CN108929365A - 一种重组蛋白的复性方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于发酵工业领域，具体涉及一种重组蛋白的复性方法，将重组蛋白的包涵体用变性液充分溶解，离心后取上清液得到变性蛋白液；将变性蛋白液与复性液混合后加入发酵罐；控制发酵罐的温度、pH、搅拌转速同时液面下通入气体复性。本发明使用菌体发酵的发酵罐进行复性，利用发酵罐可对pH、搅拌转速、温度等参数进行监测和记录的功能，不需要单独的设备和混合装置，同时采用液面下通气，并用发酵罐流量计等装置有效控制分压，保证整个复性过程可控，有利于工艺的重复性。与传统的混合复性方式相比，本发明提高了复性工艺的可控性、可追溯性和稳定性，减少了二硫键错配，提升了产品质量，降低了操作难度，并成功实现了复性工艺可放大性。

Description

一种重组蛋白的复性方法
技术领域
本发明属于发酵工业领域，具体涉及一种重组蛋白的复性方法，尤其是大规模的重组蛋白的复性方法。
背景技术
重组蛋白是以基因工程和细胞工程等技术生产的、源自生物体内的蛋白药物。重组蛋白已成为现在生物技术生产的最重要的产品。近二十几年来蛋白质药物发展迅速，目前有近百种重组蛋白药物上市，几千种处于研发状态。欧美在蛋白质药物研究上整体实力强，在全球有较大的市场。重组蛋白质药物可分为多肽和基因工程药物、单克隆抗体和基因工程抗体、重组疫苗。与以往的小分子药物相比，重组蛋白质药物具有高活性、特异性强、低毒性、生物功能明确、有利于临床应用的特点。由于其成本低、成功率高、安全可靠，已成为医药产品中的重要组成部分。
目前上市的重组蛋白药物大致可以分为以下几类：多肽类激素药：包括人胰岛素、人生长激素、卵泡刺激激素和其他激素；人造血因子：包括重组人促红细胞生成素、粒细胞/单核细胞集落刺激因子GM-CSF、其他造血相关因子；人细胞因子：包括A-干扰素、B-干扰素、其他细胞因子；人血浆蛋白因子：包括重组人凝血因子重组人凝血因子×、重组人凝血因子组织血浆酶原激活物tPA、C反应蛋白、重组人抗凝血酶；人骨形成蛋白；重组酶：1993年第一个重组酶Pulmozyme(Genetech)上市；融合蛋白：是为数很少的以抑制为作用机理的重组药物，仅有3个；外源重组蛋白：重组水蛭素(hirudin)。
重组蛋白药物的表达系统分为原核生物和真核生物表达系统。原核生物主要是大肠杆菌表达系统，真核生物表达系统主要有酵母菌、哺乳动物细胞表达系统。其中大肠杆菌由于遗传背景清楚、易操作、易调控、培养基要求简单和生长迅速等优点，广泛用于重组蛋白表达。然而由于蛋白本身的性质问题，很多蛋白无法实现在大肠杆菌中的可溶性表达，而必须采用包涵体表达的方式。而包涵体表达的蛋白，其二硫键配对和高级结构的正确形成都需要通过还原变性后再复性的方式来实现。然而，传统的混合复性法中，整个液体环境中的溶氧不够均一，工艺参数不可控，工艺重复性和可放大性较差。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种重组蛋白的复性方法，使重组蛋白的复性的可控性、可放大性和产品质量大大提高，工艺稳定性也得以增强。
为实现本发明的目的本发明采用如下技术方案：
一种重组蛋白的复性方法，包括如下步骤：
(1)将重组蛋白的包涵体用变性液充分溶解，离心后取上清得到变性蛋白液；
(2)将变性蛋白液与复性液混合后加入发酵罐；
(3)控制发酵罐的温度、pH、搅拌转速同时液面下通入气体复性。
