KR101147860B1 - 특정 아미노산의 ｔＲＮＡ와의 동시 발현을 통한 특정 아미노산 함량이 높은 단백질의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 특정 아미노산 함량이 높은 목적단백질을 코딩하는 유전자와 상기 특정 아미노산의 tRNA를 코딩하는 염기서열의 동시 발현을 통해 목적단백질의 발현을 증진시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 특정 아미노산의 tRNA와의 동시 발현을 통해 특정 아미노산 함량이 높은 단백질의 발현을 획기적으로 증진시킬 수 있어 반복단백질과 같은 특정 아미노산 함량이 높은 단백질의 생산성을 높이는데 유용하다.

아미노산, tRNA, 발현, 단백질

Description

특정 아미노산의 ｔＲＮＡ와의 동시 발현을 통한 특정 아미노산 함량이 높은 단백질의 제조방법 {Method for Preparing Protein Having High Specific Amino Acid Content Through Co-expression of tRNA of Specific Amino Acid}

본 발명은 특정 아미노산 함량이 높은 목적단백질을 코딩하는 유전자와 상기 특정 아미노산의 tRNA를 코딩하는 염기서열의 동시 발현을 통해 목적단백질의 발현을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

자연적인 또는 비자연적인 다양한 아미노산 서열들의 반복으로 이루어진 반복 단백질 폴리머가 중요한 물질로 주목 받고 있다 (Barron et al ., Curr . Opin . Chem. Biol ., 3:681, 1999; Huang et al ., J. Macromolecular Science , Part C: Polymer Reviews, 47:29, 2007; Kluge et al ., Trends in Biotechnology, 26(5):244, 2007; Nagarsekar et al ., Drug Target , 7:11, 1999; Vendrely et al ., Macromol. Biosci ., 7:401, 2007). 이는 화학적인 합성 방법으로 만들어진 폴리머와 달리, 단백질 폴리머는 유전정보 (유전자)를 근본으로 만들어지기 때문에 길이 나 입체적 성질 등 다양한 폴리머의 성질을 정확하게 조절할 수 있기 때문이다. 또한 단백질 폴리머는 생체 적합성 (biocompatibility), 생분해성 (biodegradation) 등 원하는 기계적, 화학적, 생물학적 성질들을 갖도록 할 수 있기 때문에 생체 재료 공학, 조직 공학 분야 등에서 유용하게 이용될 수 있다. 단백질 폴리머의 특성을 갖는 대표적인 반복 단백질의 반복 서열에는 엘라스틴 (elastin) (GVGVP, VPGG, APGVGV), 견섬유 (silk fibroin) (GAGAGS), 족사 (byssus) (GPGGG), 편상 실크 (flagelliform silk) (GPGGx), 거미줄 (dragline silk) (GPGQQ), GPGGY, GGYGPGS), 콜라겐 (collagen) (GAPGAPGSQGAPGLQ, GAPGTPGPQGLPGSP), 케라틴 (keratin) (AKLKLAEAKLELA), 세리신 (sericin) (SSTGSSSNTDSNSNSVGSSTSGGSSTYGYSSNSRDGSV), 및 인공합성 반복단백질 (synthetic repetitive protein) 등이 있다 (Kumar et al., Biomacromolecules, 7:2543, 2006).

