WO2018030499A1 - 不溶性組換えタンパク質凝集体の製造方法 - Google Patents

不溶性組換えタンパク質凝集体の製造方法 Download PDF

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WO2018030499A1
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recombinant protein
insoluble
producing
recombinant
protein aggregate
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利昭 大澤
祐哉 佐藤
森田　啓介
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Ｓｐｉｂｅｒ株式会社
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    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing an insoluble recombinant protein aggregate from a recombinant cell expressing an insoluble recombinant protein by a method for separating the insoluble form of the recombinant protein, and the insoluble recombination obtained by the method. It relates to protein aggregates.
  • the insoluble granules are obtained at a relatively high yield by centrifuging a suspension containing components such as proteins derived from host cells. Can be isolated with high purity and high purity.
  • a method of isolating a target protein from insoluble recombinant cells solubilized with a metal hydroxide such as sodium hydroxide has been reported.
  • the recombinant protein is in a solubilized state or insoluble in a recombinant cell, unlike a compact insoluble granule, it is difficult to separate by centrifugation, for example, the following purification A method has been reported. That is, the protein derived from the host cell is hydrolyzed with an organic acid such as formic acid or propionic acid, the insoluble material derived from the host cell is removed by centrifugation or the like, and the target recombinant protein is recovered in its native state. A method of purification by a technique such as chromatography (Patent Document 2) has been reported. In the report, the target protein remains in an undenatured state even when the organic acid is added, and does not aggregate.
  • Patent Document 2 Patent Document 2
  • the target recombinant protein is not necessarily produced as an insoluble granule in the recombinant cell, but the nature of the target recombinant protein itself, the culture composition during production, the culture temperature, the production rate, etc. It is known that the production state of insoluble granules varies greatly depending on various parameters. For this reason, research has been directed to the modification of recombinant proteins or the development of efficient production methods to produce large insoluble granules that can be centrifuged as easily as possible.
  • the present invention relates to a method for efficiently separating an insoluble body of a recombinant protein from a recombinant cell expressing the target recombinant protein as an insoluble body in the cell, and a recombinant protein aggregate by the separation method.
  • An object of the present invention is to provide a method of producing
  • the present invention relates to the following inventions, for example.
  • a method for producing a recombinant protein aggregate by separating an insoluble body of the recombinant protein as an aggregate from a recombinant cell expressing the recombinant protein in the cell as an insoluble body A method for producing a recombinant protein aggregate, comprising: disrupting a recombinant cell, aggregating an insoluble recombinant protein, and separating the obtained aggregate.
  • the method for producing a recombinant protein aggregate according to [1] comprising separating the recombinant protein aggregate with a centrifugal force of 10,000 ⁇ g or less.
  • a method for producing a recombinant protein aggregate comprising the following steps (A) to (C): (A) A step of crushing a recombinant cell expressing the target recombinant protein in an insoluble form and obtaining a crushed suspension containing the insoluble form of the recombinant protein (B) (A) step (1) adding one or more members selected from the group consisting of metal salts, acids and anionic flocculants to the crushed suspension obtained in step (1) to aggregate recombinant protein insolubles to obtain recombinant protein aggregates ( C) Step of separating the aggregate obtained in step (B) from the suspension [7] Production of the recombinant protein aggregate according to [6], wherein the step (B) further comprises heating.
  • the metal salt is a metal salt selected from the group consisting of alkaline earth metal salts and earth metal salts. .
  • the metal salt is selected from the group consisting of alkaline earth metal halides, alkaline earth metal nitrates, alkaline earth metal sulfates, earth metal halides, earth metal nitrates, and earth metal sulfates.
  • [14] The method for producing a recombinant protein aggregate according to any one of [1] to [13], wherein the disruption of the recombinant cells is mechanical disruption.
  • [15] The method for producing a recombinant protein aggregate according to any one of [1] and [6] to [14], wherein the separation of the recombinant protein aggregate is performed by filtration.
  • a method for separating an insoluble substance of a recombinant protein from a recombinant cell expressing the recombinant protein in the cell as an insoluble substance A method for separating a recombinant protein, comprising aggregating an insoluble recombinant protein after disrupting the recombinant cell and separating the resulting aggregate.
  • a method for separating a recombinant protein comprising the following steps (A) to (C): (A) A step of crushing a recombinant cell expressing the target recombinant protein in an insoluble form and obtaining a crushed suspension containing the insoluble form of the recombinant protein (B) (A) step (1) adding one or more members selected from the group consisting of metal salts, acids and anionic flocculants to the crushed suspension obtained in step (1) to aggregate recombinant protein insolubles to obtain recombinant protein aggregates ( C) Step [27] of separating the aggregate obtained in step (B) from the suspension [27] The method for separating a recombinant protein according to [26], further comprising heating in step (B).
  • [28] The method for separating a recombinant protein according to [27], further comprising stirring in the step (B).
  • [29] The method for separating a recombinant protein according to any one of [25] to [28], wherein the metal salt is a metal salt selected from the group consisting of alkaline earth metal salts and earth metal salts.
  • the metal salt is selected from the group consisting of alkaline earth metal halides, alkaline earth metal nitrates, alkaline earth metal sulfates, earth metal halides, earth metal nitrates, and earth metal sulfates.
  • [31] The method for separating a recombinant protein according to any one of [25] to [30], wherein the acid is an oxo acid.
  • the oxo acid is an oxo acid selected from the group consisting of acetic acid, sulfuric acid and citric acid.
  • the anionic flocculant is an anionic flocculant selected from the group consisting of polyacrylates, anionic polyacrylamides, and acrylamide / acrylate copolymers.
  • [34] The method for separating a recombinant protein according to any one of [21] to [33], wherein the disruption of the recombinant cells is mechanical disruption.
  • [35] The method for separating a recombinant protein according to any one of [21] and [26] to [34], wherein the separation of the recombinant protein aggregate is performed by filtration.
  • a method for producing a recombinant protein aggregate using the separation method according to any one of [1 to 38], wherein an electrical detection zone of the recombinant protein aggregate obtained by the separation method A method for producing a recombinant protein aggregate having a particle diameter measured by the method of 4 ⁇ m or more and 50 ⁇ m or less.
  • an insoluble body can be aggregated and enlarged, so that the recombinant protein of interest is expressed in the cell as an insoluble body
  • a recombinant protein aggregate can be produced by efficiently separating the insoluble body of the recombinant protein, for example, by natural sedimentation, centrifugation, or filtration.
  • insoluble or insoluble granules of the recombinant protein that could not be easily separated by centrifugation, filtration or the like can be easily separated, and the purity of the separated recombinant protein can be improved. According to the present invention, such an unexpected effect is achieved.
  • FIG. 1 is a photograph showing the results of examining the aggregation effect of an insoluble material by adding a metal salt in Example 1.
  • FIG. 2 is a photograph showing the results of examining the insoluble coagulation effect resulting from the addition of the metal salt of Example 2.
  • FIG. 3 is a photograph showing the results of examining the aggregation effect of insoluble proteins with different hydropathic indexes in Example 3 by adding metal salts.
  • FIG. 4 is a photograph showing the results of examining the aggregation effect of insoluble proteins with different hydropathic indexes in Example 4 by adding metal salts.
  • FIG. 1 is a photograph showing the results of examining the aggregation effect of an insoluble material by adding a metal salt in Example 1.
  • FIG. 2 is a photograph showing the results of examining the insoluble coagulation effect resulting from the addition of the metal salt of Example 2.
  • FIG. 3 is a photograph showing the results of examining the aggregation effect of insoluble proteins with different hydropathic indexes in
  • FIG. 5 is a photograph showing the results of analysis by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) on the improvement in purity of the target recombinant protein based on metal salt-added aggregation in Example 4.
  • A is stained with Oriole TM fluorescent gel stain (Bio-Rad) that can stain all proteins after migration, and B is InVision (responding to the His tag region of PRT410 after migration). (Trademark) It is dyed with an in-gel staining reagent with a His tag (Thermo Fisher Scientific).
  • FIG. 6 is a photograph showing the results of examining the insoluble coagulation effect by addition of acid in Example 5.
  • FIG. 6 is a photograph showing the results of examining the insoluble coagulation effect by addition of acid in Example 5.
  • FIG. 7 is a photograph showing the results of examining the insoluble coagulation effect by addition of acid in the insoluble material after washing in Example 5.
  • FIG. 8 is a photograph showing the results of examining the aggregation effect of insoluble proteins with different hydropathic indexes by addition of acid in Example 6.
  • FIG. 9 is a photograph showing the results of analysis by SDS-PAGE regarding the purity improvement of the target recombinant protein based on acid addition aggregation in Example 6.
  • FIG. 10 is a photograph showing the results of examining the aggregating effect of the insoluble material by adding the aggregating agent in Example 8.
  • FIG. 11 is a photograph showing the results of analysis by SDS-PAGE regarding the improvement in the purity of the target recombinant protein based on the addition of anionic flocculant in Example 9.
  • FIG. 12 is a diagram showing the frequency distribution and cumulative distribution of particle diameters for confirming the aggregation effect in Example 10.
  • FIG. 13 is a photograph showing the results of analysis by SDS-PAGE regarding degradation of contaminating proteins based on heating in Example 12.
  • FIG. 14 is a photograph showing the results of analysis by SDS-PAGE regarding the improvement in purity of a target recombinant protein based on heating in Example 12.
  • FIG. 12 is a diagram showing the frequency distribution and cumulative distribution of particle diameters for confirming the aggregation effect in Example 10.
  • FIG. 13 is a photograph showing the results of analysis by SDS-PAGE regarding degradation of contaminating proteins based on heating in Example 12.
  • FIG. 14 is a photograph showing the results of analysis by SDS-PAGE regarding the improvement in purity of a target recomb
  • FIG. 15 is a diagram showing the frequency distribution and cumulative distribution of the particle diameters of Samples C, X, 1, 2, and 3 for confirming the aggregation effect by continuous heating in Example 13.
  • FIG. 16 is a diagram showing the frequency distribution and cumulative distribution of the particle diameters of samples 4, 5, 6, 7, and 8 for confirming the aggregation effect by continuous heating in Example 13.
  • a method for producing a recombinant protein aggregate includes separating an insoluble body of the recombinant protein as an aggregate from a recombinant cell expressing the recombinant protein in the cell as an insoluble body.
  • a method for producing a protein aggregate comprising aggregating and separating an insoluble recombinant protein after disrupting a recombinant cell.
  • the insoluble form of the recombinant protein is preferably aggregated by adding one or more selected from the group consisting of metal salts, acids and anionic flocculants.
  • a method for producing a recombinant protein aggregate includes the following steps (A) to (C): (A) Step (B) (A) Step of obtaining a crushed suspension containing an insoluble recombinant protein by crushing a recombinant cell expressing the target recombinant protein as an insoluble in the cell Adding one or more members selected from the group consisting of metal salts, acids and anionic flocculants to the crushed suspension obtained in Step 1, and aggregating insoluble recombinant protein to obtain recombinant protein aggregate ( C) Step of separating the aggregate obtained in step (B) from the suspension
  • An insoluble recombinant protein (in this specification, sometimes referred to as “target protein”) separated by the method for producing a recombinant protein aggregate according to the present embodiment is insoluble in the following recombinant cells.
  • target protein an insoluble recombinant protein separated by the method for producing a recombinant protein aggregate according to the present embodiment
  • examples of the recombinant protein include any insoluble protein that is preferably produced on an industrial scale. Examples thereof include proteins that can be used for industrial use, proteins that can be used for medical purposes, and structural proteins.
  • proteins that can be used for industrial or medical use include enzymes, regulatory proteins, receptors, peptide hormones, cytokines, membrane and transport proteins, antigens used for vaccination, vaccines, antigen binding proteins, immunostimulatory proteins, Mention may be made of allergens, full-length antibodies and antibody fragments and derivatives thereof.
  • specific examples of the structural protein include keratin, collagen, elastin, resilin, silkworm silk and spider silk, and proteins derived therefrom.
  • a protein derived from spider silk or silkworm silk that is a fibroin-like protein
  • a protein comprising a domain sequence represented by Formula 1: [(A) n motif-REP] m
  • (A) The n motif represents an amino acid sequence composed of 4 to 20 amino acid residues
  • (A) the number of alanine residues relative to the total number of amino acid residues in the n motif is 80% or more.
  • M represents an integer of 8 to 300.
  • a plurality of (A) n motifs may be the same amino acid sequence or different amino acid sequences. May be the same or different amino acid sequences.).
  • a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1 (PRT410), SEQ ID NO: 2 (PRT853), SEQ ID NO: 3 (PRT647), SEQ ID NO: 4 (PRT699), and SEQ ID NO: 5 (PRT698), etc.
  • the hydropathic indices of these proteins are -0.81, -0.68, 0.04, 0.17, and 0.43, respectively.
  • the value of the hydropathic index is a value calculated according to the method described in International Publication No. 2014/103846.
  • a protein derived from collagen for example, a protein comprising a domain sequence represented by Formula 2: [REP2] o (where, in Formula 2, o represents an integer of 5 to 300.
  • REP2 represents Gly 1 X 1 Y And X and Y represent any amino acid residue other than Gly, and a plurality of REP2s may be the same amino acid sequence or different amino acid sequences.
  • a protein Collagen-type4-Kai
  • SEQ ID NO: 6 can be mentioned.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 corresponds to the repeat part and motif of the partial sequence of human collagen type 4 (NCBI GenBank accession number: CAA563335.1, GI: 3702452) obtained from the NCBI database.
  • An amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 (tag sequence and hinge sequence) is added to the N-terminus of the amino acid sequence from the 301st residue to the 540th residue.
  • the hydropathic index of Collagen-type4-Kai is -0.75.
  • a protein comprising a domain sequence represented by Formula 3: [REP3] p (where, in Formula 3, p represents an integer of 4 to 300.
  • REP3 represents Ser, J, J, and J.
  • Plural REP3s may have the same or different amino acid sequences. ). Specific examples include a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 7 is the amino acid sequence of resilin (NCBI GenBank accession number NP_6111157.1, Gl: 24654243), wherein Thr at 87th residue is replaced with Ser, and 95th residue
  • An amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 (tag sequence and hinge sequence) is added to the N-terminus of the amino acid sequence from the 19th residue to the 321st residue of the substituted sequence in which Asn is replaced with Asp.
  • the hydropathy index of Resilin-Kai (SEQ ID NO: 7) is -1.22.
  • elastin-derived protein examples include proteins having an amino acid sequence such as NCBI GenBank accession numbers AAC98395 (human), I47076 (sheep), and NP786966 (bovine). Specific examples include a protein containing the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8.
  • the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 at the N-terminus of the amino acid sequence from residue 121 to residue 390 of the amino acid sequence of NCBI GenBank accession number AAC98395 (tag sequence). And a hinge arrangement).
  • the hydropathic index of elastin short (SEQ ID NO: 8) is 0.42.
  • keratin-derived proteins examples include Capra hircus type I keratin.
  • a protein including the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 9 (amino acid sequence of NCBI GenBank accession number ACY30466) can be exemplified.
  • the hydropathic index of type I keratin 26 (SEQ ID NO: 9) is -0.53.
  • the recombinant cell in this embodiment is a recombinant cell expressing the recombinant protein in the cell as an insoluble substance, and can be obtained using a general method using a genetic engineering technique.
  • a recombinant cell can be transformed into a host (host cell) with an expression vector having a nucleic acid sequence encoding the protein of interest and one or more regulatory sequences operably linked to the nucleic acid sequence. Can be obtained.
  • Regulatory sequences are sequences that control the expression of recombinant proteins in the host (for example, promoters, enhancers, ribosome binding sequences, transcription termination sequences, etc.), and can be appropriately selected depending on the type of host.
  • the type of expression vector can be appropriately selected according to the type of host, such as a plasmid vector, viral vector, cosmid vector, fosmid vector, artificial chromosome vector, and the like.
  • any of prokaryotes and eukaryotes such as yeast, filamentous fungi, insect cells, animal cells and plant cells can be preferably used. More preferred are bacteria, yeasts, filamentous fungi, insect cells, plant cells and animal cells.
  • preferred examples of prokaryotes include E. coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas, Corynebacterium, Lactococcus, and more preferably E. coli cells.
  • a vector that can replicate autonomously in a host cell or can be integrated into a host chromosome and contains a promoter at a position where a nucleic acid encoding a target protein can be transcribed is preferably used.
  • a ribosome binding sequence, transcription termination sequence, or gene sequence that controls the promoter may be included.
  • the promoter may be any inducible promoter that functions in the host cell and can induce expression of the target protein.
  • An inducible promoter is a promoter that can control transcription by the presence of an inducer (expression inducer), the absence of a repressor molecule, or physical factors such as an increase or decrease in temperature, osmotic pressure or pH value.
  • prokaryotic hosts include microorganisms belonging to the genus Escherichia, Brevibacillus, Serratia, Bacillus, Microbacterium, Brevibacterium, Corynebacterium, Pseudomonas, and the like.
  • microorganisms belonging to the genus Escherichia include, for example, Escherichia coli BL21 (Novagen), Escherichia coli BL21 (DE3) (Life Technologies), Escherichia coli BLR (DE3) (Merck Millipore), Escherichia coli DH1, Escherichia ⁇ Coli GI698, Escherichia coli HB101, Escherichia coli JM109, Escherichia coli K5 (ATCC 23506), Escherichia coli KY3276, Escherichia coli MC1000, Escherichia coli MG1655 (ATCC 47076), Escherichia coli 49, Escherichia coli Rosetta (DE3) (Novagen), Escherichia coli TB1, Escherichia coli Tuner (Novagen), Escherichia coli Tuner (DE3) (Novagen), Escherichia coli W1485, Escherichia
  • microorganisms belonging to the genus Brevibacillus include, for example, Brevibacillus agri, Brevibacillus bolsterensis, Brevibacillus centroporus Brevibacillus formosas, Brevibacillus invocatus, Brevibacillus latirosporus, Brevibacillus limnophilus, Brevibacillus paravis Brevibacillus reuszeli, Brevibacillus thermolver, Brevibacillus brevis 47 (FERM BP-1223), Brevibacillus brevis 47K (FERM BP-2308), Brevibacillus brevis 47-5 (FERM BP-1664), Brevi Bacillus brevis 47-5Q (JCM8975), Brevibacillus choshinensis HPD31 (FERM BP-1087), Brevibacil Choshinensis HPD31-S (FERM BP-6623), Brevibacillus choshinensis HPD31
  • microorganisms belonging to the genus Serratia include, for example, Serratia lifafaciens ATCC 14460, Serratia entomofila, Serratia ficaria, Serratia cola (Serratia grimesii), Serratia proteamaculans, Serratia odorifera, Serratia primumica, Serratia rubiae, Sera rubia e It is possible.
  • microorganisms belonging to the genus Bacillus include Bacillus subtilis and Bacillus amyloliquefaciens.
  • microorganisms belonging to the genus Microbacterium include, for example, Microbacterium / Ammonia Filum ATCC 15354.
  • microorganisms belonging to the genus Brevibacterium include Brevibacterium divaricatam (Corynebacterium glutamicum) ATCC 14020, Brevibacterium flavum (Corynebacterium glutamicum ATCC 14067) ATCC 13826, ATCC 14067, Brevibacterium immariophyllum (Brevibaterium immariophilum) ATCC 14068, Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum ATCC 13869) ATCC 13665, ATCC 13869, Brevibacterium roseum ATCC 13825, Brevibacterium saccharolyticum TCC14066, Brevibacterium Chiogenitarisu ATCC19240, Brevibacterium album ATCC15111, mention may be made of Brevibacterium Serinumu ATCC15112 and the like.
  • Examples of microorganisms belonging to the genus Corynebacterium include, for example, Corynebacterium ammoniagenes ATCC6871, ATCC6872, Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium glutamicolicoside ATCC14067, Lamb (Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC 13870, Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806, Corynebacterium alkanolyticum ATCC 21511, Corynebacterium carnae ATCC 15991, Corynebacterium glutamicum Arm ATCC13020, ATCC13032, ATCC13060, can be named Corynebacterium Lilium ATCC15990, Corynebacterium Merasekora ATCC 17965, Corynebacterium thermo amino monocytogenes AJ12340 (FERMBP-1539), Corynebacterium Hakyurisu ATCC13868 and the like.
  • microorganisms belonging to the genus Pseudomonas include, for example, Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas fluescens, Pseudomonas fluscens, Pseudomonas fluseusas, and (Pseudomonas sp.) D-0110 and the like.
  • Any method can be used for introducing an expression vector into a prokaryotic host cell as long as it introduces DNA into the host cell.
  • a method using calcium ions [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)]
  • the protoplast method Japanese Patent Laid-Open No. 63-248394
  • the methods described in Gene, 17, 107 (1982), Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979). can do.
  • Transformation of microorganisms belonging to the genus Brevibacillus can be performed, for example, by the method of Takahashi et al. (J. Bacteriol., 1983, 156: 1130-1134) or the method of Takagi et al. (Agric. Biol. Chem., 1989, 53: 3099). -3100), or the method of Okamoto et al. (Biosci. Biotechnol. Biochem., 1997, 61: 202-203).
  • vectors for introducing a nucleic acid encoding a target protein include, for example, pBTrp2, pBTac1, pBTac2 (all available from Boehringer Mannheim), pKK233-2 (manufactured by Pharmacia) PSE280 (manufactured by Invitrogen), pGEMEX-1 (manufactured by Promega), pQE-8 (manufactured by QIAGEN), pKYP10 (Japanese Patent Laid-Open No. 58-110600), pKYP200 [Agric. Biol. Chem.