作为优选，步骤(1)所述变性液为：5-8M盐酸胍，5-20mM巯基乙醇，5-50mM Tris，pH8.0～9.0。
作为优选，步骤(2)所述复性液为：1-2M尿素，50-200mM精氨酸，pH 8.5～9.5。
作为优选，步骤(2)所述变性蛋白液与复性液的体积比为1:10～1:20。
作为优选，在变性液中投入的包涵体量应使复性体系蛋白终浓度为0.1-2.0mg/ml。
作为优选，步骤(3)所述发酵罐中复性的温度为5-15℃，pH为8.0～9.0，转速为50-150rpm，复性24-90小时。
作为优选，步骤(3)所述通入气体为通入氮气、氧气、空气、二氧化碳中一种或几种的混合气体。
作为优选，步骤(3)通入气体时使用发酵罐底部的环形分布器通入复性体系，发酵罐流量计控制气体分压为10％-60％。
作为优选，所述重组蛋白为重组人促血小板生成素模拟肽-Fc融合蛋白或重组人Fc融合蛋白。
作为优选，本发明所述复性方法还包括纯化步骤，所述纯化具体为复性液浓缩后，调节pH至5.0，过滤去除沉淀，滤液稀释后装载到预平衡过的SP BigBeads柱上，用20mMNaAc-(0.25～0.30)M NaCl的洗脱液洗脱蛋白质，洗脱液稀释、过滤后上清装载到预平衡过的SP High Performance柱上，用20mM NaAc-(0.28～0.32)M NaCl梯度洗脱蛋白质，收集洗脱组分。
由上述技术方案可知，本发明提供了一种重组蛋白的复性方法将重组蛋白的包涵体用变性液充分溶解，离心后取上清得到变性蛋白液；将变性蛋白液与复性液混合后加入发酵罐；控制发酵罐的温度、pH、搅拌转速同时液面下通入气体复性。本发明使用菌体发酵的发酵罐进行复性，利用发酵罐可对pH、搅拌转速、温度等参数进行监测和记录的功能，不需要单独的设备和混合装置，同时采用液面下通气，并用发酵罐流量计等装置有效控制分压，保证整个复性过程可控，有利于工艺的重复性。
本发明至少具有下述一种有益效果：
(1)使复性方法全程的工艺参数实现实时监控，提高了工艺可控性；
(2)使二硫键配对的正确率较传统发酵工艺有所提高，提高了产品质量；
(3)减少了人为操作可能造成的偏差，提高了工艺的稳定性；
(4)液面下通气方式使蛋白在复性过程中所处的环境更为均一，使工艺的可放大性提高，有利于较大规模的生产；
(5)方法可操作性强，充分利用发酵工业设备，无需另外的工艺装置，降低成本，易于推广，适合于工业化大生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为发酵罐内环形分布器示意图；
图2为Fc功能域正确结构和复性中易出现的二硫键错配结构的示意图；
图3为比较例五中重组人促血小板生成素模拟肽-Fc融合蛋白C7，C10氨基酸配对正确结构(上)和复性后易出现二硫键错配的肽段(下)的二级质谱信息；
图4为实施例1-4及比较例1复性后的重组人促血小板生成素模拟肽-Fc融合蛋白反相高效液相色谱图比对；
图5为实施例1-4及比较例1复性后的重组人促血小板生成素模拟肽-Fc融合蛋白毛细管电泳谱图比对。
具体实施方式
本发明公开了一种重组蛋白的复性方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为实现本发明的目的本发明采用如下技术方案：
一种重组蛋白的复性方法，包括如下步骤：
(1)将重组蛋白的包涵体用变性液充分溶解，离心后取上清得到变性蛋白液；
(2)将变性蛋白液与复性液混合后加入发酵罐；
(3)控制发酵罐的温度、pH、搅拌转速同时液面下通入气体复性。
