NO320175B1 - Fremgangsmate for fremstilling av korrekt foldet, biologisk aktivt rekombinant protein eller polypeptid. - Google Patents
Fremgangsmate for fremstilling av korrekt foldet, biologisk aktivt rekombinant protein eller polypeptid. Download PDFInfo
- Publication number
- NO320175B1 NO320175B1 NO19982155A NO982155A NO320175B1 NO 320175 B1 NO320175 B1 NO 320175B1 NO 19982155 A NO19982155 A NO 19982155A NO 982155 A NO982155 A NO 982155A NO 320175 B1 NO320175 B1 NO 320175B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- igf
- cells
- protein
- polypeptide
- buffer
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 15
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 14
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 14
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 8
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 21
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 12
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims abstract description 8
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 claims abstract description 7
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims abstract description 6
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 claims description 47
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 20
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 claims description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 12
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 11
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 11
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 8
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 claims description 8
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 8
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 claims description 7
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 claims description 6
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 5
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229960004198 guanidine Drugs 0.000 claims description 5
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 claims description 4
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 claims description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 4
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 4
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 claims description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 claims description 2
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 claims 4
- FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 Chemical compound C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N 0.000 claims 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 abstract description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 abstract description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 abstract 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 abstract 1
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 44
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 7
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 6
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 6
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 5
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 5
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 5
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 3
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 3
- XMEKHKCRNHDFOW-UHFFFAOYSA-N O.O.[Na].[Na] Chemical compound O.O.[Na].[Na] XMEKHKCRNHDFOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 238000010405 reoxidation reaction Methods 0.000 description 2
- FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J sodium diphosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- 238000005084 2D-nuclear magnetic resonance Methods 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZMCDFZZKTWFGF-UHFFFAOYSA-N Cyanamide Chemical compound NC#N XZMCDFZZKTWFGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N Erythritol Natural products OCC(O)C(O)CO UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 1
- 108010088160 Staphylococcal Protein A Proteins 0.000 description 1
- 102100035140 Vitronectin Human genes 0.000 description 1
- 108010031318 Vitronectin Proteins 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 210000003837 chick embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000044162 human IGF1 Human genes 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 150000002696 manganese Chemical class 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 description 1
- YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N oxidized gamma-L-glutamyl-L-cysteinylglycine Natural products OC(=O)C(N)CCC(=O)NC(C(=O)NCC(O)=O)CSSCC(C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CCC(N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 230000030788 protein refolding Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 239000012557 regeneration buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 229960004532 somatropin Drugs 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- HXJUTPCZVOIRIF-UHFFFAOYSA-N sulfolane Chemical compound O=S1(=O)CCCC1 HXJUTPCZVOIRIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 229940045136 urea Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/107—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides
- C07K1/113—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure
- C07K1/1133—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by chemical modification of precursor peptides without change of the primary structure by redox-reactions involving cystein/cystin side chains
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/65—Insulin-like growth factors, i.e. somatomedins, e.g. IGF-1, IGF-2
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Diabetes (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av korrekt foldet, biologisk aktivt rekombinant protein eller polypeptid, omfattende trinnene ekspresjon av proteinet i prokaryotiske celler, høsting av cellene, direkte løsning av cellene i en buffer ved pH 8 til 11 og deretter fortynning med vann og et fortynningsmiddel som består av etanol og eventuelt guanidin-hydroklorid.
Proteinet eller polypeptidet er fortrinnsvis GH, IGF-I eller IGF-II.
INNLEDNING
Et generelt stort problem når rekombinante proteiner overproduseres i effektive bakterielle ekspresjonssystemer, er relatert til foldingen av proteinproduktene til deres native konformasjoner. Mange høynivåekspresjonssystemer i Escherichia coli medfører dannelse av aggregater av denaturerte proteiner, såkalte inklusjonslegemer, som i noen tilfeller kan refoldes til det ønskede native protein. Generelle fremgangsmåter som letter refoldingen og gjør den mer effektiv er blitt funnet. En fremgangsmåte er anvendelsen av en klasse av varmesjokk-proteiner (HSP) og en annen er foldingsenzymer. Ved anvendelse av HSP unngås aggregering, og ved anvendelse av foldingsenzymer akselereres refoldingshastigheten.