그 동안 대장균을 포함한 박테리아, P. pastoris 같은 효모, 간상체바이러스 (baculovirus)로 감염시킨 곤충세포, 형질전환된 감자, 담배, 쥐 세포 등에서 재조합 반복 단백질을 발현시키는 시스템들이 개발되었다. 이런 시스템들에서 발현 가능한 단백질들의 크기는 3 - 163 kDa이었다 (Huang et al ., J. Macromolecular Science, Part C: Polymer Reviews , 47:29, 2007; Scheller et al ., Nat . Biotechnol., 19:573, 2001). 특히 대장균은 그 동안 많은 연구가 이루어진 박테리아로, 다루기 쉽고 비교적 저렴한 비용으로 산업적 배양이 가능하기 때문에, 재조합 단백질을 생산하기 위한 호스트로 유용하게 이용될 수 있다. 하지만 대장균의 경우, 번역 장치 (translation apparatus)의 한계 때문에, 고농도 발효를 통한 반 복 단백질 생산 수율은 단백질 크기에 따라 140 - 360 mg/L 정도로 매우 낮은 편이다 (Fahnestock et al ., Reviews in Molecular Biotechnology, 74:105, 1997; Scheibel et al ., Microbial Cell Factories, 3, 2004). 대장균에서 반복 단백질을, 특히 폴리머의 기계적 성질을 결정하는 고분자량의 반복 단백질을 과량으로 생산하는 것은 지금까지 여러 가지 어려움이 있었다 (Fahnestock et al ., Reviews in Molecular Biotechnology, 74:105, 2000; Huang et al ., J. Biol . Chem., 278(46):46117, 2003; Lewis et al ., Protein Expres . Purif ., 7:400, 1996; Tsung et al ., J. Biol . Chem ., 264(8):4428, 1989).

특정 합성 유전자의 발현을 개선시킬 수 있는 가장 대표적인 방법이, 그 단백질 합성에 필수적이나 호스트 내에서는 희귀한 코돈의 tRNA를 같이 발현시키는 것이다. 이런 희귀한 코돈 tRNA에는 ileX tRNA, argU tRNA, thrU tRNA, tyrU tRNA, glyT tRNA, thrT tRNA, argW tRNA, metT tRNA, leuW tRNA, proL tRNA 등이 있다.

대장균에서도 외래 유전자를 과량 발현 시킬 때 원래 적게 존재하거나 아예 없는 tRNA를 필요로 하는 코돈 유시지 (codon usage)에 문제가 있을 경우 번역이 제대로 안될 수 있다 (Baca et al ., Int . J. Parasitology, 30:113, 2000; Goldman et al ., J. Mol . Biol ., 245:467, 1995; Kane et al ., Curr . Opin . Biotechnol ., 6:494, 1995; Kurland et al ., Curr . Opin . Biotechnol ., 7: 489, 1996;). 부족한 tRNA 때문에 일어날 수 있는 번역 지연이나 조급한 번역 종결, 번역 프레임시프트 (frameshift), 잘못된 아미노산 결합 등을 막기 위해서, 특정 tRNA를 같이 과량 발현시켜서 이런 코돈 바이어스 (codon bias) 문제들을 해결하고 외래 단백질의 발현 을 증가시키는 연구들이 보고되었다 (Blattner et al ., WO 2007/124493; Catherine et al ., WO 00/36123; Imamura et al ., FEBS Letters, 457:393, 1999; Shin et al., Biotechnol . Bioprocess Eng ., 6:301, 2001; Ulrich et al ., US 6270988). 뿐만 아니라, 비자연적인 아미노산을 포함하는 단백질을 생산하기 위해서도 특정 tRNA 동시 과량 발현이 이용되고 있다 (Anderson et al ., US 2006/160175; Tirrell et al ., US 2008/160609; Shigeyuki et al ., EP 1911840).

이처럼 지금까지 희귀한 tRNA를 동시 발현시켜 생산을 개선시키는 예는 있었지만, 생산하려는 특정 반복 단백질에 많이 존재하고 필요로 하는 아미노산의 tRNA를 동시 발현시켜 단백질의 발현 양을 증가시키려는 시도는 없었다.

이에 본 발명자들은 반복단백질과 같은 목적단백질 내에 풍부하게 존재하는 아미노산의 tRNA를 동시에 발현시킬 경우, 목적단백질의 발현이 획기적으로 증가된다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 특정 아미노산 함량이 높은 단백질의 유전자와 상기 특정 아미노산의 tRNA를 코딩하는 염기서열로 형질전환된 재조합 미생물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 배양하여 특정 아미노산 함량이 높은 단백질을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 특정 아미노산 함량이 10% 이상인 목적단백질을 코딩하는 유전자와 상기 특정 아미노산의 tRNA를 코딩하는 염기서열로 형질전환된 재조합 미생물을 제공한다.

