CN102906107B - 高分子量重组丝或类丝蛋白、以及使用它们制造的微米或纳米级蜘蛛丝或者类蜘蛛丝纤维 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子量与天然丝蛋白极其相似的高分子量重组丝或类丝蛋白,并涉及使用它们制造的物理性质得到提高的微米或纳米级蜘蛛丝或类蜘蛛丝纤维。根据本发明,重组丝或类丝蛋白与源于蜘蛛的牵引丝蛋白一样具有高分子量,而由此所制造的纤维与天然丝蛋白制作的纤维相比具有优良的物理性质。因此,本发明的重组丝或类丝蛋白以及由此制造的蜘蛛丝或类蜘蛛丝纤维能够应用于以往期待应用蜘蛛丝的生物工程领域和/或医学领域等的各产业中。
Description
技术领域
本发明涉及分子量基本与天然丝蛋白类似的高分子量重组丝或类丝蛋白,以及使用它们制造的物理性质得以提高的微米或纳米级蜘蛛丝或类蜘蛛丝纤维。
背景技术
被蜘蛛用做生命线并在形成放射形蛛网时使用的蜘蛛牵引丝,其强度和弹性度大。按每单位质量计算时,蜘蛛丝的强度是钢铁的5倍,比人造纤维Kevlar坚韧3倍(Gosline,J.M.et al.,J.Exp.Biol.,202:3295,1999;Vollrath,F.&Knight,D.P.,Nature 410:541,2001)。因此,作为一种适用于各种工业用途的材料,蜘蛛牵引丝受到了广泛的关注。此外,蜘蛛牵引丝具有生物相容性和生物可降解性,因此人们期待能够应用到许多生物医学领域中。但遗憾的是,由于蜘蛛具有高度的地域保护性和攻击性,无法通过养殖蜘蛛而方便地获得天然牵引丝。因此,人们一直为了生产出重组牵引丝蛋白而不懈努力。(Lazaris,A.et al.,Science,295:472,2002;Teule,F.et al.,Nat.Protoc.,4:341,2009;Arcidiacono,S.et al.,Macromolecules,35:1262,2002;Brooks,A.E.et al.Biomacromolecules,9:1506,2008;Heim,M.,Keerl,D.&Scheibel,T.,Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,48:3584,2009;Fahnestock,S.R.et al.,Rev.Mol.Biotechnol.,74:105,2000;Scheller,J.et al.,Nat.Biotechnol.,19:573,2001;Widmaier,D.M.et al.Mol.Syst.Biol.,5:309,2009)。
到目前为止,所有研究过的蜘蛛都自然生产具有250-320kDa高分子量的牵引丝蛋白。然而,目前在大肠杆菌(E.coli)中合成的牵引丝蛋白中,最大的分子量为163kDa(Fahnestock S.R.&Irwin S.L.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,47:23,1997),这相当于蜘蛛生产的牵引丝蛋白分子量的一半。没有对更高分子量的牵引丝蛋白的报道,其原因认为是:在蛋白质的合成过程中出现错误而导致了不均匀性等问题的缘故。
于是,为了提供如产自蜘蛛的牵引丝蛋白一样具有高分子量,并且在制成纤维后,具有与天然丝蛋白相似或者更优异的物理性质的重组牵引丝蛋白,本发明人做出了许多努力,结果发现,通过在诸如大肠杆菌的细菌中同时表达甘氨酸tRNA而生成分子量为284.9kDa以上的高分子量重组丝蛋白后,纺织该重组丝蛋白,能够生产出具有比现有天然蜘蛛丝纤维更优异的物性的蜘蛛丝纤维,从而完成了本发明。
发明内容
本发明的目的在于,提供具有类似天然蜘蛛牵引丝蛋白的高分子量的重组丝蛋白。
本发明的另一目的在于,提供纺自高分子量重组丝蛋白且物理性质得以提高的的蜘蛛丝纤维。
为了达到上述目的,本发明提供高分子量重组丝或类丝蛋白,所述高分子量重组丝或类丝蛋白具有甘氨酸含量为10%以上的肽重复64~160次的结构。
