CN103275195A - 一种大肠杆菌表达包涵体蛋白纯化复性方法 - Google Patents

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李慧英
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王真
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张如民
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Abstract

本发明公开了一种大肠杆菌表达包涵体蛋白纯化复性方法，将表达包涵体蛋白的菌株离心收集，洗涤后，用BufferA进行重悬，接着用超声波或液压破碎仪破碎至清亮，经过适当离心后获得包涵体蛋白，用适当浓度的SKL溶解后，再用氧化型谷胱甘肽和还原性谷胱甘肽溶液进行处理，最终纯化复性的蛋白。本发明方法操作简单，提高了包涵体复性效率，简化了复性步骤，节约了时间并减少了操作人员的工作量，所得蛋白质纯度较高并且具有生物学活性。

Description

一种大肠杆菌表达包涵体蛋白纯化复性方法
技术领域
本发明属于生物工程下游蛋白质纯化技术领域，具体涉及一种大肠杆菌表达包涵体蛋白纯化复性方法。
背景技术
包涵体是外源基因在原核细胞中表达时，尤其在大肠杆菌中高效表达时，形成的由膜包裹的高密度、不溶性蛋白质颗粒，在显微镜下观察时为高折射区，与胞质中的其他成分有明显区别。包涵体的形成与胞质内蛋白质的生成速率有关，新生成的多肽浓度较高，无充足的时间进行折叠，从而形成非结晶、无定型的蛋白质聚集体；此外，包涵体的形成还被认为与宿主菌的培养条件（如培养基成分、温度、pH值、离子强度等）有关。
细胞中的生物学活性蛋白质常以可融性或分子复合物的形式存在，功能性的蛋白质总是折叠成特定的三维结构性型。包涵体内的蛋白是非折叠状态的聚集体，不具有生物学活性，因此要获得具有生物学活性的蛋白质必须将包涵体溶解，释放出其中的蛋白质，并进行蛋白质的复性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作方便、快捷的大肠杆菌表达包涵体蛋白纯化复性方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种大肠杆菌表达包涵体蛋白复性纯化方法，包括以下步骤：
第一步，将表达菌体离心收集，离心菌体经PBS洗涤后用Buffer A重悬，之后用超声波或液压破碎仪破碎重悬液至清亮；其中离心温度为4-10℃、离心速度为8000-12000r/min、离心时间为每200ml菌体离心1min；
第二步，在4-10℃，8000-12000r/min下离心第一步中的清亮液，接着弃去上清液，离心时间﹥10min，再用PBS洗涤沉淀；
第三步，向第二步所得沉淀中加入Buffer A、0.5mol/L的DTT和20%的SKL贮存液，使沉淀缓慢溶解，溶解条件为25℃下静置30-120min或4℃下溶解时间＞8h ，然后4-10℃、8000-12000r/min离心，取上清液，离心时间﹥10min；
第四步，向第三步的上清液中加入20%的PEG4000至终浓度为0.2%，加入50mmol/L的氧化型谷胱甘肽至终浓度为1mmol/L,加入100mmol/L的还原型谷胱甘肽至终浓度为2mmol/L，25℃下静置30-120min或4℃下反应时间＞8h，接着用TE buffer透析后即得产品；
其中，Buffer A的用量为菌体体积的1/10,DTT用量为菌体体积的1/10000，SKL用量为菌体体积的3/2000，所述百分比为重量百分比；所述Buffer A的组成为50mmol/L的Tris-base、0.5mmol/L的EDTA、50mmol/L的NaCl和体积分数为5%的甘油。
上述方法中，较好的，用PBS洗涤时洗涤次数为2-3次；第一步中利用超声波破碎仪进行破碎。
根据包涵体蛋白的特性，较好的，第二步中溶解时剧烈搅动。
上述方法中，为了使蛋白质复性完全，第四步中透析时间为72h。
为了使离心达到最好效果，较好的，离心温度为4℃，离心速率为12000r/min。
本发明方法操作简单，提高了包涵体复性效率，简化了复性步骤，节约了时间并减少了操作人员的工作量，所得蛋白质纯度较高并且具有生物学活性。
附图说明
图1为重组猪IFN-beta蛋白SDS-PAGE电泳图，图中，M为蛋白marker，1为pET-28a 空载体37℃诱导5h全蛋白，2为 pET-28a-IFN-β未诱导全蛋白，3为pET-28a- IFN-β 37℃诱导5h全蛋白，4为重组菌株破碎后上清液中全蛋白，5为重组菌株破碎后沉淀中全蛋白；
