JP6081908B2 - 不溶性の標的タンパク質の分離 - Google Patents
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Description
a)不溶性の標的タンパク質と不溶性の宿主細胞部とを含む無傷の又は破壊された宿主細胞の懸濁液を準備する工程と、
b)少なくとも1つの塩基の水溶液を、上記宿主細胞を破壊し、かつ/又は上記不溶性の宿主細胞部を可溶化するのに十分な量で上記懸濁液に添加する工程と、
c)該不溶性の標的タンパク質を、可溶化した不溶性の宿主細胞部から分離する工程と、
を含み、工程b)では、該標的タンパク質が依然として不溶性であり、該不溶性の宿主細胞部の少なくとも80%が可溶化する、無傷の又は破壊された宿主細胞の懸濁液から不溶性の標的タンパク質を単離する方法を提供する。
a)不溶性の標的タンパク質と不溶性の宿主細胞部とを含む無傷の又は破壊された宿主細胞の懸濁液を準備する工程と、
b)少なくとも1つの塩基の水溶液を、上記宿主細胞を破壊し、かつ/又は上記不溶性の宿主細胞部を可溶化するのに十分な量で上記懸濁液に添加する工程と、
c)該不溶性の標的タンパク質を、可溶化した不溶性の宿主細胞部から分離する工程と、
を含み、工程b)では、該標的タンパク質が依然として不溶性であり、該不溶性の宿主細胞部の少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%、又は更には100%が可溶化する、無傷の又は破壊された宿主細胞の懸濁液から不溶性の標的タンパク質を単離する方法を提供する。
a)不溶性の標的タンパク質と不溶性の宿主細胞部とを含む破壊された宿主細胞の懸濁液を準備する工程と、
b)少なくとも1つの塩基の水溶液を、上記不溶性の宿主細胞部を可溶化するのに十分な量で上記懸濁液に添加する工程と、
c)該不溶性の標的タンパク質を、可溶化した不溶性の宿主細胞部から分離する工程と、
を含み、工程b)では、該標的タンパク質が依然として不溶性であり、該不溶性の宿主細胞部の少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%、又は更には100%が可溶化する、破壊された宿主細胞の懸濁液から不溶性の標的タンパク質を単離する方法を提供する。
a)不溶性の標的タンパク質と不溶性の宿主細胞部とを含む無傷の宿主細胞の懸濁液を準備する工程と、
b)少なくとも1つの塩基の水溶液を、上記宿主細胞を破壊し、かつ上記不溶性の宿主細胞部を可溶化するのに十分な量で上記懸濁液に添加する工程と、
c)該不溶性の標的タンパク質を、可溶化した不溶性の宿主細胞部から分離する工程と、
を含み、工程b)では、該標的タンパク質が依然として不溶性であり、該不溶性の宿主細胞部の少なくとも80%、好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも95%、又は更には100%が可溶化する、無傷の宿主細胞の懸濁液から不溶性の標的タンパク質を単離する方法を提供する。
a)(i)不溶性の標的タンパク質(例えばスパイダーシルクタンパク質)と不溶性の細菌宿主細胞部とを含む無傷の細菌宿主細胞の培養培地、(ii)好ましくは20%の残存含水量を有する、不溶性の標的タンパク質(例えばスパイダーシルクタンパク質)と不溶性の細菌宿主細胞部とを含む無傷の細菌宿主細胞の細胞沈降物、又は(iii)上記細胞沈降物を再懸濁させた緩衝溶液を準備する工程と、
b)上記細菌宿主細胞を破壊し、上記の不溶性の細菌宿主細胞部を可溶化するために、0.05M〜0.15M、好ましくは0.05Mの最終濃度でNaOHを上記の(i)培養培地、(ii)細胞沈降物又は(iii)緩衝溶液に添加する工程と、
c)3000×g〜12000×gで遠心分離することにより(すなわち不溶性の標的タンパク質が沈殿物として存在し、かつ可溶化した不溶性の細菌宿主細胞部が廃棄することができる上清中にある)、不溶性の標的タンパク質(例えばスパイダーシルクタンパク質)を可溶化した不溶性の細菌宿主細胞部から分離する工程と、