本发明使用菌体发酵的发酵罐进行复性，利用发酵罐可对pH、搅拌转速、温度等参数进行监测和记录的功能，不需要单独的设备和混合装置，同时采用液面下通气，并用发酵罐流量计等装置有效控制分压，保证整个复性过程可控，有利于工艺的重复性。与传统的混合复性方式相比，本发明提高了复性工艺的可控性、可追溯性和稳定性，减少了二硫键错配，提升了产品质量，降低了操作难度，并成功实现了复性工艺可放大性。
在一些实施方案中，步骤(1)所述变性液为：5-8M盐酸胍，5-20mM巯基乙醇，5-50mMTris，pH 8.0～9.0。
在一些具体实施例中，所述变性液为8M盐酸胍，20mM巯基乙醇，50mM Tris，用盐酸调节使pH为9.2。在一些具体实施例中，所述变性液为：8M盐酸胍，10mM巯基乙醇，50mMTris，用盐酸调节使pH为9.0。在一些具体实施例中，所述变性液为：8M盐酸胍，20mM巯基乙醇，50mM Tris，用盐酸调节使pH为8.5～9.0。
在一些实施方案中，步骤(2)所述复性液为：1-2M尿素，50-200mM精氨酸，pH 8.5～9.5。
在一些具体实施例中，所述复性液为2M尿素，50mM精氨酸，用盐酸调节使pH为9.2。在一些具体实施例中，所述复性液为2M尿素，50mM精氨酸，用盐酸调节使pH为9.0。在一些具体实施例中，所述复性液为M尿素，50mM精氨酸，用盐酸调节使pH为8.5。
在一些实施方案中，步骤(2)所述变性蛋白液与复性液的体积比为1:10～1:20。在一些具体实施例中，所述变性蛋白液与复性液的体积比1:10。在一些具体实施例中，所述变性蛋白液与复性液的体积比1:20。
在一些实施方案中，在变性液中投入的包涵体量应使复性体系蛋白终浓度为0.1-2.0mg/ml。在一些具体实施例中，包涵体的终浓度为2mg/ml。在一些具体实施例中，包涵体的终浓度为1.75mg/ml。在一些具体实施例中，包涵体的终浓度为1mg/ml。
在一些实施方案中，步骤(3)所述发酵罐中复性的温度为5-15℃，pH为8.0～9.0，转速为50-150rpm，复性24-90小时。在一些具体实施例中，维持温度5-15℃、搅拌转速60rpm，pH9.2复性条件下进行复性24小时。在一些具体实施例中，维持温度5-15℃、搅拌转速60rpm，pH9.0复性条件下进行复性48小时。在一些具体实施例中，维持温度5-15℃、搅拌转速60-80rpm，pH9.0复性条件下进行复性48小时。在一些具体实施例中，维持温度5-15℃、搅拌转速60rpm，pH8.5复性条件下进行复性72小时。
本发明所述复性方法在利用发酵罐复性时，采用发酵罐液面下通气。其中，所述通入气体优选为通入氮气、氧气、空气、二氧化碳中一种或几种的混合气体。更优选通入氧气。
本发明所述复性方法通入气体时优选使用发酵罐底部的环形分布器将单一或混合气体通入复性体系。根据需要使用发酵罐流量计等装置来控制氮气、氧气、空气、二氧化碳等气体的混合比例。
在一些实施方案中，控制氧分压为10％-60％。
本领域技术人员可以理解，本发明所述复性方法可用于包涵体表达的任意一种重组蛋白的复性。
优选的，所述重组蛋白为重组人促血小板生成素模拟肽-Fc融合蛋白或重组人Fc融合蛋白。
在一些实施方案中，所述重组蛋白为重组人促血小板生成素模拟肽-Fc融合蛋白，该蛋白由两个相同的单体通过二硫键连接而成。其中，两个单体的N端起第7位的半胱氨酸(以下简称C7)相互以二硫键连接，两个单体的N端起第10位的半胱氨酸(以下简称C10)相互以二硫键连接。但在复性错误的情况下，单体内部的C7和C10会在单体内部形成二硫键，而未能与另一个单体中的C7或C10相连。