Imidlertid er ikke alle proteiner følsomme for disse fremgangsmåter, og andre løsninger er blitt foreslått for å øke refoldingsutbyttet. I en artikkel av J.C. Carlson et al. i Biotechnology, vol 10, januar 1992, beskrives anvendelsen av monoklonale antistoffer under proteinrefolding for å øke utbyttet av nativt protein, spesielt S-Protein.
En annen foreslått fremgangsmåte for gjenvinning av det native protein er oppløsning av inklusjonslegemeprotein med et denatureringsmiddel som guanidin eller urea og, hvis nødvendig, reduksjon av disulfidbåndet. Ved fortynning eller dialyse og reoksidering kan proteinet refoldes til det native protein.
Vellykket refolding uten dannelse av nye inklusjonslegemer er vanligvis vanskelig med høye konsentrasjoner av det rekombinante protein. Det beste utbytte oppnås vanligvis ved konsentrasjoner rundt 20-200 ug/ml. Refolding antas derfor å være en svært kostbar fremstillingsform som krever et kost-nadsintensivt medikament.
Imidlertid er utbyttet av en refoldingsfremgangsmåte uforutsigbar, siden proteinproduktet ofte aggregerer eller blir modifisert. I tillegg vil den løselige refoldede fraksjon for IGF-I og -II inneholde misfoldede utgaver, og det totale utbytte av korrekt foldet vekstfaktor er ganske lav (Samuelsson, E. et al. (1991) Bio/Technology vol. 9, side 363) .
Ulike fremgangsmåter er foreslått for å øke utbytte av korrekt foldet IGF-I.
Human insulinlignende vekstfaktor I (IGF-I) er en enkeltkjedet peptidvekstfaktor på 70 aminosyrer, først isolert fra serum. IGF-I reguleres positivt av veksthormon (GH), og viser mitogen effekt på mange celletyper. IGF-I antas derfor å mediere mange av de vekstfremmende effekter av GH. I homologi-regionene er IGF-I og insulin 4 9 % homologe, omfattende de seks cysteinrester som frembringer tre disulfidbroer. Den tredimensjonale struktur av IGF-I er blitt modellert basert på røntgenstrukturen til insulin, og denne modell er i det siste blitt bekreftet i disulfidbroregionene ved avstandsbånd frem-skaffet ved 2-D NMR-spektroskopi av IGF-I (for en oversikts-artikkel om IGF-I,' se: Insulin-like growth factors I and II, Humbel R.E. Eur.J. Biochem 190, 445-462, 1990).
Human rekombinant IGF-I er blitt fremstilt som et utskilt produkt hos både Escherichia coli og Saccharomyces cerevisiae. I isolert materiale fra begge arter finnes IGF-I hovedsakelig som misfoldede former med intermolekylære disulfidbroer. In vitro refolding av redusert IGF-I i nærvær av oksygen har i tillegg vist at nativt, upassende og aggregert IGF-I akkumulerer selv under fortynnede refoldings-
betingelser.
Refoldingsutbyttet av rekombinant IGF-I ble betydelig forbedret ved utnyttelse av en fusjonert fusjonspartner, bestående av to IgG-bindende domener (ZZ) avledet fra protein A fra stafylokokker (Samuelsson, E. et al. (1991) Bio/Technology vol. 9, side 363). ZZ-fusjonspartneren anvendes for å løse opp misfoldede molekyler før, under og etter reduksjon og reoksidering. Utbyttet av korrekt foldet IGF-I vises å være økt vesentlig, men det er fortsatt en betydelig mengde av misfoldet IGF.
Patenter og patentsøknader har også beskrevet problemene omkring misfoldete IGF og foreslått ulike forbedringer.
I Bio/Technology, bind 12, nov. 1994, Roger Hart et al., "Large Scale, In Situ Isolation of Periplasmic IGF-I from E. coli." s. 1113-1117 beskrives in situ isolering av IGF-I ved bruk av 2-fase vannløsninger.
WO 91/02807 (Amgen)(=US 5158875) beskriver en fremgangsmåte for refolding av IGF-I i nærvær av en fusjonert, kort, positivt ladet ledersekvens, der aminosyrer som lysin, arginin og histidin er fusjonert i den N-terminale N-enden av IGF-I. Inklusjonslegemer isoleres og løses i urea. I WO 93/11240 (Genentech) beskrives en fremgangsmåte for refolding av uløselig og ufullstendig foldet IGF-I som involverer opp-løsning av inklusjonslegemer og refolding i et enkelt buffer-system.