を含み、ここで工程b)では、標的タンパク質が依然として不溶性であり、不溶性の細菌宿主細胞部の少なくとも80%又は85%、好ましくは95%が可溶化するのが好ましい。
a)(i)不溶性の標的タンパク質(例えばスパイダーシルクタンパク質)と不溶性の細菌宿主細胞部とを含む破壊された細菌宿主細胞の培養培地、(ii)好ましくは15%の残存含水量を有する、不溶性の標的タンパク質(例えばスパイダーシルクタンパク質)と不溶性の細菌宿主細胞部とを含む破壊された細菌宿主細胞の細胞沈降物、又は(iii)上記細胞沈降物を再懸濁させた緩衝溶液を準備する工程と、
b)上記の不溶性の細菌宿主細胞部を可溶化するために、0.05M〜0.15M、好ましくは0.15Mの最終濃度でNaOHを上記の(i)培養培地、(ii)細胞沈降物又は(iii)緩衝溶液に添加する工程と、
c)3000×g〜12000×gで遠心分離することにより(すなわち不溶性の標的タンパク質が沈殿物として存在し、かつ可溶化した不溶性の細菌宿主細胞部が廃棄することができる上清中にある)、不溶性の標的タンパク質(例えばスパイダーシルクタンパク質)を可溶化した不溶性の細菌宿主細胞部から分離する工程と、
を含み、ここで工程b)では、標的タンパク質が依然として不溶性であり、不溶性の細菌宿主細胞部の少なくとも80%又は85%、好ましくは95%が可溶化するのも好ましい。
i)GPGXX(配列番号3)(ここでXは任意のアミノ酸であり、好ましくはそれぞれの場合で独立してA、S、G、Y、P及びQから選択される任意のアミノ酸である)、
ii)GGX(ここでXは任意のアミノ酸であり、好ましくはそれぞれの場合で独立してY、P、R、S、A、T、N及びQから選択され、より好ましくはそれぞれの場合で独立してY、P及びQから選択される任意のアミノ酸である)、
iii)Ax(ここでxは5〜10の整数である)
からなる群から選択されるコンセンサス配列を少なくとも1つ、好ましくは1つ含む、少なくとも2つの同一の反復単位を含む、これから本質的になる、又はこれからなる。
(i)アミノ酸配列として、好ましくはこの順番でGPGAS(配列番号5)、AAAAAA(配列番号13)、GGY及びGPGSG(配列番号6)、
(ii)アミノ酸配列として、好ましくはこの順番でAAAAAAAA(配列番号15)、GPGGY(配列番号7)、GPGGY(配列番号7)及びGPGGP(配列番号8)、
(iii)アミノ酸配列として、GPGQQ(配列番号4)、GPGQQ(配列番号4)、GPGQQ(配列番号4)及びGPGQQ(配列番号4)、
(iv)アミノ酸配列として、好ましくはこの順番でGPGGA(配列番号9)、GGP、GPGGA(配列番号9)、GGP、GPGGA(配列番号9)及びGGP、
(v)アミノ酸配列として、好ましくはこの順番でAAAAAAAA(配列番号15)、GPGQG(配列番号40)及びGGR、
(vi)アミノ酸配列として、好ましくはこの順番でAAAAAAAA(配列番号15)、GPGGG(配列番号10)、GGR、GGN及びGGR、
(vii)アミノ酸配列として、好ましくはこの順番でGGA、GGA、GGA、GGS、GGA及びGGS、及び/又は
(viii)アミノ酸配列として、好ましくはこの順番でGPGGA(配列番号9)、GPGGY(配列番号7)、GPGGS(配列番号11)、GPGGY(配列番号7)、GPGGS(配列番号11)及びGPGGY(配列番号7)
を含むか又はこれからなる反復単位を含む、これから本質的になる、又はこれからなる。
i)GPGXX(配列番号3)(ここでXは任意のアミノ酸であり、好ましくはそれぞれの場合で独立してA、S、G、Y、P及びQから選択される任意のアミノ酸である)、
ii)GGX(ここでXは任意のアミノ酸であり、好ましくはそれぞれの場合で独立してY、P、R、S、A、T、N及びQから選択され、より好ましくはそれぞれの場合で独立してY、P及びQから選択される任意のアミノ酸である)、及び
iii)Ax(ここでxは5〜10の整数である)
からなる群から選択されるコンセンサス配列を少なくとも1つ、好ましくは1つ含む)を含む、これから本質的になる、又はこれからなる。