  • pUC18 When using Escherichia coli as a host, pUC18, pBluescript II, pSupex, pET22b, pCold, etc. can be mentioned as suitable vectors.
  • vectors suitable for microorganisms belonging to the genus Brevibacillus include pUB110, which is known as a Bacillus subtilis vector, pHY500 (JP-A-2-31682), pNY700 (JP-A-4-278091), pHY4831 (J Bacteriol., 1987, 1239-1245), pNU200 (Shigezo Tsujitaka, Journal of Japanese Society of Agricultural Chemistry 1987, 61: 669-676), pNU100 (Appl. Microbiol. Biotechnol., 1989, 30: 75-80), pNU211 (J.
  • Promoters using prokaryotes as hosts are not limited as long as they function in host cells. Examples thereof include promoters derived from Escherichia coli or phages such as trp promoter (Ptrp), lac promoter, PL promoter, PR promoter, T7 promoter and the like. In addition, artificially modified promoters such as a promoter in which two Ptrps are connected in series (Ptrp ⁇ 2), a tac promoter, a lacT7 promoter, and a let I promoter can be used.
  • promoters derived from Escherichia coli or phages such as trp promoter (Ptrp), lac promoter, PL promoter, PR promoter, T7 promoter and the like.
  • artificially modified promoters such as a promoter in which two Ptrps are connected in series (Ptrp ⁇ 2), a tac promoter, a lacT7 promoter, and a let I promoter can be used.
  • a transcription termination sequence is not necessarily required for the expression of the nucleic acid, but it is preferable to arrange the transcription termination sequence directly under the nucleic acid encoding the target protein.
  • Examples of eukaryotic hosts include yeast, filamentous fungi (molds, etc.) and insect cells.
  • yeast examples include, for example, the genus Saccharomyces, the genus Schizosaccharomyces, the genus Kluyveromyces, the genus Trichosporon, and the genus Cwaniomyces. And yeast belonging to the genus Yarrowia and Hansenula.
  • Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae
  • Schizosaccharomyces pombe Schizosaccharomyces pombe
  • Kluyveromyces lactis Kluyveromyces lactis
  • Kluyveromyces marxianus Kluyveromyces marxianus
  • Trichosporon pullulans Trichosporon pullulans
  • Shiwaniomaisesu - Albius (Schwaniomyces alluvius)
  • Swaniomyces occidentalis Candida utilis, Pichia pastoris ( Ichia pastoris, Pichia angusta, Pichia methanolica, Pichia polymorpha, Pichia stipitropi, H. pichia Etc.
  • Expression vectors when yeast is used as the host cell are usually an origin of replication (if amplification is required in the host) and a selection marker for propagation of the vector in E. coli, a promoter for expression of the recombinant protein in yeast, and It is preferred to include a terminator as well as a selection marker for yeast.
  • the expression vector is a non-integrating vector
  • ARS autonomously replicating sequence
  • vectors in the case of using yeast as a host include YEP13 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419), YIp, pHS19, pHS15, pA0804, pHIL3O1, pHIL-S1, pPIC9K, pPICZ ⁇ , PGAZZp, ICPZB Etc.
  • promoters using yeast as a host are not limited as long as they can be expressed in yeast.
  • promoters of glycolytic genes such as hexose kinase, PHO5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter, gal 1 promoter, gal 10 promoter, heat shock polypeptide promoter, MF ⁇ 1 promoter, CUP 1 promoter, pGAP promoter, pGCW14 promoter, AOX1 promoter, MOX promoter, etc. can be mentioned.
  • any method for introducing an expression vector into yeast any method can be used as long as it is a method for introducing DNA into yeast.
  • electroporation Methods Enzymol., 194, 182 (1990)
  • spheroplast Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81, 4889 (1984)
  • lithium acetate method J. Bacteriol., 153, 163 (1983)
  • filamentous fungi examples include, for example, the genus Acremonium, the genus Aspergillus, the genus Ustilago, the genus Trichoderma, the genus Neurospora, the genus Fusarium, and Fusarium, Penicillium genus, Myceliophtora genus, Botrytis genus, Magnaporthe genus, Mucor genus, Metalithium genus, Monascus genus, Monascus genus And bacteria belonging to the genus Rhizomucor.
  • filamentous fungi include Acremonium alabamense, Acremonium cellulolyticus, Aspergillus algae or aspergillus sp. Aspergillus oryzae, Aspergillus salmon (Aspergillus sake), Aspergillus sojae (Aspergillus sojae), Aspergillus tubigensis (Aspergillus tubigenisgersgers) us niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus parasiticus, Aspergillus fisium, Aspergillus fiscus, Aspergillus fiscus Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus (Aspergillus fumigatus), Aspergillus japonicus (Aspergillus japonicus), Trichoderma bi De (Trichoderma viride), Trichoderma Hajianumu (Trichoderma harzianum), Trichoderma reesei (Tricho
  • promoters when using filamentous fungi as a host may be any of genes related to glycolysis, genes related to constitutive expression, enzyme genes related to hydrolysis, and specifically, amyB, glaA, agdA, glaB, TEF1, xynF1 tannasegene, No. 8AN, gpdA, pgkA, enoA, melO, sodM, catA, catB and the like.
  • the expression vector can be introduced into filamentous fungi using a conventionally known method.
  • a conventionally known method for example, the method of Cohen et al. (Calcium chloride method) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69: 2110 (1972)], protoplast method [Mol. Gen. Genet. 168: 111 (1979)], competent method [J. Mol. Biol. 56: 209 (1971)], electroporation method and the like.
  • Insect cells include, for example, lepidopteran insect cells. More specifically, insect cells derived from Spodoptera frugiperda such as Sf9 and Sf21, as well as nettle horsetail such as High 5 (Trichoplusia). ) Derived insect cells.
  • vectors when using insect cells as hosts include baculoviruses such as Autographa californica nuclear polyhedrosis virus, which are viruses that infect night stealing insects (Baculovirus virus). , A Laboratory Manual, WH Freeman and Company, New York (1992).
  • baculoviruses such as Autographa californica nuclear polyhedrosis virus, which are viruses that infect night stealing insects (Baculovirus virus). , A Laboratory Manual, WH Freeman and Company, New York (1992).
  • the polypeptide can be expressed by the method described in Freeman and Company, New York (1992), Bio / Technology, 6, 47 (1988), and the like. That is, after a recombinant gene transfer vector and a baculovirus are co-introduced into insect cells to obtain a recombinant virus (expression vector) in the insect cell culture supernatant, the recombinant virus is further infected with insect cells, and the polypeptide Can be expressed.
  • gene transfer vectors used in the method include pVL1392, pVL1393, and pBlueBacIII (both manufactured by Invitrogen).
  • Examples of a method for co-introducing a recombinant gene introduction vector and a baculovirus into insect cells for preparing a recombinant virus include, for example, the calcium phosphate method (Japanese Patent Laid-Open No. 227075), the lipofection method (Proc. Natl. Acad. Sci). USA, 84, 7413 (1987)).
  • the recombinant vector further contains a selection marker gene for selecting a transformant.
  • a selection marker gene for selecting a transformant for example, in E. coli, resistance genes for various drugs such as tetracycline, ampicillin, and kanamycin can be used as selection marker genes. Recessive selectable markers that can complement genetic mutations involved in auxotrophy can also be used.
  • yeast a gene resistant to geneticin can be used as a selectable marker gene, and selectable markers such as LEU2, URA3, TRP1, and HIS3, which are complementary to gene mutations involved in auxotrophy, can also be used.
  • selectable markers such as LEU2, URA3, TRP1, and HIS3, which are complementary to gene mutations involved in auxotrophy, can also be used.
  • filamentous fungi niaD (Biosci. Biotechnol.
  • aureobasidin resistance gene Mol Gen Genet, 261, 290-296, (1999)
  • benomyl resistance Marker gene selected from the group consisting of genes (Proc Natl Acad Sci USA, 83, 4869-4873, (1986)) and hygromycin resistance genes (Gene, 57, 21-26, (1987)), leucine-requiring complementary genes Etc.
  • a wild-type gene that complements the auxotrophy can be used as a selection marker gene.
  • Selection of a host transformed with the above expression vector can be performed by plaque hybridization, colony hybridization, or the like using a probe that selectively binds to the nucleic acid.
  • a probe that selectively binds to the nucleic acid.
  • the probe those obtained by modifying a partial DNA fragment amplified by the PCR method with a radioisotope or digoxigenin based on the sequence information of the nucleic acid can be used.
  • the recombinant protein is expressed in the cell as an insoluble substance.
  • the recombinant protein can be expressed by culturing the recombinant cell in a culture medium.
  • the method of culturing the recombinant cell in the culture medium can be performed according to a method usually used for culturing a host.
  • the culture medium contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and the like that can be assimilated by the host, so that the host can be cultured efficiently.
  • a medium that can be used any of a natural medium and a synthetic medium may be used.
  • Any carbon source may be used as long as it can be assimilated by the host.
  • Examples thereof include glucose, fructose, sucrose, and carbohydrates such as molasses, starch and starch hydrolysate, and organic acids such as acetic acid and propionic acid.
  • alcohols such as ethanol and propanol can be used.
  • nitrogen source examples include ammonium salts of inorganic acids or organic acids such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, and ammonium phosphate, other nitrogen-containing compounds, and peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, Casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermented cells and digested products thereof can be used.
  • inorganic acids or organic acids such as ammonia, ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium acetate, and ammonium phosphate, other nitrogen-containing compounds, and peptone, meat extract, yeast extract, corn steep liquor, Casein hydrolyzate, soybean meal and soybean meal hydrolyzate, various fermented cells and digested products thereof can be used.
  • inorganic salts examples include monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, magnesium phosphate, magnesium sulfate, sodium chloride, ferrous sulfate, manganese sulfate, copper sulfate, and calcium carbonate.
  • Cultivation of prokaryotes such as E. coli or eukaryotes such as yeast can be performed under aerobic conditions such as shaking culture or deep aeration and agitation culture.
  • the culture temperature is, for example, 15 to 40 ° C.
  • the culture time is usually 16 hours to 7 days.
  • the pH of the culture medium during the culture is preferably maintained at 3.0 to 9.0.
  • the pH of the culture medium can be adjusted using an inorganic acid, an organic acid, an alkaline solution, urea, calcium carbonate, ammonia, or the like.
  • antibiotics such as ampicillin and tetracycline may be added to the culture medium as needed during the culture.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside is used when cultivating a microorganism transformed with an expression vector using the lac promoter
  • indole acrylic is used when culturing a microorganism transformed with an expression vector using the trp promoter.
  • An acid or the like may be added to the medium.
  • Insect cell culture media include commonly used TNM-FH medium (Pharmingen), Sf-900 II SFM medium (Life Technologies), ExCell400, ExCell405 (all from JRH Biosciences), Grace ' s Insect Medium (Nature, 195, 788 (1962)) can be used.
  • Insect cell culture can be performed, for example, under a culture medium pH of 6 to 7, a culture temperature of 25 to 30 ° C., and a culture time of 1 to 5 days. Moreover, you may add antibiotics, such as a gentamicin, to a culture medium as needed during culture
  • antibiotics such as a gentamicin
  • the transformed plant cell When the host is a plant cell, the transformed plant cell may be cultured as it is, or it can be differentiated into a plant organ and cultured.
  • a medium for culturing the plant cells a commonly used Murashige and Skoog (MS) medium, White medium, or a medium in which a plant hormone such as auxin or cytokinin is added to these mediums or the like is used. be able to.
  • Animal cell culture can be performed, for example, under conditions such as a culture medium pH of 5-9 and a culture temperature of 20-40 ° C. for a culture time of 3-60 days. Moreover, you may add antibiotics, such as kanamycin and a hygromycin, to a culture medium as needed during culture
  • antibiotics such as kanamycin and a hygromycin
  • the target protein can be expressed in recombinant cells as an insoluble substance by the above method.
  • Step (A) involves disrupting a recombinant cell that is expressed in the cell with the target recombinant protein as an insoluble substance, and crushing suspension containing an insoluble recombinant protein. This is a step of obtaining a turbid liquid.
  • the disruption of the recombinant cells can be performed according to a known method. That is, cell disruption by enzyme treatment such as lysozyme, mutanolidine, lycicase, zymolyce, cell disruption by contact with organic solvents, cell disruption using osmotic pressure, ball mill, French press, high-pressure homogenizer, ultrasonic treatment, etc. It can be carried out by mechanical and mechanical cell disruption and combinations thereof.
  • enzyme treatment such as lysozyme, mutanolidine, lycicase, zymolyce
  • cell disruption by contact with organic solvents cell disruption using osmotic pressure, ball mill, French press, high-pressure homogenizer, ultrasonic treatment, etc. It can be carried out by mechanical and mechanical cell disruption and combinations thereof.
  • the culture medium obtained by the above culture can be used as it is, but in order to improve the purity of the recombinant protein obtained later, a washed suspension of recombinant cells should be used. Is preferred.
  • the washed recombinant cell suspension can be prepared by the following method. That is, the recombinant cells are separated from the culture solution by centrifugation, filtration or the like. Considering the subsequent steps, it is preferable to wash with water, and it is also preferable to wash with water after washing with a buffered aqueous solution or the like.
  • the obtained recombinant cells can be prepared by suspending them in a solution suitable for the disruption method so as to have a suitable concentration.
  • the recombinant cells obtained from the culture solution are treated with an organic solvent or the like, and the insoluble fraction after removing the soluble fraction such as the protein derived from the host of the recombinant cells is converted into a solution suitable for the above disruption method.
  • Suspensions suspended to a suitable concentration can also be used.
  • the treatment with the organic solvent contact with the organic solvent, etc.
  • the following (B) agglutination step of the recombinant protein insoluble matter can be performed.
  • suitable solutions include industrial water, deionized water, water such as RO (Reverse Osmosis) water, and buffered aqueous solutions.
  • suitable solutions include industrial water, deionized water, water such as RO (Reverse Osmosis) water, and buffered aqueous solutions.
  • buffer aqueous solution include Tris / HCl buffer solution.
  • the obtained crushed suspension contains an insoluble material of the recombinant protein.
  • insoluble matter refers to a protein that is insoluble in a solution (suspension) and may form insoluble granules.
  • the disrupted suspension contains cell debris that can be easily centrifuged, and the following aggregation step may be performed using the suspension after removing these cell debris.
  • insoluble granules in the crushed suspension may contain impurities and can be separated by centrifugation.
  • the precipitate fraction containing the insoluble granules obtained by centrifugation may be resuspended in the buffered aqueous solution, and the process may proceed to the aggregation step described below.
  • step (B) Aggregation step of recombinant protein insoluble matter
  • step (B) at least one selected from the group consisting of metal salts, acids and anionic flocculants is added to the crushed suspension obtained in step (A). It is a step of adding and aggregating insoluble recombinant protein to obtain a recombinant protein aggregate.
  • step (B) heating and / or stirring may be performed as necessary.
  • metal salts include alkaline earth metal salts and earth metal salts. Specific examples include alkaline earth metal halides, alkaline earth metal nitrates, alkaline earth metal sulfates, earth metal halides, earth metal nitrates, earth metal sulfates, and the like.
  • the metal salt is preferably a divalent or higher polyvalent metal salt.
  • alkaline earth metal halide examples include calcium chloride, magnesium chloride, magnesium bromide, calcium bromide, magnesium iodide, calcium iodide and the like.
  • alkaline earth metal nitrates examples include calcium nitrate, magnesium nitrate, strontium nitrate, and barium nitrate.
  • alkaline earth metal sulfate examples include calcium sulfate, magnesium sulfate, strontium sulfate, and barium sulfate.
  • Examples of the earth metal halide include aluminum trichloride and gallium trichloride.
  • Examples of the earth metal nitrate include aluminum nitrate and gallium nitrate.
  • Examples of the earth metal sulfate include aluminum sulfate and gallium sulfate.
  • These metal salts may be used alone or in combination of two or more.
  • Suitable metal salts include alkali metal halides and alkaline earth metal halides, and specific preferred examples include lithium chloride and calcium chloride.
  • the addition amount of the metal salt when the recombinant protein forms a compact insoluble granule in the crushed suspension, an effect can be observed even with a small addition, for example, 0.01 to 20 mM, preferably 1 to 10 mM. What is necessary is just to add a metal salt so that it may become.
  • a metal salt may be added so as to be 2 to 50 mM, preferably 5 to 10 mM.
  • an inorganic acid or an organic acid can be used as the acid.
  • Suitable acids include oxo acid and the like.
  • inorganic oxo acids include sulfuric acid, nitric acid, and phosphoric acid.
  • organic acid oxo acids include formic acid, acetic acid, citric acid, and tartaric acid.
  • oxo acid acetic acid, sulfuric acid and citric acid are preferable, and citric acid is more preferable.
  • an acid may be added so as to be 5 to 20 mM.
  • an acid may be added so as to be 2 to 50 mM, preferably 10 to 30 mM.
  • anionic flocculant refers to a polymer flocculant (polymer) having an organic anionic group.
  • examples of the anionic flocculant include polyacrylates, anionic polyacrylamides, acrylamide / acrylate copolymers, and the like.
  • Kurifama PA series (PA-923, PA-896, PA-895, PA-893, PA-865, PA-823, PA-813, PA-804, PA-465 manufactured by Kurita Kogyo Co., Ltd.) , PA-404, PA-402, PA-265, etc.), Acofloc (A-95 to A-100, A-110 to A-150, A-190, A-235H to A-) manufactured by Mitsui Chemicals Aqua Polymer Co., Ltd. 250, etc.), Sumiflock (FA-40 to FA-70), Mitsubishi Rayon Diaflock AP series (AP335B, AP741B, AP825C etc.), Taki Chemical Co., Ltd.
  • Takiflock A series (A-102 to A-) 106, A-108, A-142, A-162), Togamimi Flock (TA-089, TA-104, TA-109, It can be mentioned A-124, TA-144, TAE-2325, TAE-2335, TAE-2644 etc.) and the like.
  • these aggregating agents may have an action of aggregating host cells themselves, when using an aggregating agent, it is preferable to use a disrupted suspension from which cell debris has been removed in advance.
  • the amount of the anionic flocculant added is such that the recombinant protein is 0.001 to 0.1%, preferably 0.01 to 0.05% in the disrupted suspension. That's fine.
  • a metal salt, an acid or an anionic flocculant can be effected by addition at a low concentration by adding each in combination, alone or in combination.
  • heating may be performed so as to promote aggregation and increase the size of the aggregate.
  • the heating means is not particularly limited.
  • the heating temperature (peak temperature) is not particularly limited. From the viewpoint of efficiently obtaining an insoluble or insoluble granule and from the viewpoint of killing cells, the heating temperature is, for example, 60 ° C. according to the type of the target recombinant protein. Above, preferably 70 ° C. or higher, more preferably 80 ° C. or higher. Further, from the viewpoint of suppressing the degradation of the target protein and improving the purity of the target protein, the temperature is, for example, 130 ° C. or lower, preferably 110 ° C. or lower, more preferably 90 ° C. or lower, depending on the type of target protein.
  • the heating time is not particularly limited, but from the viewpoint of efficiently obtaining an insoluble or insoluble granule and from the viewpoint of killing cells, depending on the type of the target recombinant protein, for example, 0.5 hours or more, preferably 1 hour or more, more preferably 2 hours or more. Further, from the viewpoint of suppressing the degradation of the target protein and improving the working efficiency, it is, for example, 15 hours or less, preferably 10 hours or less, more preferably 5 hours or less, depending on the type of the target protein.
  • the heating time for obtaining insoluble or insoluble granules can be significantly shortened by the method of continuously heating the crushed suspension.
  • the temperature at which the crushed suspension is continuously heated is not particularly limited, but it depends on the type of the target recombinant protein from the viewpoint of efficiently obtaining insoluble or insoluble granules and from the viewpoint of killing cells.
  • the heating temperature is 70 ° C. or higher, preferably 80 ° C. or higher, more preferably 90 ° C. or higher.
  • the temperature is, for example, 140 ° C. or lower, preferably 120 ° C. or lower, more preferably 100 ° C. or lower, depending on the type of the target protein.
  • the heating time for obtaining an insoluble or insoluble granule in the case of continuously heating the crushed suspension is not particularly limited, but from the viewpoint of efficiently obtaining an insoluble or insoluble granule and from the viewpoint of microbial cell killing, Depending on the type of the target recombinant protein, for example, it is 1 second or longer, preferably 10 seconds or longer, more preferably 30 seconds or longer. Further, from the viewpoint of suppressing the degradation of the target protein and improving the working efficiency, it is, for example, 120 seconds or less, preferably 90 seconds or less, more preferably 60 seconds or less, depending on the type of the target protein.
  • the method for continuously heating the crushed suspension is not particularly limited as long as the insoluble or insoluble granules can be heated to 70 ° C. or higher and 140 ° C. or lower, and the temperature after heating can be maintained within 120 seconds.
  • the liquid continuous sterilizer MINI UHT T-20 (manufactured by Powerpoint International Co., Ltd.) is particularly mentioned.
  • stirring may be performed in addition to heating so that the aggregate becomes large.
  • the means for stirring is not particularly limited.