另外,本发明提供高分子量重组丝蛋白,所述高分子量重组丝蛋白具有序列号:1的肽重复64-160次的结构,并且具有192.8-482kDa的分子量。
此外,本发明提供制备高分子量重组丝或类丝蛋白的方法,其特征在于,共同表达编码所述重组丝或类丝蛋白的基因,和编码甘氨酸tRNA的核酸序列。
另外,本发明还提供制造微米或纳米级蜘蛛丝或类蜘蛛丝纤维的方法,其特征在于,使用包含所述高分子量重组丝或类丝蛋白的溶液纺丝。
本发明还提供微米或纳米级的蜘蛛丝或类蜘蛛丝纤维,其特征在于,通过所述制造微米或纳米级蜘蛛丝或类蜘蛛丝纤维的方法制造。
此外,本发明提供制造微米或纳米级的蜘蛛丝纤维的方法,其特征在于,使用包含重组丝蛋白的溶液纺丝,其中,所述重组丝蛋白具有序列号:1的肽重复64-160次的结构,并且具有192.8-482kDa的分子量。
此外,本发明提供用所述方法制造的微米或纳米级的蜘蛛丝纤维。
附图说明
图1表示用于表达重组蛋白的表达系统以及重复单位的氨基酸序列。
图2表示从10%SDS-PAGE凝胶中分离的16-聚体、32-聚体、64-聚体和96-聚体重组丝蛋白的分子量照片。
图3是表示用湿纺法从20%(w/v)重组丝蛋白溶液中纺得纤维的应力-应变曲线的图表。
图4是表示用湿纺法从20%(w/v)重组丝蛋白溶液中纺得纤维的断裂应变、拉伸强度和杨氏模量的图表。
图5是表示纤维的拉伸强度、断裂强度和杨氏模量与纺液中重组丝蛋白浓度的函数关系图表中显示了。
具体实施方式
除非特别定义,否则在本说明书涉及的技术和科学用语与本领域技术人员一般理解的含义相同。一般来说,本说明书中使用的命名法是本领域众所周知并被广泛采用的。
在本发明的详细说明中,主要用语的定义如下。
本发明说明书中的“丝蛋白”是指,分子量及结构轮廓接近天然丝蛋白的合成丝蛋白,是通过重组蛋白的制造方法生物合成的蛋白质。丝蛋白的例子包括牵引丝、丝素蛋白和鞭毛样丝蛋白。另外。本发明的“类丝蛋白”是指,与丝蛋白类似地以甘氨酸含量10%以上的肽作为重复单位,并且通过诸如重组蛋白的制造方法来生物合成的蛋白质。类丝蛋白的例子有弹性蛋白、足丝蛋白和胶原蛋白。
本发明说明书中的“蜘蛛丝纤维”是指,利用所合成重组丝蛋白制造并且与天然蜘蛛丝蛋白基本类似的纤维。“类蜘蛛丝纤维”是指,利用所合成的重组类丝蛋白制造并且物理性质与蜘蛛丝纤维相似的纤维。
本发明说明书中的“重组蛋白”是指,由一种核酸序列编码的蛋白质,即通过表达该核酸序列而产生的蛋白,所述核酸序列是嵌入诸如自主复制质粒或病毒之类的载体、或嵌入宿主细胞基因组DNA中、或者在宿主细胞中以独立分子的形式存在而插入的核酸序列。
本发明说明书中的“宿主细胞”是指,可以表达来自其他细胞或生物体的功能性基因和/或基因产物的任何细胞。
本发明的一实施方式涉及高分子量重组丝或类丝蛋白,所述高分子量重组丝或类丝蛋白具有甘氨酸含量为10%以上的肽重复64-160次的结构。
在此,构成上述丝蛋白或类丝蛋白的甘氨酸含量在10%以上的肽,是构成以下蛋白的重复肽,即所述蛋白为由牵引丝蛋白、弹性蛋白、丝素蛋白、足丝蛋白、鞭毛样丝蛋白和胶原蛋白所组成的组中选出的蛋白。序列号:1到4的氨基酸序列为牵引丝蛋白的重复肽,序列号:5到7的氨基酸序列为弹性蛋白的重复肽,序列号:8的氨基酸序列为丝素蛋白的重复肽,序列号:9的氨基酸序列为足丝蛋白的重复肽,序列号:10的氨基酸序列为鞭毛样丝蛋白的重复肽,序列号:11和12的氨基酸序列为胶原蛋白的重复肽。
序列号:1:
NH2-SGRGGLGGQGAGMAAAAAMGGAGQGGYGGLGSQGT-COOH
序列号:2:NH2-GPGQQ-COOH
序列号:3:NH2-GPGGY-COOH
序列号:4:NH2-GGYGPGS-COOH
序列号:5:NH2-GVGVP-COOH
序列号:6:NH2-VPGG-COOH
序列号:7:NH2-APGVGV-COOH
序列号:8:NH2-GAGAGS-COOH
序列号:9:NH2-GPGGG-COOH
序列号:10:NH2-GPGGX-COOH
序列号:11:NH2-GAPGAPGSQGAPGLQ-COOH