발명은 또한, 특정 아미노산 함량이 10% 이상인 목적단백질을 코딩하는 유전자와 상기 특정 아미노산의 tRNA를 코딩하는 염기서열을 함유하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 미생물을 배양하여 특정 아미노산 함량이 10% 이상인 목적단백질을 발현시킨 다음, 상기 발현된 목적단백질을 회수하는 것을 특징으로 하는 특정 아미노산을 10% 이상 함유하는 단백질의 제조방법을 제공한다.

발명에 있어서, 상기 목적단백질은 특정 올리고펩티드가 반복된 구조를 가지는 반복단백질인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 반복단백질은 엘라스틴 (elastin), 실크단백질, 족사 (byssus), 편상 실크 (flagelliform silk), 거미줄 (dragline silk), 콜라겐 (collagen), 케라틴 (keratin), 및 세리신 (sericin)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.

본 발명은 특정 아미노산의 tRNA와의 동시 발현을 통해 특정 아미노산 함량이 높은 단백질의 발현을 획기적으로 증진시킬 수 있어, 반복단백질과 같은 특정 아미노산 함량이 높은 단백질의 생산성을 높이는데 유용하다.

본 발명은 특정 아미노산의 함량이 높은 목적단백질의 발현을 증진시키는 방법에 관한 것으로, 특정 아미노산 함량이 10% 이상인 목적단백질을 코딩하는 유전자와 상기 특정 아미노산의 tRNA를 코딩하는 염기서열로 형질전환된 재조합 미생물을 이용하여 상기 목적단백질을 코딩하는 유전자와 상기 특정 아미노산의 tRNA를 코딩하는 염기서열의 동시 발현을 통해 목적단백질의 발현을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

발명의 일 실시예에서는 Nephila clavipes에서 얻은 거미줄 (dragline silk) 단백질을 변형시킨 실크단백질을 코딩하는 유전자와 글리신 tRNA를 코딩하는 염기서열로 형질전환된 재조합 대장균을 제작하고, 상기 재조합 대장균을 배양한 결과, 글리신 (41%), 알라닌 (18%), 및 세린 함량 (6.3%)이 높은 실크단백질이 과 발현되는 것을 확인하였다. 아울러, 실크단백질은 특정 아미노산 염기서열 (SGRGGLGGTGAGMAAAAAMGGAGQGGYGGLGSQG)이 반복된 구조를 가지는 반복 단백질로, 32, 48, 및 64번 반복된 실크단백질의 발현이 획기적으로 증가하는 것을 확인하였다. 아울러, 세린 풍부 단백질의 발현을 촉진한다고 알려진 cysK 유전자와 글리신의 tRNA를 코딩하는 염기서열을 동시에 발현시킨 경우, 실크단백질의 발현 양이 더욱 증가한다는 것을 확인하였다.

글리신 함량이 10% 이상으로 높은 실크 단백질의 생산이 글리신 tRNA의 과발현을 통해 증가되는 결과를 보면, 글리신 함량이 높은 실크 단백질뿐만 아니라, 특정 아미노산 함량이 높은 (10% 이상) 다른 단백질의 생산에도 특정 아미노산 tRNA의 과발현이 유용하다는 것은 당업자에게 자명하다 할 것이다.

실크 단백질 이외에, 특정 아미노산 함량이 높은 반복 단백질로는 엘라스틴 (elastin) (GVGVP, VPGG, APGVGV), 족사 (byssus) (GPGGG), 편상 실크 (flagelliform silk) (GPGGx), 거미줄 (dragline silk) (GPGQQ, GPGGY, GGYGPGS), 콜라겐 (collagen) (GAPGAPGSQGAPGLQ, GAPGTPGPQGLPGSP), 케라틴 (keratin) (AKLKLAEAKLELA), 세리신 (sericin) (SSTGSSSNTDSNSNSVGSSTSGGSSTYGYSSNSRDGSV), 및 인공합성 반복단백질 (synthetic repetitive protein) 등이 있다. 본 발명에 따른 개념을 족사 (byssus)에 적용할 경우, 글리신 또는 프로린 tRNA와의 동시 발현을 통해 GPGGG가 반복되어 있는 족사의 발현양을 증진시킬 수 있을 것이다.