  • the stirring speed is not particularly limited, but is preferably a speed at which insoluble aggregates in the solution do not precipitate from the viewpoint of efficiently obtaining insoluble granules, for example, 70 rpm or more, preferably 150 rpm or more, and more preferably 300 rpm or more.
  • it is 1500 rpm or less, Preferably it is 1000 rpm or less, More preferably, it is 500 rpm or less. What is necessary is just to perform stirring time in the arbitrary time between the coagulation
  • the process is a process of separating the aggregate obtained in the process (B) from the suspension.
  • Aggregation of the recombinant protein insoluble material begins simultaneously with the addition of one or more selected from the group consisting of metal salts, acids and anionic flocculants to the disruption suspension, and then suitable separation means such as natural sedimentation, centrifugation Separation or filtration can be used to separate the aggregates.
  • suitable separation means such as natural sedimentation, centrifugation Separation or filtration can be used to separate the aggregates.
  • the mixture is heated and further stirred as necessary to promote aggregation and increase the size of the aggregate and facilitate separation. .
  • aggregates can be recovered by centrifugation at 2500 ⁇ g for 5-30 minutes.
  • the recombinant protein originally forms insoluble granules that can be centrifuged in the crushed suspension
  • one or more selected from the group consisting of metal salts, acids and anionic flocculants are added, heated, By stirring as necessary, the insoluble granules can be further enlarged and allowed to settle naturally.
  • One or more selected from the group consisting of metal salts, acids and anionic flocculants is also added to the recombinant protein insoluble matter that is difficult to separate by centrifugation, heated, and insoluble granules by stirring if necessary Is further enlarged and can be separated by centrifugation, filtration, or the like.
  • centrifugal separation of insoluble granules can be carried out with a low centrifugal force such as 2,500 ⁇ g.
  • a cylindrical centrifugal separator with a high centrifugal force of 12,000 ⁇ g or more is used. It's being used.
  • insoluble recombinant proteins can be precipitated as aggregates at a lower centrifugal force, so that separations such as Westphalia, Clarifier, and Alfa Laval, which have been used only for the separation of bacterial cells so far, are possible.
  • plate-type centrifuges and decanter-type centrifuges, as well as basket-type centrifuges, can be used for the separation of insoluble recombinant proteins.
  • These separation plate type and decanter type centrifuges have a centrifugal force of 10,000 ⁇ g or less, and can be used for extremely industrial production because they can continuously separate a large amount of suspension.
  • membrane separation can be easily performed.
  • the membrane can be more easily separated by heating and stirring as necessary.
  • the separation operation only by the separation operation, impurities derived from the host cell that can be separated from the recombinant protein insoluble matter can be removed, and the purity of the recombinant protein can be improved. Further, when the separated recombinant protein insoluble matter is resuspended and the aggregation and separation steps are performed again, the purity can be further improved.
  • the particle diameter of the recombinant protein aggregate obtained by the separation step of the recombinant protein aggregate can be measured, for example, by an electrical detection zone method.
  • the particle diameter of the recombinant protein aggregate is, for example, 4 ⁇ m or more, preferably 5 ⁇ m or more, more preferably 10 ⁇ m or more, and further preferably 15 ⁇ m or more.
  • the upper limit of the particle size of the aggregate is not particularly limited, but may be 50 ⁇ m or less, 40 ⁇ m or less, 30 ⁇ m or less, or 20 ⁇ m or less.
  • Examples of the electrical detection band method include a particle size distribution measuring method based on JIS Z 8832, and in particular, a measuring method using a particle size analyzer CDA-1000 (Sysmex Corporation).
  • the recombinant protein aggregate obtained by the separation can be further purified using, for example, the method described in JP 2013-523665 A to improve the purity.
  • nucleic acids were each cloned into a cloning vector (pUC118). Thereafter, the nucleic acid was cleaved by restriction enzyme treatment with NdeI and EcoRI, and then recombined with the protein expression vector pET-22b (+) to obtain an expression vector.
  • Escherichia coli BLR (DE3) was transformed with the five types of expression vectors, respectively, to obtain transformed Escherichia coli (recombinant cells) expressing the target protein.
  • the transformed E. coli was cultured in 2 mL of LB medium containing ampicillin for 15 hours.
  • the culture solution was added to 100 mL of a seed culture medium (Table 2) containing ampicillin so that the OD 600 was 0.005.
  • the culture temperature was kept at 30 ° C., and flask culture was performed until the OD 600 reached 5 (about 15 hours) to obtain a seed culture solution.
  • the seed culture solution was added to a jar fermenter to which 500 mL of production medium (Table 3) was added so that the OD 600 was 0.05.
  • the culture solution temperature was maintained at 37 ° C., and the culture was performed at a constant pH of 6.9. Further, the dissolved oxygen concentration in the culture solution was maintained at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration.
  • a feed solution (glucose 455 g / 1 L, yeast extract 120 g / 1 L) was added at a rate of 1 mL / min.
  • the culture solution temperature was maintained at 37 ° C., and the culture was performed at a constant pH of 6.9.
  • the dissolved oxygen concentration in the culture solution was maintained at 20% of the dissolved oxygen saturation concentration, and cultured for 20 hours.
  • 1M isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside (IPTG) was added to the culture solution to a final concentration of 1 mM to induce expression of the target protein.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside
  • Example 1 Effect of addition of metal salt 1
  • DNase SIGMA-ALDRICH
  • Lysozyme Thermo Fisher Scientific
  • E. coli BLR DE3 expressing PRT853 (HI: -0.68) as an insoluble material
  • GAA high-pressure homogenizer
  • TOMY MX-305 After crushing, using a centrifuge (TOMY MX-305), the mixture was treated at 11,000 ⁇ g for 5 minutes to obtain an insoluble material.
  • the insoluble material was thus a relatively small insoluble granule that had to be centrifuged for a significant amount of time to obtain.
  • metal salts shown in Table 4 were added so as to be 0.5M.
  • FIG. 1 is a photograph of each sample when centrifuged at 2,680 ⁇ g for 10 seconds after addition of the metal salt.
  • the insoluble material can be precipitated by centrifuging at 2,680 ⁇ g for 10 seconds.
  • Example 2 Effect of adding metal salt 2 For the metal salts (magnesium chloride, calcium chloride, magnesium sulfate and magnesium nitrate) which were excellent in Example 1 in the aggregation effect, the aggregation effect at a low concentration was confirmed using an insoluble material of PRT853 (see Table 5).
  • FIG. 2 is a photograph of each sample when centrifuged at 2,680 ⁇ g for 10 seconds after the addition of the metal salt.
  • Any metal salt showed an aggregation effect even at 1 mM, but a significant aggregation effect was observed at 5 mM or more.
  • Example 3 Effect of HI on different proteins The effect of adding metal salts in proteins with different degrees of hydrophobicity was confirmed.
  • four types of insoluble PRT410 HI: -0.81), PRT647 (HI: 0.04), PRT699 (HI: 0.17), PRT698 (HI: 0.43)
  • the body was confirmed to have a coagulation effect by adding metal salts (calcium chloride and magnesium chloride).
  • DNase 1.8 ⁇ g / g wet cell body and Lysozyme 164 ⁇ g / g wet cell body were added to the RO water suspension of E. coli BLR (DE3) expressing each insoluble material, and using a high-pressure homogenizer at room temperature and 600 bar.
  • the cells were treated 4 times with pressure to disrupt the cells.
  • calcium chloride or magnesium chloride was added to the crushed suspension so that the concentration was 10 to 150 mM, and the mixture was centrifuged at 2,680 ⁇ g for 10 seconds to confirm the state of aggregation.
  • FIG. 3 is a photograph of each sample when centrifuged at 2,680 ⁇ g for 10 seconds after the addition of the metal salt.
  • FIG. 4 is a photograph of each sample when centrifuged at 2,680 ⁇ g for 10 seconds after addition of the metal salt. As shown in FIG. 4, the effect of adding a metal salt was recognized as in Example 3. Moreover, as shown below, the purity of an insoluble matter can be improved by the said resuspension.
  • FIG. 5 and Table 6 show the results of improving the purity of the insoluble material by the addition of metal salt and the centrifuge resuspension operation.
  • FIG. 5 is a photograph showing the results (electrophoresis results) of SDS-PAGE analysis of each treatment solution of PRT410 obtained in Example 3 and Example 4.
  • lane 1 has a suspension of PRT410 (crushed suspension) immediately after disrupting the cells with a high-pressure homogenizer
  • lane 2 has 10 mM in the disrupted suspension.
  • Calcium chloride was added to the precipitate, and after precipitation, centrifuged at 2,500 ⁇ g for 5 minutes, and the resulting precipitate fraction, lane 3, was added with magnesium chloride to 10 mM in the crushed suspension. After precipitation, the mixture was centrifuged at 2,500 ⁇ g for 5 minutes, and the molecular weight marker protein was applied to the resulting precipitate fraction and M lane, respectively.
  • FIG. 5 A in FIG. 5 is stained with Oriole TM fluorescent gel stain (Bio-Rad) that can stain all proteins after migration, and FIG. 5B is the His tag region of PRT410 after migration. It is stained with a reacting InVision (trademark) His-tagged in-gel staining reagent (Thermo Fisher Scientific). PRT410 having a theoretical molecular weight of 53.6 kDa was detected as a band at a position close to a molecular weight marker of 60 kDa.
  • Oriole TM fluorescent gel stain Bio-Rad
  • FIG. 5B is the His tag region of PRT410 after migration. It is stained with a reacting InVision (trademark) His-tagged in-gel staining reagent (Thermo Fisher Scientific). PRT410 having a theoretical molecular weight of 53.6 kDa was detected as a band at a position close to a molecular weight marker of 60 kDa.
  • the purity of the precipitate fraction obtained without adding the metal salt was 10.5%, it could be aggregated and precipitated more compactly with the addition of the metal salt.
  • the purity could be improved to 34.1% by adding magnesium chloride (see lanes 1 to 3 in FIG. 5, Table 6 (immediately after crushing)).
  • lane 4 has a crushed suspension (lane 1) precipitated by centrifugation at 11,000 ⁇ g, 20 ° C. for 5 minutes, and the resulting precipitate fraction is shown.
  • lane 5 calcium chloride was added to the centrifuge resuspension to 10 mM, and 2,500 ⁇ g. Centrifugation was performed at a low speed centrifugation for 5 minutes, and the resulting precipitate fraction, lane 6, was added with magnesium chloride to 10 mM to the centrifuge resuspension, and 2,500 ⁇ g for 5 minutes.
  • This metal salt addition method was confirmed to be not only extremely effective for insoluble aggregation, but also an effective means for removing host cell-derived impurities.
  • the recovery was measured by measuring the absorbance at 595 nm with a microplate reader (TECAN, Infinite F200), and measuring the absorbance before centrifugation at 0%, 11,000 ⁇ g, 10 minutes, and the absorbance of the supernatant after 100 minutes. Calculated as a percentage.
  • the method for adding the metal salt is not limited to the type as long as it is an insoluble protein, and the insoluble matter is aggregated as well as derived from the host cell regardless of whether the insoluble form is a compact insoluble granule. It was confirmed that this is an extremely effective method for removing impurities and an excellent method capable of recovering insoluble matter with a very high yield.
  • Example 5 Effect of acid addition 1] DNase (SIGMA-ALDRICH) 1.8 ⁇ g / g wet cells and Lysozyme (Thermo Fisher Scientific) in an aqueous RO suspension of E. coli BLR (DE3) expressing PRT853 (HI: -0.68) as an insoluble material ) was added 164 ⁇ g / g wet cells and treated with a high-pressure homogenizer (GEA, Panda plus) four times at room temperature and a pressure of 600 bar to obtain a disrupted suspension of the cells.
  • DNase SIGMA-ALDRICH
  • Lysozyme Thermo Fisher Scientific
  • FIG. 6 is a photograph of each sample after centrifugation.
  • insoluble materials could not be obtained by sedimentation under the low-speed centrifugation conditions.
  • this low-speed centrifugation was performed at any concentration of acid shown in Table 8. Under the conditions, insoluble aggregates could be obtained (Samples 2 to 10).
  • Example 6 Effect of addition of acid on proteins with different HI
  • PRT410 HI: -0.81
  • PRT647 HI: 0.04
  • PRT699 HI: 0.17
  • PRT698 HI: 0.43
  • 5 to 30 mM citric acid was added, and the insoluble aggregation effect was confirmed as follows.
  • DNase 1.8 ⁇ g / g wet cell body and Lysozyme 164 ⁇ g / g wet cell body were added to the RO water suspension of E. coli BLR (DE3) expressing each insoluble material, and using a high-pressure homogenizer at room temperature and 600 bar. The cells were treated 4 times with pressure to disrupt the cells. After crushing, citric acid was added to the crushing suspension to 5 to 30 mM and centrifuged at 2,500 ⁇ g for 30 seconds to confirm the state of aggregation.
  • FIG. 8 is a photograph of each sample after centrifugation.
  • H is a sample obtained by centrifuging a suspension without addition of citric acid at 11,000 ⁇ g for 5 minutes.
  • FIG. 9 is a photograph showing the result (electrophoresis result) of each processing solution of PRT410 analyzed by SDS-PAGE.
  • the molecular weight marker protein is added to the M lane, the acid-free disrupted suspension is added to the lane 1, and 10 mM citric acid is added to the disrupted suspension. The protein concentration was applied to 1.5 ⁇ g.
  • 2 of OrioleTM fluorescent gel stain Bio-Rad
  • InVisionTMHis-tagged in-gel staining reagent Thermo Fisher Scientific
  • PRT410 having a theoretical molecular weight of 53.6 kDa was detected as a band at a position close to a molecular weight marker of 60 kDa.
  • the purity of the precipitate fraction obtained without addition of acid was 11.6%, but it could be aggregated and precipitated compactly by addition of acid, so that the purity could be improved to 23.7%. (See FIG. 9).
  • This acid addition method was confirmed not only to be extremely effective for insoluble aggregation, but also to be an effective means for removing host cell-derived impurities.
  • the acid addition method is not limited to the type as long as it is an insoluble protein, and insoluble matter aggregation and host cell-derived impurities are used regardless of whether the insoluble matter is present in the form of compact insoluble granules. It has been confirmed that this is an excellent method that is an extremely effective means for removing water and that can recover an insoluble material in an extremely high yield.
  • Example 7 Lipopolysaccharide (LPS) removal effect
  • Escherichia coli used as a host cell LPS called endotoxin derived from the cell wall peculiar to Gram-negative bacteria exists. If the endotoxin is present in excess, it is known to have effects such as fever, multiple organ failure, and tachycardia, and it is preferable to reduce it.
  • the LPS content in the insoluble material aggregated by addition of the metal salt or acid of the present invention was measured, and the effect of reducing LPS was confirmed.
  • Metal salt and insoluble material (1) to which no acid was added were obtained by the following method. That is, DNase (SIGMA-ALDRICH) 1.8 ⁇ g / g wet cells and Lysozyme (Thermo Fisher Scientific) 164 ⁇ g / g wet cells were added to the RO water suspension of E. coli BLR (DE3) expressing PRT853.
  • the cells were crushed by using a high-pressure homogenizer (GEA, Panda plus) four times at room temperature and a pressure of 600 bar. After crushing, it was treated at 11,000 ⁇ g for 20 minutes using a centrifuge (TOMY MX-305). The precipitate fraction was again suspended in RO water and treated at 11,000 ⁇ g for 30 minutes. This washing operation was performed twice. The obtained precipitate fraction was suspended again in RO water and treated at 11,000 ⁇ g for 60 minutes to obtain insoluble matter (1) as the precipitate fraction.
  • the insoluble material (1) was obtained at 20 ° C.
  • the insoluble material (2) aggregated by the addition of metal salt was obtained by the following method. That is, it processed by the high pressure homogenizer 4 times, and it carried out by the method similar to the above until it disrupted a microbial cell. After crushing, 10 mM calcium chloride was added to agglomerate the insoluble material and treated with 2,500 ⁇ g for 10 minutes. The obtained precipitate fraction was suspended again in RO water and treated with 2,500 ⁇ g for 10 minutes. This washing operation was performed twice to obtain an insoluble material (2) by adding a metal salt as a precipitate fraction.
  • the insoluble material (3) aggregated by acid addition was obtained by the following method. That is, instead of adding a metal salt, an insoluble material (3) obtained by acid addition was obtained in the same manner as that for obtaining the insoluble material (2) to which metal salt was added, except that 10 mM citric acid was added.
  • the LPS content in these three types of insolubles was measured by the following method.
  • A Preparation of measurement sample About 75 mg of the above three types of insoluble samples (insoluble matter (1) 75.5 mg, insoluble matter (2) 75.1 mg, insoluble matter (3) 75.0 mg) were weighed, and 50 mg / Distilled water for injection (Otsuka Pharmaceutical Factory Co., Ltd.) was added to make a mL to prepare a suspension. After stirring with a vortex mixer, the pH was confirmed, and 5N sodium hydroxide aqueous solution (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was added to adjust to neutral. The insoluble sample was heat-treated at 90 using a block heater for 20 minutes. After heat dissipation, centrifugation was performed at 10,000 rpm for 10 minutes, and the supernatant was collected and used as a measurement stock solution.
  • LPS content was reduced in insoluble materials (2) and (3) aggregated by adding metal salts or acids compared to insoluble material (1) obtained without adding them. It was done. In particular, LPS content was extremely low in the insoluble material (3) obtained by aggregation with acid.
  • the method of aggregating and obtaining the insoluble material by adding a metal salt or acid was an excellent method capable of reducing the LPS content.
  • E. coli BLR E. coli BLR
  • PRT853 HI: ⁇ 0.68
  • the cells were treated four times at a pressure of 600 bar at room temperature to disrupt the cells and obtain a disrupted suspension.
  • the flocculant shown in Table 12 is added to the crushed suspension to 0.05%, and the insoluble granules are settled by standing or centrifuging (2,680 ⁇ g for 10 seconds). Checked the situation. The results are shown in FIG. Only an anionic polyacrylate-based flocculant (Klifam PA-896) was able to effectively precipitate insoluble granules in both cases of standing and centri
  • Example 9 Purity Improvement Effect by Anionic Flocculant
  • the anionic flocculant Cryfarm PA-896 for which the aggregation effect was confirmed in Example 8 the effect of adding the cells to the disrupted suspension and the centrifuge resuspension was confirmed.
  • This centrifuge resuspension is a suspension obtained by centrifuging a crushed suspension at 11,000 ⁇ g and 20 ° C. for 5 minutes, and resuspending the obtained precipitate fraction in RO water.
  • a disrupted suspension of bacterial cells was obtained in the same manner as in Example 8, except that E. coli BLR (DE3) expressing PRT410 (HI: -0.81) as insoluble granules was used.
  • lane 1 has a suspension of PRT410 (crushed suspension) immediately after disrupting the cells with a high-pressure homogenizer, and lane 2 has 0.01% of the disrupted suspension.
  • Lane 3 contains 11,000 ⁇ of the crushed suspension (lane 1). g, sedimentation by centrifugation at 20 ° C.
  • Example 10 Effect of acid addition, heating and stirring
  • DNase 1.8 ⁇ g / g wet cells and lysozyme 164 ⁇ g / g wet cells were added to the RO water suspension of E. coli BLR (DE3) expressing PRT410, and using a high-pressure homogenizer at room temperature and a pressure of 600 bar. The cells were treated 4 times to disrupt the cells. After crushing, the mixture was centrifuged at 2,500 ⁇ g for 10 minutes, the supernatant was discarded and adjusted to 2.5-fold concentration, and the concentrate was diluted 2.5 times with RO water.
  • Citric acid was added to the crushed suspension so as to be 20 mM, and then heated and stirred as necessary to obtain aggregates.
  • Each sample was processed according to the conditions described in Table 14. Heating was performed using a hot tub, and the heating time was the maintenance time from when the hot tub reached 80 ° C. Stirring was performed at 200 rpm.
  • the obtained aggregates were measured for particle concentration and median diameter using a particle size analyzer CDA-1000 (Sysmex Corporation). The results are shown in Table 14.
  • FIG. 12 shows the frequency distribution and cumulative distribution of the median diameter.
  • Example 11 Effect of improving filterability by acid type
  • the effect of improving filterability by adding an acid was confirmed. Since it was confirmed that filtration was possible by addition of an acid, the effect of improving the filterability by the type of acid was compared for three types of acids: citric acid, hydrochloric acid, and sulfuric acid.
  • the experimental method was the same as Example 10 except that the acid was different.
  • the acid treatment is performed by heating and stirring at 80 ° C. for 2 hours.
  • Tables 15 and 16 show examples of the results regarding the relationship between the maximum filtration amount and the filtration time and the permeation flux. As a result of the comparison, it was confirmed that citric acid was industrially excellent because the maximum filtration amount of citric acid was the largest and the permeation flux was stable.
  • FIG. 13 and FIG. 14 are photographs showing the results (electrophoresis results) of analysis of each treatment solution of PRT799 and PRT587 by SDS-PAGE. Each treatment solution was adjusted to pH 3.75 by adding citric acid.
  • a crushed suspension heated at 80 ° C. for 3 hours was applied to lane 1, and a crushed suspension that was not heated was applied to lane 2. It was confirmed that the crushed suspension in lane 1 was decomposed by heating.