US 5 151 501 (American Cyanamid) beskriver en fremgangsmåte for oppløsning og naturliggjøring av soraa-tropiner (veksthormoner) ved å dispergere refraktære soma-tropinlegemer i en løsning inneholdende sulfolan, etterfulgt av fortynning.
WO 9319084 (Synergen) beskriver en fremgangsmåte for fremstilling av aktiv IGF-I, omfattende trinnene ekspresjon i prokaryotisk celle, tilføring av et første reduksjonsmiddel, tilføring av et denatureringsmiddel (f.eks. urea), tilføring av et oksideringsmiddel (f.eks. oksidert glutation eller cystein) og tilsetting av et andre reduksjonsmiddel (f.eks. DTT, cystein etc). Met-IGF-I uttrykkes.
WO 9506064 beskriver en fremgangsmåte for å øke utbyttet av korrekt refolding av et polypeptid, der kobber-eller mangansalt er til stede under refoldingstrinnet, og WO 9506059 (Genentech) beskriver en fremgangsmåte for isolering av celler ved tilsetting av en fasedannende forbindelse som danner flere vannfaser.
Vi har nå oppfunnet en ny, forenklet fremgangsmåte for fremstilling av korrekt foldet, biologisk aktivt rekombinant protein eller polypeptid. Det henvises spesielt til rekombinant IGF-I etter ekspresjon av Z-IGF-I. Det henvises her til EP 230 869, spesielt til eksemplene. Det er oppnådd spesielt høye ekspresjonsnivåer (opp til 15 g/l ved fermentering) med Escherichia coli som uttrykker hybridproteinet Z-IGF-I. Selv om fremgangsmåten her beskrives med IGF-I som det foretrukne polypeptid, kan den også anvendes for rekombinant fremstilling av andre polypeptider, når det dannes misfoldede forbindelser og det totale utbytte av korrekt foldede polypeptider er ganske lavt.
I følge foreliggende fremgangsmåte kan trinnene for mekanisk ødeleggelse av cellene og isoleringen og vaskingen av refraktære legemer utgå. Foreliggende fremgangsmåte er enklere enn de tidligere beskrevne, og medfører et høyt utbytte.
OPPFINNELSEN
Oppfinnelsen angår en fremgangsmåte for fremstilling av korrekt foldet, biologisk aktivt rekombinant protein eller polypeptid, omfattende trinnene:
a) ekspresjon av proteinet i prokaryotiske celler,
b) høsting av cellene,
c) direkte oppløsning av cellene i en buffer ved pH ca. 8 til 11, fortrinnsvis ca. 8, med et kaotropt middel og et
reduksjonsmiddel, og
d) fortynning med vann og et fortynningsmiddel. Proteinet kan f.eks. være IGF-I, IGF-II eller GH.
Når proteinet er IGF-I omfatter fremgangsmåten
fortrinnsvis trinnene:
a) ekspresjon av et IGF-I-fusjonsprotein i prokaryotisk cellesystem, fortrinnsvis i E Coli,
b) høsting av cellene,
c) direkte oppløsning av cellene i en buffer ved pH 8
til 11, fortrinnsvis ca. 8, med et kaotropt middel eller et
reduksjonsmiddel,
d) fortynning med vann og et fortynningsmiddel
e) tilsetting av et avspaltingsmiddel og
f) rensing for å fremstille det biologisk aktive IGF-I.
IGF-I-fusjonsproteinet er fortrinnsvis et hybrid Z-IGF-I. Bufferen i trinnet c) kan være f.eks. Tris (Tris-[hydroksymetyl]aminometanhydroklorid) eller glysin.
Det kaotrope middel i trinn c) er fortrinnsvis guanidin eller urea, og guanidin kan anvendes ved en konsentrasjon på 3-7 M, fortrinnsvis 5 M. Reduksjonsmiddelet i trinn c) kan være f.eks. DTT(DL-ditiotreitol) eller cystein, og fortynningsmiddelet i trinn d) kan være etanol.
Etter trinn d) reduseres fortrinnsvis pH under pH 6, og helst til pH 4 eller lavere.