결국, 상기 예시된 반복단백질뿐만 아니라 특정 아미노산의 함량이 10%이상으로 높은 단백질의 경우에도, 특정 아미노산의 tRNA와의 동시 발현을 통해 그 발 현양을 증진시킬 수 있을 것이다.

아울러, 본 발명에서는 재조합 미생물로 목적단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합벡터와 특정 아미노산의 tRNA를 코딩하는 염기서열을 함유하는 재조합벡터로 형진전환된 미생물만을 예시하고 있으나, 상기 목적단백질을 코딩하는 유전자와 특정 아미노산의 tRNA를 코딩하는 염기서열을 동시에 함유하는 재조합벡터로 숙주 미생물을 형질전환하거나, 또는 상기 목적단백질을 코딩하는 유전자를 숙주 미생물의 염색체에 삽입한 다음, 특정 아미노산의 tRNA를 코딩하는 염기서열을 함유하는 재조합 벡터를 도입하여 수득할 수도 있다. 아울러, 목적단백질을 코딩하는 유전자와 특정 아미노산의 tRNA를 코딩하는 염기서열을 모두 숙주 미생물의 염색체에 삽입하여 재조합 미생물을 수득할 수도 있다.

본 발명에서, "벡터(vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드(plasmid)" 및 "벡터(vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 본 발명의 목적상, 플라스미드 벡터를 이용하는 게 바람직하다. 이러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수 개에서 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다. 라이게이션 후에, 벡터는 적절한 숙주세포로 형질전환되어야 한다. 형질전환은 칼슘 클로라이드 방법 또는 전기천공법(electroporation) (Neumann, et al., EMBO J., 1:841, 1982) 등을 사용해서 용이하게 달성될 수 있다.

본 발명에 따른 유전자의 과발현을 위하여 사용되는 벡터는 당업계에 공지된 발현 벡터가 사용될 수 있다.

염기서열은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결(operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서 열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서(enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터(oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.

당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질전환 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점(replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 재조합벡터 내에 포함되게 된다. 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 재조합벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.

상술한 재조합 벡터에 의해 형질전환된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다.

물론 모든 벡터가 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다.

또한 본 발명에서는 숙주미생물로 대장균 만을 예시하고 있으나, 이에 국한되지 않는다는 것은 당업자에게 자명하다 할 것이다. 예컨대, 다른 종류의 박테리아, 효모, 또는 곰팡이를 사용하는 것도 가능하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것이 아니라는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 재조합 플라스미드 pTet - glyVXY 의 제작

유전자 조작을 위한 모든 과정은 표준화된 방법을 따랐다 (Sambrook et al ., Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989). 글리신 tRNA를 암호화하는 glyVWX 유전자를 확보하기 위하여, 대장균 W3110 (derived from E. coli K-12, λ^-, F^-, prototrophic) 균주로부터 분리한 염색체를 주형으로 사용하고, 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다.

서열번호 1: 5'-GCTCGATATCTAACGACGCAGAAATGCGAAA-3'

서열번호 2: 5'-CATTGGATCCTAAGATTACAGCCTGAGGCTGTG-3'

PCR은 Pfu 폴리머라제 (polymerase) (SolGent, 한국)를 사용하였으며, 반응 조건은 다음과 같다. 첫 번째 변성 (denaturation)은 95℃에서 4 분간 한 번 하였으며, 이 후 두 번째 변성은 95℃에서 20 초간, 결합 (annealing)은 51℃에서 30 초간, 연장 (extension)은 72℃에서 60 초간 수행하였으며, 이를 10 회 반복하였다. 그리고 추가로 95℃에서 20 초간 변성, 60℃에서 30 초간 결합, 72℃에서 60 초간 연장을 19회 반복하였다. 이 후 72℃에서 5분간 마지막 연장을 한 번 수행하였다.