  • lane 1 was applied with a non-heated crushed suspension
  • lane 2 was applied with a crushed suspension heated at 80 ° C. for 2 hours. It was confirmed that the band near the 40 kDa molecular marker was decomposed, and the detection intensity of the band (target protein) detected in the vicinity of the 100 kDa molecular marker in lane 2 was compared with the band in lane 1 that was not heated. Since it was detected at 1.2 times, the purity of the target protein was confirmed to be improved by heating.
  • Example 13 Effect of continuous heating
  • E. coli BLR E. coli BLR (DE3) expressing PRT799
  • DNase was added at 1.8 ⁇ g / g wet cell body and Lysozyme at 164 ⁇ g / g wet cell body, and using a high-pressure homogenizer at room temperature, The cells were crushed four times at a pressure of 600 bar. After crushing, use a centrifuge (TOMY MX-305), centrifuge at 2,500 xg for 10 minutes, discard the supernatant, adjust to 2.5-fold concentration, and then concentrate the concentrate with RO water. Diluted 2.5 times.
  • Citric acid was added to the crushed suspension so as to be 20 mM, and then heated to obtain an aggregate.
  • Each sample was processed according to the conditions described in Table 17. Heating is performed using a liquid continuous sterilizer MINI UHT T-20 (manufactured by Powerpoint International), and the heating temperature is 80 ° C., 85 ° C., 90 ° C., or 95 ° C. Performed in 30 or 60 seconds.
  • the obtained aggregates were measured for particle concentration and median diameter using a particle size analyzer CDA-1000 (Sysmex Corporation). The results are shown in Table 17. 14 and 15 show the frequency distribution and cumulative distribution of the median diameter.
  • the aggregate obtained using the liquid continuous sterilizer MINI UHT T-20 (manufactured by Powerpoint International) has a particle size equal to or larger than that of the aggregate obtained by heating in a hot tub. It was.
  • Table 18 shows the results of the filtration area and the maximum filtration amount of Samples X, 5, 6, 7, and 8. According to Table 18, the filterability when heated at high temperature for a short time using a liquid continuous sterilizer is about the same as or higher than when heated for 2 hours using a hot tub, and the crushed suspension It was confirmed that the filterability was improved by heating at a high temperature for a short time.

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Abstract

本発明は、目的とする組換えタンパク質を不溶体として細胞内に発現している組換え細胞から、当該組換えタンパク質の不溶体を効率よく分離する方法を提供することを目的とする。本発明は、組換えタンパク質を不溶体として細胞内に発現している組換え細胞から、当該組換えタンパク質の不溶体を分離する方法であって、組換え細胞を破砕後に、組換えタンパク質の不溶体を凝集させ、分離することを含む、製造方法を提供する。

Description

不溶性組換えタンパク質凝集体の製造方法
　本発明は、不溶性組換えタンパク質を発現する組換え細胞から、当該組換えタンパク質の不溶体を分離する方法によって不溶性組換えタンパク質凝集体を製造する方法、及び、該方法によって得られた不溶性組換えタンパク質凝集体に関する。
　目的とするタンパク質の工業規模での生産は、遺伝子組換え宿主細胞を利用して可能になっている。組換え細胞により生産された組換えタンパク質を単離、精製する方法も多数報告されている。
　組換え細胞内に組換えタンパク質が不溶体としてコンパクトに不溶性顆粒として生成された場合、宿主細胞由来のタンパク質等の成分を含む懸濁液を遠心分離することより、当該不溶性顆粒を比較的高収率及び高純度で単離することが可能である。例えば、目的とするタンパク質を、水酸化ナトリウム等の金属水酸化物によって可溶化した不溶性の組換え細胞から単離する方法（特許文献１）等が報告されている。
　一方、組換えタンパク質が組換え細胞内で可溶化状態、あるいは不溶体であっても、コンパクトな不溶性顆粒とは異なり、遠心分離により分離することが困難である場合には、例えば、以下の精製方法が報告されている。すなわち、ギ酸やプロピオン酸等の有機酸で宿主細胞由来のタンパク質を加水分解処理し、宿主細胞由来の不溶性物質を遠心分離等で除去後、目的とする組換えタンパク質を未変性状態で回収し、クロマトグラフィー等の手法で精製する方法（特許文献２）等が報告されている。当該報告において、目的タンパク質は当該有機酸を添加されても未変性状態のままであり、凝集することはない。
　組換え細胞内で、目的とする組換えタンパク質が必ず不溶性顆粒として生成されるわけではなく、目的とする組換えタンパク質自体の性質、あるいは生産時の培地組成、培養温度、生成速度等の培養過程の様々なパラメーターにより、不溶性顆粒の生成状況は大きく変わることが知られている。そのため、できるだけ容易に遠心分離可能な大きな不溶性顆粒を生成するよう、組換えタンパク質の改変、あるいは効率的な生産方法の開発に研究は向けられている。
　一方で、遠心分離が困難あるいは非常に時間のかかるような微細な不溶体、あるいは不溶性顆粒を容易に遠心分離、濾過等で分離することのできる方法があれば極めて工業的に有益であるが、そのような方法は知られていない。
特表２０１３－５２３６６５号公報 特表２００４－５０３２０４号公報
　本発明は、目的とする組換えタンパク質を不溶体として細胞内に発現している組換え細胞から、当該組換えタンパク質の不溶体を効率よく分離する方法、及び該分離方法によって組換えタンパク質凝集体を製造する方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、遠心分離が困難、又は非常に時間のかかるような、微細な組換えタンパク質の不溶体又は不溶性顆粒を容易に分離することのできる方法を鋭意検討した結果、効率的に当該不溶体又は不溶性顆粒を凝集させ巨大化させることにより、容易に組換えタンパクを分離できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　即ち、本発明は、例えば、以下の各発明に関する。
［１］　組換えタンパク質を不溶体として細胞内に発現している組換え細胞から、当該組換えタンパク質の不溶体を凝集体として分離し、組換えタンパク質凝集体を製造する方法であって、
　組換え細胞を破砕後に、組換えタンパク質の不溶体を凝集させ、得られた凝集体を分離することを含む、組換えタンパク質凝集体の製造方法。
［２］　上記組換えタンパク質凝集体を、１０，０００×ｇ以下の遠心力で分離することを含む、［１］に記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
［３］　上記組換えタンパク質凝集体を、分離板型遠心分離機、バスケット型遠心分離機及びデカンタ型遠心分離機からなる群より選ばれる遠心分離機で分離することを含む、［１］又は［２］に記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
［４］　上記組換えタンパク質凝集体を、自然沈降又は濾過により分離することを含む、［１］に記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
［５］　上記組換えタンパク質の不溶体の凝集が、金属塩、酸及びアニオン性凝集剤からなる群から選ばれる１種以上を添加することにより行われる、［１］～［４］のいずれかに記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
［６］　以下（Ａ）～（Ｃ）の工程を含む、組換えタンパク質凝集体の製造方法。
　（Ａ）目的とする組換えタンパク質を不溶体として細胞内に発現している組換え細胞を破砕して、組換えタンパク質の不溶体を含む破砕懸濁液を得る工程
　（Ｂ）（Ａ）工程で得られた破砕懸濁液に金属塩、酸及びアニオン性凝集剤からなる群から選ばれる１種以上を添加し、組換えタンパク質の不溶体を凝集させ、組換えタンパク質凝集体を得る工程
　（Ｃ）（Ｂ）工程で得られた凝集体を懸濁液から分離する工程
［７］　上記（Ｂ）工程において、さらに加熱することを含む、［６］に記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
［８］　上記（Ｂ）工程において、さらに撹拌することを含む、請求項７記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
［９］　上記金属塩が、アルカリ土類金属塩及び土類金属塩からなる群から選ばれる金属塩である、［５］～［８］のいずれかに記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
［１０］　上記金属塩が、アルカリ土類金属ハロゲン化物、アルカリ土類金属硝酸塩、アルカリ土類金属硫酸塩、土類金属ハロゲン化物、土類金属硝酸塩及び土類金属硫酸塩からなる群から選ばれる金属塩である、［９］に記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
［１１］　上記酸が、オキソ酸である、［５］～［１０］のいずれかに記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
［１２］　上記オキソ酸が、酢酸、硫酸及びクエン酸からなる群から選ばれるオキソ酸である、［１１］に記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
［１３］　上記アニオン性凝集剤が、ポリアクリル酸塩、アニオン性ポリアクリルアミド及びアクリルアミド・アクリル酸塩共重合体からなる群より選ばれるアニオン性凝集剤である、［５］～［１２］のいずれかに記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
［１４］　上記組換え細胞の破砕が機械的破砕である、［１］～［１３］のいずれかに記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
［１５］　上記組換えタンパク質凝集体の分離が、濾過により行われる、［１］及び［６］～［１４］のいずれかに記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
［１６］　上記組換え細胞が、細菌、酵母、糸状真菌、昆虫細胞、植物細胞及び動物細胞からなる群から選ばれる宿主を形質転換した組換え細胞である、［１］～［１５］のいずれかに記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
［１７］　上記組換えタンパク質が、構造タンパク質である、［１］～［１６］のいずれかに記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
［１８］　上記構造タンパク質が、ケラチン、コラ－ゲン、エラスチン、レシリン、カイコシルク及びスパイダーシルクからなる群から選ばれるタンパク質由来のタンパク質である、［１７］に記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
［１９］　得られた組換えタンパク質凝集体の、電気的検知帯法によって測定した粒子径が４μｍ以上５０μｍ以下である、［１］～［１８］のいずれかに記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
［２０］　［１］～［１８］のいずれかに記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法によって得られた組換えタンパク質凝集体であって、電気的検知帯法によって測定した粒子径が４μｍ以上５０μｍ以下である、組換えタンパク質凝集体。
［２１］　組換えタンパク質を不溶体として細胞内に発現している組換え細胞から、当該組換えタンパク質の不溶体を分離する方法であって、
　組換え細胞を破砕後に、組換えタンパク質の不溶体を凝集させ、得られた凝集体を分離することを含む、組換えタンパク質の分離方法。
［２２］　上記組換えタンパク質凝集体を、１０，０００×ｇ以下の遠心力で分離することを含む、［２１］に記載の組換えタンパク質の分離方法。
［２３］　上記組換えタンパク質凝集体を、分離板型遠心分離機、バスケット型遠心分離機及びデカンタ型遠心分離機からなる群より選ばれる遠心分離機で分離することを含む、［２１］又は［２２］に記載の組換えタンパク質の分離方法。
［２４］　上記組換えタンパク質凝集体を、自然沈降又は濾過により分離することを含む、［２１］に記載の組換えタンパク質の分離方法。
［２５］　上記組換えタンパク質の不溶体の凝集が、金属塩、酸及びアニオン性凝集剤からなる群から選ばれる１種以上を添加することにより行われる、［２１］～［２４］のいずれかに記載の組換えタンパク質の分離方法。
［２６］　以下（Ａ）～（Ｃ）の工程を含む、組換えタンパク質の分離方法。
　（Ａ）目的とする組換えタンパク質を不溶体として細胞内に発現している組換え細胞を破砕して、組換えタンパク質の不溶体を含む破砕懸濁液を得る工程
　（Ｂ）（Ａ）工程で得られた破砕懸濁液に金属塩、酸及びアニオン性凝集剤からなる群から選ばれる１種以上を添加し、組換えタンパク質の不溶体を凝集させ、組換えタンパク質凝集体を得る工程
　（Ｃ）（Ｂ）工程で得られた凝集体を懸濁液から分離する工程
［２７］　（Ｂ）工程において、さらに加熱することを含む［２６］に記載の組換えタンパク質の分離方法。
［２８］　（Ｂ）工程において、さらに撹拌することを含む［２７］に記載の組換えタンパク質の分離方法。
［２９］　上記金属塩が、アルカリ土類金属塩及び土類金属塩からなる群から選ばれる金属塩である［２５］～［２８］のいずれかに記載の組換えタンパク質の分離方法。
［３０］　上記金属塩が、アルカリ土類金属ハロゲン化物、アルカリ土類金属硝酸塩、アルカリ土類金属硫酸塩、土類金属ハロゲン化物、土類金属硝酸塩及び土類金属硫酸塩からなる群から選ばれる金属塩である、［２９］に記載の組換えタンパク質の分離方法。
［３１］　上記酸が、オキソ酸である、［２５］～［３０］のいずれかに記載の組換えタンパク質の分離方法。
［３２］　上記オキソ酸が、酢酸、硫酸及びクエン酸からなる群から選ばれるオキソ酸である、［３１］に記載の組換えタンパク質の分離方法。
［３３］　上記アニオン性凝集剤が、ポリアクリル酸塩、アニオン性ポリアクリルアミド及びアクリルアミド・アクリル酸塩共重合体からなる群より選ばれるアニオン性凝集剤である、［２５］～［３２］のいずれかに記載の組換えタンパク質の分離方法。
［３４］　上記組換え細胞の破砕が機械的破砕である、［２１］～［３３］のいずれかに記載の組換えタンパク質の分離方法。
［３５］　上記組換えタンパク質凝集体の分離が、濾過により行われる、［２１］及び［２６］～［３４］のいずれかに記載の組換えタンパク質の分離方法。
［３６］　上記組換え細胞が、細菌、酵母、糸状真菌、昆虫細胞、植物細胞及び動物細胞からなる群から選ばれる宿主を形質転換した組換え細胞である、［２１］～［３５］のいずれかに記載の組換えタンパク質の分離方法。
[３７]　上記組換えタンパク質が、構造タンパク質である、［２１］～［３６］のいずれかに記載の組換えタンパク質の分離方法。
［３８］　上記構造タンパク質がケラチン、コラ－ゲン、エラスチン、レシリン、カイコシルク及びスパイダーシルクからなる群から選ばれるタンパク質由来のタンパク質である、［３７］に記載の組換えタンパク質の分離方法。
［３９］　［１～３８］のいずれかに記載の分離方法を用いて組換えタンパク質凝集体を製造する方法であって、該分離方法によって得られた組換えタンパク質凝集体の、電気的検知帯法によって測定した粒子径が４μｍ以上５０μｍ以下である組換えタンパク質凝集体の製造方法。
　本発明の組換えタンパク質凝集体の製造方法によれば、不溶体を凝集させ巨大化させることができるため、目的とする組換えタンパク質を不溶体として細胞内に発現している組換え細胞から、当該組換えタンパク質の不溶体を、例えば自然沈降、遠心分離又は濾過によって効率よく分離することによって、組換えタンパク質凝集体を製造することができる。さらに、これまで遠心分離、濾過等によって容易に分離できなかった、組換えタンパク質の不溶体又は不溶性顆粒が容易に分離できるのみならず、分離した組換えタンパク質の純度を向上させることができる。本発明によればこのような予想外の効果が奏される。
図１は、実施例１の金属塩添加による不溶体の凝集効果を検討した結果を示す写真である。 図２は、実施例２の金属塩添加による不溶体の凝集効果を検討した結果を示す写真である。 図３は、実施例３の、金属塩添加によるハイドロパシーインデックスの異なるタンパク質の不溶体の凝集効果を検討した結果を示す写真である。 図４は、実施例４の、金属塩添加によるハイドロパシーインデックスの異なるタンパク質の不溶体の凝集効果を検討した結果を示す写真である。 図５は、実施例４の、金属塩添加凝集に基づく目的とする組換えタンパク質の純度向上に関する、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）による分析の結果を示す写真である。Ａは、泳動後、全てのタンパク質を染色可能なＯｒｉｏｌｅ（商標）蛍光ゲルステイン（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）で染色したものであり、Ｂは、泳動後、ＰＲＴ４１０のＨｉｓタグ領域に反応するＩｎＶｉｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｓタグ付きゲル内染色試薬（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で染色したものである。 図６は、実施例５の、酸添加による不溶体の凝集効果を検討した結果を示す写真である。 図７は、実施例５の、洗浄した後の不溶体における、酸添加による不溶体の凝集効果を検討した結果を示す写真である。 図８は、実施例６の、酸添加によるハイドロパシーインデックスの異なるタンパク質の不溶体の凝集効果を検討した結果を示す写真である。 図９は、実施例６の、酸添加凝集に基づく目的とする組換えタンパク質の純度向上に関する、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析の結果を示す写真である。 図１０は、実施例８の、凝集剤添加による不溶体の凝集効果を検討した結果を示す写真である。 図１１は、実施例９の、アニオン性凝集剤添加凝集に基づく目的とする組換えタンパク質の純度向上に関する、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析の結果を示す写真である。 図１２は、実施例１０の、凝集効果を確認するための粒子径の頻度分布及び累積分布を示す図である。 図１３は、実施例１２の、加熱に基づく夾雑タンパク質の分解に関する、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析の結果を示す写真である。 図１４は、実施例１２の、加熱に基づく目的とする組換えタンパク質の純度向上に関する、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析の結果を示す写真である。 図１５は、実施例１３の、連続加熱による凝集効果を確認するための、サンプルＣ、Ｘ、１、２、及び３の粒子径の頻度分布及び累積分布を示す図である。 図１６は、実施例１３の、連続加熱による凝集効果を確認するための、サンプル４、５、６、７、及び８の粒子径の頻度分布及び累積分布を示す図である。
　以下、本発明を実施するための形態について詳細に説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
　一実施形態に係る組換えタンパク質凝集体の製造方法は、組換えタンパク質を不溶体として細胞内に発現している組換え細胞から、当該組換えタンパク質の不溶体を凝集体として分離し、組換えタンパク質凝集体を製造する方法であって、組換え細胞を破砕後に、組換えタンパク質の不溶体を凝集させ、分離することを含むことを特徴とする。当該製造方法は、組換えタンパク質の不溶体の凝集が、金属塩、酸及びアニオン性凝集剤からなる群から選ばれる１種以上を添加することにより行われることが好ましい。
　別の実施形態に係る組換えタンパク質凝集体の製造方法は、以下（Ａ）～（Ｃ）の工程を含むことを特徴とする：
（Ａ）目的とする組換えタンパク質を不溶体として細胞内に発現している組換え細胞を破砕して、組換えタンパク質の不溶体を含む破砕懸濁液を得る工程
（Ｂ）（Ａ）工程で得られた破砕懸濁液に金属塩、酸及びアニオン性凝集剤からなる群から選ばれる１種以上を添加し、組換えタンパク質の不溶体を凝集させ、組換えタンパク質凝集体を得る工程
（Ｃ）（Ｂ）工程で得られた凝集体を懸濁液から分離する工程
（組換えタンパク質）
　本実施形態に係る組換えタンパク質凝集体の製造方法によって分離する不溶性組換えタンパク質（本明細書において、「目的とするタンパク質」という場合がある。）は、不溶体として下記の組換え細胞内にて発現される。組換えタンパク質としては、工業規模での製造が好ましい任意の不溶性タンパク質を挙げることができ、例えば、工業用に利用できるタンパク質、医療用に利用できるタンパク質、構造タンパク質等を挙げることができる。工業用又は医療用に利用できるタンパク質の具体例としては、酵素、制御タンパク質、受容体、ペプチドホルモン、サイトカイン、膜及び輸送タンパク質、予防接種に使用する抗原、ワクチン、抗原結合タンパク質、免疫刺激タンパク質、アレルゲン、完全長抗体及び抗体フラグメント並びにこれらの誘導体を挙げることができる。構造タンパク質の具体例としては、ケラチン、コラ－ゲン、エラスチン、レシリン、カイコシルク及びスパイダーシルク、並びにこれら由来のタンパク質等を挙げることができる。
　フィブロイン様タンパク質であるスパイダーシルク又はカイコシルク由来のタンパク質として、例えば、式１：［（Ａ）ｎモチーフ－ＲＥＰ］ｍで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式１中、（Ａ）ｎモチーフは４～２０アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示し、かつ（Ａ）ｎモチーフ中の全アミノ酸残基数に対するアラニン残基数が８０％以上である。ＲＥＰは１０～２００アミノ酸残基から構成されるアミノ酸配列を示す。ｍは８～３００の整数を示す。複数存在する（Ａ）ｎモチーフは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。複数存在するＲＥＰは、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。具体的には、配列番号１（ＰＲＴ４１０）、配列番号２（ＰＲＴ８５３）、配列番号３（ＰＲＴ６４７）、配列番号４（ＰＲＴ６９９）、及び配列番号５（ＰＲＴ６９８）で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質等を挙げることができる。これらのタンパク質のハイドロパシーインデックスはそれぞれ－０．８１、－０．６８、０．０４、０．１７、及び０．４３である。ハイドロパシーインデックスの値は国際公開第２０１４／１０３８４６号に記載の方法に従って算出した値である。