序列号:12:NH2-GAPGTPGPQGLPGSP-COOH
本发明中,以上述序列号:1所示的氨基酸序列作为重复单位并以包含64个该重复单位的方式制造的重组丝蛋白(以下称为64聚体)的分子量为约192.8kDa,说明了能够制造出分子量大于现有大肠杆菌内合成的最大牵引丝蛋白(163kDa)的重组丝蛋白。而且,以上述序列号:1所示的氨基酸序列作为重复单位并以包含96个该重复单位的方式制造的重组丝蛋白(以下称为96聚体)的分子量达到了284.9kDa,确认了其具有与从蜘蛛获得的天然丝蛋白的分子量(250-320kDa)基本相似的高分子量。
然而,当以160个以上的重复单位含有上述肽序列时,超出了大肠杆菌所具有蛋白的合成范畴,因此,本发明的重组丝或类丝蛋白的特征是具有肽重复64-160次的结构,优选重复80-160次,更优选重复96-160次。
在本发明中用作重复单位的氨基酸序列不局限于与序列号:1-12完全相同的序列。而且,在此所述的氨基酸序列也包括变异体。因此,本发明中蛋白质的氨基酸序列也涵盖了由于氨基酸插入、缺失和替换所产生的有别于这里所公开序列的所有序列。
优选氨基酸替换是将一个氨基酸用与其结构和/或化学性质相似的氨基酸替代,即保守氨基酸置换。氨基酸替换可根据所涉及残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两亲性而进行。例如,非极性(疏水性)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和蛋氨酸;中性极性的氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺;带正电荷的(碱性)氨基酸包括赖氨酸、精氨酸和组氨酸;带负电荷的(酸性)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。
重复单位中“插入”与“缺失”氨基酸的个数通常在1到5个之间,优选为1、2或3个。重复单位中的附加氨基酸个数通常少于100个,优选低于80个,更优选低于50个,最优选低于20个。将这些氨基酸插入到本发明的重复单位中从而插入到蛋白质内和/或附加到蛋白质内。值得注意的是,本发明中所构想的附加氨基酸仅限于不会对本申请蛋白质所要求的特性产生负面影响的附加氨基酸。
通过使用重组DNA技术系统化地在蛋白质中制造氨基酸的插入、缺失或置换,并检测所得重组变体的活性,可以实验确定可允许的变化程度。这对于本领域技术人员来讲属于常规实验。
因此,本发明的特征在于,将具有与序列号:1至少有90%以上同源性的氨基酸序列作为重复单位。本申请中,“至少有90%以上的同源性”意指,与序列号:1的序列有91%、91.5%、92%、92.5%、93%、93.5%、94%、94.5%、95%、95.5%、96%、96.5%、97%、97.5%、98%、98.5%、99%、99.5%的同一性。“同源性”是指两段氨基酸序列之间的相似度。有同源性是指,在序列和功能上都相似。同源性的对比可通过目测进行,但通常更普遍地借助现成的基因对比程序来计算两个以上序列之间同源性的百分比(Wilbur,W.J.&Lipman,D.J.,Proc.Natl.Acad.Sd.USA.,80:726,1983)。
在本发明中,通过在细菌中共同表达甘氨酸tRNA来制备重组丝蛋白或重组类丝蛋白。因而,本发明的另一实施方式涉及制备重组丝或类丝蛋白的方法,其特征在于,共同表达编码重组丝蛋白或重组类丝蛋白的基因和编码甘氨酸tRAA的核酸序列。此时,优选上述细菌为大肠杆菌。也就是说,与以往技术中无法制备高分子量的重组丝蛋白不同地,在本发明中,通过在诸如大肠杆菌的细菌中,共同表达编码甘氨酸tRAA的核酸序列、和编码以序列号:1的氨基酸作为重复单位的丝蛋白的基因,能够制备出分子量高达192.8kDa以上的重组丝蛋白。因此,本发明的以序列号:1的氨基酸序列作为重复单位的丝蛋白的特点在于,其分子量为192.8~482kDa。
本发明的另一实施方式涉及蜘蛛丝纤维或类蜘蛛丝纤维,其是通过纺织高分子量重组丝蛋白或类丝蛋白而制造的物理性质得以提高的蜘蛛丝纤维或类蜘蛛丝纤维。