상기 PCR에 의해 얻어진 DNA을 아가로스 젤 전기영동하여, 정제된 479 bp의 PCR 산물을 얻었다. 이를 제한효소 BamHI과 EcoRV (New England Biolabs, 미국)로 동시에 자르고, 지속적으로 발현될 수 있는 테트라사이클린 (tetracycline) 저항 유전자 (tet)의 프로모터를 이용하기 위해, 플라스미드 pACYC184 (New England Biolabs, 미국)도 같은 제한효소들로 절단하였다. 절단한 PCR 산물과 플라스미드를 T4 DNA 리가아제 (ligase) (Roche, 독일)로 연결 (ligation)시키고, 이를 대장균 Top10 (F^- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)￠0lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL (Str^R) endA1 nupG)에 형질전환시켰다. 형질전환 균주는 34 mg/L 클로람페니콜 (chloramphenicol)을 포함한 LB 아가 고체배지 (트립톤 10 g/L, yeast extract 5 g/L, NaCl 5 g/L, 아가 15 g/L)에서 선택하여, 재조합 플라스미드 pTet-glyVXY를 수득하였다 (도 1). 제작된 재조합 플라스미드는 제한효소로 잘라서 확인하고, 염기 서열 분석으로 확인하였다.

실시예 2: 재조합 플라스미드 pTet - gly2 의 제작

유전자 조작을 위한 모든 과정은 표준화된 방법을 따랐다 (Sambrook et al ., Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989). 글리신 tRNA를 암호화하는 glyVXY 유전자를 더욱 과량 발현시키기 위하여, pTet-glyVXY를 주형으로 하고 서열번호 3, 4의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다.

서열번호 3: 5'-GGCTCGCATGCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGA-3

서열번호 4: 5'-ATTGTCGACTGCTGCAGTAAGATTACAGCCTGAGGCTGTG-3

PCR은 Pfu 폴리머라제 (polymerase) (SolGent, 한국)를 사용하였으며, 반응 조건은 다음과 같다. 첫 번째 변성 (denaturation)은 95℃에서 3 분간 한 번 하였으며, 이 후 두 번째 변성은 95℃에서 20 초간, 결합 (annealing)은 52℃에서 30 초간, 연장 (extension)은 72℃에서 50 초간 수행하였으며, 이를 10 회 반복하였다. 그리고 추가로 95℃에서 20 초간 변성, 62℃에서 30 초간 결합, 72℃에서 50 초간 연장을 19회 반복하였다. 이 후 72℃에서 5분간 마지막 연장을 한 번 수행하였다.

상기 PCR에 의해 얻어진 DNA을 아가로스 젤 전기영동하여, 정제된 674 bp의 PCR 산물을 얻었다. 647 bp의 PCR 산물과 플라스미드 pTet-glyVXY를 제한효소 SphI과 SalI (New England Biolabs, 미국)으로 각각 절단하고 T4 DNA 리가아제 (ligase) (Roche, 독일)로 연결시킨 후, 이를 대장균 Top10 에 형질전환시켰다. 형질전환 균주는 34 mg/L 클로람페니콜 (chloramphenicol)을 포함한 LB 아가 고체배지 (트립톤 10 g/L, yest extract 5 g/L, NaCl 5 g/L, 아가 15 g/L)에서 선택하여, 재조합 플라스미드 pTet-gly2를 수득하였다 (도 2). 제작된 재조합 플라스미드는 제한효소로 잘라서 확인하고, 염기 서열 분석으로 확인하였다.

실시예 3: 재조합 플라스미드 pgly - cysK 의 제작

유전자 조작을 위한 모든 과정은 표준화된 방법을 따랐다 (Sambrook et al ., Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989). 글리신 tRNA 유전자와 시스테인 합성단백질 A (cycteine synthase A)를 암호화하는 cysK 유전자를 같이 과량 발현시키기 위하여, 플라스미드 pter-gly2를 제한효소 SalI (New England Biolabs, 미국)으로 자르고 크레노우 (Klenow) 효소를 이용하여 블런트 말단을 만든 후 제한효소 ClaI으로 절단하였다. 그리고 이것을 제한효소 ClaI과 EcoRV로 자른 플라스미드 pAC104CysK (Han et al ., Appl . Environ . Microbiol ., 69(10):5772, 2003)와 연결시켜서, 상기 예와 같은 방법으로 재조합 플라스미드 pgly-cysK를 수득하였다 (도 3). 제작된 재조합 플라스미드는 제한효소로 잘라서 확인하였다.