Ved fremstillingen av IGF-I redyseres pH fortrinnsvis til pH 3 eller lavere mellom trinnene d) og e).
Et konsentreringstrinn og et bufferbytte mellom trinnene d) og e), der kromatografi og/eller ionebytte fortrinnsvis anvendes, omfattes også av oppfinnelsen. Avspaltingsmiddelet i trinn e) ved fremstillingen av IGF-I kan være hydroksylamin, et enzym eller et annet avspaltingsmiddel.
Rensetrinnene for fremstillingen av det rene protein eller polypeptid omfatter f.eks. kationebytte, RP-HPLC og/eller hydrofobinteraksjonskromatografi (HIC).
Når IGF-I fremstilles som Z-IGF-I, har IGF-I en bedre løselighet, hvilket betyr at det kan anvendes en høyere konsentrasjon av redusert IGF-I i løsning, som medfører en høy mengde av riktig foldet IGF-I som er av stor betydning for en industriell fremgangsmåte for fremstilling av IGF-I.
EKSEMPLER
Det rekombinante humane IGF-I (rhIGF-I) som anvendes 1 eksperimentene ble fremstilt i E Coli i henhold til fremgangsmåten beskrevet i EP 230 869, eksempel VIII, (men i en fermentor) omfattende dyrking ved 37 °C i 20 timer.
Eksempel 1
Oppløsning
Cellene ble høstet etter fermentering ved sentri-fugering eller krysstrømningsfiltrering.
Deretter ble cellene løst i:
13 1 celleløsning, våtvekt 498 g/l
5 mol/l guanidinhydroklorid
97 mmol/1 Tris-base
159 mmol/1 Tris-HCl
2 mmol/1 etylendinitrotetraeddiksyre-dinatriumsalt-dihydrat
(EDTA)
4 mmol/1 ditiotreitol (DDT)
Totalt volum: 16,9 1
pH ble holdt på 8,1, oppløsningen ble utført i 3 timer med omrøring ved 15 °C.
Refolding
Oppløsningsløsningen ble fortynnet med 33,8 1 22,5 % etanolløsning, fortynningsfaktor 3.
pH ble holdt på 8,1 under røring ved 15 °C.
Refoldingen ble stoppet etter 20 timer ved tilsetting av konsentrert saltsyre til pH av løsningen var <3,1.
RP-HPLC-analyse av konsentrasjonen av Z-IGF-I i refoldingsløsningen ga 3,249 g korrekt foldet Z-IGF-I/1.
Eksempel 2
Oppløsning
Cellene ble høstet etter fermentering ved sentri-fugering og krysstrømningfiltrering.
Deretter ble cellene løst i:
154 ml celleløsning, våtvekt 450 g/l
4,5 mol/l guanidinhydroklorid
400 mmol/1 glysin
0,2 % Tween 20
2 mmol/1 etylendinitrotetraeddiksyre-dinatriumsalt-dihydrat
(EDTA)
3 mmol/1 ditiotreitol (DDT)
Totalt volum: 200 ml
pH ble holdt på 10,0, oppløsningen ble utført i 3 timer under omrøring ved romtemperatur.
Refolding
Oppløsningsløsningen ble fortynnet med 125 ml etanol, 400 ml vann> 66,8 g guanidinhydroklorid, fortynningsfaktor 4.
pH ble holdt på 10,0, under omrøring ved romtemperatur .
Refoldingen ble stoppet etter 20 timer ved tilsetning av konsentrert saltsyre inntil pH av løsningen var <3,1.
RP-HPLC-analyse av konsentrasjonen av Z-IGF-I i refoldingsløsningen ga 1,38 g korrekt foldet Z-IGF-I/1.
Eksempel 3
Oppløsning
Cellene ble høstet etter fermentering ved sentri-fugering eller krysstrømningsfiltrering.
Deretter ble cellene løst i:
900 ml celleløsning, våtvekt 720 g/l
6 mol/l guanidinhydroklorid
97 mmol/1 Tris-base
159 mmol/1 Tris-HCl
2 mmol/1 etylendinitrotetraeddiksyre-dinatriumsalt-dihydrat
(EDTA)
3 mmol/1 ditiotreitol (DDT)
Totalt volum: 1,17 1
pH ble holdt på 8,0, oppløsningen ble utført i 3 timer under omrøring ved 15 °C.
