CN103265615B - 一种人发中生物活性肽提取物及提取方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人发中提取生物活性肽（BAPs）的方法，对人发依次经二硫键还原剂、NH₂CONH₂、CH₅N₃·HCl和NaOH的处理，通过浓缩或稀释，用分光光度法调控活性肽含量，制得液相或固相剂型BAPs。制得的BAPs提取物用于制备治疗胃肠病的药物。该产品剂型多样，性能稳定，经压力蒸汽灭菌，无菌有效期可达2年，易于保存；原料来源充足，易于形成产业化生产。

Description

一种人发中生物活性肽提取物及提取方法和应用

技术领域

本发明涉及一类生物活性肽（biologically active peptides,BAPs）；尤其是涉及一种人发中的生物活性肽提取物BAPs；本发明还涉及该生物活性肽提取方法和BAPs在胃肠病治疗中的应用。

背景技术

胃肠病是一类常见病、高发病，特别是中老年人，占发病率的70%以上。胃肠病长期得不到有效治疗，严重影响人体营养的吸收和毒素的排出，致使免疫力大幅度下降，而引发诸如胃肠出血、穿孔甚至癌变等严重并发症。

胃肠病大多是由于有害菌引起胃肠黏膜发炎所致,其元凶当数幽门螺杆菌（HelicobacterPylori,HP），无论是各种胃黏膜炎症，还是胃肠溃疡，乃至于癌变都有它的参与。如HP到达胃黏膜后，通过白细胞呼吸爆发及脱颗粒释放氧自由基，产生大量脂质过氧化物（lipidperoxide,LPO），破坏胃黏膜的完整性。HP在胃肠病的发展中也起着举足轻重的作用。西医学对胃肠病的治疗除了使用抗酸剂、受体阻断剂和黏膜保护剂等药物治疗外，还非常注重杀菌消炎，通常同时使用两种抗生素。虽然暂时缓解了症状，消除了炎症，但采用抗生素在杀灭有害菌的同时，也杀灭了有益菌。胃肠失去有益菌的保护，一旦停药很容易再次感染，导致胃肠病反复发作，久治不愈，逐步演变成慢性胃肠病。

传统中药对胃肠病的治疗针对性差，药物剂量大，服用周期长。而且药物刺激更增大了胃肠黏膜的损伤，在胃肠病治疗方面存在“药多伤胃和见效缓慢”的问题。

生物制剂对胃肠病的治疗一般采用直接补充有益菌。肠道是人体的重要免疫器官，有益菌可以分泌一些抗原物质，激活并强化肠道的免疫系统。而生物制剂所补充的有益菌并非人体自身内部的菌群，这种有益菌医学上称为“外来菌”。虽然能使胃肠不适症状得到抑制和缓解，但由于人体生理功能会排斥“外来菌”，使“外来菌”难以在胃肠道定殖生存。临床表现为：吃有效，有依赖，一停药，易复发。

发明内容

本发明的目的在于提供一种人发中生物活性肽BAPs提取物。

本发明的另一目的在于提供一种人发中提取生物活性肽BAPs的方法。

本发明的又一目的在于提取的生物活性肽BAPs在制备胃肠病治疗药物中的应用。

本发明一种人发中生物活性肽提取物，通过以下步骤制得：

（1）定量称取经清洗、脱脂、干燥的人发，加7～10倍的0.4～2.0mol/L二硫键还原试剂，在70～100℃处理0.3～1小时；用透析法除去反应后产物中剩余的二硫键还原试剂，80±10℃干燥；

（2）在步骤1处理所得的产物中加7～10倍的5～10mol/L的NH₂CONH₂，在30～80℃处理12～24小时；用透析法除去反应后产物中剩余的NH₂CONH₂，80±10℃干燥；

（3）在步骤2处理所得的产物中加7～10倍的0.2～1mol/L的CH₅N₃·HCl，在30～80℃处理0.5～2小时；用透析法除去反应后产物中剩余的CH₅N₃·HCl，80±10℃干燥；