在本发明中,使用含有上述高分子量重组丝蛋白或类丝蛋白的纺液,并通过喷丝头儿纺丝,能够生产出微米级或纳米级的蜘蛛丝纤维。
在此使用的“纺液(dope solution)”意指含有丝蛋白的所有液体混合物,对其进行挤压成型,以形成蜘蛛丝纤维或进行流延成膜(Film casting)。当将蛋白单体(single chain)作为单体(monomer)时,除了蛋白单体以外,纺液也可以含有例如二聚体、三聚体和四聚体的高阶聚合物。通常,纺液为pH在4.0-12.0的水溶液,并且含有低于40%(w/v)的有机物或离液剂。优选纺液不含有有机溶剂或者离液剂,但可以含有可提高溶液保存性、稳定性或可操作性的添加剂。
本发明中的纺液优选含有20-80%(w/v)的重组丝蛋白。
此外,采用湿纺法时,将上述纺液纺至液体凝固槽中。优选上述液体凝固槽含有选自由甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、水和硫酸铵水溶液组成的组中的液体。
另一方面,蜘蛛丝纤维的直径可以由喷丝头的直径来决定。例如,上述蜘蛛丝纤维的直径可以为0.6~50μm,但并不仅限于此。
在本发明的一个实施例中,测量了上述由湿纺法制造的蜘蛛丝纤维的物理性质(比如拉伸强度,杨氏模量和断裂应变)。测量结果表明,利用本发明高分子量的重组丝蛋白,能够制造出物理性质得到提高的蜘蛛丝纤维。特别是,由96聚体重组丝蛋白制造的纤维显示出508±108MPa的拉伸强度和15±5%的断裂应变,这与用天然N.clavipes蜘蛛牵引丝所测得的数值(740-1,200MPa和18-27%)相仿。尤其是96聚体纤维的杨氏模量为21±4GPa,相当于天然牵引丝(11-14GPa)的两倍。本发明的96聚体的拉伸强度为508±108MPa,是迄今为止报道的重组蜘蛛丝蛋白中最高的拉伸强度。
除以上描述的湿纺法之外,也可以利用电纺法生产纤维。在电纺法中,对含有高分子量重组丝蛋白或重组类丝蛋白的溶液施加电压,从而将溶液向所加电场的方向喷射。依照此方法,可以得到微米级或纳米级蜘蛛丝纤维或类蜘蛛丝纤维。
举例来说,在室温下,将重组丝蛋白在六氟异丙醇(HFIP;Sigma)中溶解2天,得到12%(w/v)的丝蛋白溶液。在电纺过程中,对使用了铂丝电极的玻璃移液管尖端的一滴丝溶液液滴,施加12kV的电压。当所加电场力超过丝溶液液滴的表面张力时,会形成纤维喷射,并向所加电场方向喷射。可将纤维收集在铝覆盖平板上的玻璃材料上,而且,为了诱导β平面的形成,可对某种程度的电纺丝纤维进行甲醇处理。此时,在室温下培养24小时后进行风干3天,而后便可以测量其物理性质。
接下来,根据原子显微镜的力曲线测量,可以计算出每个所用样品的杨氏模量。在室温(21℃)下测量悬臂挠度转换中光电探测器的灵敏度后,用硅悬臂(FESP,Veeco Instruments Inc.)和原子显微镜Dimension V(VeecoInstruments Inc.,Plainview,NY)绘制力-距离曲线。每个样品约测量20次,并且测量杨氏模量时,在每个力曲线中可以应用一个修正的赫兹模型(Hertz,1882,Sneddon,1965)。根据所得参数可以直接计算出每个样品的杨氏模量。在赫兹模型中,杨氏模量(E)由以下方程给出:
E=pF(1-v2)/(2a2tana) (1)
F=kd (2)
其中,F、v、a、k和d分别表示尖端的力、泊松比、样品的应变、悬臂的弹簧常数和悬臂挠度。根据尖端的形状与弹簧常数、悬臂的种类和挠度以及样品的泊松比,可以确定纤维的杨氏模量。
另一方面,本说明书定义的重组丝蛋白/重组类丝蛋白及由其制造的纤维、细丝、膜、泡沫、球体、纳纤丝、水凝胶等,均可用于生物工程和/或医学领域,优选用作在伤口缝合或覆盖系统的制造以及神经外科手术和眼科手术中使用的缝合材料。此外,该蛋白/丝线可使用于替代材料的制造中,优选用于人造软骨或肌腱材料的制造中。