(i)アミノ酸配列として、好ましくはこの順番でGPGAS(配列番号5)、AAAAAA(配列番号13)、GGY及びGPGSG(配列番号6)を含む又はこれからなる反復単位、
(ii)アミノ酸配列として、好ましくはこの順番でAAAAAAAA(配列番号15)、GPGGY(配列番号7)、GPGGY(配列番号7)及びGPGGP(配列番号8)を含む又はこれからなる反復単位、
(iii)アミノ酸配列として、GPGQQ(配列番号4)、GPGQQ(配列番号4)、GPGQQ(配列番号4)及びGPGQQ(配列番号4)を含む又はこれからなる反復単位、
(iv)アミノ酸配列として、好ましくはこの順番でGPGGA(配列番号9)、GGP、GPGGA(配列番号9)、GGP、GPGGA(配列番号9)及びGGPを含む又はこれからなる反復単位、
(v)アミノ酸配列として、好ましくはこの順番でAAAAAAAA(配列番号15)、GPGQG(配列番号40)及びGGRを含む又はこれからなる反復単位、
(vi)アミノ酸配列として、好ましくはこの順番でAAAAAAAA(配列番号15)、GPGGG(配列番号10)、GGR、GGN及びGGRを含む又はこれからなる反復単位、
(vii)アミノ酸配列として、好ましくはこの順番でGGA、GGA、GGA、GGS、GGA及びGGSを含む又はこれからなる反復単位、及び/又は
(viii)アミノ酸配列として、好ましくはこの順番でGPGGA(配列番号9)、GPGGY(配列番号7)、GPGGS(配列番号11)、GPGGY(配列番号7)、GPGGS(配列番号11)及びGPGGY(配列番号7)を含む又はこれからなる反復単位
を含む、これから本質的になる、又はこれからなる。
(i)反復単位として(GPGXX)n(配列番号3)(ここでXは任意のアミノ酸であり、好ましくはそれぞれの場合で独立してA、S、G、Y、P及びQから選択される任意のアミノ酸であり、nは2、3、4、5、6、7、8又は9である)、
ii)反復単位として(GGX)n(ここでXは任意のアミノ酸であり、好ましくはそれぞれの場合で独立してY、P、R、S、A、T、N及びQから選択され、より好ましくはそれぞれの場合で独立してY、P及びQから選択される任意のアミノ酸であり、nは2、3、4、5、6、7又は8である)、及び/又は
iii)反復単位として(Ax)n(ここでxは5〜10の整数であり、nは2、3、4、5、6、7、8、9又は10である)
を含む、これから本質的になる、又はこれからなる。
(i)式(C)mでは、配列番号21によるアミノ酸配列で表される、数「m」のCモジュール、すなわち2個〜64個のCモジュールが互いに組み合わせられ、
(ii)式(C)mNRzでは、配列番号21によるアミノ酸配列で表される、数「m」のCモジュール、すなわち2個〜64個のCモジュールが互いに組み合わせられ、上記Cモジュールはさらに、数「z」の非反復(NR)単位、すなわち1個〜3個の非反復(NR)単位、例えば配列番号41によるアミノ酸配列で表される非反復(NR)単位NR3又は配列番号42によるアミノ酸配列で表される非反復(NR)単位NR4と組み合わせられ、
(iii)式NRz(C)mでは、数「z」の非反復(NR)単位、すなわち1個〜3個の非反復(NR)単位、例えば配列番号41によるアミノ酸配列で表される非反復(NR)単位NR3又は配列番号42によるアミノ酸配列で表される非反復(NR)単位NR4が存在し(z=1)、又は互いに組み合わせられ(z=2又は3)、上記非反復(NR)単位(複数も可)はさらに、配列番号21によるアミノ酸配列で表される、数「m」のCモジュール、すなわち2個〜64個のCモジュールと組み合わせられ、
(iv)式NRz(C)mNRzでは、数「z」の非反復(NR)単位、すなわち1個〜3個の非反復(NR)単位、例えば配列番号41によるアミノ酸配列で表される非反復(NR)単位NR3又は配列番号42によるアミノ酸配列で表される非反復(NR)単位NR4が存在し(z=1)、又は互いに組み合わせられ(z=2又は3)、上記非反復(NR)単位(複数も可)はさらに、配列番号21によるアミノ酸配列で表される、数「m」のCモジュール、すなわち2個〜64個のCモジュールと組み合わせられ、上記モジュールCはさらに、数「z」の非反復(NR)単位、すなわち1個〜3個の非反復(NR)単位、例えば配列番号41によるアミノ酸配列で表される非反復(NR)単位NR3又は配列番号42によるアミノ酸配列で表される非反復(NR)単位NR4と組み合わせられ、