（4）在步骤3处理所得的产物中加7～10倍的0.5～3.0mol/LNaOH，在30～100℃处理0.5～4小时，用HCl调pH到7.3～7.5；

（5）对步骤（4）所得的产物通过浓缩或稀释，用分光光度法调控活性肽含量40～50mg/mL，通过透析或加入NaCl，用渗透压仪调控渗透压到300±20mOsm/L，封装灭菌，制得液相剂型生物活性肽BAPs；

或者对步骤（4）所得的产物通过浓缩或稀释，用分光光度法调控活性肽含量90～100mg/mL，通过透析或加入NaCl，用渗透压仪调渗透压到60±10mOsm/L，冷冻干燥，封装灭菌，制得固相剂型生物活性肽BAPs。

本发明一种人发中生物活性肽提取物的提取方法，包括以下步骤：

（1）定量称取经清洗、脱脂、干燥的人发，加7～10倍的0.4～2.0mol/L二硫键还原试剂，在70～100℃处理0.3～1小时；用透析法除去反应后产物中剩余的二硫键还原试剂，80±10℃干燥；

（2）在步骤1处理所得的产物中加7～10倍的5～10mol/L的NH₂CONH₂，在30～80℃处理12～24小时；用透析法除去反应后产物中剩余的NH₂CONH₂，80±10℃干燥；

（3）在步骤2处理所得的产物中加7～10倍的0.2～1mol/L的CH₅N₃·HCl，在30～80℃处理0.5～2小时；用透析法除去反应后产物中剩余的CH₅N₃·HCl，80±10℃干燥；

（4）在步骤3处理所得的产物中加7～10倍的0.5～3.0mol/LNaOH，在30～100℃处理0.5～4小时，用HCl调pH到7.3～7.5；

（5）对步骤（4）所得的产物通过浓缩或稀释，用分光光度法调控活性肽含量40～50mg/mL，通过透析或加入NaCl，用渗透压仪调控渗透压到300±20mOsm/L，封装灭菌，制得液相剂型生物活性肽BAPs；

或者对步骤（4）所得的产物通过浓缩或稀释，用分光光度法调控活性肽含量90～100mg/mL，通过透析或加入NaCl，用渗透压仪调渗透压到60±10mOsm/L，冷冻干燥，封装灭菌，制得固相剂型生物活性肽BAPs。

本发明将上述人发中生物活性肽提取物用于制备治疗胃肠病药物中。

上述BAPs提取物，经液相色谱-电喷雾-四极杆飞行时间串联质谱（LC-ESI-MS/MS）分析，结果显示含有分子量从1000～7000D的多种肽，具有以下特性和功能：

1、BAPs是蛋白质的降解产物，分子量远少于蛋白质，到达胃肠后无需再酶解或水解，利用肽自身的活性和能量主动直接吸收，并以完整的形式被利用，即时充分发挥其功能特性。

2、经实验证实，BAPs具有类似于抗菌肽的抗菌活性。它们不是抗菌素，却能起到有效杀灭致病菌的效果，具有高效防腐的功能。对于HP相关性胃肠病的治疗，根除HP是首选的治疗手段，而本品对杀灭HP有比较理想的效果。

3、BAPs富含巯基，抗体分子含有相当数量的二硫键，巯基正好为抗体的合成提供大量的二硫键。从而调节机体免疫系统的功能，提高抗感染能力，有利于胃肠损伤组织的修复，有效防止胃肠病的复发。

4、近年来研究发现，胃肠溃疡患者血清中丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量明显升高，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性明显降低，认为胃肠溃疡的发生与氧自由基有密切关系。还发现自由基与HP阳性胃癌的发生也密切相关。自由基通过破坏胃上皮细胞增殖与凋亡的平衡，产生亚硝酸盐等致癌物质，直接损伤DNA而导致基因变异，促使癌变发生。由于BAPs富含巯基，有较强的还原性，具有强抗氧化作用，能有效清除自由基。