另外,本发明中的蜘蛛丝纤维或类蜘蛛丝纤维可以用于:制造诸如医用胶带、植皮片、替换韧带和外科手术用修复网等的医疗器材;并且可以广泛地应用于工业及商业产品中,比如服装面料、防弹背心衬里、输送面料、包或钱包带、缆绳、绳子、粘接材料、非粘接材料、皮包带材料、汽车罩及其零部件、飞机制造材料、耐气候性材料、灵活隔断材料、体育器材;并且,可以应用于实际上需要具有高拉伸强度和高弹性特点的几乎所有的纤维及织物。本发明还可应用于稳定原纤维产品的适应性和其他形式的应用,比如用于干喷涂料、珠状颗粒、或与其它成分的混合使用。
本发明中的重组丝蛋白或重组类丝蛋白可以添加到纤维素、角蛋白和胶原蛋白产品中,因此,本发明还涉及包括纤维素和/或角蛋白和/或胶原蛋白以及本发明的重组蛋白的纸制品或护发护肤产品。含有本发明蛋白的纸制品和护发护肤产品表现出优异的特性,特别是优异的拉伸强度或抗撕裂强度。再者,本发明的高分子量重组蛋白还可以用作纺织品和皮革制品的涂层,从而赋予涂层产品稳定性与耐用性。丝蛋白特别显示出作为皮革制品涂层的适用性,此时,能够避免或至少削弱鞣革对于环境的负面作用。
实施例
下面,通过实施例更详细地说明本发明。但这些实施例仅用于例示本发明,本领域技术人员应该理解本发明的范围并不限定于这些实施例中。
实施例1:高分子量丝蛋白表达载体pSH32、pSH48、pSH64、pSH80和pSH96的构建,编码甘氨酸tRNA的核酸序列表达载体的构建,以及各种分子量重组丝蛋白的制备。
1-1:pSH32、pSH48、pSH64、pSH80和pSH96的构建。
所有基因操作步骤皆按标准方法进行(Sambrook et al.,Molecular cloning:a laboratory manual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor,New York,1989)。为了构建重组质粒pSH32,质粒pSH16a(Lee et al.,Theories and Applications of Chem.Eng.,8(2):3969,2002)(序列号:13)经限制性内切酶SpeI和NheI(New England Biolabs,USA)酶切,得到长1.7kb的片段,经限制性内切酶SpeI处理后连接到脱磷酸化的质粒pSH16a上,从而得到了含有编码序列号:14的32聚体丝蛋白的核酸序列的重组质粒pSH32。用限制性内切酶SpeI和NheI酶切检查插入片段的方向。以同样的方式,用内切酶SpeI和NheI酶切质粒pSH16a得到1.7kb的片段,而后将该片段连接到经内切酶SpeI酶切的质粒pSH32上,以得到重组质粒pSH48。另外,质粒pSH32经过内切酶SpeI和NheI酶切,得到长3.4kb的片段,而后连接到经内切酶SpeI酶切过的质粒pSH32上,从而得到含有编码序列号:15的64聚体丝蛋白的核酸序列的重组质粒pSH64。每个插入片段的方向经内切酶SpeI和NheI酶切而检测。另外,同样地,向经内切酶SpeI酶切的质粒pSH64,分别插入pSH16a或pSH32的SpeI-NheI酶切DNA片段,由此,分别构建包含有编码序列号:16的80聚体丝蛋白的核酸序列的重组质粒pSH80,以及包含有编码序列号:17的96聚体丝蛋白的核酸序列的质粒pSH96。每个质粒中插入片段的方向可以通过内切酶SpeI和NheI酶切来检测。图1显示了重组丝蛋白的表达结构以及蛋白重复单位的氨基酸序列。其中,对应于序列号:1的氨基酸重复单位的核酸序列与序列号:18的核酸序列相同。
1-2:pTet-glyVXY载体的构建
所有基因操作步骤都按照标准方法进行(Sambrook et al.,Molecularcloning:a laboratory manual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989)。为了确保编码甘氨酸tRNA的glyVWX基因,以从大肠杆菌W3110菌株(源自原养型菌株大肠杆菌K-12,λ-,F-)中分离得到的染色体DNA作为模板,以序列号:19和序列号:20为引物,进行多聚酶链式反应(PCR)。