(v)式(AQ)nでは、数「n」のAモジュールとQモジュールとの組合せ、すなわち6個〜24個のAモジュールとQモジュールとの組合せ(ここでモジュールAは配列番号20によるアミノ酸配列により表され、モジュールQは配列番号22によるアミノ酸配列により表される)が互いに組み合わされ、
(vi)式(AQ)nNRzでは、数「n」のAモジュールとQモジュールとの組合せ、すなわち6個〜24個のAモジュールとQモジュールとの組合せ(ここでモジュールAは配列番号20によるアミノ酸配列により表され、モジュールQは配列番号22によるアミノ酸配列により表される)が互いに組み合わされ、上記AモジュールとQモジュールとの組合せはさらに、数「z」の非反復(NR)単位、すなわち1個〜3個の非反復(NR)単位、例えば配列番号41によるアミノ酸配列で表される非反復(NR)単位NR3又は配列番号42によるアミノ酸配列で表される非反復(NR)単位NR4と組み合わせられ、
(vii)式NRz(AQ)nでは、数「z」の非反復(NR)単位、すなわち1個〜3個の非反復(NR)単位、例えば配列番号41によるアミノ酸配列で表される非反復(NR)単位NR3又は配列番号42によるアミノ酸配列で表される非反復(NR)単位NR4が存在し(z=1)、又は互いに組み合わせられ(z=2又は3)、上記非反復(NR)単位(複数も可)はさらに、数「n」のAモジュールとQモジュールとの組合せ、すなわち6個〜24個のAモジュールとQモジュールとの組合せ(ここでモジュールAは配列番号20によるアミノ酸配列により表され、モジュールQは配列番号22によるアミノ酸配列により表される)と組み合わせられ、
(viii)式NRz(AQ)nNRZでは、数「z」の非反復(NR)単位、すなわち1個〜3個の非反復(NR)単位、例えば配列番号41によるアミノ酸配列で表される非反復(NR)単位NR3又は配列番号42によるアミノ酸配列で表される非反復(NR)単位NR4が存在し(z=1)、又は互いに組み合わせられ(z=2又は3)、上記非反復(NR)単位(複数も可)はさらに、数「n」のAモジュールとQモジュールとの組合せ、すなわち6個〜24個のAモジュールとQモジュールとの組合せ(ここでモジュールAは配列番号20によるアミノ酸配列により表され、モジュールQは配列番号22によるアミノ酸配列により表される)と組み合わせられ、上記AモジュールとQモジュールとの組合せはさらに、数「z」の非反復(NR)単位、すなわち1〜3個の非反復(NR)単位、例えば配列番号41によるアミノ酸配列で表される非反復(NR)単位NR3又は配列番号42によるアミノ酸配列で表される非反復(NR)単位NR4と組み合わせられ、
(ix)式(QAQ)oでは、数「o」のQモジュールと、Aモジュールと、Qモジュールとの組合せ、すなわち8個〜16個のQモジュールと、Aモジュールと、Qモジュールとの組合せ(ここでモジュールQは配列番号22によるアミノ酸配列で表され、モジュールAは配列番号20によるアミノ酸配列で表される)が互いに組み合わされ、
(x)式(QAQ)oNRzでは、数「o」のQモジュールと、Aモジュールと、Qモジュールとの組合せ、すなわち8個〜16個のQモジュールと、Aモジュールと、Qモジュールとの組合せ(ここでモジュールQは配列番号22によるアミノ酸配列で表され、モジュールAは配列番号20によるアミノ酸配列で表される)が互いに組み合わされ、上記Qモジュールと、Aモジュールと、Qモジュールとの組合せはさらに、数「z」の非反復(NR)単位、すなわち1個〜3個の非反復(NR)単位、例えば配列番号41によるアミノ酸配列で表される非反復(NR)単位NR3又は配列番号42によるアミノ酸配列で表される非反復(NR)単位NR4と組み合わせられ、