重组人促血小板生成素模拟肽-Fc融合蛋白的错配的具体定位和定量信息可以通过液质联用仪器检测胰蛋白酶消化后肽段来监测，该错配还可通过反相色谱和毛细管电泳进行分离。
在一些实施例中，本发明采用液质联用仪器对采用本发明所述复性方法复性的重组人促血小板生成素模拟肽-Fc融合蛋白的二硫键错配比例进行了检测，同时还进行了反相高效液相色谱检测和毛细管电泳检测。结果显示本发明的复性方法相比于传统方法，降低了产品错配率，尤其是在放大时有明显优势。随着复性规模的放大，二硫键错配并未上升，反而表现出下降，其反相色谱纯度和毛细管电泳纯度也均随规模放大而上升。
进一步，作为优选，本发明所述复性方法还包括纯化步骤，所述纯化具体为复性液浓缩后，调节pH至5.0，过滤去除沉淀，滤液稀释后装载到预平衡过的SP BigBeads柱上，用20mM NaAc-(0.25～0.30)M NaCl的洗脱液洗脱蛋白质，洗脱液稀释、过滤后上清装载到预平衡过的SP High Performance柱上，用20mM NaAc-(0.28～0.32)M NaCl梯度洗脱蛋白质，收集洗脱组分。
在一些是实施方案中，所述纯化具体为复性液超滤浓缩大约2-3倍，用乙酸调节pH至5.0，滤膜过滤去除沉淀，将上清稀释至电导率不高于16ms/cm，装载到预平衡过的SPBigBeads柱上，之后用20mM NaAc-0.25～0.30M NaCl的洗脱液洗脱蛋白质，洗脱液稀释2-3倍，滤膜过滤后上清装载到预平衡过的SP High Performance柱上，用20mM NaAc-0.28～0.32M NaCl梯度洗脱蛋白质，分段收集过滤洗脱组分，经反相高效液相色谱法(具体方法参照实施例一(6))分析，将反相纯度不低于90％的组分进行合并。
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
实施例一、重组人促血小板生成素模拟肽-Fc融合蛋白复性(550ml)
(1)变性液的配制
配制50ml变性液，其成分为：8M盐酸胍，20mM巯基乙醇，50mM Tris，用盐酸调节使pH为9.2。投入包涵体至复性体系蛋白终浓度为0.5-1.5mg/ml。包涵体投入量：包涵体干燥前后分别用天平称量，计算包涵体干湿重比，使其干重为20g/L变性液。
(2)复性液的配制
配制500ml复性液，其成分为：2M尿素，50mM精氨酸，用盐酸调节使pH为9.2。
(3)混合复性
变性蛋白液与复性液按1:10的比例混合并在1L发酵罐中进行复性，维持温度5-15℃、通气氧分压10％-60％，搅拌转速60rpm，pH9.2保持此复性条件进行复性24小时，参数记录如表1。
表1复性参数
计时(小时) 温度(℃) 搅拌转速(rpm) pH
0 9 60 9.2
6 10 62 9.1
12 10 59 9.2
24 11 58 9.0
(4)收获复性蛋白，复性液超滤浓缩大约2-3倍，用乙酸调节pH至5.0，滤膜过滤去除沉淀，将上清稀释至电导率不高于16ms/cm，装载到预平衡过的SP BigBeads柱上，之后用20mM NaAc-(0.25～0.30)M NaCl的洗脱液洗脱蛋白质。洗脱液稀释2-3倍，滤膜过滤后上清装载到预平衡过的SP High Performance柱上，用20mM NaAc-(0.28～0.32)M NaCl梯度洗脱蛋白质，分段收集过滤洗脱组分，经反相高效液相色谱法(按照下述(6)条件进行反相色谱检测)分析，将反相纯度不低于90％的组分进行合并。
(5)二硫键错配比检测方法：