图2为小鼠免疫效价检测结果；其中A、B、C为经过复性后蛋白免疫小鼠情况，D、E、F为未经过复性蛋白免疫小鼠情况，G为阴性小鼠情况。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明，但本发明的保护范围并不限于此。
实验中所用Buffer A的组成为50 mmol/L的Tris-base、0.5mmol/L的EDTA、50mmol/L的NaCl和体积分数为5%的甘油。
实施例中mM表示mmol/L。
实施例1
将猪IFN-beta通过分子克隆的方法连接入原核表达质粒PET-28a，经诱导表达后发现其重组蛋白是以包涵体的方式表达，应用本发明方法对包涵体蛋白进行提取并复性，其具体操作如下：
（1）诱导表达重组菌株PET-28a-IFN-beta 200ml，4℃、12000rpm离心1min集菌，然后用PBS洗涤菌体3次，用20ml Buffer A重悬菌体，接着用超声波破碎仪破碎至清亮；
（2）将清亮液在４℃、12000rpm条件下离心20min，弃上清液；
（3）用PBS洗涤沉淀3次；
（4）往沉淀中加20ml Buffer A以及20ul的0.5mol/L 的DTT及0.3ml 20%的SKL贮存液，剧烈搅动，使其缓慢溶解，室温（25℃）静置100分钟；
（5）将步骤（4）中所得溶液在4℃、12000rpm条件下离心20 min，取上清液；
（6）向上清液中加20% PEG4000 210ul至终浓度为0.2%，加50mM（0.03g/mL）的氧化型谷胱甘肽420ul至终浓度为１mM,加100mM（0.03g/mL）的还原型谷胱甘肽420ul至终浓度为2mM,25℃静置100分钟；
（7）用1×TE Buffer（pH8.0)透析72小时;取出后分装，-80℃保存备用。重组猪IFN-beta蛋白SDS-PAGE电泳图如图1所示。
利用实施例1中所得经过复性的包涵体蛋白对BLA B/C小鼠进行免疫，共免疫3只；同时以未进行复性处理的蛋白为对照组，也免疫3只。每次的免疫剂量为100ug/只，免疫周期为2周。
经过2次免疫后，对实验组和对照组进行断尾采血，检测免疫效价。小鼠免疫检测结果如图2所示。
结果表明，应用本发明方法提取的包涵体蛋白经复性后，免疫原性良好。
实施例2
将FMDV-VP1通过分子克隆的方法连接入原核表达质粒PET-32a，经诱导表达后发现其重组蛋白是以包涵体的方式表达，应用本发明方法对包涵体蛋白进行提取并复性，其具体操作如下：
（1）诱导表达重组菌株1000ml，10℃、8000rpm离心5min集菌，然后用PBS洗涤菌体2次，用100ml Buffer A重悬菌体，接着用液压破碎仪破碎至清亮；
（2）将清亮液在10℃、8000rpm条件下离心15min，弃上清液；
（3）用PBS洗涤沉淀2次；
（4）往沉淀中加100ml Buffer A以及100ul的0.5mol/L 的DTT及1.5ml 20%的SKL贮存液，剧烈搅动，使其缓慢溶解，室温（25℃）静置120分钟；
（5）10℃、8000rpm离心15 min，取上清液；
（6）向上清液中加20% PEG4000至终浓度为0.2%，加50mM（0.03g/mL）的氧化型谷胱甘肽至终浓度为１mM,加100mM（0.03g/mL）的还原型谷胱甘肽至终浓度为2mM,然后4℃下过夜（9h）。
（7）用1×TE（pH8.0)透析72小时;取出后分装，-80℃保存备用。
实施例3
将CSFV-E2通过分子克隆的方法连接入原核表达质粒PET-30a，经诱导表达后发现其重组蛋白是以包涵体的方式表达，应用本发明方法对包涵体蛋白进行提取并复性，其具体操作如下：
（1）诱导表达重组菌株600ml，6℃、10000rpm离心3min集菌，然后用PBS洗涤菌体4次，用60ml Buffer A重悬菌体，接着用超声波破碎仪破碎至清亮；
（2）将清亮液在6℃、10000rpm条件下离心18min，弃上清液；
（3）用PBS洗涤沉淀4次；
（4）往沉淀中加60ml Buffer A以及60ul的0.5mol/L 的DTT及0.9ml 20%的SKL贮存液，剧烈搅动，使其缓慢溶解，室温（25℃）静置80分钟；
（5）6℃、10000rpm离心18 min，取上清液；
（6）向上清液中加20% PEG4000至终浓度为0.2%，加50mM（0.03g/mL）的氧化型谷胱甘肽至终浓度为１mM,加100mM（0.03g/mL）的还原型谷胱甘肽至终浓度为2mM,25℃静置80分钟；
（7）用1×TE（pH8.0)透析72小时;取出后分装，-80℃保存备用。
通过蛋白SDS-PAGE电泳检测和小鼠免疫试验表明，利用本发明方法纯化复性所得包涵体蛋白纯度高，免疫原性好。