Refolding
Oppløsningsløsningen ble fortynnet med 547 ml etanol, 1786 ml vann, fortynningsfaktor 3.
Totalt volum 3,6 1
pH ble holdt på 8,1, under omrøring ved 15 °C.
Refoldingen ble stoppet etter 21 timer.ved tilsetting av konsentrert saltsyre til pH av løsningen var <3,1.
RP-HPLC-analyse av konsentrasjonen ga 1,32 g korrekt foldet Z-IGF-I/1.
Utbytte
Oppløsning: 74 % (av Z-IGF-I fra fermentoren) Totalt, oppløsning og refolding: 41 %.
Endelig renset IGF-I ble vist å ha biologisk aktivitet f.eks. på lårben fra kyllingembryo og RRA (radio-reseptoranalyse).
Eksempel 4, første rensetrinn
En løsning fra refoldingstrinnet ble fortynnet med WFI (vann for injeksjon), fortynningsfaktor 3, og klarnet på en krysstrømningsmembran før applisering på en kationbytter (Pharmacia Biotech BPG 200/500,SP-Sepharose FF, 9,5 liter, 0,33 m karhøyde).
Følgende buffere ble anvendt:
Kolonnen ble vasket med 1 kolonnevolum (CV) WFI, kolonnen ble behandlet med 3 CV ekvilibreringsbuffer, og prøven ble deretter applisert på kolonnen.
Kolonnen ble først vasket med 3 CV vaskebuffer 1 og deretter med 4 CV vaskebuffer 2.
Produktet ble eluert med 5 CV elueringsbuffer og kolonnen ble behandlet med 2 CV regenereringsbuffer og 2 CV med renholdsbuffer.
I henhold til RP-HPLC var utbyttet i forbindelse med rensetrinnet 98 % korrekt foldet IGF-I.
Eksempel 5, avspaltingstrinn
Etter det første rensetrinn på en kationbyttekolonne, ble avspalting av Z fra IGF-I utført.
Til. et kar ble det tilsatt: 40 1 fra kationbytter-reservoaret, 1428 g natriumdifosfat og 4,0 1 hydroksylamin, 50 % oppløsning. pH ble justert til 9,55 (med NaOH) og temperaturen ble holdt på 40 °C.
Reaksjonen ble stoppet etter 3 timer ved å senke temperaturen til 25 °C og tilsette 40 1 konsentrert eddiksyre (HAC) og 160 liter WFI.
pH ble justert til 3,30.
I henhold til RP-HPLC var utbyttet i forbindelse med dette trinn 84 % korrekt foldet, ikke-oksidert IGF-I.
Eksempel 6, avspaltingstrinn
Etter det første rensetrinn på en kationbyttekolonne, ble avspalting av Z fra IGF-I utført.
Til et kar ble det tilsatt: 18,6 1 fra kationbytter-reservoaret, 664 g natriumdifosfat og 2,17 1 hydroksylamin, 50 % oppløsning. pH ble justert til 9,5 (med HAc) og temperaturen ble holdt på 40 °C. Reaksjonen ble stoppet etter 3 timer ved å senke temperaturen til 25 °C og tilsette 22,3 1 konsentrert
HAc og 93 1 WFI. pH ble justert til 3,35.
I henhold til RP-HPLC ble utbyttet i forbindelse med dette trinn 61 % korrekt foldet, ikke-oksidert IGF-I.
Claims (16)
1. Fremgangsmåte for fremstilling av korrekt foldet, biologisk aktivt rekombinant protein eller polypeptid, omfattende trinnene: a) ekspresjon av proteinet eller polypeptidet i prokaryotiske celler b) høsting av cellene c) direkte oppløsning av cellene i en buffer ved pH 8 til 11 med et kaotropt middel og et reduksjonsmiddel og d) fortynning med vann og et fortynningsmiddel som består av etanol og eventuelt guanidin-hydroklorid.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, der proteinet er IGF-I, IGF-II eller GH.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, der proteinet er IGF-I og som omfatter trinnene: a) ekspresjon av et IGF-I-fusjonsprotein i prokaryotisk cellesystem, fortrinnsvis i E Coll b) høsting av cellene, c) direkte oppløsning av cellene i en buffer på pH 8 til 11 med et kaotropt middel og et reduksjonsmiddel, d) fortynning med vann og et fortynningsmiddel som består av etanol og eventuelt guanidin-hydroklorid, e) tilsetting av et avspaltingsmiddel og f) rensing for å fremstille den biologisk aktive IGF-I.