仪器和试剂：乙腈，甲酸，三羟甲基氨基甲烷，胰蛋白酶。Waters质谱仪Xevo G2-XSQTof，冷冻干燥离心机，色谱柱ACQUITYPeptide BEH C18，1.7μm，2.1mm×100mm。
样品处理：将100μg的蛋白加入10kD超滤管，用超纯水在12000rpm超滤换液并浓缩至不多于50μl。将样品转移至EP管中，加入1ml 150mM tris-10％乙腈溶液(pH7.8)，混匀。取胰蛋白酶1μg加进1ml蛋白溶液体系中，混匀，37℃水浴酶切16小时。酶切后样品溶液，用冷冻干燥离心机蒸干后，用100μl水复溶。
液相条件：流动相A：500ml超纯水中加入甲酸500μl，超声处理10分钟。流动相B：500ml乙腈加入甲酸500μl，超声处理10分钟。流速0.2ml/min，检测波长220nm，洗脱程序如表2。
表2洗脱程序
时间(min) 流动相B％
0 5
1 5
50 36
60 36
61 90
66 90
67 5
70 5
质谱条件：采集模式：MSe,分析模式：分辨率模式(Resolution模式)，毛细管电压:3.00kV，锥孔电压:40V，源温度：100℃，去溶剂温度：350℃，去溶剂气体流速：600L/h，锥孔气体流速：50L/h，质荷比采集范围：200-2000,低能量通道电压：6.00V，高能量通道电压：25--45v。
计算方法：最易发生二硫键错配的位点为C7，C10，正确的二硫键配对方式为C7与C7在两个单体之间相配，C10与C10在两个单体之间相配，胰酶消化后，其对应的质谱信号为两个单体的N末端起第二个酶切肽段连接形成的T2-T2的响应值；错误的配对方法为C7与C10在单体内配对，胰酶消化后，其对应的质谱信号为N末端起第二个肽段T2的响应值。计算T2的响应值与T2/T2响应值的比值。
(6)反相高效液相色谱检测方法
色谱柱：C8色谱柱，5μm，4.6×250mm，流速1ml/min)，检测波长220nm，柱温箱温度40℃，平衡相A 0.1％TFA/水，洗脱相B 40％乙腈/40％异丙醇/20％水/0.08％TFA，洗脱时间程序如表3所示。
表3洗脱时间程序
时间(min) 洗脱相B％
0.01 35
3.00 35
10.00 42
42.00 47
45.10 70
50.00 70
50.01 35
60.00 Stop
(7)毛细管电泳检测方法
CE仪器为Beckman公司的PA 800plus。毛细管凝胶为GE公司试剂。
样品配制成约1mg/ml后，用SDS样品稀释液稀释至约0.5mg/ml，并加入分子量为10kD的内标标准品后上样。上样电压为50KV，持续时间20s，电泳电压为150KV，电泳时间30min。
实施例二、重组人促血小板生成素模拟肽-Fc融合蛋白复性(22L)
(1)变性液的配制
配制2L变性液，其成分为：8M盐酸胍，10mM巯基乙醇，50mM Tris，用盐酸调节使pH为9.0。包涵体投入量：包涵体干燥前后分别用天平称量，计算包涵体干湿重比，使其干重为17.5g/L变性液。
(2)复性液的配制
配制20L复性液，其成分为：2M尿素，50mM精氨酸，用盐酸调节使pH为9.0。
(3)混合复性
变性蛋白液与复性液按1:10的比例混合并在45L发酵罐中进行复性。维持温度5-15℃、通气氧分压10％-60％、搅拌转速60rpm，pH9.0保持此复性条件进行复性48小时。复性规模为22L。参数记录如表4
表4复性参数
计时(小时) 温度(℃) 搅拌转速(rpm) pH
0 9 61 9.0
12 8 59 9.0
24 9 60 9.0