序列号:19:5'-GCTCGATATCTAACGACGCAGAAATGCGAAA-3'
序列号:20:5'-CATTGGATCCTAAGATTACAGCCTGAGGCTGTG-3'
在如下条件下使用Pfu聚合酶(SolGent,Korea)进行PCR反应:在95℃下进行初始变性(denaturation)4分钟、然后在95℃下进行第二次变性20秒、在51℃下退火(annealing)30秒、及在72℃下延伸(extension)60秒,将上述过程循环10次。之后在95℃下变性20秒、在60℃下退火30秒、以及在72℃下延伸60秒,将该过程循环19次;接下来在72℃下最后延伸5分钟。
对由上述PCR获得的DNA进行琼脂糖凝胶电泳,得到纯化的479-bpPCR产物。用限制性内切酶BamHI和EcoRV(New England Biolabs,USA)同时酶切PCR产物,为了利用可持续表达的四环素抗性基因(tet)的启动子,质粒也经由同样的内切酶酶切。将酶切后的PCR产物和质粒用T4DNA连接酶(Roche,Germany)彼此连接到一起,并将该连接产物转化到大肠杆菌Top10(F-mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)¢0lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 araD139Δ(ara-leu)7697galU galK rpsL(StrR)endA1 nupG)菌株中。在含有34mg/L氯霉素的LB固体琼脂培养基(10g/L胰蛋白胨,5g/L酵母提取物,5g/L NaCl和15g/L琼脂)中挑选转化菌株,从而构建重组质粒pTet-glyVXY。所构建的重组质粒经内切酶酶切和碱基序列分析确认。
1-3:重组质粒pTet-gly2的构建
所有基因操作步骤都按照标准方法进行(Sambrook et al.,Molecularcloning:a laboratory manual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York,1989)。为了更过量表达编码甘氨酸tRNA的glyVXY基因,以pTet-glyVXY作为模板,以序列号:21、22作为引物,进行PCR反应。
序列号:21:
5'-GGCTCGCATGCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGA-3'
序列号:22:
5'-ATTGTCGACTGCTGCAGTAAGATTACAGCCTGAGGCTGTG-3'
在如下条件下使用Pfu聚合酶(SolGent,Korea)进行PCR反应:在95℃下进行初始变性3分钟、然后在95℃下进行第二次变性20秒、在52℃退火30秒、以及在72℃延伸50秒,将上述过程循环10次;而后在95℃变性20秒、在62℃退火30秒、以及在72℃延伸50秒,将该过程循环19次;接下来在72℃最后延伸5分钟。
对由上述PCR获得的DNA进行琼脂糖凝胶电泳,得到纯化的674-bpPCR产物。用限制性内切酶SphI和SalI(New England Biolabs,USA)分别酶切674-bp PCR产物和质粒pTet-glyVXY,并用T4DNA连接酶(Roche,Germany)连接在一起,而后将连接产物转化到大肠杆菌Top10菌种。在含有34mg/L氯霉素的LB固体琼脂培养基(10g/L胰蛋白胨,5g/L酵母提取物,5g/L NaCl和15g/L琼脂)中挑选转化菌株,从而构建出重组质粒pTet-gly2。所构建的重组质粒通过内切酶酶切和碱基序列分析确认。
1-4:各种分子量重组丝蛋白的制备