4. Fremgangsmåte i følge et hvilket som helst av kravene 1 til 3, der IGF-I-fusjonsproteinet er hybrid Z-IGF-I.
5. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 4, der bufferen i trinn c) er Tris eller glysin.
6. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5, der pH i trinn c) er 8.
7. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6, der det kaotrope middel i trinn c) er guanidin eller urea.
8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, der guanidin blir brukt i en konsentrasjon fra 3-7 M.
9. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 8, der reduksjonsmiddelet i trinn c) er DTT eller cystein.
10. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 9, der fortynningsmiddelet i trinn d) er etanol.
11. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 10, der pH reduseres etter trinn d), fortrinnsvis under pH 6, helst til pH 3 eller lavere.
12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, der pH reduseres til pH 3 eller lavere mellom trinnene d) og e) .
13. Fremgangsmåte ifølge krav 3, der det er et konsentreringstrinn og et bufferbytte mellom trinnene d) og e) .
14. Fremgangsmåte ifølge krav 13, der kromatografi og/eller ionebytte anvendes.
15. Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 14, der avspaltingsmiddelet i trinn e) er hydroksylamin.
16. Fremgangsmåte ifølge krav 14, der rensetrinnet f) omfatter kationebytte, RP-HPLC og/eller hydrofobinteraksjonskromatografi (HIC).
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE9504019A SE9504019D0 (sv) | 1995-11-13 | 1995-11-13 | Method for production of proteins |
| PCT/SE1996/001456 WO1997018233A1 (en) | 1995-11-13 | 1996-11-12 | Method for producing a correctly folded, biological active recombinant protein |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO982155D0 NO982155D0 (no) | 1998-05-12 |
| NO982155L NO982155L (no) | 1998-05-12 |
| NO320175B1 true NO320175B1 (no) | 2005-11-07 |
Family
ID=20400188
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO19982155A NO320175B1 (no) | 1995-11-13 | 1998-05-12 | Fremgangsmate for fremstilling av korrekt foldet, biologisk aktivt rekombinant protein eller polypeptid. |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6605706B1 (no) |
| EP (1) | EP0952981B1 (no) |
| JP (1) | JP3930051B2 (no) |
| AT (1) | ATE261985T1 (no) |
| AU (1) | AU705192B2 (no) |
| CA (1) | CA2236751C (no) |
| DE (1) | DE69631906T2 (no) |
| HK (1) | HK1023781A1 (no) |
| NO (1) | NO320175B1 (no) |
| SE (1) | SE9504019D0 (no) |
| WO (1) | WO1997018233A1 (no) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6653098B1 (en) * | 1998-02-23 | 2003-11-25 | G. D. Searle & Co. | Method of producing mouse and human endostatin |
| MXPA00009564A (es) * | 1998-03-31 | 2004-03-10 | Thongua Gantech Biotechnology | Proteina quimerica que contiene una secuencia similar a la caperona intramolecular y su aplicacion a la produccion de insulina. |
| GB9913437D0 (en) * | 1999-06-09 | 1999-08-11 | Medical Res Council | Fusion proteins |
| FR2820424B1 (fr) * | 2001-02-05 | 2004-01-02 | Merieux Oravax | Procede de purification de alpa |
| EP2041154B1 (en) | 2006-07-14 | 2018-12-12 | Genentech, Inc. | Refolding of recombinant proteins |
| US9119832B2 (en) | 2014-02-05 | 2015-09-01 | The Regents Of The University Of California | Methods of treating mild brain injury |
| WO2017075535A1 (en) | 2015-10-28 | 2017-05-04 | Oxeia Biopharmaceuticals, Inc. | Methods of treating neurodegenerative conditions |
| JPWO2022097216A1 (no) * | 2020-11-05 | 2022-05-12 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE8505922D0 (sv) * | 1985-12-13 | 1985-12-13 | Kabigen Ab | Construction of an igg binding protein to facilitate downstream processing using protein engineering |