48 9 59 9.0
(4)收获复性蛋白，按照实施例1所述方法纯化后进行分析检测。
二硫键配对检测：同实施例一。
反相高效液相色谱检测方法：同实施例一。
毛细管电泳检测方法：同实施例一。
实施例三、重组人促血小板生成素模拟肽-Fc融合蛋白复性(176L)
(1)变性液的配制
配制16L，其成分为：8M盐酸胍，20mM巯基乙醇，50mM Tris，用盐酸调节使pH为9.0。包涵体投入量：包涵体干燥前后分别用天平称量，计算包涵体干湿重比，使其干重为17.5g/L变性液。
(2)复性液的配制
配制160L，其成分为：2M尿素，50mM精氨酸，用盐酸调节使pH为9.0。
(3)混合复性
变性蛋白液与复性液按1:10的比例混合后在300L发酵罐中进行复性。维持温度5-15℃、通气氧分压10％-60％、搅拌转速60-80rpm，pH9.0保持此复性条件进行复性48小时，复性规模为176L。参数记录如表5。
表5复性参数
计时(小时) 温度(℃) 搅拌转速(rpm) pH
0 12 69 9.0
12 10 70 9.1
24 11 72 9.1
48 12 71 9.0
(4)收获复性蛋白，按照实施例1所述方法纯化后进行分析检测。
二硫键错配比例：同实施例一。
反相高效液相色谱检测：同实施例一。
毛细管电泳检测方法：同实施例一。
实施例四、重组人Fc蛋白复性(21L)
(1)变性液的配制
配制1L，其成分为：8M盐酸胍，20mM巯基乙醇，50mM Tris，用盐酸调节使pH为8.5。包涵体投入量：包涵体干燥前后分别用天平称量，计算包涵体干湿重比，使其干重为20g/L变性液。
(2)复性液的配制
配制20L，其成分为：2M尿素，50mM精氨酸，用盐酸调节使pH为8.5。
(3)混合复性
变性蛋白液与复性液按1:20的比例混合并在45L发酵罐中进行复性。维持温度5-10℃、通气氧分压10％-60％、搅拌转速60rpm，pH8.5，保持此复性条件进行复性72小时，复性规模为21L。参数记录如表6。
表6复性参数
计时(小时) 温度(℃) 搅拌转速(rpm) pH
0 9 60 8.5
12 10 61 8.6
24 9 62 8.4
48 9 60 8.5
72 10 62 8.5
(4)收获复性蛋白，按照实施例1所述方法纯化后进行分析检测。
二硫键错配比例检测：同实施例一。
比较例一、重组人促血小板生成素模拟肽Fc融合蛋白复性(22L)
采用传统的反应瓶复性工艺进行复性
(1)变性液的配制
变性液的配制同实施例二。
将包涵体用变性液搅拌溶解，离心后取上清；
(2)复性液的配制
复性液的配制同实施例二。
(3)混合复性
将用变性液与复性液经混合后，在反应瓶中继续反应，在反应瓶中保持表面通气，使用磁力搅拌器搅拌，搅拌转速控制在20rpm左右。复性72h。
(4)收获复性蛋白，按照实施例1所述方法纯化后进行分析检测。
二硫键错配检测：同实施例一。
反相高效液相色谱检测：同实施例一。
毛细管电泳检测：同实施例一。
其中，重组人促血小板生成素模拟肽-Fc融合蛋白C7，C10氨基酸配对的正确结构和复性后易出现二硫键错配的肽段二级质谱信息图如图3所示。复性后C7-C10错配肽段的二级质谱碎片信息见表7。
表7C7-C10错配肽段的二级质谱碎片信息
碎片 碎片分子量(Da) 实测分子量(Da) 误差(Da)
b3 340.2 340.2 -0.001
b7 738.3 738.3 0.000