为了制备具有各种分子量的丝蛋白,将实施例1-1中构建的pSH16a载体和pSH32载体分别引入到实施例1-2中获得的重组质粒pTet-glyVXY和大肠杆菌BL21(DE3)菌株(F-ompT hsdSB(rB-mB-)gal dcm(DE3);带有T7RNA聚合酶基因的噬菌体)(New England Biolabs,USA)中。另外,将pSH64载体和pSH96载体分别引入到实施例1-3中获得的pTetgly2载体和大肠杆菌BL21(DE3)菌株中。将如此转化获得的菌株接种到含有34mg/L氯霉素和25mg/L卡那霉素的LB液体培养基(10g/L胰蛋白胨,5g/L酵母提取物,5g/L NaCl)中,于30℃和180rpm连续振荡培养。在接种1%后,当用分光光度仪在波长600nm下所测得的光密度(O.D.)达到0.2、0.4或0.6时,向每个菌株加入1mM IPTG以诱导表达丝蛋白基因。诱导丝蛋白表达5小时后收集培养液。
为了分析所制备的重组蛋白,将所收集的每组培养物在4℃和10000g离心分离10分钟,将得到的细胞颗粒(Cell Pellets)溶解于TE缓冲液和5xLaemmli样品缓冲溶液中。取等量(0.024mg)的样品,并用10%SDS-PAGE进行分离,用Coomassie亮蓝R250(Bio-Rad,USA)染色,随后用GS-710校准成像密度计(Bio-Rad,USA)定量。使用Bradford蛋白质定量法,以牛血清白蛋白为基准溶液,测量样品中蛋白质含量(Bradford,M.M.,Anal.Biochem.,72:248,1976)。
结果,如图2所示,16聚体(用pSH16a载体制备)、32聚体(用pSH32载体制备)、64聚体(用pSH64载体制备)和96聚体(用pSH96载体制备)的重组丝蛋白分子量分别为约50.4kDa、100.7kDa、192.8kDa和284.9kDa。在现有的技术中,已知合成于大肠杆菌的最大牵引丝蛋白的分子量为163kDa,并且认为难以生成分子量大于163kDa的丝蛋白(Fahnestock,S.R.&Irwin,S.L.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,47:23,1997;Vendrely,C.&Scheibel,T.,Macromol.Biosci.,7:401,2007;Lazaris,A.,et al.,Science,295:472,2002)。然而根据本发明,通过共同表达甘氨酸tRNA的编码核酸序列与上述表达载体,可以产生具有如192.8kDa和284.9kDa这样高分子量的重组丝蛋白。
实施例2:湿纺法生产蜘蛛丝纤维-分子量对湿纺纤维机械性能的影响
将实施例1-2中制备的重组丝蛋白分别溶解在纺织溶剂六氟异丙醇(HFIP;Sigma)中而制备纺液后,用泵(KDS100;KD Scientific)以1-2ml/hr的速度对纺液注射成型。至于纺液中丝蛋白的浓度,由于溶解性和粘稠度的关系,天然96聚体蛋白的最大操作浓度为20%(w/v),因此,所有的纺织均在纺液中丝蛋白浓度为20%(w/v)的条件下进行。此时,通过26-G注射器针头(KoreaVaccine Co.,Ltd.),将纺液从1-ml Kovax注射器射出至装有含90%(v/v)甲醇的水的凝固装置中,进行注射成型。
纺丝之后,将所纺纤维放置在凝固装置中20分钟,并且,当用手分别拉长时,纤维拉长至原来的5倍。图3显示了纤维的应力-应变曲线。
接下来,在室温下对纤维进行干燥,并且为了防止纤维在测量过程中收缩并为了保持其拉伸长度,将纤维始终置于张力下。测试前,使纤维样品(n=10)在相对湿度50%和室温条件下适应24小时。用100g的负荷传感器在万能拉力试验机(RB302ML,R&B Inc.)上进行抗拉试验。标距长度为20mm,十字头速度为10mm/min。机械性能数据以平均值±标准偏差(n=10)表示。使用未配对t-测验进行统计学分析,当P<0.05时,认为有统计学意义。
测量结果如图4所示,随着丝蛋白分子量的增加,纤维的机械性能(诸如断裂应变、拉伸强度和杨氏模量)得到了提高(32聚体的断裂应变为3.27±0.32%、拉伸强度为202±25MPa、杨氏模量为8.28±0.85GPa;64聚体的断裂应变为4.31±0.64%、拉伸强度为252±26MPa、杨氏模量为10.14±0.67GPa;96聚体的断裂应变为15±5%、拉伸强度为508±108MPa,杨氏模量为21±4GPa)。特别是,与由64聚体以下的重组丝蛋白生成的蜘蛛丝纤维相比,使用分子量达到284.9kDa的96聚体重组丝蛋白所生产的蜘蛛丝纤维,其断裂应变、拉伸强度和杨氏模量都得到了超过预期的显著提高。