(xi)式NRz(QAQ)oでは、数「z」の非反復(NR)単位、すなわち1個〜3個の非反復(NR)単位、例えば配列番号41によるアミノ酸配列で表される非反復(NR)単位NR3又は配列番号42によるアミノ酸配列で表される非反復(NR)単位NR4が存在し(z=1)、又は互いに組み合わせられ(z=2又は3)、上記非反復(NR)単位(複数も可)はさらに、数「o」のQモジュールと、Aモジュールと、Qモジュールとの組合せ、すなわち8個〜16個のQモジュールと、Aモジュールと、Qモジュールとの組合せ(ここでモジュールQは配列番号22によるアミノ酸配列で表され、モジュールAは配列番号20によるアミノ酸配列で表される)と組み合わせられ、
(xii)式Ypでは、配列番号28によるアミノ酸配列で表される、数「p」のYモジュール、すなわち8個〜16個のYモジュールが互いに組み合わされ、
(xiii)式Xpでは、配列番号27によるアミノ酸配列で表される、数「p」のXモジュール、すなわち8個〜16個のXモジュールが互いに組み合わされ、
(xiv)式Kpでは、配列番号23によるアミノ酸配列で表される、数「p」のKモジュール、すなわち8個〜16個のKモジュールが互いに組み合わされる。
(i)(C)mNRz若しくはNRz(C)mにおけるzは1であり、mは2〜64(すなわち2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63又は64)の整数であり、(C)mNRz若しくはNRz(C)mにおけるzは2であり、mは2〜64(すなわち2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63又は64)の整数であり、若しくは(C)mNRz若しくはNRz(C)mにおけるzは3であり、mは2〜64(すなわち2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63又は64)の整数であり、
(ii)(AQ)nNRz若しくはNRz(AQ)nにおけるzは1であり、nは6〜24(すなわち6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23又は24)の整数であり、(AQ)nNRz若しくはNRz(AQ)nにおけるzは2であり、nは6〜24(すなわち6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23又は24)の整数であり、若しくは(AQ)nNRz若しくはNRz(AQ)nにおけるzは3であり、nは6〜24(すなわち6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23又は24)の整数であり、
(iii)NRz(QAQ)o若しくは(QAQ)oNRzにおけるzは1であり、oは8〜16(すなわち8、9、10、11、12、13、14、15又は16)の整数であり、NRz(QAQ)o若しくは(QAQ)oNRzにおけるzは2であり、oは8〜16(すなわち8、9、10、11、12、13、14、15又は16)の整数であり、若しくはNRz(QAQ)o若しくは(QAQ)oNRzにおけるzは3であり、oは8〜16(すなわち8、9、10、11、12、13、14、15又は16)の整数であり、
(iv)NRz(C)mNRzにおけるzは1であり、mは2〜64(すなわち2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63又は64)の整数であり、NRz(C)mNRzにおけるzは2であり、mは2〜64(すなわち2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63又は64)の整数であり、若しくはNRz(C)mNRzにおけるzは3であり、mは2〜64(すなわち2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63又は64)の整数であり、又は