　コラーゲン由来のタンパク質として、例えば、式２：［ＲＥＰ２］ｏで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式２中、ｏは５～３００の整数を示す。ＲＥＰ２はＧｌｙ一Ｘ一Ｙから構成されるアミノ酸配列を示し、Ｘ及びＹはＧｌｙ以外の任意のアミノ酸残基を示す。複数存在するＲＥＰ２は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。具体的には、配列番号６で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質（Ｃｏｌｌａｇｅｎ－ｔｙｐｅ４－Ｋａｉ）を挙げることができる。配列番号６で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したヒトのコラーゲンタイプ４の部分的な配列（ＮＣＢＩのＧｅｎBａｎｋのアクセッション番号：ＣＡＡ５６３３５．１、ＧＩ：３７０２４５２）のリピート部分及びモチーフに該当する３０１残基目から５４０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１０で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。Ｃｏｌｌａｇｅｎ－ｔｙｐｅ４－Ｋａｉのハイドロパシーインデックスは、－０．７５である。
　レシリン由来のタンパク質として、例えば、式３：［ＲＥＰ３］ｐで表されるドメイン配列を含むタンパク質（ここで、式３中、ｐは４～３００の整数を示す。ＲＥＰ３はＳｅｒ一Ｊ一Ｊ一Ｔｙｒ一Ｇｌｙ一Ｕ－Ｐｒｏから構成されるアミノ酸配列を示す。Ｊは任意のアミノ酸残基を示し、特にＡｓｐ、Ｓｅｒ及びＴｈｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。Ｕは任意のアミノ酸残基を示し、特にＰｒｏ、Ａｌａ、Ｔｈｒ及びＳｅｒからなる群から選ばれるアミノ酸残基であることが好ましい。複数存在するＲＥＰ３は、互いに同一のアミノ酸配列でもよく、異なるアミノ酸配列でもよい。）を挙げることができる。具体的には配列番号７で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号７で示されるアミノ酸配列は、レシリン（ＮＣＢＩのＧｅｎBａｎｋのアクセッション番号ＮＰ＿６１１１５７．１、Ｇｌ：２４６５４２４３）のアミノ酸配列において、８７残基目のＴｈｒをＳｅｒに置換し、かつ９５残基目のＡｓｎをＡｓｐに置換した置換した配列の１９残基目から３２１残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１０で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。Ｒｅｓｉｌｉｎ－Ｋａｉ（配列番号７）のハイドロパシーインデックスは、－１．２２である。
　エラスチン由来のタンパク質として、例えば、ＮＣＢＩのＧｅｎBａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５（ヒト）、Ｉ４７０７６（ヒツジ）、ＮＰ７８６９６６（ウシ）等のアミノ酸配列を有するタンパク質を挙げることができる。具体的には、配列番号８で示されるアミノ酸配列を含むタンパク質を挙げることができる。配列番号８で示されるアミノ酸配列は、ＮＣＢＩのＧｅｎBａｎｋのアクセッション番号ＡＡＣ９８３９５のアミノ酸配列の１２１残基目から３９０残基目までのアミノ酸配列のＮ末端に配列番号１０で示されるアミノ酸配列（タグ配列及びヒンジ配列）が付加されたものである。ｅｌａｓｔｉｎ　ｓｈｏｒｔ（配列番号８）のハイドロパシーインデックスは、０．４２である。
　ケラチン由来のタンパク質として、例えば、カプラ・ヒルクス（Ｃａｐｒａ　ｈｉｒｃｕｓ）のタイプＩケラチン等を挙げることができる。具体的には、配列番号９で示されるアミノ酸配列（ＮＣＢＩのＧｅｎBａｎｋのアクセッション番号ＡＣＹ３０４６６のアミノ酸配列）を含むタンパク質を挙げることができる。ｔｙｐｅ　Ｉ　ｋｅｒａｔｉｎ　２６（配列番号９）のハイドロパシーインデックスは、－０．５３である。
（組換え細胞）
　本実施形態における組換え細胞は、組換えタンパク質を不溶体として細胞内に発現している組換え細胞であり、遺伝子工学的手法を用いた一般的な方法を用いて取得できる。
　組換え細胞は、例えば、目的とするタンパク質をコードする核酸配列と、当該核酸配列に作動可能に連結された１又は複数の調節配列とを有する発現ベクターで宿主（宿主細胞）を形質転換することにより得ることができる。
　調節配列は、宿主における組換えタンパク質の発現を制御する配列（例えば、プロモータ、エンハンサー、リボソーム結合配列、転写終結配列等）であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。発現ベクターの種類は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、コスミドベクター、フォスミドベクター、人工染色体ベクター等、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。
　宿主として、原核生物、並びに酵母、糸状真菌、昆虫細胞、動物細胞及び植物細胞等の真核生物のいずれも好適に用いることができる。細菌、酵母、糸状真菌、昆虫細胞、植物細胞及び動物細胞であることがより好ましい。例えば原核生物の好ましい例として、大腸菌、バチルス・ズブチリス、シュードモナス、コリネバクテリウム、ラクトコッカス等を挙げることができ、より好ましくは、大腸菌細胞を挙げることができる。
　発現ベクターとしては、宿主細胞において自立複製が可能、又は宿主の染色体中への組込みが可能で、目的とするタンパク質をコードする核酸を転写できる位置にプロモータを含有しているものが好適に用いられる。リボソーム結合配列、転写終結配列、又はプロモータを制御する遺伝子配列が含まれていてもよい。
　プロモータとして、宿主細胞中で機能し、目的とするタンパク質を発現誘導可能な誘導性プロモータであればよい。誘導性プロモータは、誘導物質（発現誘導剤）の存在、リプレッサー分子の非存在、又は温度、浸透圧若しくはｐＨ値の上昇若しくは低下等の物理的要因により、転写を制御できるプロモータである。
　原核生物の宿主としては、エシェリヒア属、ブレビバチルス属、セラチア属、バチルス属、ミクロバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属及びシュードモナス属等に属する微生物を挙げることができる。
　エシェリヒア属に属する微生物として、例えば、エシェリヒア・コリ　ＢＬ２１（ノバジェン社）、エシェリヒア・コリ　ＢＬ２１（ＤＥ３）（ライフテクノロジーズ社）、エシェリヒア・コリ　ＢＬＲ（ＤＥ３）（メルクミリポア社）、エシェリヒア・コリ　ＤＨ１、エシェリヒア・コリ　ＧＩ６９８、エシェリヒア・コリ　ＨＢ１０１、エシェリヒア・コリ　ＪＭ１０９、エシェリヒア・コリ　Ｋ５（ＡＴＣＣ　２３５０６）、エシェリヒア・コリ　ＫＹ３２７６、エシェリヒア・コリ　ＭＣ１０００、エシェリヒア・コリ　ＭＧ１６５５（ＡＴＣＣ　４７０７６）、エシェリヒア・コリ　Ｎｏ．４９、エシェリヒア・コリ　Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）（ノバジェン社）、エシェリヒア・コリ　ＴＢ１、エシェリヒア・コリ　Ｔｕｎｅｒ（ノバジェン社）、エシェリヒア・コリ　Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）　（ノバジェン社）、エシェリヒア・コリ　Ｗ１４８５、エシェリヒア・コリ　Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ　２７３２５）、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）　ＸＬ１－Ｂｌｕｅ、エシェリヒア・コリ　ＸＬ２－Ｂｌｕｅ等を挙げることができる。
　ブレビバチルス属に属する微生物として、例えば、ブレビバチルス・アグリ、ブレビバチルス・ボルステレンシス、ブレビバチルス・セントロポラスブレビバチルス・フォルモサス、ブレビバチルス・インボカツス、ブレビバチルス・ラチロスポラス、ブレビバチルス・リムノフィルス、ブレビバチルス・パラブレビス、ブレビバチルス・レウスゼリ、ブレビバチルス・サーモルバー、ブレビバチルス・ブレビス４７（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１２２３）、ブレビバチルス・ブレビス４７Ｋ（ＦＥＲＭ　ＢＰ－２３０８）、ブレビバチルス・ブレビス４７－５（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１６６４）、ブレビバチルス・ブレビス４７－５Ｑ（ＪＣＭ８９７５）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１（ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０８７）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１－Ｓ（ＦＥＲＭ　ＢＰ－６６２３）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＨＰＤ３１－ＯＫ（ＦＥＲＭ　ＢＰ－４５７３）、ブレビバチルス・チョウシネンシスＳＰ３株（Ｔａｋａｒａ社製）等を挙げることができる。
　セラチア属に属する微生物として、例えば、セラチア・リクエファシエンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｃｅ）ＡＴＣＣ１４４６０、セラチア・エントモフィラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｅｎｔｏｍｏｐｈｉｌａ）、セラチア・フィカリア（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｉｃａｒｉａ）、セラチア・フォンティコーラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｆｏｎｔｉｃｏｌａ）、セラチア・グリメシ（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｇｒｉｍｅｓｉｉ）、セラチア・プロテアマキュランス（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎｓ）、セラチア・オドリフェラ（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｏｄｏｒｉｆｅｒａ）、セラチア・プリムシカ（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｐｌｙｍｕｔｈｉｃａ）、セラチア・ルビダエ（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｒｕｂｉｄａｅａ）等を挙げることができる。
　バチルス属に属する微生物として、例えば、バチルス・サチラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）等を挙げることができる。
　ミクロバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム　ＡＴＣＣ１５３５４等を挙げることができる。
　ブレビバクテリウム属に属する微生物として、例えば、ブレビバクテリウム・ディバリカタム（コリネバクテリウム・グルタミカム）ＡＴＣＣ１４０２０、ブレビバクテリウム・フラバム（コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７）ＡＴＣＣ１３８２６、ＡＴＣＣ１４０６７、ブレビバクテリウム・インマリオフィラム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｍｍａｒｉｏｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６８、ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム（コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９）ＡＴＣＣ１３６６５、ＡＴＣＣ１３８６９、ブレビバクテリウム・ロゼウムＡＴＣＣ１３８２５、ブレビバクテリウム・サッカロリティカム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１４０６６、ブレビバクテリウム・チオゲニタリスＡＴＣＣ１９２４０、ブレビバクテリウム・アルバムＡＴＣＣ１５１１１、ブレビバクテリウム・セリヌムＡＴＣＣ１５１１２等を挙げることができる。
　コリネバクテリウム属に属する微生物として、例えば、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ６８７１、ＡＴＣＣ６８７２、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）ＡＴＣＣ１３０３２、コリネバクテリウム・グルタミカム　ＡＴＣＣ１４０６７、コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）ＡＴＣＣ１３８７０、コリネバクテリウム・アセトグルタミカムＡＴＣＣ１５８０６、コリネバクテリウム・アルカノリティカムＡＴＣＣ２１５１１、コリネバクテリウム・カルナエＡＴＣＣ１５９９１、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０２０，ＡＴＣＣ１３０３２，ＡＴＣＣ１３０６０、コリネバクテリウム・リリウムＡＴＣＣ１５９９０、コリネバクテリウム・メラセコーラＡＴＣＣ１７９６５、コリネバクテリウム・サーモアミノゲネスＡＪ１２３４０（ＦＥＲＭＢＰ－１５３９）、コリネバクテリウム・ハーキュリスＡＴＣＣ１３８６８等を挙げることができる。
　シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属に属する微生物として、例えば、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・ブラシカセラム（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｒｕｍ）、シュードモナス・フルバ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｕｌｖａ）、及びシュードモナス・エスピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐ．）Ｄ－０１１０等を挙げることができる。
　上記原核生物の宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、上記宿主細胞へＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができる。例えば、カルシウムイオンを用いる方法〔Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　ＵＳＡ，６９，２１１０　（１９７２）〕、プロトプラスト法（特開昭６３－２４８３９４）、又はＧｅｎｅ，１７，１０７（１９８２）やＭｏｌｅｃｕｌａｒ　＆　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１６８，１１１（１９７９）に記載の方法等を挙げることができる。
　ブレビバチルス属に属する微生物の形質転換は、例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉらの方法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８３，１５６：１１３０－１１３４）や、Ｔａｋａｇｉらの方法（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９８９，５３：３０９９－３１００）、又はＯｋａｍｏｔｏらの方法（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９７，６１：２０２－２０３）により実施することができる。
　目的とするタンパク質をコードする核酸を導入するベクター（以下、単に「ベクター」という。）としては、例えば、ｐＢＴｒｐ２、ｐＢＴａｃ１、ｐＢＴａｃ２（いずれもベーリンガーマンハイム社より市販）、ｐＫＫ２３３－２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＳＥ２８０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、ｐＧＥＭＥＸ－１（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）、ｐＱＥ－８（ＱＩＡＧＥＮ社製）、ｐＫＹＰ１０（特開昭５８－１１０６００）、ｐＫＹＰ２００〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４８，６６９（１９８４）〕、ｐＬＳＡ１〔Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３，２７７（１９８９）〕、ｐＧＥＬ１〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２，４３０６（１９８５）〕、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ　ＳＫ（－）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）、ｐＴｒｓ３０〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３０（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０７）より調製〕、ｐＴｒｓ３２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９／ｐＴｒＳ３２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－５４０８）より調製〕、ｐＧＨＡ２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＩＧＨＡ２（ＦＥＲＭ　Ｂ－４００）より調製、特開昭６０－２２１０９１〕、ｐＧＫＡ２〔Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＩＧＫＡ２（ＦＥＲＭ　ＢＰ－６７９８）より調製、特開昭６０－２２１０９１〕、ｐＴｅｒｍ２（ＵＳ４６８６１９１、ＵＳ４９３９０９４、ＵＳ５１６０７３５）、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５、ｐＣ１９４、ｐＥＧ４００〔Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７２，２３９２（１９９０）〕、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）、ｐＥＴシステム（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）等を挙げることができる。
　宿主としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉを用いる場合は、ｐＵＣ１８、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ、ｐＳｕｐｅｘ、ｐＥＴ２２ｂ、ｐＣｏｌｄ等を好適なベクターとして挙げることができる。
　ブレビバチルス属に属する微生物に好適なベクターの具体例として、枯草菌ベクターとして公知であるｐＵＢ１１０、又はｐＨＹ５００（特開平２－３１６８２号公報）、ｐＮＹ７００（特開平４－２７８０９１号公報）、ｐＨＹ４８３１（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８７，１２３９－１２４５）、ｐＮＵ２００（鵜高重三、日本農芸化学会誌１９８７，６１：６６９－６７６）、ｐＮＵ１００（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９８９，３０：７５－８０）、ｐＮＵ２１１（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９２，１１２：４８８－４９１）、ｐＮＵ２１１Ｒ２Ｌ５（特開平７－１７０９８４号公報）、ｐＮＨ３０１（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９２，５８：５２５－５３１）、ｐＮＨ３２６、ｐＮＨ４００（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９９５，１７７：７４５－７４９）、ｐＨＴ２１０（特開平６－１３３７８２号公報）、ｐＨＴ１１０Ｒ２Ｌ５（Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９４，４２：３５８－３６３）、又は大腸菌とブレビバチルス属に属する微生物とのシャトルベクターであるｐＮＣＯ２（特開２００２－２３８５６９号公報）等を挙げることができる。
　原核生物を宿主とした場合のプロモータとしては、宿主細胞中で機能するものであれば制限されない。例えば、ｔｒｐプロモータ（Ｐｔｒｐ）、ｌａｃプロモータ、ＰＬプロモータ、ＰＲプロモータ、Ｔ７プロモータ等の大腸菌又はファージ等に由来するプロモータを挙げることができる。またＰｔｒｐを２つ直列させたプロモータ（Ｐｔｒｐ×２）、ｔａｃプロモータ、ｌａｃＴ７プロモータ、ｌｅｔ　Ｉプロモータのように人為的に設計改変されたプロモータ等も用いることができる。　リボソーム結合配列であるシャイン－ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列と開始コドンとの間を適当な距離（例えば６～１８塩基）に調節したプラスミドを用いることが好ましい。上記発現ベクターにおいて、上記核酸の発現には転写終結配列は必ずしも必要ではないが、目的とするタンパク質をコードする核酸の直下に転写終結配列を配置することが好ましい。
　真核生物の宿主としては、例えば、酵母、糸状真菌（カビ等）及び昆虫細胞を挙げることができる。
　酵母としては、例えば、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、シゾサッカロマイセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クリベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）属、シワニオミセス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）属、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属、ヤロウィア属及びハンゼヌラ属等に属する酵母を挙げることができる。より具体的には、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）、クリベロマイセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｌａｃｔｉｓ）、クリベロマイセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ　ｍａｒｘｉａｎｕｓ）、トリコスポロン・プルランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ　ｐｕｌｌｕｌａｎｓ）、シワニオマイセス・アルビウス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ　ａｌｌｕｖｉｕｓ）、シワニオマイセス・オシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ　ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、キャンディダ・ユーティリス（Ｃａｎｄｉｄａ　ｕｔｉｌｉｓ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ　ｐａｓｔｏｒｉｓ）ピキア・アングスタ（Ｐｉｃｈｉａ　ａｎｇｕｓｔａ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ　ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア・ポリモルファ（Ｐｉｃｈｉａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ピキア・スチピチス（Ｐｉｃｈｉａ　ｓｔｉｐｉｔｉｓ）、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ　ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）等を挙げることができる。