실시예 4: 재조합 플라스미드 pSH32 , pSH48 및 pSH64 의 제작

유전자 조작을 위한 모든 과정은 표준화된 방법을 따랐다 (Sambrook et al ., Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989). 재조합 플라스미드 pSH32를 제작하기 위하여, 플라스미드 pSH16a (Lee et al ., Theories and Applications of Chem . Eng ., 8(2):3969, 2002)를 제한효소 SpeI과 N heI (New England Biolabs, 미국)으로 절단하여 1.7 kb의 조각을 얻어, 제한효소 SpeI으로 자른 플라스미드 pSH16a와 연결시켜서 재조합 플라스미드 pSH32를 수득하였다. 연결된 인서트 (insert)의 방향은 제한효소 SpeI과 NheI으로 잘라서 확인하였다. 같은 방법으로, 플라스미드 pSH16a를 제한효소 SpeI과 NheI으로 절단한 1.7 kb의 조각을, 제한효소 SpeI으로 자른 플라스미드 pSH32와 연결시켜서 재조합 플라스미드 pSH48을, 플라스미드 pSH32를 제한효소 SpeI과 NheI으로 절단한 3.4 kb의 조각을, 제한효소 SpeI으로 자른 플라스미드 pSH32와 연결시켜서 재조합 플라스미드 pSH64를 획득하였다. 각각 연결된 인서트 (inset)의 방향은 제한효소 SpeI과 NheI으로 잘라서 확인하였다.

실시예 5: 글리신 tRNA 동시 과량 발현을 통한 32번 반복된 실크 단백질의 발현

실크 단백질 생산에 있어서 글리신 tRNA 유전자 동시 과량 발현의 효과를 확인하기 위하여, 실시예 1과 4에서 수득한 플라스미드 pTet-glyVXY와 pSH32를 대장 균 BL21 (DE3) (F- ompT hsdSB(rB - mB -) gal dcm (DE3) a prophage carrying the T7 RNA polymerase gene) (New England Biolabs, 미국)에 넣었다. 대조군으로 플라스미드 pACYC184와 pSH32로 형질전환한 대장균 BL21 (DE3) 균주를 사용하였다.

이렇게 형질전환된 균주들을 34 mg/L 클로람페니콜 (chloramphenicol)과 25 mg/L 카나마이신 (kanamycin)이 포함된 LB 액체 배지 (트립톤 10 g/L, yest extract 5 g/L, NaCl 5 g/L)에 접종하여 30℃에서 180 rpm으로 지속적으로 흔들어주며 배양하였다. 1% 접종 후 분광광도계로 600 nm 파장에서 측정한 광학밀도 (O.D.)가 0.2, 0.4 또는 0.6일 때, 1 mM IPTG를 첨가하여 실크 단백질 유전자 발현을 유도하였다. 유도 발현 5 시간 후에 배양액을 채취하였다. 재조합 단백질 분석을 위해, 채취된 배양액을 4℃, 10,000 g에서 10분간 원심분리를 하여 세포 덩어리 (pellet)를 얻고, 이를 TE 완충용액과 5x Laemmli 샘플 완충용액에 녹였다. 같은 양 (0.024 mg)의 샘플을 10% SDS-PAGE를 이용해 분리하고, Coomassie brilliant blue R250 (Bio-Rad, 미국) 용액으로 염색하여, GS-710 Calibrated Imaging Densitometer (Bio-Rad, 미국)를 이용하여 정량화하였다 (도 4). 그 결과, 유도한 시점에 상관없이, 글리신 tRNA 과량 발현으로 인해, 32번 반복된 실크 단백질의 발현이 대조군에 비해 50% 정도 증가되는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 6: 글리신 tRNA 동시 과량 발현을 통한 48번 반복된 실크 단백질의 발현

실크 단백질 생산에 있어서 글리신 tRNA 유전자 동시 과량 발현의 효과를 확인하기 위하여, 실시예 1과 4에서 수득한 플라스미드 pTet-glyVXY와 pSH48을 대장 균 BL21 (DE3) (F- ompT hsdSB(rB - mB -) gal dcm (DE3) a prophage carrying the T7 RNA polymerase gene) (New England Biolabs, 미국)에 넣었다. 대조군으로 플라스미드 pACYC184와 pET30a 또는 pACYC184와 pSH48로 형질전환한 대장균 BL21 (DE3) 균주를 사용하였다.