即,由96聚体重组丝蛋白纺制的纤维显示了508±108MPa的拉伸强度与15±5%的断裂应变,这与天然N.clavipes蜘蛛牵引丝的数值(740-1200MPa;18-27%)相接近。尤其是96聚体纤维的杨氏模量为21±4GPa,相当于天然牵引丝(11-14GPa)杨氏模量的两倍。本发明的96聚体纤维的拉伸强度(508±108MPa)为迄今为止得到的重组蜘蛛丝蛋白中最高的拉伸强度。
实施例3:纺液浓度对湿纺纤维性质的影响
为了检验纺液中重组丝蛋白浓度对所纺纤维性能的影响,将16聚体、32聚体和64聚体的蛋白分别以最大操作浓度进行纺织,并与实施例2进行比较。
其结果,如图5所示,当16聚体蛋白的浓度从20%增大到最高浓度30%的时候,所纺纤维的性能有了显著提高。然而,当32聚体蛋白的浓度从20%增高到最高浓度27%的时候,纤维的断裂应变和拉伸强度的虽然有所提高,但并不具有统计学意义。此外,64聚体蛋白的最大操作浓度为23%,此时的机械性能与已经实验过的浓度20%时的机械性能相比没有太大的区别,即,机械性能基本没有变化。
以上,对本发明的特定功能进行了详细说明,但对于本领域技术人员而言,上述的内容仅仅是优选的实施方式,而并不能限制本发明的范围。因此,本发明的实质范围将由所附权利要求和其等同物来定义。
工业实用性
本发明提供分子量与天然丝蛋白极基本相似的高分子量重组丝或类丝蛋白、以及使用它们制造的物理性质得到提高的微米或纳米级蜘蛛丝或类蜘蛛丝纤维。本发明的重组丝蛋白和重组类丝蛋白与源于蜘蛛的牵引丝蛋白一样具有高分子量,而且,由此所制造的纤维具有类似天然丝蛋白或优于天然丝蛋白物理性质。因此,本发明的重组丝蛋白和重组类丝蛋白、以及由此产生的纤维能够应用于以往非常期待应用蜘蛛丝的生物工程领域和/或医学领域等的各类产业中,因此,具有工业实用性。
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Claims (12)
1.一种高分子量重组丝蛋白或类丝蛋白,具有序列号:1的肽重复64~160次的结构,并且具有192.8~482kDa的分子量。
2.如权利要求1所述的高分子量重组丝蛋白或类丝蛋白,其中,具有含量为10%以上的甘氨酸。
3.如权利要求1所述的高分子量重组丝蛋白或类丝蛋白,其中,具有所述肽重复80~160次的结构。
4.如权利要求1所述的高分子量重组丝蛋白或类丝蛋白,其中,具有所述肽重复96~160次的结构。
5.一种高分子量重组丝或类丝蛋白的制造方法,其中,
在细菌中共同表达编码权利要求1~4中任一项所述的重组丝或类丝蛋白的基因和编码甘氨酸tRNA的核酸序列。
6.如权利要求5所述的方法,其中,所用细菌为大肠杆菌。
7.一种微米级或纳米级蜘蛛丝或类蜘蛛丝纤维的制造方法,其中,
对包含权利要求1~4中任一项所述的高分子量重组丝或类丝蛋白的纺液进行纺丝。
8.如权利要求7所述的方法,其中,
使用包含20~80%(w/v)重组丝或类丝蛋白的纺液进行湿纺法纺丝。
9.如权利要求8所述的方法,其中,将纺液纺至液体凝固槽中。
10.如权利要求9所述的方法,其中,所述凝固槽包含选自以下组的液体:甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、水和硫酸铵水溶液。
11.一种微米级或纳米级蜘蛛丝或类蜘蛛丝纤维,其中,
通过权利要求7所述的方法制备。
12.如权利要求11所述的微米级或纳米级蜘蛛丝或类蜘蛛丝纤维,其中,
所述微米级或纳米级蜘蛛丝纤维至少具有252MPa的拉伸强度、10.14GPa以上的杨氏模量和4.31%以上的断裂应变。
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