(v)NRz(AQ)nNRzにおけるzは1であり、nは6〜24(すなわち6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23若しくは24)の整数であり、NRz(AQ)nNRzにおけるzは2であり、nは6〜24(すなわち6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23若しくは24)の整数であり、又はNRz(AQ)nNRzにおけるzは3であり、nは6〜24(すなわち6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23若しくは24)の整数であり、
NRは非反復単位、好ましくはNR3又はNR4を表す。
(i)アミノ酸配列GCGGGGGGSGGGG(配列番号35)からなるTAGCYS1、
(ii)アミノ酸配列GCGGGGGG(配列番号36)からなるTAGCYS2、
(iii)アミノ酸配列GCGGSGGGGSGGGG(配列番号37)からなるTAGCYS3、
(iv)アミノ酸配列GKGGGGGGSGGGG(配列番号38)からなるTAGLYS1、及び
(v)アミノ酸配列GKGGGGGG(配列番号39)からなるTAGLYS2
からなる群から選択されるアミノ末端及び/又はカルボキシ末端TAGを更に含む。
a)不溶性の標的タンパク質を含むタンパク質溶液を準備する工程と、
b)少なくとも1つの塩基の水溶液を、上記宿主細胞を破壊し、かつ/又は上記不溶性の宿主細胞部を可溶化するのに十分な量で上記溶液に添加する工程と、
c)該不溶性の標的タンパク質を、可溶化した不溶性の宿主細胞部から分離する工程と、
を含み、工程b)では、該標的タンパク質が依然として不溶性であり、該不溶性の宿主細胞部の少なくとも80%が可溶化する、タンパク質溶液から不溶性の標的タンパク質を単離する方法を提供する。
微生物細胞を室温で900バールの圧力でホモジナイザー[APV Gaulin GmbH、LAB60−15 RBFI]を用いて2回溶解/破壊した。得られる細胞残屑溶液を9000×gで30分間、20℃で遠心分離した。上清を廃棄し、細胞残屑沈降物を一段階の精製に用いた。
微生物細胞溶液の調製による細胞残屑沈降物(実施例1)の湿重量を、要求される希釈容量を調整するために求めた。細胞残屑沈降物(湿重量)と0.05MのNaOHとの比率は1:3(w/w)であった。本実施例では、細胞残屑沈降物は5グラムと測定された。したがってサンプル添加物の重量は15グラムと算出された。本実験の添加物は、A:0.05MのNaOH;B:0.05MのNaOH及び4.8Mの尿素、C:0.05MのNaOH及び0.1% Tween 20、D:4.8Mの尿素、E:2Mの塩酸グアニジン、又はF:0.1% Tween 20であった。全てのサンプルを十分にかき混ぜながら20℃で45分間インキュベートした。インキュベーション後、サンプルを8000×gで、30分間、20℃で遠心分離した(図1を参照されたい)。A、B及びCの沈降物は、ほとんど全てが高純度のC16標的タンパク質からなる白色ペレットを示した。サンプルD、サンプルE及びサンプルFでは、はっきりした相分離は観察されなかった。
微生物細胞の調製による細胞残屑沈降物の湿重量を、要求される希釈容量を調整するために求めた。細胞残屑沈降物(湿重量)と0.05MのNaOHとの比率は1:3(w/w)であった。本実施例では、細胞残屑沈降物は1キログラムと測定された。したがって0.05MのNaOHの重量は3kgと算出された(総重量:4kg)。サンプルを混合しながら20℃で45分間インキュベートした。インキュベーション後、サンプルを8000×gで、30分間、20℃で遠心分離した。この工程の後、C16標的タンパク質はペレット画分に存在し、上清は廃棄した。H2Oによる2回の更なる洗浄工程(8000×g、30分、20℃での遠心分離)を実施し、C16標的タンパク質の純度を増大させた。本実施例では、精製されたC16標的タンパク質の量を、Huemmerich et al., Biochemistry 2004, 43, 13604-13612に記載されたような精製方法のものと比較した。本方法と対比して、Huemmerich et al.による精製は、微生物細胞の調製による細胞破壊後に上清を用いて実施された。