이렇게 형질전환된 균주들을 실시예 5와 같은 조건에서 배양하여 실크 단백질 발현 정도를 SDS-PAGE로 관찰하였다 (도 5). 그 결과, 글리신 tRNA 과량 발현으로 인해, 48번 반복된 실크 단백질의 발현이 대조군에 비해 3배 정도 증가되는 것을 확인하였다.

실시예 7: 글리신 tRNA 동시 과량 발현을 통한 64번 반복된 실크 단백질의 발현

실크 단백질 생산에 있어서 글리신 tRNA 유전자 동시 과량 발현의 효과를 확인하기 위하여, 실시예 1과 4에서 수득한 플라스미드 pTet-glyVXY와 pSH64를 대장균 BL21 (DE3) (F- ompT hsdSB(rB - mB -) gal dcm (DE3) a prophage carrying the T7 RNA polymerase gene) (New England Biolabs, 미국)에 넣었다. 대조군으로 플라스미드 pACYC184와 pSH64로 형질전환한 대장균 BL21 (DE3) 균주를 사용하였다.

이렇게 형질전환된 균주들을 실시예 5와 같은 조건에서 배양하여 실크 단백질 발현 정도를 SDS-PAGE로 분석하였다 (도 6). 그 결과, 글리신 tRNA 과량 발현으로 인해, 64번 반복된 실크 단백질의 발현이 대조군에 비해 5배 정도 증가되는 것을 확인하였다.

실시예 8: 글리신 tRNA 와 cys K 유전자 동시 과량 발현을 통한 다양하게 반복된 실크 단백질의 발현

세린 풍부 단백질의 경우, cysK 유전자와의 동시발현을 통해 그 발현 양이 증가된다는 것이 입증된 바 있다 (KR 10-0489500). 본 실시예에서 사용한 실크 단백질은 글리신(41%) 이외에도 세린 함량 (6.3%)이 높을 뿐만 아니라, 글리신 생합성에 직접적인 전구체로서 세린이 필요하게 된다. 글리신 tRNA 유전자와 cysK 유전자의 동시 발현의 효과를 확인하기 위하여, 대장균 BL21 (DE3) (F- ompT hsdSB(rB - mB-) gal dcm (DE3) a prophage carrying the T7 RNA polymerase gene, New England Biolabs, 미국) 균주에 두 가지 플라스미드, 실시예 3에서 수득한 플라스미드 pgly-cysK와, pET30a, pSH16a, 또는 실시예 4에서 수득한 pSH32, pSH64를 각각 같이 형질전환한 균주 4가지를 제작하였다.

이렇게 형질전환된 균주들을 실시예 5와 같은 조건에서 배양하여 실크 단백질 발현 정도를 SDS-PAGE로 관찰하였다 (도 7). 그 결과, 글리신 tRNA와 cysK 유전자의 동시 과량 발현으로 인해, 여러 번 반복된 실크 단백질의 발현이 유의하게 증가하였으며, 생장도 좋아지는 것을 확인하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정 의된다고 할 것이다.

도 1은 플라스미드 pTet-glyVXY의 유전자 지도이다.

도 2는 플라스미드 pTet-gly2의 유전자 지도이다.

도 3은 플라스미드 pgly-cysK의 유전자 지도이다.