5、过去一直认为胃酸分泌过多是造成胃肠溃疡发病的原因之一，确切地说应该是胃液中游离酸过多是造成胃肠溃疡发病的原因之一。BAPs可以结合胃液中过剩的游离酸，而得以有效治疗和预防胃肠溃疡病。

6、BAPs具有细胞粘附的功能信息，可诱导细胞分泌一些细胞因子。目前认为与胃肠溃疡关系密切的细胞因子有转化生长因子（transforming growth factor,TGF），血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）,碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）等。在胃肠溃疡的愈合过程中，它们通过不同的途径发挥其生物学作用。且部分抗溃疡药正是通过细胞因子的介导而提高溃疡愈合的质量，减少复发。

该产品剂型多样，性能稳定，经压力蒸汽灭菌，无菌有效期可达2年，易于保存；原料来源充足，易于形成产业化生产。

具体实施方式

实施例一

（1）定量称取经清洗、脱脂、干燥的人发，加8倍的0.5mol/L C₄H₁₀O₂S₂，在80℃处理1小时；用透析法除去反应后产物中剩余的C₄H₁₀O₂S₂，80±10℃干燥；

（2）在步骤1所得的产物中加10倍的9mol/L的NH₂CONH₂，在40℃处理20小时；用透析法除去反应后产物中剩余的NH₂CONH₂，80±10℃干燥；

（3）在步骤2所得的产物中加8倍的0.4mol/L的CH₅N₃·HCl，在30℃处理1.5小时；用透析法除去反应后产物中剩余的CH₅N₃·HCl，80±10℃干燥；

（4）在步骤3所得的产物中加10倍的0.6mol/L NaOH，在100℃处理0.6小时，用HCl调pH到7.4；通过稀释，用分光光度法调控活性肽含量50mg/mL，通过加入NaCl，用渗透压仪调控渗透压到300±20mOsm/L，封装灭菌，制得液相剂型BAPs。

实施例二

（1）定量称取经清洗、脱脂、干燥的人发，加10倍1.8mol/L C₂H₆OS，在100℃处理0.4小时；用透析法除去反应后产物中剩余的C₂H₆OS，80±10℃干燥；

（2）在步骤1所得的产物中加8倍的6mol/L的NH₂CONH₂，在80℃处理14小时；用透析法除去反应后产物中剩余的NH₂CONH₂，80±10℃干燥；

（3）在步骤2所得的产物中加9倍的0.8mol/L的CH₅N₃·HCl，在70℃处理0.8小时；用透析法除去反应后产物中剩余的CH₅N₃·HCl，80±10℃干燥；

（4）在步骤3所得的产物中加10倍的2.0mol/L NaOH，在30℃处理4小时，用HCl调pH到7.4；通过浓缩，用分光光度法调控活性肽含量100mg/mL。通过透析，用渗透压仪调控渗透压到60±10mOsm/L。

（5）步骤4所得的产物，冷冻干燥，封装灭菌，制得固相剂型BAPs。

用实施例一制得的液相剂型BAPs治疗大鼠胃溃疡（gastric ulcer,GU）的疗效观察如下：

将健康Wistar大鼠随机分为4组，即1（正常对照）组、2（GU模型）组、3（欣洛维治疗）组，4（BAPs治疗）组，每组12只。1组于胃窦前壁注入30μL生理盐水，其余3个组均于胃窦前壁注入30μL冰乙酸达胃壁肌层与浆膜层之间，建立大鼠GU模型。造模成功后，1组和2组不给予药物干预，自由饮水；3组给欣洛维2.0mg/kg·d（相当于成人的剂量/kg/d），4组给BAPs1.0mg/kg/d，连续14d灌服。采用试剂盒测定血清中MDA含量和SOD活性，取材测量胃黏膜溃疡面积(Gastric ulcer area,GUA)，并计算愈合率（Gastric mucosa ulcer healing rate,GUHR），GUHR(%)=(1-3组或4组的GUA均值/2组的GUA均值)×100%。

