀门V4、V5、V6连通I44-I46-I56-F4管道进行清洗，清洗工作时间5min。

然后换用包涵体溶解液清洗，开启蠕动泵P1，流速10ml/min，调节第一电磁阀门V1连通A1-I11管道至复性瓶，注入包涵体溶解液；同时开启蠕动泵P3，流速10ml/min，调节第四、五、六电磁阀门V4、V5、V6连通I44-I46-I56-F4管道进行清洗；同时开启蠕动泵P2，流速5ml/min，调节第二、三电磁阀门V2、V3连通I22-I2f-I3r-F3至废液瓶，清洗工作时间2min。

暂时关闭蠕动泵P3，开启蠕动泵P1，流速10ml/min，调节第一电磁阀门V1连通A1-I11管道至复性瓶，注入体积200ml包涵体溶解液，关闭蠕动泵P1。

开启蠕动泵P3，流速1.0ml/min，调节第四、五、六电磁阀门V4、V5、V6连通I44-I46-I6f-column-I5r-F4。

调节第一电磁阀门V1连通A2-I11至复性瓶，开启蠕动泵P1，流速1.0ml/min，然后复性过夜。

关闭蠕动泵P1、P3，调节第四、五、六电磁阀门V4、V5、V6连通B3-I46-I56-F4至废液瓶，开启蠕动泵P3，流速1ml/min，清洗管道；调节第四、五、六电磁阀门V4、V5、V6连通B3/B4-I46-I6f-column-I5r-F4至收集器，进行线性洗脱。

关闭蠕动泵P1、P3，开启蠕动泵P2，流速10ml/min，调节第二、三电磁阀门V2、V3连通I22-I2f-I3r-F3至废液瓶。

将管道A1、A2、A3和B1、B2、B3都插到超纯水中，开启蠕动泵P1，流速40ml/min，，时间5min；关闭蠕动泵P1，开启蠕动泵P2，流速50ml/min，调节第二、三电磁阀门V2、V3连通I22-I2f-I3r-F3至废液瓶，继续清洗复性瓶3次；调节蠕动泵P3流速10ml/min，调节第四、五、六电磁阀门V4、V5、V6连通I44-I46-I56-F4，清洗5min。

调节蠕动泵P3流速10ml/min，调节第四、五、六电磁阀门V4、V5、V6连通B1B2B3-I46-I56-F4，清洗5min。

调节蠕动泵P3流速1.0ml/min，调节第四、五、六电磁阀门V4、V5、V6连通B1B2B3-I46-I6f-column-I5r-F4，清洗10个柱体积。

将管道A1、A2、A3和B1、B2、B3都插到20％乙醇溶液中，开启蠕动泵P1，流速40ml/min，蠕动泵P2、P3流速10ml/min，调节第一电磁阀门V1连通A1A2A3-I11至复性瓶，调节第二、三电磁阀门V2、V3连通I22-I2f-I3r-F3至废液瓶，调节第四、五、六电磁阀门V4、V5、V6连通I44-I46-I56-I55，清洗1min。

关闭蠕动泵P1、P2，调节蠕动泵P3流速1ml/min，调节第四、五、六电磁阀门V4、V5、V6连通B1B2B3-I46-I6f-column-I5r-F4至废液瓶，清洗5个柱体积。

最后卸下Q-FF柱，保存好检测器收集到得数据曲线，关闭系统。

结果：

本实施例1为简单稀释与柱复性相结合实施例，通过非线性变性剂浓度变化梯度复性蛋白。本实施例中，通过微电脑处理器，通过程序来设置、控制和执行操作单元命令(包括管道清洗、复性方法的选择、管路设计等)，因此，操作按时序方法自动化完成，提高了工作效率。

如表1所示(柱复性)，柱蛋白结合量为2mg左右，复性后蛋白质量得率为60％，活性回收率(反相HPLC测定)为60％。此外，与采用人工操作或半自动化操作相比，使用本发明装置不仅大大降低了劳动强度，而且节省时间，不易发生操作错误。

表1

实施例2

变性蛋白的复性

采用图1所示的装置进行变性蛋白的复性。

待复性的变性蛋白是人源巨噬细胞金属弹性蛋白酶催化区域(MMP12)。

复性工艺说明：包涵体溶解液溶解包涵体后，调节蛋白浓度，缓慢地滴加到复性液1中，然后快速滴加透析液，等容透析一定时间后，缓慢滴加复性液2，复性过夜，最后浓缩、置换溶液，收集样品。