도 4는 32번 반복된 실크 단백질의 발현 수준을 SDS-PAGE로 관찰한 결과를 나타낸 것이다. (레인 1: 단백질 표준 분자량을 보여주는 마커; 레인 2와 4: 플라스미드 pSH32와 pACYC184로 형질전환된 균주를 OD₆₀₀ 0.2와 0.4에서 각각 발현 유도시킨 결과; 레인 3, 5, 6: 플라스미드 pSH32와 pTet-glyVXY로 형질전환된 균주를 OD₆₀₀ 0.2, 0.4, 0.6에서 각각 발현 유도시킨 결과)

도 5는 48번 반복된 실크 단백질의 발현 수준을 SDS-PAGE로 관찰한 결과를 나타낸 것이다. (레인 1: 단백질 표준 분자량을 보여주는 마커; 레인 2: 플라스미드 pET30a와 pACYC184로 형질전환된 균주를 OD₆₀₀ 0.4에서 발현 유도시킨 결과; 레인 3, 플라스미드 pSH48과 pACYC184로 형질전환된 균주를 OD₆₀₀ 0.4에서 발현 유도시킨 결과; 레인 4: 플라스미드 pSH48과 pTet-glyVXY로 형질전환된 균주를 OD₆₀₀ 0.4에서 발현 유도시킨 결과)

도 6은 64번 반복된 실크 단백질의 발현 수준을 SDS-PAGE로 관찰한 결과를 나타낸 것이다. (레인 1: 단백질 표준 분자량을 보여주는 마커; 레인 2: 플라스미드 pSH64와 pACYC184로 형질전환된 균주를 OD₆₀₀ 0.4에서 발현 유도시킨 결과; 레인 3: 플라스미드 pSH64와 ptet-gly2로 형질전환된 균주를 OD₆₀₀ 0.4에서 발현 유도시킨 결과)

도 7은 48번 반복된 실크 단백질의 발현 수준을 SDS-PAGE로 관찰한 결과를 나타낸 것이다. (레인 1: 단백질 표준 분자량을 보여주는 마커; 레인 2: 플라스미드 pET30a와 pgly-cysK로 형질전환된 균주를 OD₆₀₀ 0.4에서 발현 유도시킨 결과; 레인 3, 플라스미드 pSH16a와 pgly-cysK로 형질전환된 균주를 OD₆₀₀ 0.4에서 발현 유도시킨 결과; 레인 4: 플라스미드 pSH32와 pgly-cysK로 형질전환된 균주를 OD₆₀₀ 0.4에서 발현 유도시킨 결과; 레인 5: 플라스미드 pSH48과 pgly-cysK로 형질전환된 균주를 OD₆₀₀ 0.4에서 발현 유도시킨 결과)

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Method for Preparing Protein Having High Specific Amino Acid Content Through Co-expression of tRNA of Specific Amino Acid <130> P08-B143 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gctcgatatc taacgacgca gaaatgcgaa a 31 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 cattggatcc taagattaca gcctgaggct gtg 33 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ggctcgcatg ctcatgtttg acagcttatc atcga 35 <210> 4 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 attgtcgact gctgcagtaa gattacagcc tgaggctgtg 40

Claims (14)

1. "SGRGGLGGTGAGMAAAAAMGGAGQGGYGGLGSQG"의 아미노산 서열을 가지는 올리고 펩타이드가 64회 반복되는 실크단백질을 코딩하는 유전자와 글리신의 tRNA를 코딩하는 염기서열이 도입되어 있고, 상기 실크단백질의 생성능이 3배 이상 증가된 재조합 대장균.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, cysK 유전자가 추가로 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 재조합 대장균.
5. 제1항에 있어서, 상기 tRNA를 코딩하는 염기서열은 glyVXY 유전자의 염기서열인 것을 특징으로 하는 재조합 대장균.
6. 삭제
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11. 제1항, 제4항 및 제5항 중 어느 한 항의 재조합 대장균을 배양하여 "SGRGGLGGTGAGMAAAAAMGGAGQGGYGGLGSQG"의 아미노산 서열을 가지는 올리고 펩타이드가 64회 반복되는 실크단백질을 발현시킨 다음, 상기 발현된 실크단백질을 회수하는 것을 특징으로 하는 실크단백질의 제조방법.
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14. 삭제

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