標的タンパク質C16を含有する微生物細胞溶液を0.05MのNaOHで処理した。実施例1及び実施例2に記載のように、微生物細胞を、室温で900バールの圧力でホモジナイザー[APV Gaulin GmbH、LAB60−15 RBFI]を用いて2回溶解した。得られる細胞残屑溶液を9000×gで30分間、20℃で遠心分離した。上清を廃棄し、細胞残屑沈降物を一段階の精製に用いた。微生物細胞溶液の調製による細胞残屑沈降物(実施例1)の湿重量を、要求される希釈容量を調整するために求めた。細胞残屑沈降物(湿重量)と0.05MのNaOHとの比率は1:3(w/w)であった。
Claims (25)
- 無傷の又は破壊された宿主細胞の懸濁液から不溶性の組換え標的シルクタンパク質を精製する方法であって、
a)不溶性の組換え標的シルクタンパク質と不溶性の宿主細胞部とを含む無傷の又は破壊された宿主細胞の懸濁液を準備する工程と、
b)少なくとも1つの塩基の水溶液を、前記宿主細胞を破壊し、かつ/又は前記不溶性の宿主細胞部を可溶化するのに十分な量で前記懸濁液に添加する工程と、
c)該不溶性の組換え標的シルクタンパク質を、可溶化した不溶性の宿主細胞部から精製する工程と、
を含み、工程b)では、少なくとも1つの塩基が金属水酸化物又はアンモニアであり、不溶性の宿主細胞部の少なくとも80%が可溶化し、精製される不溶性の組換え標的シルクタンパク質が全精製工程を通して不溶性のままである、
方法。 - 宿主細胞が細菌、酵母、植物又は昆虫の宿主細胞である、請求項1に記載の方法。
- 精製した不溶性の組換え標的シルクタンパク質が、少なくとも80%の純度を有する、請求項1又は2に記載の方法。
- 金属水酸化物が、水酸化ナトリウム(NaOH)、水酸化カリウム(KOH)、及び水酸化カルシウム(Ca(OH)2)からなる群から選択されるか、又はそれらの組合せである、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 塩基が水酸化ナトリウム(NaOH)である、請求項4に記載の方法。
- 工程(b)での該塩基の最終濃度が、0.005M〜1Mの範囲である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- (i)工程b)の前での、(ii)工程b)中での、及び/又は(iii)工程b)の後での少なくとも1つの試薬の添加を更に含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 試薬が変性剤、コスモトロピック剤及び洗浄剤からなる群から選択されるか、又はそれらの組合せである、請求項7に記載の方法。
- (i)変性剤が尿素(CH4N2O)若しくは塩酸グアニジン(CH5N3HCl)であり、
(ii)コスモトロピック剤がリン酸塩若しくは硫酸塩であり、又は
(iii)洗浄剤がポリオキシエチレン(20)ソルビタンモノラウレート、オクチルフェノールエトキシレート、SDS若しくはポリアルキレングリコールエーテルである、請求項8に記載の方法。 - (i)尿素の最終濃度が0.1M〜10Mの範囲であり、又は
(ii)塩酸グアニジンの最終濃度が0.01M〜3Mの範囲である、請求項9に記載の方法。 - 工程c)における、可溶化した不溶性の宿主細胞部からの不溶性の組換え標的シルクタンパク質の精製が、遠心分離、沈降及び/又は濾過により達成される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 工程b)の後で、かつ工程c)の前に前記懸濁液の均質化工程b’)を更に含む、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法。
- 工程c)の後に、精製した不溶性の組換え標的シルクタンパク質を水溶液、有機溶液、及び/又は尿素で洗浄する工程d)を更に含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載の方法。