表1BAPs治疗大鼠GU疗效观察

组别	n	GUHR(%)	MDA（nmol/mL）	SOD（U/mL）
					1（正常对照）组	12	－	10.1±3.2	224±18
2（GU模型）组	12	－	27.6±5.6*	113±11*
					3(欣洛维治疗)组	12	78.7	13.7±4.2※	181±15※
4（BAPs治疗）组	12	87.4	12.1±3.5※	205±16※

与1组比较：*p＜0.01；与2组比较：^※p＜0.01

MDA是脂质过氧化反应的分解产物，具有很强的生物毒性，可加重溃疡的形成。SOD是需氧代谢细胞中清除自由基的主要酶之一，可对抗和阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞。当胃黏膜损伤时，表现为MDA的含量升高，SOD的活性降低。BAPs可能是通过增加组织中SOD的活性而减轻了对胃粘膜的损害，从而起到了加速溃疡愈合的作用。实验结果表明，与1组比较，2组MDA含量显著升高(p＜0.01)，SOD活性显著降低(p＜0.01)。与2组比较，3组MDA含量显著降低(p＜0.01)，SOD活性显著升高(p＜0.01)；4组MDA含量显著降低(p＜0.01)，SOD活性显著升高(p＜0.01)，而且GUHR高达87.4%。说明BAPs具有明显的抗胃溃疡作用。

用实施例二制得的固相剂型BAPs治疗大鼠慢性萎缩性胃炎（chronic atrophic gastritis,CAG）的疗效观察如下：

将健康Wistar大鼠随机分为4组，即1（正常对照）组、2（CAG模型）组、3（维酶素治疗）组，4（BAPs治疗）组，每组12只。除1组予生理盐水灌胃外，其余3个组均用水杨酸钠灌胃联合自由饮用氨水法建立大鼠CAG模型。造模成功后，1组和2组不给予药物干预，自由饮水；3组给维霉素350mg/kg·d（相当于成人的剂量/kg/d），4组给BAPs1.0mg/kg/d连续50d灌服。采用酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbentassay,ELISA）测定血清生长抑素（somatostatin,SS）和胃泌素（gastrin,Gas）的含量，取材测量胃黏膜损伤面积(gastric mucosa injury area,GMIA)，并计算愈合率（Gastric mucosainjury healing rate,GMIHR），GMIHR(%)=(1-3组或4组的GMIA均值/2组的GMIA均值)×100%。

表2BAPs治疗大鼠CAG疗效观察

组别	n	GMIHR(%)	SS（pg/mL）	Gas（pg/mL）
					1（正常对照）组	12	－	4.10±1.07	69.15±8.72
2（CAG模型）组	12	－	47.91±8.13*	35.87±4.75*
					3(维酶素治疗)组	12	78.5	23.25±5.21#	54.45±6.73#

4（BAPs治疗）组

12

89.3

6.59±1.53※

65.21±8.18※

与1组比较：*p＜0.01；与2组比较：#p＜0.05，^※p＜0.01

Gas是由胃及十二指肠G细胞合成、分泌的胃肠道多肽激素，既能刺激胃酸和胃蛋白酶的分泌，又能通过增加DNA、RNA及蛋白的合成来刺激胃黏膜细胞的生长，增加胃黏膜血流量，从而发挥营养胃黏膜的功能。CAG患者随着胃窦萎缩的不断加重，G细胞数量不断减少，Gas的含量随之下降。胃肠激素中的SS作为人体内重要的炎症负性调节肽之一。正常情况下，SS不但能抑制胃酸和胃蛋白酶分泌，而且还能与Gas组成Gas-SS-胃酸分泌轴，维持胃肠的正常生理功能。SS的异常表达可导致组织细胞生长调节失控，最终形成肿瘤。本实验结果显示:与1组比较，2组SS含量显著升高(p＜0.01)，Gas含量显著降低(p＜0.01)。与2组比较，3组SS含量明显下降(p＜0.05)，Gas含量明显升高(p＜0.05)；4组SS含量显著下降(p＜0.01)，Gas含量显著升高(p＜0.01)。BAPs可通过升高CAG大鼠血清Gas含量，降低血清SS含量：①使Gas-SS-胃酸分泌轴正常发挥，促进Gas、胃酸、胃蛋白酶等分泌，纠正低酸状态，发挥其保护胃黏膜、促进腺体的再生、增加胃黏膜血流的作用。②发挥调节细胞凋亡、修复胃黏膜损伤。BAPs通过以上作用来实现对CAG大鼠胃黏膜病理改变的修复，达到治疗CAG的目的。GMIHR高达89.3%，说明BAPs治疗大鼠CAG，疗效显著。