Claims (6)

1.一种大肠杆菌表达包涵体蛋白纯化复性方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步，将表达菌体离心收集，离心菌体经PBS洗涤后用Buffer A重悬，之后用超声波或液压破碎仪破碎至清亮；其中离心温度为4-10℃、离心速度为8000-12000r/min、离心时间为每200ml菌体离心1min；
第二步，在4-10℃、8000-12000r/min下离心第一步中的清亮液，弃去上清液，离心时间﹥10min，再用PBS洗涤沉淀；
第三步，向沉淀中加入Buffer A、0.5mol/L的DTT和20%的SKL贮存液，使沉淀缓慢溶解，溶解条件为25℃下静置30-120min或4℃下溶解时间＞8h ，然后4-10℃、8000-12000r/min离心，取上清液，离心时间﹥10min；
第四步，向第三步的上清液中加入20%的PEG4000至终浓度为0.2%，加入50mmol/L的氧化型谷胱甘肽至终浓度为1mmol/L,加入100mmol/L的还原型谷胱甘肽至终浓度为2mmol/L，25℃下静置30-120min或4℃下反应时间＞8h，接着用TE buffer透析后即得产品；
其中，Buffer A的用量为菌体体积的1/10,DTT用量为菌体体积的1/10000，SKL用量为菌体体积的3/2000，所述百分比为重量百分比；所述Buffer A的组成为50 mmol/L的Tris-base、0.5mmol/L的EDTA、50mmol/L的NaCl和体积分数为5%的甘油。
2.如权利要求1所述一种大肠杆菌表达包涵体蛋白纯化复性方法，其特征在于，用PBS洗涤时洗涤次数为2-3次。
3.如权利要求1所述一种大肠杆菌表达包涵体蛋白纯化复性方法，其特征在于，第一步中利用超声波破碎仪进行破碎。
4.如权利要求1所述一种大肠杆菌表达包涵体蛋白纯化复性方法，其特征在于，第二步中溶解时剧烈搅动。
5.如权利要求1所述一种大肠杆菌表达包涵体蛋白纯化复性方法，其特征在于，第四步中透析时间为72h。
6.如权利要求1所述一种大肠杆菌表达包涵体蛋白纯化复性方法，其特征在于，离心温度为4℃，离心速率为12000r/min。
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