　酵母を宿主細胞として用いる場合の発現ベクターは通常、複製起点（宿主における増幅が必要である場合）及び大腸菌中でのベクターの増殖のための選抜マーカ、酵母における組換えタンパク質発現のためのプロモータ及びターミネータ、並びに酵母のための選抜マーカを含むことが好ましい。
　発現ベクターが非組込みベクターの場合、さらに自己複製配列（ＡＲＳ）を含むことが好ましい。これにより細胞内における発現ベクターの安定性を向上させることができる（Ｍｙｅｒｓ、Ａ．Ｍ．、ｅｔ　ａｌ．（１９８６）Ｇｅｎｅ　４５：２９９－３１０）。
　酵母を宿主として用いる場合のベクターとしては、例えば、ＹＥＰ１３（ＡＴＣＣ３７１１５）、ＹＥｐ２４（ＡＴＣＣ３７０５１）、ＹＣｐ５０（ＡＴＣＣ３７４１９）、ＹＩｐ、ｐＨＳ１９、ｐＨＳ１５、ｐＡ０８０４、ｐＨＩＬ３Ｏｌ、ｐＨＩＬ－Ｓ１、ｐＰＩＣ９Ｋ、ｐＰＩＣＺα、ｐＧＡＰＺα、ｐＰＩＣＺ　Ｂ等を挙げることができる。
　酵母を宿主とした場合のプロモータの具体例としては、酵母中で発現できるものであれば制限されない。例えば、ヘキソースキナーゼ等の解糖系の遺伝子のプロモータ、ＰＨＯ５プロモータ、ＰＧＫプロモータ、ＧＡＰプロモータ、ＡＤＨプロモータ、ｇａｌ　１プロモータ、ｇａｌ　１０プロモータ、ヒートショックポリペプチドプロモータ、ＭＦα１　プロモータ、ＣＵＰ　１プロモータ、ｐＧＡＰプロモータ、ｐＧＣＷ１４プロモータ、ＡＯＸ１プロモータ、ＭＯＸプロモータ等を挙げることができる。
　酵母への発現ベクターの導入方法としては、酵母にＤＮＡを導入する方法であればいずれも用いることができ、例えば、エレクトロポレーション法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９４，１８２（１９９０））、スフェロプラスト法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８１，４８８９（１９８４））、酢酸リチウム法（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３））、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）に記載の方法等を挙げることができる。
　糸状真菌としては、例えば、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ウスチラーゴ（Ｕｓｔｉｌａｇｏ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、ノイロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、フミコーラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、マイセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｏｒａ）属、ボトリティス（Ｂｏｔｒｙｔｓ）属、マグナポルサ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）属、ムコア（Ｍｕｃｏｒ）属、メタリチウム（Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ）属、モナスカス（Ｍｏｎａｓｃｕｓ）属、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、及びリゾムコア属に属する菌等を挙げることができる。
　糸状真菌の具体例として、アクレモニウム・アラバメンゼ（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ａｌａｂａｍｅｎｓｅ）、アクレモニウム・セルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、アスペルギルス・アクレアツス（アキュレータス）（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・サケ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓａｋｅ）、アスペルギルス・ゾジエ（ソーヤ）（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・テュビゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・パラシチクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ）、アスペルギルス・フィクム（フィキュウム）（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｉｃｕｕｍ）、アスペルギルス・フェニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｐｈｏｅｉｃｕｓ）、アスペルギルス・フォエチズス（フェチダス）（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・フラーブス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｌａｖｕｓ）、アスペルギルス・フミガタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ヤポニクス（ジャポニカス）（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、トリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｖｉｒｉｄｅ）、トリコデルマ・ハージアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ　ｒｅｓｅｅｉ）、クリソスポリウム・ルクノエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ　ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、サーモアスクス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、スポロトリクム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ）、スポロトリクム・セルロフィルム（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｐｈｉｌｕｍ）、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ　ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、チラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、ノイロスポラ・クラザ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ　ｃｒａｓｓａ）、フザリウム・オキシスポーラス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｏｘｙｓｐｏｒｕｓ）、フザリウム・グラミネルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコーラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ　ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、ペニシリウム・クリゾゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、ペニシリウム・カマンベルティ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｃａｍｅｍｂｅｒｔｉ）、ペニシリウム・カネセンス（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｃａｎｅｓｃｅｎｓ）、ペニシリウム・エメルソニ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、ペニシリウム・フニクロスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）、ペニシリウム・グリゼオロゼウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｇｒｉｓｅｏｒｏｓｅｕｍ）、ペニシリウム・パープロゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ペニシリウム・ロケフォルチ（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｒｏｑｕｅｆｏｒｔｉ）、マイセリオフトラ・サーモフィルム（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔａｏｒａ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）、ムコア・アンビグス（Ｍｕｃｏｒ　ａｍｂｉｇｕｕｓ）、ムコア・シイルシネロイデェス（Ｍｕｃｏｒ　ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）、ムコア・フラギリス（Ｍｕｃｏｒ　ｆｒａｇｉｌｉｓ）、ムコア・ヘマリス（Ｍｕｃｏｒ　ｈｉｅｍａｌｉｓ）、ムコア・イナエクイスポラス（Ｍｕｃｏｒ　ｉｎａｅｑｕｉｓｐｏｒｕｓ）、ムコア・オブロンジエリプティカス（Ｍｕｃｏｒ　ｏｂｌｏｎｇｉｅｌｌｉｐｔｉｃｕｓ）、ムコア・ラセモサス（Ｍｕｃｏｒ　ｒａｃｅｍｏｓｕｓ）、ムコア・レクルバス（Ｍｕｃｏｒ　ｒｅｃｕｒｖｕｓ）、ムコア・サトゥルニナス（Ｍｏｃｏｒ　ｓａｔｕｒｎｉｎｕｓ）、ムコア・サブティリススミウス（Ｍｏｃｏｒ　ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｍｕｓ）、オガタエア・ポリモルファ（Ｏｇａｔａｅａ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ファネロケーテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ　ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、リゾムコア・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ　ｍｉｅｈｅｉ）、リゾムコア・プシルス（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ　ｐｕｓｉｌｌｕｓ）、リゾプス・アルヒザス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ａｒｒｈｉｚｕｓ）等を挙げることができる。
　糸状真菌を宿主とした場合のプロモータの具体例としては、解糖系に関する遺伝子、構成的発現に関する遺伝子、加水分解に関する酵素遺伝子等いずれであってもよく、具体的にはａｍｙＢ、ｇｌａＡ、ａｇｄＡ、ｇｌａＢ、ＴＥＦ１、ｘｙｎＦ１ｔａｎｎａｓｅｇｅｎｅ、Ｎｏ．８ＡＮ、ｇｐｄＡ、ｐｇｋＡ、ｅｎｏＡ、ｍｅｌＯ、ｓｏｄＭ、ｃａｔＡ、ｃａｔＢ等を挙げることができる。
　糸状真菌への発現ベクターの導入は，従来公知の方法を用いて行うことができる。例えば、Ｃｏｈｅｎらの方法（塩化カルシウム法）［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，６９：２１１０（１９７２）］、プロトプラスト法［Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１６８：１１１（１９７９）］、コンピテント法［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５６：２０９（１９７１）］、エレクトロポレーション法等を挙げることができる。
　昆虫細胞として、例えば、鱗翅類の昆虫細胞が挙げられ、より具体的には、Ｓｆ９、及びＳｆ２１等のスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ　ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）由来の昆虫細胞、並びに、Ｈｉｇｈ　５等のイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ　ｎｉ）由来の昆虫細胞等を挙げることができる。
　昆虫細胞を宿主として用いる場合のベクターとしては、例えば、夜盗蛾科昆虫に感染するウイルスであるアウトグラファ・カリフォルニカ・ヌクレアー・ポリヘドロシス・ウイルス（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ　ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ　ｎｕｃｌｅａｒ　ｐｏｌｙｈｅｄｒｏｓｉｓ　ｖｉｒｕｓ）等のバキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒｓ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９２））を挙げることができる。
　昆虫細胞を宿主として用いる場合には、例えばカレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒｓ，　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ　ａｎｄ　Ｃｏｍｐａｎｙ，　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ（１９９２）、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，６，４７（１９８８）等に記載された方法によって、ポリペプチドを発現することができる。すなわち、組換え遺伝子導入ベクター及びバキュロウイルスを昆虫細胞に共導入して昆虫細胞培養上清中に組換えウイルス（発現ベクター）を得た後、さらに組換えウイルスを昆虫細胞に感染させ、ポリペプチドを発現させることができる。該方法において用いられる遺伝子導入ベクターとしては、例えば、ｐＶＬ１３９２、ｐＶＬ１３９３、ｐＢｌｕｅＢａｃＩＩＩ（ともにＩｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）等を挙げることができる。
　組換えウイルスを調製するための、昆虫細胞への組換え遺伝子導入ベクターとバキュロウイルスの共導入方法としては、例えば、リン酸カルシウム法（特開平２－２２７０７５）、リポフェクション法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，７４１３（１９８７））等を挙げることができる。
　上記組換えベクターは、形質転換体選択のための選択マーカ遺伝子をさらに含有していることが好ましい。例えば、大腸菌においては、選択マーカ遺伝子としては、テトラサイクリン、アンピシリン、カナマイシン等の各種薬剤に対する耐性遺伝子を用いることができる。栄養要求性に関与する遺伝子変異を相補できる劣性の選択マーカも使用できる。酵母においては、選択マーカ遺伝子として、ジェネティシンに対する耐性遺伝子を用いることができ、栄養要求性に関与する遺伝子変異を相補する遺伝子、ＬＥＵ２、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、ＨＩＳ３等の選択マーカも使用できる。糸状真菌においては、選択マーカ遺伝子として、ｎｉａＤ（Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５９，１７９５－１７９７（１９９５））、ａｒｇＢ（Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌ，６，３８６－３８９，（１９８４）），ｓＣ（Ｇｅｎｅ，８４，３２９－３３４，（１９８９））、ｐｔｒＡ（ＢｉｏｓｃｉＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　Ｂｉｏｃｈｅｍ，６４，１４１６－１４２１，（２０００））、ｐｙｒＧ（ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ，１１２，２８４－２８９，（１９８３）），ａｍｄＳ（Ｇｅｎｅ，２６，２０５－２２１，（１９８３））、オーレオバシジン耐性遺伝子（Ｍｏｌ　Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔ，２６１，２９０－２９６，（１９９９））、ベノミル耐性遺伝子（Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，８３，４８６９－４８７３，（１９８６））及びハイグロマイシン耐性遺伝子（Ｇｅｎｅ，５７，２１－２６，（１９８７））からなる群より選ばれるマーカ遺伝子、ロイシン要求性相補遺伝子等を挙げることができる。また、宿主が栄養要求性変異株の場合には、選択マーカ遺伝子として当該栄養要求性を相補する野生型遺伝子を用いることもできる。
　上記発現ベクターで形質転換された宿主の選択は、上記核酸に選択的に結合するプローブを用いたプラークハイブリダイゼーション及びコロニーハイブリダイゼーション等で行うことができる。当該プローブとしては、上記核酸の配列情報に基づき、ＰＣＲ法によって増幅した部分ＤＮＡ断片をラジオアイソトープ又はジゴキシゲニンで修飾したものを用いることができる。
（組換えタンパク質の発現）
　目的とするタンパク質を発現するための上記発現ベクターで形質転換された組換え細胞において、組換えタンパク質は、不溶体として細胞内に発現されている。組換えタンパク質は、組換え細胞を培養培地中で培養することにより発現させることができる。組換え細胞を培養培地中で培養する方法は、宿主の培養に通常用いられる方法に従って行うことができる。
　上記宿主が、大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物である場合、培養培地として、該宿主が資化し得る炭素源、窒素源及び無機塩類等を含有し、該宿主の培養を効率的に行える培地であれば天然培地、合成培地のいずれを用いてもよい。
　炭素源としては、該宿主が資化し得るものであればよく、例えば、グルコース、フラクトース、スクロース、及びこれらを含有する糖蜜、デンプン及びデンプン加水分解物等の炭水化物、酢酸及びプロピオン酸等の有機酸、並びにエタノール及びプロパノール等のアルコール類を用いることができる。
　窒素源としては、例えば、アンモニア、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム及びリン酸アンモニウム等の無機酸又は有機酸のアンモニウム塩、その他の含窒素化合物、並びにペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、大豆粕及び大豆粕加水分解物、各種発酵菌体及びその消化物を用いることができる。
　無機塩としては、例えば、リン酸第一カリウム、リン酸第二カリウム、リン酸マグネシウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、硫酸銅及び炭酸カルシウムを用いることができる。
　大腸菌等の原核生物又は酵母等の真核生物の培養は、例えば、振盪培養又は深部通気攪拌培養等の好気的条件下で行うことができる。培養温度は、例えば、１５～４０℃である。培養時間は、通常１６時間～７日間である。培養中の培養培地のｐＨは３．０～９．０に保持することが好ましい。培養培地のｐＨの調整は、無機酸、有機酸、アルカリ溶液、尿素、炭酸カルシウム及びアンモニア等を用いて行うことができる。
　また、培養中必要に応じて、アンピシリン及びテトラサイクリン等の抗生物質を培養培地に添加してもよい。プロモータとして誘導性のプロモータを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときには、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、ｌａｃプロモータを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシド等を、ｔｒｐプロモータを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドールアクリル酸等を培地に添加してもよい。
　昆虫細胞の培養培地としては、一般に使用されているＴＮＭ－ＦＨ培地（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ社製）、Ｓｆ－９００　ＩＩ　ＳＦＭ培地（Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）、ＥｘＣｅｌｌ４００、ＥｘＣｅｌｌ４０５（いずれもＪＲＨ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）、Ｇｒａｃｅ’ｓ　Ｉｎｓｅｃｔ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｎａｔｕｒｅ，１９５，７８８（１９６２））等を用いることができる。
　昆虫細胞の培養は、例えば、培養培地のｐＨ６～７、培養温度２５～３０℃等の条件下で、培養時間１～５日間とすることができる。また、培養中必要に応じて、ゲンタマイシン等の抗生物質を培養培地に添加してもよい。
　宿主が植物細胞の場合、形質転換された植物細胞をそのまま培養してもよく、また植物の器官に分化させて培養することができる。該植物細胞を培養する培地としては、一般に使用されているムラシゲ・アンド・スクーグ（ＭＳ）培地、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）培地、又はこれらの培地にオーキシン、サイトカイニン等、植物ホルモンを添加した培地等を用いることができる。
　動物細胞の培養は、例えば、培養培地のｐＨ５～９、培養温度２０～４０℃等の条件下で、培養時間３～６０日間とすることができる。また、培養中必要に応じて、カナマイシン、ハイグロマイシン等の抗生物質を培地に添加してもよい。
　上記方法により目的とするタンパク質を、不溶体として組換え細胞内において発現させることができる。
（Ａ）組換え細胞の破砕工程
　工程（Ａ）は、目的とする組換えタンパク質を不溶体として細胞内に発現している組換え細胞を破砕して、組換えタンパク質の不溶体を含む破砕懸濁液を得る工程である。
　組換え細胞の破砕は、公知の方法に準じて行うことができる。すなわち、リゾチーム、ムタノリジン、リチケース、ザイモリエース等の酵素処理による細胞の破砕、有機溶媒等との接触による細胞破砕、浸透圧を用いた細胞破砕、ボールミル、フレンチプレス、高圧ホモジナイザー、超音波処理等の物理的・機械的な細胞破砕及びこれらの組合せにより行うことができる。
　組換え細胞の破砕には、上記培養により得られた培養液をそのまま用いることができるが、後に得られる組換えタンパク質の純度を向上させるために、洗浄した組換え細胞の懸濁液を用いることが好ましい。
　洗浄した組換え細胞の懸濁液は以下の方法で調製することができる。すなわち、培養液より遠心分離、濾過等により組換え細胞を分離する。後の工程を考慮すると水で洗浄することが好ましく、緩衝水溶液等で洗浄後、さらに水で洗浄することも好ましい。得られた組換え細胞を、上記破砕方法に適した溶液に、適した濃度となるように懸濁することにより調製することができる。
　また、培養液より得られた組換え細胞を有機溶媒等で処理し、組換え細胞の宿主由来のタンパク質等の可溶性画分を除去後の不溶性画分を、上記破砕方法に適した溶液に、適した濃度となるように懸濁した懸濁液も用いることができる。この場合、有機溶媒等処理により菌体が破砕されている場合は、当該有機溶媒等処理（有機溶媒等との接触等）を上記破砕処理とみなすことができる。すなわち、有機溶媒等処理後、下記（Ｂ）組換えタンパク質不溶体の凝集工程を行うことができる。
　適した溶液としては、工業用水、脱イオン水、ＲＯ（Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｏｓｍｏｓｉｓ）水等の水、緩衝水溶液等を挙げることができる。緩衝水溶液としては、例えばＴｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液等をあげることができる。
　得られた破砕懸濁液は、組換えタンパク質の不溶体を含む。本明細書において、「不溶体」とは、溶液（懸濁液）に不溶性であるタンパク質を指し、不溶性顆粒を形成する場合もある。
　また、破砕懸濁液には容易に遠心分離可能な細胞破壊片が含まれており、これら細胞破壊片を除去後の懸濁液を用いて下記凝集工程を行ってもよい。