本发明的以上具体实施方式并不是对本发明保护范围的限定，本发明的具体实施方式不限于此，因此，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，对本发明做出的其它多种形式的修改、替换或变更，均落在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种人发中生物活性肽提取物，其特征在于通过以下步骤制得：

（1）定量称取经清洗、脱脂、干燥的人发，加7～10倍的0.4～2.0mol/L二硫键还原试剂，在70～100℃处理0.3～1小时；用透析法除去反应后产物中剩余的二硫键还原试剂，80±10℃干燥；

（2）在步骤1处理所得的产物中加7～10倍的5～10mol/L的NH₂CONH₂，在30～80℃处理12～24小时；用透析法除去反应后产物中剩余的NH₂CONH₂，80±10℃干燥；

（3）在步骤2处理所得的产物中加7～10倍的0.2～1mol/L的CH₅N₃·HCl，在30～80℃处理0.5～2小时；用透析法除去反应后产物中剩余的CH₅N₃·HCl，80±10℃干燥；

（4）在步骤3处理所得的产物中加7～10倍的0.5～3.0mol/LNaOH，在30～100℃处理0.5～4小时，用HCl调pH到7.3～7.5；

（5）对步骤（4）所得的产物通过浓缩或稀释，用分光光度法调控活性肽含量40～50mg/mL，通过透析或加入NaCl，用渗透压仪调控渗透压到300±20mOsm/L，封装灭菌，制得液相剂型生物活性肽BAPs；

或者对步骤（4）所得的产物通过浓缩或稀释，用分光光度法调控活性肽含量90～100mg/mL，通过透析或加入NaCl，用渗透压仪调控渗透压到60±10mOsm/L，冷冻干燥，封装灭菌，制得固相剂型生物活性肽BAPs。

2.一种权利要求1所述人发中生物活性肽提取物的提取方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）定量称取经清洗、脱脂、干燥的人发，加7～10倍的0.4～2.0mol/L二硫键还原试剂，在70～100℃处理0.3～1小时；用透析法除去反应后产物中剩余的二硫键还原试剂，80±10℃干燥；

（2）在步骤1处理所得的产物中加7～10倍的5～10mol/L的NH₂CONH₂，在30～80℃处理12～24小时；用透析法除去反应后产物中剩余的NH₂CONH₂，80±10℃干燥；

（3）在步骤2处理所得的产物中加7～10倍的0.2～1mol/L的CH₅N₃·HCl，在30～80℃处理0.5～2小时；用透析法除去反应后产物中剩余的CH₅N₃·HCl，80±10℃干燥；

（4）在步骤3处理所得的产物中加7～10倍的0.5～3.0mol/LNaOH，在30～100℃处理0.5～4小时，用HCl调pH到7.3～7.5；

（5）对步骤（4）所得的产物通过浓缩或稀释，用分光光度法调控活性肽含量40～50mg/mL，通过透析或加入NaCl，用渗透压仪调控渗透压到300±20mOsm/L，封装灭菌，制得液相剂型生物活性肽BAPs；

或者对步骤（4）所得的产物通过浓缩或稀释，用分光光度法调控活性肽含量90～100mg/mL，通过透析或加入NaCl，用渗透压仪调控渗透压到60±10mOsm/L，冷冻干燥，封装灭菌，制得固相剂型生物活性肽BAPs。

3.权利要求1所述生物活性肽提取物在制备治疗胃肠病药物中的应用。