- 有機溶液が、エタノール(EtOH)、メタノール(CH3OH)、ヘキサン(C6H14)、ジエチルエーテル(C4H10O)及び/又はイソプロパノール(C3H8O)を含有する、請求項13に記載の方法。
- 不溶性の組換え標的シルクタンパク質が、少なくとも85%の前記標的シルクタンパク質からなるタンパク質凝集体を形成する、請求項1〜14のいずれか一項に記載の方法。
- 不溶性の組換え標的シルクタンパク質が、少なくとも2つの同一の反復単位を含むシルクタンパク質である、請求項1〜15のいずれか一項に記載の方法。
- シルクタンパク質が、各々が、
i)GPGXX(配列番号3)(ここでXはそれぞれA、S、G、Y、P及びQのアミノ酸から独立して選択される)、
ii)GGX(ここでXはY、P、R、S、A、T、N及びQのアミノ酸から選択される)、及び
iii)Ax(ここでAはAのアミノ酸であり、xは5〜10の整数である)
からなる群から選択されるコンセンサス配列を少なくとも1つ含む少なくとも2つの同一の反復単位を含む、請求項16に記載の方法。 - 反復単位が独立して、モジュールA(配列番号20)、モジュールC(配列番号21)、モジュールQ(配列番号22)、モジュールK(配列番号23)、モジュールsp(配列番号24)、モジュールS(配列番号25)、モジュールR(配列番号26)、モジュールX(配列番号27)若しくはモジュールY(配列番号28)、又はその変異体から選択される、請求項16又は17に記載の方法。
- シルクタンパク質が少なくとも1つの非反復(NR)単位を更に含む、請求項16〜18のいずれか一項に記載の方法。
- NR単位が、NR3(配列番号41)若しくはその変異体、又はNR4(配列番号42)若しくはその変異体である、請求項19に記載の方法。
- シルクタンパク質が、ADF−3(配列番号1)又はその変異体、ADF−4(配列番号2)又はその変異体、MaSp I(配列番号43)又はその変異体、MaSp II(配列番号44)又はその変異体、(C)m、(C)mNRz、NRz(C)m、NRz(C)mNRz、(AQ)n、(AQ)nNRz、NRz(AQ)n、NRz(AQ)nNRz 、(QAQ)o、NRz(QAQ)o、(QAQ)oNRz、Yp、Xp、及びKp(ここで、mは2〜64の整数であり、nは6〜24の整数であり、oは8〜16の整数であり、pは8〜16の整数であり、zは1〜3の整数であり、NRは非反復単位を表し、Cは反復単位のモジュールC(配列番号21)を表し、Aは反復単位のモジュールA(配列番号20)を表し、Qは反復単位のモジュールQ(配列番号22)を表し、Yは反復単位のモジュールY(配列番号28)を表し、Xは反復単位のモジュールX(配列番号27)を表し、Kは反復単位のモジュールK(配列番号23)を表す)からなる群から選択される、請求項16〜20のいずれか一項に記載の方法。
- シルクタンパク質が、C16NR4、C32NR4、(AQ)12NR3、(AQ)24NR3、(AQ)12、(AQ)24、C16、C32、NR4C16NR4、NR4C32NR4、NR3C16NR3、NR3C32NR3、NR4(AQ)12NR4、NR4(AQ)24NR4、NR3(AQ)12NR3、NR3(AQ)24NR3、(QAQ)8又は(QAQ)16である、請求項21に記載の方法。
- シルクタンパク質が、TAGCYS1(配列番号35)、TAGCYS2(配列番号36)、TAGCYS3(配列番号37)、TAGLYS1(配列番号38)及びTAGLYS2(配列番号39)からなる群から選択されるアミノ末端及び/又はカルボキシ末端のTAGを更に含む、請求項16〜22のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜23のいずれか一項に記載の方法が4℃〜60℃の温度で実施される、方法。
- 請求項1〜24のいずれか一項に記載の方法が10kPa〜1000kPaの圧力で実施される、方法。
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