　さらに、破砕懸濁液中の不溶性顆粒が不純物を巻き込み、遠心分離により分離可能な場合がある。そのような場合には遠心分離し、取得された不溶性顆粒を含む沈殿画分を上記緩衝水溶液に再懸濁させて、下記凝集工程に進んでもよい。
（Ｂ）組換えタンパク質不溶体の凝集工程
　工程（Ｂ）は、上記（Ａ）工程で得られた破砕懸濁液に金属塩、酸及びアニオン性凝集剤からなる群から選ばれる１種以上を添加し、組換えタンパク質の不溶体を凝集させ、組換えタンパク質凝集体を得る工程である。工程（Ｂ）において、必要に応じて、加熱及び／又は撹拌することを行ってもよい。
　金属塩として、例えば、アルカリ土類金属塩、土類金属塩を挙げることができる。具体的にはアルカリ土類金属ハロゲン化物、アルカリ土類金属硝酸塩、アルカリ土類金属硫酸塩、土類金属ハロゲン化物、土類金属硝酸塩、土類金属硫酸塩等を挙げることができる。金属塩としては２価以上の多価金属塩が好ましい。
　アルカリ土類金属ハロゲン化物としては、例えば塩化カルシウム、塩化マグネシウム、臭化マグネシウム、臭化カルシウム、ヨウ化マグネシウム、ヨウ化カルシウム等を挙げることができる。
　アルカリ土類金属硝酸塩としては、例えば、硝酸カルシウム、硝酸マグネシウム、硝酸ストロンチウム、硝酸バリウム等を挙げることができる。
　アルカリ土類金属硫酸塩としては、例えば、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸ストロンチウム、硫酸バリウム等を挙げることができる。
　土類金属ハロゲン化物としては、例えば三塩化アルミニウム、三塩化ガリウム等を挙げることができる。
　土類金属硝酸塩としては、例えば硝酸アルミニウム、硝酸ガリウム等を挙げることができる。
　土類金属硫酸塩としては、例えば硫酸アルミニウム、硫酸ガリウム等を挙げることができる。
　これらの金属塩は、それぞれ単独で用いてもよく、２種類以上を併用してもよい。
　好適な金属塩としてはアルカリ金属ハロゲン化物、アルカリ土類金属ハロゲン化物があげられ、具体的な好適例としては、塩化リチウム、塩化カルシウム等を挙げることができる。
　金属塩の添加量としては、組換えタンパク質が破砕懸濁液においてコンパクトな不溶性顆粒を形成している場合には少量の添加でも効果が認められ、例えば０．０１～２０ｍＭ、好ましくは１～１０ｍＭとなるように金属塩を添加すればよい。不溶性顆粒を形成していない不溶体又は遠心分離では沈降させるために時間の掛かるような不溶性顆粒の場合には、２～５０ｍＭ、好ましくは５～１０ｍＭとなるように金属塩を添加すればよい。
　酸としては、無機酸及び有機酸のいずれも用いることができる。好適な酸としてはオキソ酸等を挙げることができる。
　無機酸のオキソ酸としては、硫酸、硝酸、リン酸等を挙げることができる。有機酸のオキソ酸としては、蟻酸、酢酸、クエン酸、酒石酸等を挙げることができる。オキソ酸としては、酢酸、硫酸、クエン酸が好ましく、クエン酸がより好ましい。
　酸の添加量としては、組換えタンパク質が破砕懸濁液においてコンパクトな不溶性顆粒を形成している場合には少量の添加でも効果が認められ、例えば０．０１～２０ｍＭ、好ましくは１～２０ｍＭ、さらに好ましくは５～２０ｍＭとなるように酸を添加すればよい。不溶性顆粒を形成していない不溶体又は遠心分離では沈降させるために時間の掛かるような不溶性顆粒の場合には、２～５０ｍＭ、好ましくは１０～３０ｍＭとなるように酸を添加すればよい。
　これらの酸は、それぞれ単独で用いてもよく、２種類以上を併用してもよい。
　本明細書において「アニオン性凝集剤」とは、有機系のアニオン基を有する高分子凝集剤（ポリマー）を指す。アニオン性凝集剤としては、例えば、ポリアクリル酸塩系、アニオン性ポリアクリルアミド系、アクリルアミド・アクリル酸塩共重合体系等をあげることができる。具体的には、栗田工業社製のクリファームＰＡシリーズ（ＰＡ－９２３、ＰＡ－８９６、ＰＡ－８９５、ＰＡ－８９３、ＰＡ－８６５、ＰＡ－８２３、ＰＡ－８１３、ＰＡ－８０４、ＰＡ－４６５、ＰＡ－４０４、ＰＡ－４０２、ＰＡ－２６５等）、三井化学アクアポリマー社製のアコフロック（Ａ－９５～Ａ－１００、Ａ－１１０～Ａ－１５０、Ａ－１９０、Ａ－２３５Ｈ～Ａ－２５０等）、スミフロック（ＦＡ－４０～ＦＡ－７０）、三菱レイヨン社製のダイヤフロックＡＰシリーズ（ＡＰ３３５Ｂ、ＡＰ７４１Ｂ、ＡＰ８２５Ｃ等）、多木化学株式会社製のタキフロックＡシリーズ（Ａ－１０２～Ａ－１０６、Ａ－１０８、Ａ－１４２、Ａ－１６２）、戸上電機製作所のトガミフロック（ＴＡ－０８９、ＴＡ－１０４、ＴＡ－１０９、ＴＡ－１２４、ＴＡ－１４４、ＴＡＥ－２３２５、ＴＡＥ－２３３５、ＴＡＥ－２６４４等）等をあげることができる。
　これら凝集剤の中には、宿主細胞自体を凝集させる作用を有することもあるため、凝集剤を用いる場合には細胞破壊片をあらかじめ取り除いた破砕懸濁液を用いることが好ましい。アニオン性凝集剤の添加量としては、組換えタンパク質が破砕懸濁液において、０．００１～０．１％、好ましくは０．０１～０．０５％となるようにアニオン性凝集剤を添加すればよい。
　金属塩、酸又はアニオン性凝集剤の添加は、それぞれ単独より、組み合わせて添加することにより低濃度の添加で効果が得られる。
　（Ｂ）の凝集工程において、金属塩、酸及びアニオン性凝集剤からなる群から選ばれる１種以上を添加したのち、凝集を促進し凝集体が大型となるように、加熱を行ってもよい。加熱の手段は特に限定されない。加熱温度（ピーク温度）は特に限定されないが、効率よく不溶体又は不溶性顆粒を得る観点及び菌体死菌化の観点から、目的とする組換えタンパク質の種類に応じて、たとえば加熱温度は６０℃以上、好ましくは７０℃以上、さらに好ましくは８０℃以上である。また目的タンパク質の分解を抑制し、目的タンパク質の純度向上の観点から、目的タンパク質の種類に応じて、たとえば１３０℃以下、好ましくは１１０℃以下、さらに好ましくは９０℃以下である。
　加熱時間（加熱温度を維持する時間）は、特に限定されないが、効率よく不溶体又は不溶性顆粒を得る観点及び菌体死菌化の観点から、目的とする組換えタンパク質の種類に応じて、たとえば０．５時間以上、好ましくは１時間以上、さらに好ましくは２時間以上である。また目的タンパク質の分解を抑制し、作業効率向上の観点から、目的タンパク質の種類に応じて、たとえば１５時間以下、好ましくは１０時間以下、さらに好ましくは５時間以下である。
　破砕懸濁液を連続して加熱する方法により不溶体又は不溶性顆粒を得るための加熱時間を大幅に短縮することができる。破砕懸濁液を連続して加熱する場合の温度は、特に限定されないが、効率よく不溶体又は不溶性顆粒を得る観点及び菌体死菌化の観点から、目的とする組換えタンパク質の種類に応じて、たとえば加熱温度は７０℃以上、好ましくは８０℃以上、さらに好ましくは９０℃以上である。また目的タンパク質の分解を抑制し、目的タンパク質の純度向上の観点から、目的タンパク質の種類に応じて、たとえば１４０℃以下、好ましくは１２０℃以下、さらに好ましくは１００℃以下である。
　破砕懸濁液を連続して加熱する場合の不溶体又は不溶性顆粒を得るための加熱時間は、特に限定されないが、効率よく不溶体又は不溶性顆粒を得る観点及び菌体死菌化の観点から、目的とする組換えタンパク質の種類に応じて、たとえば１秒以上、好ましくは１０秒以上、さらに好ましくは３０秒以上である。また目的タンパク質の分解を抑制し、作業効率向上の観点から、目的タンパク質の種類に応じて、たとえば１２０秒以下、好ましくは９０秒以下、さらに好ましくは６０秒以下である。
　破砕懸濁液を連続して加熱する方法は特に限定されず、不溶体又は不溶性顆粒を７０℃以上１４０℃以下に加熱でき、加熱後の温度を１２０秒間以内で保持できればよく、液体連続殺菌装置等を使用する方法が挙げられ、特に液体連続殺菌装置ＭＩＮＩ　ＵＨＴ　Ｔ－２０（パワーポイント・インターナショナル社製）が挙げられる。
　（Ｂ）の凝集工程において、凝集体が大型となるように、加熱に加えてさらに撹拌を行ってもよい。撹拌の手段は特に限定されない。撹拌速度は特に限定されないが、効率よく不溶性顆粒を得る観点より、溶液中の不溶体の凝集体が沈殿しない速度が好ましく、例えば、７０ｒｐｍ以上、好ましくは１５０ｒｐｍ以上、さらに好ましくは３００ｒｐｍ以上である。また形成された不溶体の破砕を抑制する観点から１５００ｒｐｍ以下、好ましくは１０００ｒｐｍ以下、さらに好ましくは５００ｒｐｍ以下である。撹拌時間は、（Ｂ）の凝集工程の間の任意の時間に行わればよく、加熱する場合は、加熱と共に行われるのが好ましい。
（Ｃ）組換えタンパク質凝集体の分離工程
　（Ｃ）工程は、（Ｂ）工程で得られた凝集体を懸濁液から分離する工程である。破砕懸濁液への金属塩、酸及びアニオン性凝集剤からなる群から選ばれる１種以上の添加と同時に組換えタンパク質不溶体の凝集が始まり、その後適宜な分離手段、例えば、自然沈降、遠心分離又は濾過を用いて凝集体を分離することができる。金属塩、酸及びアニオン性凝集剤からなる群から選ばれる１種以上の添加後、加熱し、必要に応じてさらに撹拌することにより凝集が促進され凝集体が大型となり、より分離が容易となる。
　一例では、２，５００×ｇ、５～３０分の遠心分離により、凝集体を回収することができる。組換えタンパク質が破砕懸濁液において元々遠心分離可能な不溶性顆粒を形成している場合には、金属塩、酸及びアニオン性凝集剤からなる群から選ばれる１種以上の添加し、加熱し、必要に応じて撹拌することにより不溶体顆粒をさらに巨大化し、自然沈降させることも可能である。遠心分離により分離することが困難な組換えタンパク質不溶体も、金属塩、酸及びアニオン性凝集剤からなる群から選ばれる１種以上の添加し、加熱し、必要に応じて撹拌により不溶体顆粒をさらに巨大化し、遠心分離、濾過等により分離可能となる。
　これまで不溶性顆粒の遠心分離において、２，５００×ｇのような低遠心力で沈降させることができるとの報告はなく、通常は１２，０００×ｇ以上の高遠心力の円筒型遠心分離機が利用されている。しかしながら、本発明によればより低遠心力で不溶性組換えタンパク質を凝集体として沈降させることができるため、これまで菌体の分離にしか使用できなかったウェストファリア、クラリファイヤー、アルファ・ラバルといった、分離板型（ディスク型）遠心分離機、及びデカンタ型遠心分離機、さらにたとえばバスケット型遠心分離機を、不溶性組換えタンパク質の分離に使用することができることを意味する。これら分離板型及びデカンタ型遠心分離機は、１０，０００×ｇ以下の遠心力を有し、大量の懸濁液を連続的に分離処理できるため、極めて工業生産において有用な手段となり得る。
　また、上記の凝集工程を行わなかった場合、通常の遠心分離により容易に沈降可能な大型の不溶性顆粒であっても、膜濾過においては目詰まりする可能性が高いが、当該凝集工程を行うことにより容易に膜分離可能となる。特に金属塩、酸及びアニオン性凝集剤からなる群から選ばれる１種以上添加後に、加熱し、必要に応じて撹拌することにより、より容易に膜分離可能となる。
　さらに分離操作のみで、当該組換えタンパク質不溶体と分離可能な宿主細胞由来の不純物を除去することができ、組換えタンパク質の純度を向上させることができる。また、分離した組換えタンパク質不溶体を再懸濁して、再度凝集及び分離工程を行うと、より純度を向上させることができる。
　（Ｃ）組換えタンパク質凝集体の分離工程によって得られた組換えタンパク質凝集体の粒子径は、たとえば電気的検知帯法によって測定することができる。組換えタンパク質凝集体の粒子径は、ろ過性向上の観点から、例えば４μｍ以上、好ましくは５μｍ以上、より好ましくは１０μｍ以上、さらに好ましくは１５μｍ以上である。また、凝集体の粒子径の上限は特に限定されないが、５０μｍ以下であってもよく、４０μｍ以下あってもよく、３０μｍ以下であってもよく、２０μｍ以下であってもよい。
　電気的検知帯法としては、ＪＩＳ　Ｚ　８８３２に準拠した粒子径分布測定方法が挙げられ、特に粒子径数分析装置ＣＤＡ－１０００（シスメックス株式会社）を使用した測定方法が挙げられる。
　分離によって取得された組換えタンパク質凝集体は、例えば、特表２０１３－５２３６６５号公報に記載の方法等を利用してさらに精製して純度を向上させることができる。
　以下、実施例に基づいて本発明をより具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
（１）目的とするタンパク質発現株（組換え細胞）の作製
　配列番号１（ＰＲＴ４１０）、配列番号２（ＰＲＴ８５３）、配列番号３（ＰＲＴ６４７）、配列番号４（ＰＲＴ６９９）及び配列番号５（ＰＲＴ６９８）で示されるアミノ酸配列を有するクモ糸由来の配列を有するフィブロインをコードする核酸、ＧＥＮ４９５、ＧＥＮ９７１、ＧＥＮ７４０、ＧＥＮ７９７及び、ＧＥＮ７９６をそれぞれ合成した。当該核酸には、５’末端にＮｄｅＩサイト及び終止コドン下流にＥｃｏＲＩサイトを付加した。各タンパク質のハイドロパシー　インデックス（ＨＩ）及び分子量は表１に示した通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　これら５種類の核酸をそれぞれクローニングベクター（ｐＵＣ１１８）にクローニングした。その後、同核酸をＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩで制限酵素処理して切り出した後、タンパク質発現ベクターｐＥＴ－２２ｂ（＋）に組換えて発現ベクターを得た。当該５種類の発現ベクターで、大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）をそれぞれ形質転換して、目的とするタンパク質を発現する形質転換大腸菌（組換え細胞）を得た。
（２）目的とするタンパク質の発現
　上記形質転換大腸菌を、アンピシリンを含む２ｍＬのＬＢ培地で１５時間培養した。当該培養液を、アンピシリンを含む１００ｍＬのシード培養用培地（表２）にＯＤ６００が０．００５となるように添加した。培養液温度を３０℃に保ち、ＯＤ６００が５になるまでフラスコ培養を行い（約１５時間）、シード培養液を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　当該シード培養液を５００ｍＬの生産培地（表３）を添加したジャーファーメンターにＯＤ６００が０．０５となるように添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにした。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　生産培地中のグルコースが完全に消費された直後に、フィード液（グルコース４５５ｇ／１Ｌ、酵母エキス　１２０ｇ／１Ｌ）を１ｍＬ／分の速度で添加した。培養液温度を３７℃に保ち、ｐＨ６．９で一定に制御して培養した。また培養液中の溶存酸素濃度を、溶存酸素飽和濃度の２０％に維持するようにし、２０時間培養を行った。その後、１Ｍのイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を培養液に対して終濃度１ｍＭになるよう添加し、目的のタンパク質を発現誘導させた。ＩＰＴＧ添加後２０時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製した菌体を用いてＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、ＩＰＴＧ添加に依存した目的とするタンパク質サイズのバンドの出現により、目的とするタンパク質が不溶体として発現されていることを確認した。
〔実施例１　金属塩の添加効果その１〕
　不溶体としてＰＲＴ８５３（ＨＩ：－０．６８）を発現している大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）のＲＯ水懸濁液にＤＮａｓｅ（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ）１．８μｇ／ｇ湿菌体、及びＬｙｓｏｚｙｍｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１６４μｇ／ｇ湿菌体添加し、高圧ホモジナイザー（ＧＥＡ，　Ｐａｎｄａ　ｐｌｕｓ）を用い室温、６００バールの圧力で４回処理し、菌体を破砕した。破砕後、遠心分離機（ＴＯＭＹ　ＭＸ－３０５）を用い、１１，０００×ｇ、５分間処理し、不溶体を取得した。当該不溶体はこのように、取得するためにはかなりの時間をかけて遠心分離する必要のある、比較的小さな不溶性顆粒であった。当該不溶性顆粒を水に懸濁後、０．５Ｍとなるように表４に示す金属塩を添加した。図１は、金属塩の添加後、２，６８０×ｇで１０秒間遠心分離したときの各サンプルの写真である。
　多価金属塩を添加することにより、２，６８０×ｇで１０秒間遠心分離することにより不溶体を沈降させることができることを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
〔実施例２　金属塩の添加効果その２〕
　実施例１で凝集効果が優れていた金属塩（塩化マグネシウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム及び硝酸マグネシウム）について、ＰＲＴ８５３の不溶体を用いて、低濃度での凝集効果を確認した（表５参照）。図２は、金属塩の添加後、２，６８０×ｇで１０秒間遠心分離したときの各サンプルの写真である。
　いずれの金属塩も１ｍＭでも凝集効果は認められたが、５ｍＭ以上で顕著な凝集効果が認められた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
〔実施例３　ＨＩの異なるタンパク質での効果〕
　疎水性度の異なるタンパク質における金属塩の添加効果を確認した。実施例１と同様の方法で、ＰＲＴ４１０（ＨＩ：－０．８１）、ＰＲＴ６４７（ＨＩ：０．０４）、ＰＲＴ６９９（ＨＩ：０．１７）、ＰＲＴ６９８（ＨＩ：０．４３）の４種類の不溶体について金属塩（塩化カルシウム及び塩化マグネシウム）の添加による凝集効果を確認した。
　各不溶体を発現している大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）のＲＯ水懸濁液にＤＮａｓｅ１．８μｇ／ｇ湿菌体、及びＬｙｓｏｚｙｍｅを１６４μｇ／ｇ湿菌体添加し、高圧ホモジナイザーを用い室温、６００バールの圧力で４回処理し、菌体を破砕した。破砕後、当該破砕懸濁液に、１０～１５０ｍＭとなるように、塩化カルシウム又は塩化マグネシウムを添加し、２，６８０×ｇで１０秒間遠心分離し、凝集の状況を確認した。図３は、金属塩の添加後、２，６８０×ｇで１０秒間遠心分離したときの各サンプルの写真である。
　当該遠心分離操作により、ＰＲＴ４１０、ＰＲＴ６９９の不溶体は、金属塩（塩化カルシウム及び塩化マグネシウム）を添加することなく沈殿化可能であったが、少量でも金属塩添加により、よりコンパクトに沈殿化させることができることを確認した。一方、ＰＲＴ６４７、ＰＲＴ６９８は金属塩を添加しなければ当該遠心条件で沈殿化させることができなかったが、金属塩添加により凝集、沈殿化させることができた。特に高濃度にするほど、よりコンパクトに凝集、沈殿化させることができた（図３参照）。
　疎水性度の異なるタンパク質において金属塩の添加効果が認められたため、本金属塩添加方法は様々なタンパク質の不溶体の凝集に応用できると考えられる。
〔実施例４　精製純度の向上〕
　ＰＲＴ４１０、ＰＲＴ６４７、ＰＲＴ６９９、ＰＲＴ６９８の４種類の不溶体は、１１，０００×ｇ、２０℃の遠心分離であれば、５分間で沈降させることができた。遠心分離で得られた当該沈殿画分を再度ＲＯ水に懸濁し、当該懸濁液（遠沈再懸濁液）への金属塩の添加効果を確認した。
　ＲＯ水に再懸濁した不溶体に対して、実施例３と同様にして金属塩の添加効果を確認した。図４は、金属塩の添加後、２，６８０×ｇで１０秒間遠心分離したときの各サンプルの写真である。図４に示すとおり、実施例３と同様に金属塩添加効果が認められた。また、以下に示すとおり、当該再懸濁により不溶体の純度を向上させることができる。
　図５及び表６は、金属塩の添加、及び遠沈再懸濁操作による不溶体の純度向上の結果を示す。図５は、実施例３及び実施例４で得られたＰＲＴ４１０の各処理液をＳＤＳ－ＰＡＧＥで解析した結果（泳動結果）を示す写真である。図５のＡ及びＢ中、レーン１には、高圧ホモジナイザーで菌体を破砕した直後のＰＲＴ４１０の懸濁液（破砕懸濁液）、レーン２には、当該破砕懸濁液に１０ｍＭとなるように塩化カルシウムを添加し、沈殿化後、２，５００×ｇで５分間遠心分離し、得られた沈殿画分、レーン３には、当該破砕懸濁液に１０ｍＭとなるように塩化マグネシウムを添加し、沈殿化後、２，５００×ｇで５分間遠心分離し、得られた沈殿画分、Ｍレーンには、分子量マーカータンパク質をそれぞれアプライした。
　図５のＡは、泳動後、全てのタンパク質を染色可能なＯｒｉｏｌｅ（商標）蛍光ゲルステイン（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）で染色したもの、図５のＢは、泳動後、ＰＲＴ４１０のＨｉｓタグ領域に反応するＩｎＶｉｓｉｏｎ（商標）Ｈｉｓタグ付きゲル内染色試薬（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で染色したものである。理論分子量が５３．６ｋＤａのＰＲＴ４１０は６０ｋＤａの分子量マーカに近い位置にバンドとして検出された。
　Ｇｅｌ　Ｄｏｃ（商標）　ＥＺ　Ｇｅｌ　Ｉｍａｇｅｒ　（ＢＩＯＲＡＤ社製）を用い、Ｏｒｉｏｌｅ染色したゲルの泳動バンドを解析し、各処理液における、ＰＲＴ４１０の精製純度を算出した。結果を表６（破砕直後）に示す。
　金属塩を添加せずに得られた沈殿画分の純度は１０．５％であったが、金属塩添加によりよりコンパクトに凝集、沈殿化させることができたため、塩化カルシウム添加で３０．７％、塩化マグネシウム添加により３４．１％まで純度を向上させることができた（図５のレーン１～３、表６（破砕直後）参照）。
　また、図５のＡ及びＢ中、レーン４には、破砕懸濁液（レーン１）を１１，０００×ｇ、２０℃、５分間の遠心分離により沈降させ、得られた当該沈殿画分を再度ＲＯ水に懸濁させた懸濁液（遠沈再懸濁液）、レーン５には、当該遠沈再懸濁液に１０ｍＭとなるように塩化カルシウムを添加し、２，５００×ｇで５分間の低速遠心で遠心分離し、得られた沈殿画分、レーン６には、当該遠沈再懸濁液に１０ｍＭとなるように塩化マグネシウムを添加し、２，５００×ｇで５分間の低速遠心で遠心分離し、得られた沈殿画分をそれぞれアプライした。高圧ホモジナイザーで菌体を破砕した直後の懸濁液を１１，０００×ｇ、２０℃、５分間の遠心分離により沈降させ、得られた当該沈殿画分を再度ＲＯ水に懸濁することにより（遠沈再懸濁液）、１０．５％から３４．８％に純度を向上させることができる（図５のレーン４、表６（遠沈再懸濁）参照）が、当該遠沈再懸濁液に１０ｍＭとなるように塩化カルシウム又は塩化マグネシウムを添加し、不溶体を凝集させることにより、２，５００×ｇで５分間の低速遠心で分離可能となり、また得られた沈殿画分の純度はそれぞれ４８．６％及び５０．１％まで向上した（図５のレーン５及び６、表６（遠沈再懸濁）参照）、このように、金属塩添加により著しく純度を向上させることができた。
　本金属塩添加方法は、不溶体の凝集に極めて効果があるのみならず、宿主細胞由来の不純物の除去に有効な手段であることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　また、ＰＲＴ４１０、ＰＲＴ６４７、ＰＲＴ６９９、ＰＲＴ６９８の４種類の不溶体の遠沈再懸濁液、及び破砕懸濁液に５０ｍＭの金属塩を添加し、凝集後に２，６８０×ｇで１０秒間遠心分離して得られた沈殿画分について、それぞれタンパク質の回収率を求めた。結果を表７に示した。
　回収率はマイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ，Ｉｎｆｉｎｉｔｅ　Ｆ２００）により５９５ｎｍの吸光度を測定し、遠心分離前の吸光度の数値を０％、１１，０００×ｇ、１０分間処理したものの上清の吸光度の数値を１００％として算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表７から明らかのように、金属塩添加により、極めて高収率で不溶体を回収することができた。
　本金属塩添加方法は、不溶性のタンパク質であればその種類に限定されず、また不溶体の存在形態がコンパクトな不溶体顆粒であるか否かに関わらず、不溶体の凝集並びに宿主細胞由来の不純物の除去に極めて有効な手段であり、且つ極めて高収率で不溶体を回収することができる、優れた方法であることが確認された。
〔実施例５　酸の添加効果その１〕
　不溶体としてＰＲＴ８５３（ＨＩ：－０．６８）を発現している大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）のＲＯ水懸濁液にＤＮａｓｅ（ＳＩＧＭＡ－ＡＬＤＲＩＣＨ）１．８μｇ／ｇ湿菌体、及びＬｙｓｏｚｙｍｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１６４μｇ／ｇ湿菌体添加し、高圧ホモジナイザー（ＧＥＡ，　Ｐａｎｄａ　ｐｌｕｓ）を用い室温、６００バールの圧力で４回処理し、菌体の破砕懸濁液を取得した。
　当該破砕懸濁液に、１０～１００ｍＭとなるように（サンプル番号と酸の濃度の関係は、表８参照）、酢酸、クエン酸又は硫酸を添加し、２，５００×ｇで３０秒間遠心分離し、不溶体の凝集の状況を確認した。図６は、遠心分離後の各サンプルの写真である。酸無添加（サンプル１）では、この低速遠心分離条件で不溶体を沈降させ取得することができなかったが、酸を添加することにより、表８に示すいずれの濃度の酸でもこの低速遠心分離条件で不溶体の凝集体を取得することができた（サンプル２～１０）。