具体操作说明：准备好包涵体溶解液、复性液1、复性液2、透析液；用包涵体溶解液溶解洗涤好的包涵体，并充分变性2小时。

将管道A1、A2、A3、A4都插到超纯水中，开启蠕动泵P1，流速40ml/min，时间1min；关闭蠕动泵P1，开启蠕动泵P2，流速50ml/min，时间1min，调节第二、三电磁阀门V2、V3连通I22-I2f-I3r-F3至废液瓶；反转蠕动泵P2，调节第二、三电磁阀门V2、V3连通I33-I3r-I2f-F2至废液瓶；

安装上超滤模块，清洗超滤模块。开启蠕动泵P1，流速40ml/min，时间2min；关闭蠕动泵P1，开启蠕动泵P2，流速50ml/min，时间2min，调节第二、三电磁阀门V2、V3连通I22-I2f-I3r-F3至废液瓶。

A1包涵体溶解液，A2进复性液1，A3进复性液2，A4进透析液。

调节第一电磁阀V1连通A2-I11至复性瓶，开启蠕动泵P1，流速40ml/min，时间5min。

调节第一电磁阀V1连通A1-I11至复性瓶，开启蠕动泵P1，流速1.0ml/min。

调节第一电磁阀V1连通A4-I11至复性瓶，开启蠕动泵P1，流速4.0ml/min；调节第二、三电磁阀V2、V3连通I 22-I2f-I3r-I33，开启蠕动泵P2，流速50ml/min时间4h。

调节第一电磁阀V1连通A3-I11至复性瓶，开启蠕动泵P1，流速1.0ml/min；调节第二、三电磁阀V2、V3连通I22-I2f-I3r-I33，开启蠕动泵P2，流速10ml/min时间10h。

调节第一电磁阀V1连通A4-I11至复性瓶，开启蠕动泵P1，流速4.0ml/min；调节第二、三电磁阀V2、V3连通I22-I2f-I3r-I33，开启蠕动泵P2，流速100ml/min时间4h。

关闭蠕动泵P1，调节第二、三电磁阀V2、V3连通I22-I2f-I3r-F3，开启蠕动泵P2，流速2ml/min，收集样品。

将管道A1、A2、A3、A4、F2都插到超纯水中，开启蠕动泵P1，流速40ml/min，时间1min；关闭蠕动泵P1，开启蠕动泵P2，流速50ml/min，时间5min，调节第二、三电磁阀门V2、V3连通F2-I2f-I3r-I33至复性瓶。

将管道F2都插到20％乙醇中，开启蠕动泵P2，流速50ml/min，时间5min，调节第二、三电磁阀门V2、V3连通F2-I2f-I3r-I33至复性瓶；卸下超滤模块保存。

开启蠕动泵P2，流速50ml/min，调节第二、三电磁阀门V2、V3连通I22-I2f-I3r-F3至废液瓶，抽光复性瓶中溶液，开启蠕动泵P1，流速40ml/min，时间1min。

将管道A1、A2、A3、A4都插到20％乙醇中，开启蠕动泵P2，流速50ml/min，调节第二、三电磁阀门V2、V3连通I22-I2f-I3r-F3至废液瓶，开启蠕动泵P1，流速40ml/min，时间1min。

最后关闭系统。

结果：

实施例2采用连续透析复性方法，从而方便控制变性剂浓度的变化速率，提高变性蛋白复性的成功率。由于传统的透析复性方法使得变性蛋白局限于体积较小的透析带中而不能实现大规模蛋白制备，而采用本发明的自动复性装置后，改进后的复性方法可以任意改变复性釜大小，从而实现大规模蛋白的制备。

如图6和表2所示，连续梯度透析方法明显提高了MMP12蛋白复性得率，优于包括简单稀释复性(simple dilution)、分步透析复性(step-wisedialysis)在内的常规复性方法。