注：b3离子和b7离子的分子量之差应为CPPC四个氨基酸残基之和。CPPC残基的分子量之和为103+97+97+103＝400Da。而b7与b3的分子量之差为738-340＝398，相差的2Da说明在CPPC残基中脱去了两个氢原子，二硫键位点得到确认。
实施例五、检测结果统计
用相同方式纯化后得到的重组蛋白分别按照实施例一所述方法进行二硫键错配检测、反相高效液相色谱检测和毛细管电泳检测。其中实施例一-四及比较例一蛋白C7，C10二硫键配对的液质联用分析数据见表8，实施例一-四及比较例一复性后的重组人促血小板生成素模拟肽-Fc融合蛋白反相高效液相色谱图比对见图4，实施例一-四及比较例一复性后的重组人促血小板生成素模拟肽-Fc融合蛋白毛细管电泳谱图比对见图5，不同复性方式的检测结果统计，见表9。
表8不同实施例和比较例中蛋白C7，C10二硫键配对的液质联用分析数据
表9不同复性方式的结果比较
从上述检测结果来看，本发明的复性方法相比于传统方法，降低了产品错配率，尤其是在放大时有明显优势。随着复性规模的放大，二硫键错配并未上升，反而表现出下降，其反相色谱纯度和毛细管电泳纯度也均随规模放大而上升。表明本发明所述复性方法适于大规模生产，且有进一步放大的可能。
而且对于相同复性规模的相同产品(比较例一与实施例二)，实施例二的反相色谱纯度明显高于比较例一，二硫键错配明显低于比较例一。

Claims (10)

1.一种重组蛋白的复性方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将重组蛋白的包涵体用变性液充分溶解，离心后取上清液得到变性蛋白液；
(2)将变性蛋白液与复性液混合后加入发酵罐；
(3)控制发酵罐的温度、pH、搅拌转速同时液面下通入气体复性。
2.根据权利要求1所述的复性方法，其特征在于，步骤(1)所述变性液为：5-8M盐酸胍，5-20mM巯基乙醇，5-50mM Tris，pH 8.0～9.0。
3.根据权利要求1所述的复性方法，其特征在于，步骤(2)所述复性液为：1-2M尿素，50-200mM精氨酸，pH 8.5～9.5。
4.根据权利要求1所述的复性方法，其特征在于，步骤(2)所述变性蛋白液与复性液的体积比为1:10～1:20。
5.根据权利要求1所述的复性方法，其特征在于，在变性液中投入的包涵体量应使复性体系蛋白终浓度为0.1-2.0mg/ml。
6.根据权利要求1所述的复性方法，其特征在于，步骤(3)所述发酵罐中复性的温度为5-15℃，pH为8.0～9.0，转速为50-150rpm，复性24-90小时。
7.根据权利要求1所述的复性方法，其特征在于，步骤(3)所述通入气体为通入氮气、氧气、空气、二氧化碳中一种或几种的混合气体。
8.根据权利要求7所述的复性方法，其特征在于，步骤(3)通入气体时使用发酵罐底部的环形分布器通入复性体系，发酵罐流量计控制气体分压为10％-60％。
9.根据权利要求1所述的复性方法，其特征在于，所述重组蛋白为重组人促血小板生成素模拟肽-Fc融合蛋白或重组人Fc融合蛋白。
10.根据权利要求1所述的复性方法，其特征在于，还包括纯化步骤，所述纯化具体为复性液浓缩后，调节pH至5.0，过滤去除沉淀，滤液稀释后装载到预平衡过的SP BigBeads柱上，用20mM NaAc-(0.25～0.30)M NaCl的洗脱液洗脱蛋白质，洗脱液稀释、过滤后上清装载到预平衡过的SP High Performance柱上，用20mM NaAc-(0.28～0.32)M NaCl梯度洗脱蛋白质，收集洗脱组分。
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