　ＲＯ水に再懸濁した後（遠沈再懸濁液）の不溶体における酸の添加効果についても検討した。すなわち、菌体の破砕懸濁液を、遠心分離機（ＴＯＭＹ　ＭＸ－３０５）を用い、１１，０００×ｇ、５分間処理し、不溶体を取得した。当該不溶体はこのように、酸を添加しなければ取得するためにはかなりの遠心力及び時間をかけて遠心分離する必要のある、比較的小さな不溶性顆粒である。当該不溶体をＲＯ水に懸濁後（遠沈再懸濁液）、上記同様表８に示す濃度の酸を添加し、２，５００×ｇで３０秒間遠心分離し、不溶体の凝集の状況を確認した。図７は、遠心分離後の各サンプルの写真である。ＲＯ水に再懸濁した遠沈再懸濁液においても、酸で効果的に凝集させることができることが確認できた。また、ＲＯ水への再懸濁により、顆粒が洗浄され、培地及び菌体由来成分等が除去されるため、ＲＯ水への再懸濁を行わなかった不溶体と比較して、見た目でも純麗な不溶体を取得することができた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
〔実施例６　ＨＩの異なるタンパク質での酸の添加効果〕
　疎水性度の異なるＰＲＴ４１０（ＨＩ：－０．８１）、ＰＲＴ６４７（ＨＩ：０．０４）、ＰＲＴ６９９（ＨＩ：０．１７）、ＰＲＴ６９８（ＨＩ：０．４３）の４種類の不溶体について、実施例５と同様の方法で、５～３０ｍＭのクエン酸を添加し、不溶体の凝集効果を以下のように確認した。
　各不溶体を発現している大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）のＲＯ水懸濁液にＤＮａｓｅ１．８μｇ／ｇ湿菌体、及びＬｙｓｏｚｙｍｅを１６４μｇ／ｇ湿菌体添加し、高圧ホモジナイザーを用い室温、６００バールの圧力で４回処理し、菌体を破砕した。破砕後、当該破砕懸濁液に、５～３０ｍＭとなるように、クエン酸を添加し、２，５００×ｇで３０秒間遠心分離し、凝集の状況を確認した。図８は、遠心分離後の各サンプルの写真である。
　図８中、０、５、１０、２０及び３０は、それぞれクエン酸を添加した濃度（ｍＭ）を示す（０ｍＭは、クエン酸無添加。）。Ｈは、クエン酸無添加懸濁液を１１，０００×ｇ、５分間遠心分離したサンプルである。
　いずれのタンパク質の不溶体も、酸を添加しなければ、１１，０００×ｇ、５分間の遠心分離条件でなければ取得できなかったが、１０ｍＭ以上のクエン酸を添加することにより、いずれのタンパク質においても、低速遠心分離により不溶体を取得することができた。５ｍＭのクエン酸添加でも凝集は見られたが、３０秒間という短い時間では沈降は不完全であった（図８参照）。
　疎水性度の異なるタンパク質において酸の添加効果が認められたため、本酸添加方法は様々なタンパク質の不溶体の凝集に応用できると考えられる。
　また、１０ｍＭのクエン酸を添加し、低速遠心分により回収したＰＲＴ４１０、ＰＲＴ６４７、ＰＲＴ６９９、ＰＲＴ６９８の４種類の沈殿画分について、実施例４と同様にして、それぞれタンパク質の回収率を求めた。結果を表９に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　表９から明らかのように、いずれのタンパク質においても、酸添加により、ロスなく不溶体を回収することができた。
　次に、回収したＰＲＴ４１０不溶体の純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより解析した。図９は、ＰＲＴ４１０の各処理液をＳＤＳ－ＰＡＧＥで解析した結果（泳動結果）を示す写真である。図９中、Ｍレーンには、分子量マーカータンパク質、レーン１には、酸無添加の破砕懸濁液、レーン２には、破砕懸濁液に１０ｍＭのクエン酸を添加し、回収した不溶体を、タンパク質濃度がそれぞれ１．５μｇになるようにアプライした。泳動後の染色には、全てのタンパク質を染色可能なＯｒｉｏｌｅＴＭ蛍光ゲルステイン（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）及びＰＲＴ４１０のＨｉｓタグ領域に反応するＩｎＶｉｓｉｏｎＴＭＨｉｓタグ付きゲル内染色試薬（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）の２種類を用いた。理論分子量が５３．６ｋＤａのＰＲＴ４１０は６０ｋＤａの分子量マーカに近い位置にバンドとして検出された。
　Ｇｅｌ　Ｄｏｃ（商標）　ＥＺ　Ｇｅｌ　Ｉｍａｇｅｒ　（ＢＩＯＲＡＤ社製）を用い、Ｏｒｉｏｌｅ染色したゲルの泳動バンドを解析し、各処理液における、ＰＲＴ４１０の精製純度を算出した。結果を表１０に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　酸を添加せずに得られた沈殿画分の純度は１１．６％であったが、酸添加によりコンパクトに凝集、沈殿化させることができたため、２３．７％まで純度を向上させることができた（図９参照）。
　本酸添加方法は、不溶体の凝集に極めて効果があるのみならず、宿主細胞由来の不純物の除去に有効な手段であることが確認された。
　本酸添加方法は、不溶性のタンパク質であればその種類に限定されず、また不溶体の存在形態がコンパクトな不溶体顆粒であるか否かに関わらず、不溶体の凝集並びに宿主細胞由来の不純物の除去に極めて有効な手段であり、且つ極めて高収率で不溶体を回収することができる、優れた方法であることが確認された。
〔実施例７　リポ多糖（ＬＰＳ）除去効果〕
　宿主細胞として用いた大腸菌には、グラム陰性菌特有の細胞壁由来の内毒素と呼ばれるＬＰＳが存在する。当該内毒素は過剰に存在すると発熱、多臓器不全、頻脈等の作用を有することが知られており、低減下することが好ましい。本発明の金属塩又は酸添加により凝集させた不溶体中のＬＰＳ含量を測定し、ＬＰＳの低減下効果を確認した。
　金属塩及び酸添加を行っていない不溶体（１）は以下の方法で取得した。
　すなわち、ＰＲＴ８５３を発現している大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）のＲＯ水懸濁液にＤＮａｓｅ（ＳＩＧＭＡ-ＡＬＤＲＩＣＨ）１．８μｇ／ｇ湿菌体、及びＬｙｓｏｚｙｍｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１６４μｇ／ｇ湿菌体添加し、高圧ホモジナイザー（ＧＥＡ，　Ｐａｎｄａ　ｐｌｕｓ）を用い室温、６００バールの圧力で４回処理し、菌体を破砕した。破砕後、遠心分離機（ＴＯＭＹ　ＭＸ－３０５）を用い、１１，０００×ｇ、２０分間処理した。沈殿画分を再度ＲＯ水に懸濁し、１１，０００×ｇ、３０分間処理した。この洗浄操作を２回行った。得られた沈殿画分を再度ＲＯ水に懸濁し、１１，０００×ｇ、６０分間処理し、沈殿画分として不溶体（１）を取得した。当該不溶体（１）の取得は２０℃で行った。
　金属塩添加で凝集させた不溶体（２）は以下の方法で取得した。
　すなわち、高圧ホモジナイザーで４回処理し、菌体を破砕するまでは上記と同様の方法で行なった。破砕後、１０ｍＭの塩化カルシウムを添加し、不溶体を凝集させ、２，５００×ｇで１０分間処理した。得られた沈殿画分を、再度ＲＯ水に懸濁し、２，５００×ｇで１０分間処理した。この洗浄操作を２回行い、沈殿画分として金属塩添加による不溶体（２）を取得した。
　酸添加で凝集させた不溶体（３）は以下の方法で取得した。
　すなわち、金属塩を添加する代わりに、１０ｍＭのクエン酸を添加する以外は上記金属塩添加の不溶体（２）の取得と同じ方法で、酸添加による不溶体（３）を取得した。
　これら３種類の不溶体中のＬＰＳ含量を以下の方法で測定した。
（ア）測定サンプルの調製
　上記３種類の不溶体サンプル約７５ｍｇ（不溶体（１）７５．５ｍｇ，不溶体（２）７５．１ｍｇ，不溶体（３）７５．０ｍｇ）を秤量し、５０ｍｇ／ｍＬになるように注射用蒸留水（大塚製薬工場株式会社）を加え懸濁液を調製した。ボルテックスミキサーで攪拌後、ｐＨを確認し、５Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（和光純薬工業株式会社）を加えて中性となるように調整した。当該不溶体サンプルを、ブロックヒーターを用い、９０で、２０分間加熱処理した。放熱後、１０，０００ｒｐｍ、１０分間遠心分離を行い、上清を回収し、測定原液とした。
（イ）ＬＰＳ含量の測定
　リムルスＥＳ－ｉｌシングルテストワコー（和光純薬工業株式会社）を用い、添付の説明資料に従って、トキシノメーター（ＥＴ－６０００／Ｊ、和光純薬工業株式会社）を用いた比濁時間分析を行った。測定には、エンドトキシン標準品として、キットに添付されているＣＳＥ（Ｅ．ｃｏｌｉ　ＵＫＴ－Ｂ）を用いた。各検体についてはじめに測定原液を１，０００希釈して測定した。不溶体（１）及び不溶体（２）は１，０００倍希釈により測定値が得られたが、不溶体（３）は検出限度以下（く０．０１ＥＵ／ｍＬ）であったため、希釈倍率を変え、１０倍希釈で測定値を得ることができた。結果を表１１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　金属塩又は酸を添加して凝集させた不溶体（２）及び（３）では、これらを添加せずに取得した不溶体（１）と比較して、ＬＰＳ含量が低減されていることが確認された。特に酸で凝集させ取得した不溶体（３）ではＬＰＳ含量は極めて低濃度であった。金属塩又は酸を添加して不溶体を凝集、取得する方法はＬＰＳ含量を低減させることも可能な優れた方法であった。
〔実施例８　アニオン性凝集剤による凝集効果〕
　不溶性顆粒としてＰＲＴ８５３（ＨＩ：－０．６８）を発現している大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）のＲＯ水懸濁液にＤＮａｓｅ１．８μｇ／ｇ湿菌体、及びＬｙｓｏｚｙｍｅを１６４μｇ／ｇ湿菌体添加し、高圧ホモジナイザーを用いて室温にて６００バールの圧力で４回処理し、菌体を破砕し、破砕懸濁液を得た。破砕後、当該破砕懸濁液に、０．０５％となるように、表１２に示す凝集剤を添加し、静置あるいは遠心分離（２，６８０×ｇで１０秒間）により当該不溶性顆粒の沈降状況を確認した。結果を図１０に示す。
　アニオン性ポリアクリル酸塩系凝集剤（クリファーム　ＰＡ－８９６）のみが、静置及び遠心分離のいずれの場合も、不溶性顆粒を効果的に沈降させることができた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
〔実施例９　アニオン性凝集剤による純度向上効果〕
　実施例８で凝集効果が確認されたアニオン性凝集剤クリファーム　ＰＡ－８９６について、菌体の破砕懸濁液及び遠沈再懸濁液への添加効果を確認した。この遠沈再懸濁液は、破砕懸濁液を１１，０００×ｇ、２０℃で５分間遠心分離し、得られた沈殿画分をＲＯ水に再度懸濁した懸濁液である。菌体の破砕懸濁液は、不溶性顆粒としてＰＲＴ４１０（ＨＩ：－０．８１）を発現している大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）を用いた以外は実施例８と同様の方法で得た。
　凝集剤の添加後、２，５００×ｇで５分間遠心分離し、得られた沈殿画分における不溶体の純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥで解析した。結果を図１１に示す。図１１中、レーン１には、高圧ホモジナイザーで菌体を破砕した直後のＰＲＴ４１０の懸濁液（破砕懸濁液）、レーン２には、当該破砕懸濁液に０．０１％となるようにクリファーム　ＰＡ－８９６を添加し、沈殿化後、２，５００×ｇで５分間遠心分離し、得られた沈殿画分、レーン３には、破砕懸濁液（レーン１）を１１，０００×ｇ、２０℃、５分間の遠心分離により沈降させ、得られた沈殿画分を再度ＲＯ水に懸濁させた懸濁液（遠沈再懸濁液）、レーン４には、当該遠沈再懸濁液に０．０１％となるようにクリファーム　ＰＡ－８９６を添加し、２，５００×ｇで５分間の低速遠心で遠心分離し、得られた沈殿画分をそれぞれアプライした。泳動後の染色には、全てのタンパク質を染色可能なＯｒｉｏｌｅＴＭ蛍光ゲルステイン（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）及びＰＲＴ４１０のＨｉｓタグ領域に反応するＩｎＶｉｓｉｏｎＴＭＨｉｓタグ付きゲル内染色試薬（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）の２種類を用いた。理論分子量が５３．６ｋＤａのＰＲＴ４１０は６０ｋＤａの分子量マーカに近い位置にバンドとして検出された。
　破砕懸濁液に０．０１％となるようにクリファーム　ＰＡ－８９６を添加し、不溶体を凝集させることにより、２，５００×ｇで５分間の低速遠心で分離可能となり、得られた沈殿画分の純度は１２．２％から５３．５％に向上した（図１１のレーン１及び２、表１３（破砕直後）参照）。高圧ホモジナイザーで菌体を破砕した直後の懸濁液を１１，０００×ｇ、２０℃、５分間の遠心分離により沈降させ、得られた当該沈殿画分を再度ＲＯ水に懸濁することにより（遠沈再懸濁液）、沈殿画分の純度は１２．２％から３６．３％に向上させることができる（図１１のレーン１及び３、表１３（遠沈再懸濁）参照）が、さらに、当該遠沈再懸濁液に０．０１％となるようにクリファーム　ＰＡ－８９６を添加し、不溶体を凝集させることにより、２，５００×ｇで５分間の低速遠心で分離可能となり、得られた沈殿画分の純度は３６．３％からさらに５１．８％に向上した（図１１のレーン３及び４、表１３（遠沈再懸濁）参照）。このように、アニオン性凝集剤添加により著しく純度を向上させることができた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
〔実施例１０　酸添加、加熱及び撹拌による効果〕
　ＰＲＴ４１０の不溶体を用いて、加熱による凝集効果を確認した。ＰＲＴ４１０を発現している大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）のＲＯ水懸濁液にＤＮａｓｅ１．８μｇ／ｇ湿菌体、及びＬｙｓｏｚｙｍｅを１６４μｇ／ｇ湿菌体添加し、高圧ホモジナイザーを用い室温、６００バールの圧力で４回処理し、菌体を破砕した。破砕後、２，５００×ｇで１０分間遠心分離し、上澄み液を廃棄して２．５倍濃縮に調整した後、濃縮液をＲＯ水で２．５倍希釈した。当該破砕懸濁液に、２０ｍＭとなるように、クエン酸を添加し、その後、必要に応じて、加熱及び撹拌を行い、凝集体を得た。それぞれのサンプルは表１４に記載の条件によって処理した。加熱は、温浴槽を用い、加熱時間は温浴槽が８０℃に達した時点からの維持時間であった。撹拌は２００ｒｐｍで行った。得られた凝集体について、粒子径数分析装置ＣＤＡ－１０００（シスメックス株式会社）を用い、粒子濃度及びメジアン径を測定した。結果は表１４に示した。また、図１２はメジアン径の頻度分布及び累積分布を示す。
　酸の添加をせず、撹拌もしないサンプルＸ、酸を添加せず加熱しただけのサンプル１、及び、酸を添加せず加熱し、撹拌したサンプル２は、ほとんど凝集効果が認められなかった。一方、加熱／撹拌せず、酸添加のみのサンプル３はサンプルＸ、１及び２に比べて粒子径の増大が認められた。さらに、８０℃にて２時間加熱したサンプル７は、サンプル３に比べてさらなる粒子径の増大が認められた。加熱時間が異なり、さらに撹拌したサンプル４～６は、撹拌することにより、より粒子径の増大効果が認められた。凝集は処理時間に依存するが、少なくとも０．５時間から効果が認められた。この傾向は、図１２によって証明されている。濾過性は、粒度分布のピークがシャープであるほど向上するため、酸を添加し、加熱、撹拌を行うことで濾過性が向上することが図１２より確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
〔実施例１１　酸の種類による濾過性向上効果〕
　ＰＲＴ４１０の不溶体を用いて、酸の添加による濾過性の向上効果を確認した。酸添加により濾過することが可能であることを確認したため、酸の種類による濾過性向上効果をクエン酸、塩酸、硫酸の３種類の酸について比較した。実験方法は、酸が異なる以外、実施例１０と同じであった。酸処理は、８０℃にて２時間、加熱・撹拌し、最大濾過量及び、濾過時間と透過流束の関係に関する結果の一例を表１５、及び表１６に示す。比較の結果、クエン酸の最大濾過量が最も大きく、透過流束が安定していることから、工業的にはクエン酸が優れていることが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
〔実施例１２　加熱によるタンパク質純度向上効果〕
　加熱されたＰＲＴ７９９（配列番号１１、２００ｋＤａ）及び、ＰＲＴ５８７（配列番号１２、１００ｋＤａ）の不溶体の純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより解析した。図１３、及び図１４は、ＰＲＴ７９９及び、ＰＲＴ５８７の各処理液をＳＤＳ－ＰＡＧＥで解析した結果（泳動結果）を示す写真である。各処理液は、クエン酸を添加し、ｐＨを３．７５に調整した。図１３は、レーン１には、８０℃、３時間加熱した破砕懸濁液をアプライし、レーン２には、加熱していない破砕懸濁液をアプライした。レーン１の破砕懸濁液は加熱により夾雑タンパク質が分解されていることを確認した。図１４のレーン１には加熱をしていない破砕懸濁液をアプライし、レーン２には、８０℃、２時間加熱した破砕懸濁液をアプライした。４０ｋＤａの分子マーカ付近のバンドが分解されていることが確認され、レーン２の１００ｋＤａの分子マーカ付近に検出されているバンド（目的タンパク質）の検出強度が加熱していないレーン１のバンドと比較し１．２倍で検出されていることから、加熱により目的タンパク質の純度向上が確認された。
〔実施例１３　連続加熱による効果〕
　ＰＲＴ７９９の不溶体を用いて、連続加熱による凝集効果を確認した。ＰＲＴ７９９を発現している大腸菌ＢＬＲ（ＤＥ３）のＲＯ水懸濁液に、ＤＮａｓｅを１．８μｇ／ｇ湿菌体、Ｌｙｓｏｚｙｍｅを１６４μｇ／ｇ湿菌体で添加し、高圧ホモジナイザーを用いて、室温、６００バールの圧力で４回処理し、菌体を破砕した。破砕後、遠心分離機（ＴＯＭＹ　ＭＸ－３０５）を用い、２，５００×ｇで１０分間遠心分離し、上澄み液を廃棄して、２．５倍濃縮に調整した後、濃縮液をＲＯ水で２．５倍希釈した。当該破砕懸濁液に、２０ｍＭとなるように、クエン酸を添加し、その後、加熱を行い、凝集体を得た。それぞれのサンプルは表１７に記載の条件によって処理した。加熱は、液体連続殺菌装置ＭＩＮＩ　ＵＨＴ　Ｔ－２０（パワーポイント・インターナショナル社製）を用い、加熱温度は８０℃、８５℃、９０℃、又は９５℃であり、当該破砕懸濁液の加熱時間は、３０秒又は６０秒で行った。得られた凝集体について、粒子径数分析装置ＣＤＡ－１０００（シスメックス株式会社）を用い、粒子濃度及びメジアン径を測定した。結果は表１７に示した。また、図１４及び図１５はメジアン径の頻度分布及び累積分布を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　表１７の結果から、温浴槽を用い加熱温度８０℃、加熱時間２時間で加熱することで得られたサンプルＸの凝集体と、液体連続殺菌装置ＭＩＮＩ　ＵＨＴ　Ｔ－２０（パワーポイント・インターナショナル社製）を用い加熱温度が８０℃、８５℃、９０℃、又は９５℃、加熱時間が３０秒、又は６０秒で得られたサンプル１、２、３、４、５、６、７、又は８の凝集体を比較すると、液体連続殺菌装置ＭＩＮＩ　ＵＨＴ　Ｔ－２０（パワーポイント・インターナショナル社製）を用いて得られた凝集体は、温浴槽で加熱して得られた凝集体と同等以上の粒子径であった。
　当該破砕懸濁液を高温、短時間で加熱することで効率よく凝集体を巨大化できることが図１５及び図１６よりも確認できた。
〔実施例１４　連続加熱による濾過性向上効果〕
　サンプルＸ、５、６、７、及び８の濾過面積及び最大濾過量の結果は表１８に示した。表１８よれば、液体連続殺菌装置を用いて高温、短時間で加熱する場合の濾過性は、温浴槽を用いて２時間加熱した場合と同程度又は同程度以上であり、当該破砕懸濁液の加熱を高温、短時間とすることで濾過性が向上することを確認した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018

Claims (20)

  1. 　組換えタンパク質を不溶体として細胞内に発現している組換え細胞から、当該組換えタンパク質の不溶体を凝集体として分離し、組換えタンパク質凝集体を製造する方法であって、
    　組換え細胞を破砕後に、組換えタンパク質の不溶体を凝集させ、得られた凝集体を分離することを含む、組換えタンパク質凝集体の製造方法。
  2. 　前記組換えタンパク質凝集体を、１０，０００×ｇ以下の遠心力で分離することを含む、請求項１に記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
  3. 　前記組換えタンパク質凝集体を、分離板型遠心分離機、バスケット型遠心分離機及びデカンタ型遠心分離機からなる群より選ばれる遠心分離機で分離することを含む、請求項１又は２に記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
  4. 　前記組換えタンパク質凝集体を、自然沈降又は濾過により分離することを含む、請求項１に記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
  5. 　前記組換えタンパク質の不溶体の凝集が、金属塩、酸及びアニオン性凝集剤からなる群から選ばれる１種以上を添加することにより行われる、請求項１～４のいずれか一項に記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
  6. 　以下（Ａ）～（Ｃ）の工程を含む、組換えタンパク質凝集体の製造方法。
    　（Ａ）目的とする組換えタンパク質を不溶体として細胞内に発現している組換え細胞を破砕して、組換えタンパク質の不溶体を含む破砕懸濁液を得る工程
    　（Ｂ）（Ａ）工程で得られた破砕懸濁液に金属塩、酸及びアニオン性凝集剤からなる群から選ばれる１種以上を添加し、組換えタンパク質の不溶体を凝集させ、組換えタンパク質凝集体を得る工程
    　（Ｃ）（Ｂ）工程で得られた凝集体を懸濁液から分離する工程
  7. 　前記（Ｂ）工程において、さらに加熱することを含む、請求項６に記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
  8. 　前記（Ｂ）工程において、さらに撹拌することを含む、請求項７に記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
  9. 　前記金属塩が、アルカリ土類金属塩及び土類金属塩からなる群から選ばれる金属塩である、請求項５～８のいずれか一項に記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
  10. 　前記金属塩が、アルカリ土類金属ハロゲン化物、アルカリ土類金属硝酸塩、アルカリ土類金属硫酸塩、土類金属ハロゲン化物、土類金属硝酸塩及び土類金属硫酸塩からなる群から選ばれる金属塩である、請求項９に記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
  11. 　前記酸が、オキソ酸である、請求項５～１０のいずれか一項に記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
  12. 　前記オキソ酸が、酢酸、硫酸及びクエン酸からなる群から選ばれるオキソ酸である、請求項１１に記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
  13. 　前記アニオン性凝集剤が、ポリアクリル酸塩、アニオン性ポリアクリルアミド及びアクリルアミド・アクリル酸塩共重合体からなる群より選ばれるアニオン性凝集剤である、請求項５～１２のいずれか一項に記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
  14. 　前記組換え細胞の破砕が機械的破砕である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
  15. 　前記組換えタンパク質凝集体の分離が、濾過により行われる、請求項１及び６～１４のいずれか一項に記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
  16. 　前記組換え細胞が、細菌、酵母、糸状真菌、昆虫細胞、植物細胞及び動物細胞からなる群から選ばれる宿主を形質転換した組換え細胞である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
  17. 　前記組換えタンパク質が、構造タンパク質である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
  18. 　前記構造タンパク質が、ケラチン、コラ－ゲン、エラスチン、レシリン、カイコシルク及びスパイダーシルクからなる群から選ばれるタンパク質由来のタンパク質である、請求項１７に記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
  19. 　得られた組換えタンパク質凝集体の、電気的検知帯法によって測定した粒子径が４μｍ以上５０μｍ以下である、請求項１～１８のいずれか一項に記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
  20. 　請求項１～１８のいずれか一項に記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法によって得られた組換えタンパク質凝集体であって、電気的検知帯法によって測定した粒子径が４μｍ以上５０μｍ以下である、組換えタンパク質凝集体。
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