采用连续透析复性时，获得的复性后的蛋白为11mg左右，复性后蛋白质量得率为95％，活性回收率(反相HPLC测定)为90％。

表2

实施例3

采用图1所示的装置进行变性蛋白的复性。

待复性的变性蛋白是牛血清白蛋白Fv(BSA)。

复性工艺说明：变性蛋白等容复性过程中复性釜复性体积与复性液滴加流速的比值对复性结果的探讨。

具体操作说明：变性蛋白等容复性过程中，保持蛋白浓度不变，改变复性釜中复性起始体积V(ml)和复性液滴加速率F(ml/min)，最终达到变性蛋白复性终点。

等容复性过程中变性剂随时间的变化：改变F/V比值，变性剂浓度降低趋势差异较大。

结果：

在本实施例中，先针对连续透析复性方法过程中变性剂浓度变化进行考察。结果发现，F/V比值越大，复性釜内变性剂浓度降低速率越快。结果如图7所示。

根据图7可以看出，通过改变F/V比值可以很方便地控制变性剂浓度变化速率。变性剂浓度降低太快容易导致变性蛋白复性过程中形成大量的沉淀。缓慢降低变性剂浓度可有利于提高部分变性蛋白复性效率。

因此，将复性方案确定为：采用100F/V比值为0.125和实施例2中所述的连续透析复性方法，对牛血清白蛋白(BSA)进行复性。

结果，复性后蛋白质量得率为80％，蛋白活性回收率(反相HPLC测定)为90％。

表3

该结果表明：使用本发明的自动复性装置，不仅可以省时省力且高效地实现变性蛋白复性，并且对于技术人员开发新的复性工艺提供了极大的便利和设计空间，有助于确定最佳的复性方案。

讨论

本发明的变性蛋白复性装置主要包括储液流加装置、变性蛋白复性釜、搅拌装置、超滤模块、层析柱、检测器、收集器、单板机、平板电脑、第一、第二和第三蠕动泵(数控泵)、第一、第二、第三、第四、第五和第六电磁阀门、废液瓶等，其中检测器包括UV紫外检测、电导检测和pH检测等，储液装置包括多个储液瓶通过管道与第一和第四电磁阀门出入口连通，搅拌装置为磁力搅拌器，其搅拌子位于变性蛋白复性釜底部。

本发明的变性蛋白复性装置集成了稀释复性、透析复性和柱复性等方法，除了可以满足常规单个复性方法的操作要求外，还可以进一步组合使用两种或两种以上复性方法，如稀释/透析结合使用、稀释/柱复性结合使用等等，然后再采纳合理设计的溶液控制方式，从而实现复性工艺的延伸。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (23)

1.一种用于使变性蛋白复性形成有活性的目的蛋白的变性蛋白复性装置，其特征在于，该装置包括：

变性蛋白复性釜，其中变性蛋白在所述复性釜中进行复性反应；

超滤模块，所述的超滤模块与复性釜连通构成一液体流通回路，其中所述的超滤模块用于通过透析复性使得变性蛋白复性并且通过超滤截留复性的蛋白；

柱复性模块，所述的柱复性模块与复性釜连通构成一液体流通回路，其中所述的柱复性模块用于通过柱复性使得变性蛋白复性；

用于驱动液体流动的数控泵；

用于控制液体流动的电磁阀门；和

与所述数控泵和电磁阀门的相连接并用于控制所述数控泵和电磁阀门的处理器。

2.如权利要求1所述的变性蛋白复性装置，其特征在于，该装置还包括用于收集复性后的目的蛋白收集器；和/或用于收集复性过程中的废液的废液收集器。

3.如权利要求1所述的变性蛋白复性装置，其特征在于，所述的柱复性模块包括层析柱以及任选的位于层析柱出口端下游的检测器。

4.如权利要求1所述的变性蛋白复性装置，其特征在于，所述的电磁阀门包括：

用于控制复性液流入复性釜的第一电磁阀门V1，其中所述第一电磁阀门V1与复性液或盛装复性液的储液器和复性釜相连通；

用于控制复性釜中液体流出复性釜的第二电磁阀门V2，其中所述第二电磁阀门V2与超滤模块连通，并且任选地与一废液排出管道相连通；

用于控制从超滤模块流出的液体流入复性釜的第三电磁阀门V3，其中所述第三电磁阀门V3与超滤模块和复性釜相连通，并且任选地与一废液排出管道相连通；

用于控制复性釜中液体流出复性釜并流向层析柱的第四电磁阀门V4，其中所述第四电磁阀门V4与柱复性模块连通，并且所述的第四电磁阀门V4还与层析液或盛装层析液的储液器相连通，从而将层析液导向柱复性模块；和

用于控制从柱复性模块流出的液体流入复性釜的第五电磁阀门V5，其中所述第五电磁阀门V5与柱复性模块和复性釜相连通，并且任选地与一废液排出管道相连通。

5.如权利要求1或4所述的变性蛋白复性装置，其特征在于，所述的数控泵包括：

用于驱动复性液流入复性釜的第一数控泵P1；

用于驱动复性釜中液体流出复性釜并流向超滤模块的第二数控泵P2；和

用于驱动复性釜中液体流出复性釜并流向柱复性模块的第三数控泵P3。

6.如权利要求1所述的变性蛋白复性装置，其特征在于，该装置还包括与复性蛋白复性釜连通的储液瓶，其中所述储液瓶用于盛装复性液。

7.如权利要求1所述的变性蛋白复性装置，其特征在于，所述的处理器包括：单片机、平板电脑。

8.如权利要求5所述的变性蛋白复性装置，其特征在于，所述的装置还具有位于第三数控泵P3和层析柱之间并与第三数控泵P3和层析柱相流通的第六电磁阀门V6。

9.如权利要求4所述的变性蛋白复性装置，其特征在于，在第五电磁阀门V5和第六电磁阀门V6通过一管道连通，从而用于洗涤共享管道、数控泵。

10.如权利要求4所述的变性蛋白复性装置，其特征在于，层析柱的洗涤液通过第五电磁阀门V5流向第六电磁阀门V6，进而流入层析柱。

11.如权利要求1所述的变性蛋白复性装置，其特征在于，所述的复性液包括：洗脱液、洗涤用缓冲液。

12.如权利要求1所述的变性蛋白复性装置，其特征在于，所述的蛋白收集器是自动收集器。

13.如权利要求1所述的变性蛋白复性装置，其特征在于，所述的复性釜包括复性瓶，并且该复性瓶配有封盖，且该封盖设有第一、第二、第三、第四和第五进液口。

14.如权利要求4所述的变性蛋白复性装置，其特征在于，所述的第一电磁阀门V1为具有四路液体流向的四元梯度电磁阀；和/或；

第二电磁阀门V2为耐压型三通电磁阀；和/或

第四电磁阀门V4为具有四路液体流向的四元梯度电磁阀。

15.如权利要求1所述的变性蛋白复性装置，其特征在于，第三电磁阀门V3和六电磁阀门V6为夹管型三通电磁阀，第五电磁阀门V5由两个夹管型三通电磁阀门组成。

16.如权利要求4所述的变性蛋白复性装置，其特征在于，所述超滤模块具有进料口、截留口和渗透口，其中进料口与第二电磁阀门V2相连通，截留口与第三电磁阀门V3相连通，其渗透口与一废液排出管道相连通。

17.如权利要求1所述的变性蛋白复性装置，其特征在于，所述的超滤模块和/或柱复性模块是自由拆卸的。

18.如权利要求5所述的变性蛋白复性装置，其特征在于，所述的第一数控泵P1、第二数控泵P2、和/或第三数控泵P3是蠕动泵。

19.如权利要求4所述的变性蛋白复性装置，其特征在于，所述层析柱的进料口与第六电磁阀门V6相连通，层析柱出样口与第五电磁阀门V5连通。

20.如权利要求4所述的变性蛋白复性装置，其特征在于，所述层析柱出样口与第五电磁阀门V5之间的装有检测器。

21.如权利要求20所述的变性蛋白复性装置，其特征在于，所述的层析柱包括：亲和层析柱、离子交换柱、疏水层析柱和分子筛柱。

22.如权利要求1-21中任一所述的变性蛋白复性装置的用途，其特征在于，用于使变性蛋白复性，从而形成有活性的目的蛋白。

23.一种使变性蛋白复性形成有活性的目的蛋白的方法，其特征在于，包括步骤：用权利要求1－21中任一所述的变性蛋白复性装置进行蛋白复性，从而形成或获得复性后的有活性的目的蛋白。