| US5231178A (en) | 1991-01-16 | 1993-07-27 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Method for the purification of intact, correctly-folded insulin-like growth factor-1 |
| US5288931A (en) * | 1991-12-06 | 1994-02-22 | Genentech, Inc. | Method for refolding insoluble, misfolded insulin-like growth factor-I into an active conformation |
| DE59305396D1 (de) * | 1992-12-02 | 1997-03-20 | Hoechst Ag | Verfahren zur Gewinnung von Proinsulin mit korrekt verbundenen Cystinbrücken |
| US5407810A (en) * | 1993-08-20 | 1995-04-18 | Genentech, Inc. | Aqueous multiple-phase isolation of polypeptide |
| US5663304A (en) * | 1993-08-20 | 1997-09-02 | Genentech, Inc. | Refolding of misfolded insulin-like growth factor-I |
-
1995
- 1995-11-13 SE SE9504019A patent/SE9504019D0/xx unknown
-
1996
- 1996-11-12 DE DE69631906T patent/DE69631906T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1996-11-12 CA CA002236751A patent/CA2236751C/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-11-12 JP JP51878397A patent/JP3930051B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-11-12 AU AU76596/96A patent/AU705192B2/en not_active Ceased
- 1996-11-12 US US09/051,941 patent/US6605706B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-11-12 EP EP96939406A patent/EP0952981B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-11-12 AT AT96939406T patent/ATE261985T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-11-12 WO PCT/SE1996/001456 patent/WO1997018233A1/en active IP Right Grant
-
1998
- 1998-05-12 NO NO19982155A patent/NO320175B1/no not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-04-26 HK HK00102454A patent/HK1023781A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US6605706B1 (en) | 2003-08-12 |
| ATE261985T1 (de) | 2004-04-15 |
| NO982155D0 (no) | 1998-05-12 |
| JP3930051B2 (ja) | 2007-06-13 |
| AU7659696A (en) | 1997-06-05 |
| JP2000500023A (ja) | 2000-01-11 |
| AU705192B2 (en) | 1999-05-20 |
| SE9504019D0 (sv) | 1995-11-13 |
| NO982155L (no) | 1998-05-12 |
| CA2236751A1 (en) | 1997-05-22 |
| DE69631906D1 (de) | 2004-04-22 |
| EP0952981B1 (en) | 2004-03-17 |
| DE69631906T2 (de) | 2005-01-20 |
| EP0952981A1 (en) | 1999-11-03 |
| CA2236751C (en) | 2007-01-09 |
| HK1023781A1 (en) | 2000-09-22 |
| WO1997018233A1 (en) | 1997-05-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Rudolph et al. | In vitro folding of inclusion body proteins | |
| Marston et al. | [20] Solubilization of protein aggregates | |
| US5756672A (en) | Refolding of polypeptides | |
| KR101741859B1 (ko) | 화학적으로 조절된 산화환원 상태를 사용한 단백질의 재폴딩 | |
| EP0215625B1 (en) | Protein recovery | |
| EP3337820B1 (en) | An improved refolding process for antibody's fragments | |
| CA2444480C (en) | Methods and compositions for production of recombinant peptides | |
| KR20140135959A (ko) | 온-컬럼 효소적 절단 | |
| NO320175B1 (no) | Fremgangsmate for fremstilling av korrekt foldet, biologisk aktivt rekombinant protein eller polypeptid. | |
| US6586575B1 (en) | Purification of somatotropin from transformed microorganisms | |
| Kelley et al. | Folding of eukaryotic proteins produced in Escherichia coli | |
| Jia et al. | Peptide models of four possible insulin folding intermediates with two disulfides | |
| US7189811B2 (en) | Process for solubilization of recombinant proteins expressed as inclusion body | |
| AU739394B2 (en) | Process for the preparation of active somatotropin from inclusion bodies | |
| AU684117B2 (en) | Use of IGF-BP for refolding of IGF | |
| Marston et al. | Scale-up of the recovery and reactivation of recombinant proteins | |
| US7071313B1 (en) | Methods of purifying authentic IGF from yeast hosts | |
| US7193042B1 (en) | Methods for purifying authentic IGF from yeast hosts | |
| EP0578472A2 (en) | A process for recovering peptides expressed as fusion proteins |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |