CN113512574A - 一种重组角蛋白生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组角蛋白生产方法，包括如下步骤，重组角蛋白发酵准备，空罐灭菌，实罐灭菌，重组角蛋白接种，重组角蛋白发酵，取样检测，破菌，纯化，精纯化，Q柱纯化以及洗脱等工艺步骤。本发明为重组角蛋白的发酵和纯化分离提供了一种可行的大规模生产方法，整个生产过程能够保证重组角蛋白氨基酸结构的完整性，并且重组角蛋白的分离纯度较高，使得重组角蛋白不仅能够应用到药品、医疗器械、化妆品等更多的领域和能够发挥更好的功效。
Description
技术领域
本发明涉及角蛋白生产技术领域，尤其是涉及一种重组角蛋白生产方法。
背景技术
角蛋白是纤维结构蛋白家族之一，它是构成头发、角、爪和人体皮肤外层的主要蛋白质，角蛋白可保护上皮组织细胞免受损伤或者压力，随着科技的发展，由于角蛋白具有高抗性的理化性质和特殊的生物学作用，在维持表皮正常的生理功能中起着重要的作用，因此，角蛋白常用于饲料和食品工业、制药、肥料、农药、化妆品等各个领域，应用范围十分广泛。
以前角蛋白都是通过采用强酸或者强碱将人体毛发、羊毛或者羽绒等进行水解后提取，但是该步骤会导致角蛋白中一些有益的氨基酸在水解的过程中被完全破坏。另外一方面是角蛋白的分离难度大，使得能够得到的角蛋白量少，严重限制了角蛋白在各个领域中的应用。随着科技的发展，现在已经研究出了重组角蛋白，但是重组角蛋白的工业生产是亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术中的上述问题，本发明提出了一种重组角蛋白生产方法，解决了现在的重组角蛋白如何实现工业生产等技术问题。
本发明的技术方案为：一种重组角蛋白生产方法，包括如下步骤：
S1、发酵准备：配置需要用灭菌锅灭菌的种子培养液，灭菌锅灭菌，配置发酵罐盐培养基1，清洗发酵罐；
S2、空罐灭菌：灭菌前关闭发酵罐所有阀门，打开蒸汽发生器，15～25min后，在控制面板点击灭菌操作，进行多阶段灭菌；
S3、实罐灭菌：取出灭菌锅灭菌的溶液，混合补料，排水，加入发酵罐盐培养基1后进行灭菌；
S4、接种，将重组角蛋白种子液接种在冷却至室温的种子液培养基中；
S5、发酵：发酵罐准备，打开发酵罐的搅拌开关，将发酵罐的转速、温度、流速由手动设置为自动；在发酵罐罐顶阀处点燃酒精棉，再打开罐顶阀，加入接种的种子液培养基，再加入发酵罐盐培养基2，关闭罐顶阀，开始发酵；
S6、取样：调节转速为300～700rpm，加碱调节PH值为7.0～7.5，加补料，诱导，诱导后取样检测，将发酵罐的温度、转速、压力、流速、PH值由自动设置为手动，然后将发酵液进行离心操作，收集沉淀得到菌体在冰箱中保存，发酵结束；
S7、破菌：从冰箱中取出菌体，按照1：20加入25mmol/L磷酸氢二钠十二水溶液，搅拌溶解，用高压匀浆机破菌，将高压匀浆机的压力设置为800～1200Bar，温度设置为4～6℃，破菌5次，离心收集菌体沉淀；
S8、纯化：配置平衡缓冲液，配制8mol/L的尿素，按25Mm/L的量加入PB溶液，溶解过滤，PH值调至7.8，用1mol/L尿素溶液洗涤菌体沉淀，离心收集菌体沉淀，用8mol/L尿素溶液溶解菌体沉淀，加入适量的PB溶液，用磁力搅拌器搅拌，然后离心后取上清液，用平衡缓冲液稀释后过滤，调节其PH值为7.8，作为上样样品；
打开紫外检测仪和蠕动泵，将蠕动泵的数值调到8.0用纯水将1L层析柱填料中的20％酒精冲洗干净，纯水冲洗后，用平衡缓冲液冲洗层析柱，使得紫外检测仪数值稳定，将紫外检测仪的光量值调到零；
将上样样品注入到层析柱内，然后用平衡缓冲液冲洗层析柱后，用洗脱液1和洗脱液2依次进行洗脱，同时分别收集样品；
S9、透析：选取透析袋，将样品装入透析袋内并封闭透析袋，将装入样品的透析袋放入25mmol/L磷酸氢二钠十二水溶液的透析液中过夜，取出，抽滤得到重组角蛋白样品；
S10、Q柱纯化：将保存好的Q柱连接到纯化仪上，调节流速为5.0，打开纯化仪电源进行清洗；
配置上样平衡液、洗脱液3和洗脱液4；
用纯水冲洗Q柱，然后上样平衡液，观察紫外吸收度数值，直至其数值平稳无波动后归零；
将重组角蛋白样品注入Q柱内，流速调为3.0，观察吸光度数值变化，当数值快速上升至一定数值时，接收出液管流出的液体即为穿透液，当吸光度数值开始下降至一定数值时停止接受，并记录下降值；
S11、洗脱：重组角蛋白样品上样完后，向Q柱内继续注入上样平衡液，待穿透液接收完成后，至吸光度数值再次平衡稳定后，将上样平衡液换成洗脱液3，当吸光度数值上升至一定值后开始下降，下降至一定数值即停止接收，并记录下峰值；洗脱液3上样完毕后，继续上样平衡液，待洗脱液3接收完毕后，将出液管放入废液桶内，至吸光度数值再次平衡稳定后，继续上样洗脱液4，待吸光度数值快速上升至一定数值时将出液管放入干净的锥形瓶中接收液体即为洗脱液4，当吸光度数值上升至一定值后开始下降，下降至一定数值即停止接收，并记录下峰值；
S12、清洗Q柱并封口保存。
优选地，按质量计算，所述S1步骤中种子液培养基按照每升种子液精准称取YeastExtract 10g、Tryptone 20g，NaCl 20g，葡萄糖10g用蒸馏水溶解并定容至2L，并且在121℃下灭菌30min。
优选地，按质量计算，所述S1步骤中发酵罐盐培养基1的配置方法：按照每升种子液精准称取磷酸氢二钠十二水500g，磷酸二氢钾50g，氯化铵20g，氯化钠15g，消泡剂1ml，酵母粉80g，蛋白胨100g，用纯水溶解并定容至18L，并且在121℃下灭菌30min。
优选地，按质量计算，所述S5步骤中发酵罐盐培养基2的配置方法：按照每升种子液精准称取七水硫酸镁20g，葡萄糖100g加蒸馏水配制为0.2L。
优选地，所述步骤S2中多阶段灭菌包括如下步骤：灭菌第一阶段，打开夹套排水阀门，蒸汽进入夹套，罐体升温至98℃后，进入下一阶段；灭菌第二阶段，关闭夹套排水阀门，打开罐顶排气阀，保持罐内压力为正，打开排冷凝水阀，打开蒸汽进入空气管路的阀门，当蒸汽进入罐体后，打开罐底蒸汽进入阀门，再打开罐底阀，加快升温，当升至121℃后，进入下一阶段；灭菌第三阶段，关闭罐底阀，打开取样阀，保温30min后进入下一阶段；灭菌第四阶段，打开空气进气阀门与空气流量计，依次关闭蒸汽进入空气管路的阀门、取样阀和罐底蒸汽进入阀门，停止运行蒸汽发生器，排空蒸汽发生器内的蒸汽，当温度降至110℃进入下一阶段；灭菌第五阶段，继续降温至45℃进入下一阶段。灭菌第六阶段，继续降温至设定温度，灭菌结束；灭菌结束后，先关闭排气阀，等压力达到0.06～0.07Mpa后再关空气进气阀门与空气流量计。
优选地，所述步骤S3中补料包括补料1和补料2，所述补料1的配置方法按照每升补料1称取甘油或者葡萄糖500g用纯水溶解并定容至700ml，121℃灭菌30min；按照每升补料1称取Yeast Extract 100g、Tryptone 60g用纯水溶解并定容至300ml，然后将700ml与300ml溶液混合均匀作为补料1；所述补料2的配置方法为按照每升补料2称取IPTG50g并用纯水配制在无菌环境中过滤得到补料2。
优选地，所述步骤S8中的洗脱液1为加了50mM咪唑的平衡液，洗脱液2为加了100mM咪唑的平衡液。
优选地，所述步骤S10中上样平衡液的配制方法为配制8mol/L的尿素，按25mM/L的量加入PB，溶解过滤，调PH至9.0。
优选地，所述步骤S10中洗脱液3的制备方法为在上样平衡液中按0.1mol/L的量NaCl；洗脱液4的制备方法为在上样平衡液中按0.3mol/L的量加入NaCl。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明为重组角蛋白的发酵和纯化分离提供了一种可行的大规模生产方法，整个生产过程能够保证重组角蛋白氨基酸结构的完整性，并且重组角蛋白的分离纯度较高，使得重组角蛋白不仅能够应用到更多的领域，还能够发挥更好的功效。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明中的技术方案进一步说明。
实施例1
一种重组角蛋白生产方法，包括如下步骤：
S1、发酵准备：配置需要用灭菌锅灭菌的种子培养液，灭菌锅灭菌，配置发酵罐盐培养基，清洗发酵罐；
S2、空罐灭菌：灭菌前关闭发酵罐所有阀门，打开蒸汽发生器，15min后，在控制面板点击灭菌操作，进行多阶段灭菌；
S3、实罐灭菌：取出灭菌锅灭菌的溶液，混合补料，排水，加入发酵罐盐培养基1后进行灭菌；
S4、接种，将重组角蛋白种子液接种在冷却至室温的种子液培养基中；
S5、发酵：发酵罐准备，打开发酵罐的搅拌开关，将发酵罐的转速、温度、流速由手动设置为自动；在发酵罐罐顶阀处点燃酒精棉，再打开罐顶阀，加入接种的种子液培养基，再加入发酵罐盐培养基2，关闭罐顶阀，开始发酵；
S6、取样：调节转速为300rpm，加碱调节PH值为7.5，加补料，诱导，诱导后取样检测，将发酵罐的温度、转速、压力、流速、PH值由自动设置为手动，然后将发酵液进行离心操作，收集沉淀得到菌体在冰箱中保存，发酵结束；
S7、破菌：从冰箱中取出菌体，按照1：20加入25mmol/L磷酸氢二钠十二水溶液，搅拌溶解，用高压匀浆机破菌，将高压匀浆机的压力设置为800Bar，温度设置为4℃，破菌5次，离心收集菌体沉淀；
S8、纯化：配置平衡缓冲液，配制8mol/L的尿素，按25Mm/L的量加入PB溶液，溶解过滤，PH值调至7.8，用1mol/L尿素溶液洗涤菌体沉淀，离心收集菌体沉淀，用8mol/L尿素溶液溶解菌体沉淀，加入适量的PB溶液，用磁力搅拌器搅拌，然后离心后取上清液，用平衡缓冲液稀释后过滤，调节其PH值为7.8，作为上样样品；
打开紫外检测仪和蠕动泵，将蠕动泵的数值调到8.0用纯水将1L层析柱填料中的20％酒精冲洗干净，纯水冲洗后，用平衡缓冲液冲洗层析柱，使得紫外检测仪数值稳定，将紫外检测仪的光量值调到零；
将上样样品注入到层析柱内，然后用平衡缓冲液冲洗层析柱后，用洗脱液1和洗脱液2依次进行洗脱，同时分别收集样品；
S9、透析：选取透析袋，将样品装入透析袋内并封闭透析袋，将装入样品的透析袋放入25mmol/L磷酸氢二钠十二水溶液的透析液中过夜，取出，抽滤得到重组角蛋白样品；
S10、Q柱纯化：将保存好的Q柱连接到纯化仪上，调节流速为5.0，打开纯化仪电源进行清洗；
配置上样平衡液、洗脱液3和洗脱液4；
用纯水冲洗Q柱，然后上样平衡液，观察紫外吸收度数值，直至其数值平稳无波动后归零；
将重组角蛋白样品注入Q柱内，流速调为3.0，观察吸光度数值变化，当数值快速上升至一定数值时，接收出液管流出的液体即为穿透液，当吸光度数值开始下降至一定数值时停止接受，并记录下降值；
S11、洗脱：重组角蛋白样品上样完后，向Q柱内继续注入上样平衡液，待穿透液接收完成后，至吸光度数值再次平衡稳定后，将上样平衡液换成洗脱液3，当吸光度数值上升至一定值后开始下降，下降至一定数值即停止接收，并记录下峰值；洗脱液3上样完毕后，继续上样平衡液，待洗脱液3接收完毕后，将出液管放入废液桶内，至吸光度数值再次平衡稳定后，继续上样洗脱液4，待吸光度数值快速上升至一定数值时将出液管放入干净的锥形瓶中接收液体即为洗脱液4，当吸光度数值上升至一定值后开始下降，下降至一定数值即停止接收，并记录下峰值；
S12、清洗Q柱并封口保存。
按质量计算，所述S1步骤中种子液培养基按照每升种子液精准称取YeastExtract 10g、Tryptone 20g，NaCl 20g，葡萄糖10g用蒸馏水溶解并定容至2L，并且在121℃下灭菌30min。
按质量计算，所述S1步骤中发酵罐盐培养基1的配置方法：按照每升种子液精准称取磷酸氢二钠十二水500g，磷酸二氢钾50g，氯化铵20g，氯化钠15g，消泡剂1ml，酵母粉80g，蛋白胨100g，用纯水溶解并定容至18L，并且在121℃下灭菌30min。
按质量计算，所述S5步骤中发酵罐盐培养基2的配置方法：按照每升种子液精准称取七水硫酸镁20g，葡萄糖100g加蒸馏水配制为0.2L。
所述步骤S2中多阶段灭菌包括如下步骤：灭菌第一阶段，打开夹套排水阀门，蒸汽进入夹套，罐体升温至98℃后，进入下一阶段；灭菌第二阶段，关闭夹套排水阀门，打开罐顶排气阀，保持罐内压力为正，打开排冷凝水阀，打开蒸汽进入空气管路的阀门，当蒸汽进入罐体后，打开罐底蒸汽进入阀门，再打开罐底阀，加快升温，当升至121℃后，进入下一阶段；灭菌第三阶段，关闭罐底阀，打开取样阀，保温30min后进入下一阶段；灭菌第四阶段，打开空气进气阀门与空气流量计，依次关闭蒸汽进入空气管路的阀门、取样阀和罐底蒸汽进入阀门，停止运行蒸汽发生器，排空蒸汽发生器内的蒸汽，当温度降至110℃进入下一阶段；灭菌第五阶段，继续降温至45℃进入下一阶段。灭菌第六阶段，继续降温至设定温度，灭菌结束；灭菌结束后，先关闭排气阀，等压力达到0.06～0.07Mpa后再关空气进气阀门与空气流量计。所述步骤S3中补料包括补料1和补料2，所述补料1的配置方法按照每升补料1称取甘油或者葡萄糖500g用纯水溶解并定容至700ml，121℃灭菌30min；按照每升补料1称取YeastExtract 100g、Tryptone 60g用纯水溶解并定容至300ml，然后将700ml与300ml溶液混合均匀作为补料1；所述补料2的配置方法为按照每升补料2称取IPTG50g并用纯水配制在无菌环境中过滤得到补料2。所述步骤S8中配制平衡液的方法为配制5L 8mol/L的尿素，按25mM/L的量加入PB，溶解过滤，调节PH至7.8。
所述步骤S8中的洗脱液1为加了50mM咪唑的平衡液，洗脱液2为加了100mM咪唑的平衡液。
所述步骤S10中上样平衡液的配制方法为配制8mol/L的尿素，按25mM/L的量加入PB，溶解过滤，调PH至9.0。
所述步骤S10中洗脱液3的制备方法为在上样平衡液中按0.1mol/L的量NaCl；洗脱液4的制备方法为在上样平衡液中按0.3mol/L的量加入NaCl。
实施例2
一种重组角蛋白生产方法，包括如下步骤：
S1、发酵准备：配置需要用灭菌锅灭菌的种子培养液，灭菌锅灭菌，配置发酵罐盐培养基1，清洗发酵罐；
S2、空罐灭菌：灭菌前关闭发酵罐所有阀门，打开蒸汽发生器，20min后，在控制面板点击灭菌操作，进行多阶段灭菌；
S3、实罐灭菌：取出灭菌锅灭菌的溶液，混合补料，排水，加入发酵罐盐培养基1后进行灭菌；
S4、接种，将重组角蛋白种子液接种在冷却至室温的种子液培养基中；
S5、发酵：发酵罐准备，打开发酵罐的搅拌开关，将发酵罐的转速、温度、流速由手动设置为自动；在发酵罐罐顶阀处点燃酒精棉，再打开罐顶阀，加入接种的种子液培养基，再加入发酵罐盐培养基2，关闭罐顶阀，开始发酵；
S6、取样：调节转速为500rpm，加碱调节PH值为7.2，加补料，诱导，诱导后取样检测，将发酵罐的温度、转速、压力、流速、PH值由自动设置为手动，然后将发酵液进行离心操作，收集沉淀得到菌体在冰箱中保存，发酵结束；
S7、破菌：从冰箱中取出菌体，按照1：20加入25mmol/L磷酸氢二钠十二水溶液，搅拌溶解，用高压匀浆机破菌，将高压匀浆机的压力设置为1000Bar，温度设置为5℃，破菌5次，离心收集菌体沉淀；
S8、纯化：配置平衡缓冲液，配制8mol/L的尿素，按25Mm/L的量加入PB溶液，溶解过滤，PH值调至7.8，用1mol/L尿素溶液洗涤菌体沉淀，离心收集菌体沉淀，用8mol/L尿素溶液溶解菌体沉淀，加入适量的PB溶液，用磁力搅拌器搅拌，然后离心后取上清液，用平衡缓冲液稀释后过滤，调节其PH值为7.8，作为上样样品；
打开紫外检测仪和蠕动泵，将蠕动泵的数值调到8.0用纯水将1L层析柱填料中的20％酒精冲洗干净，纯水冲洗后，用平衡缓冲液冲洗层析柱，使得紫外检测仪数值稳定，将紫外检测仪的光量值调到零；
将上样样品注入到层析柱内，然后用平衡缓冲液冲洗层析柱后，用洗脱液1和洗脱液2依次进行洗脱，同时分别收集样品；
S9、透析：选取透析袋，将样品装入透析袋内并封闭透析袋，将装入样品的透析袋放入25mmol/L磷酸氢二钠十二水溶液的透析液中过夜，取出，抽滤得到重组角蛋白样品；
S10、Q柱纯化：将保存好的Q柱连接到纯化仪上，调节流速为5.0，打开纯化仪电源进行清洗；
配置上样平衡液、洗脱液3和洗脱液4；
用纯水冲洗Q柱，然后上样平衡液，观察紫外吸收度数值，直至其数值平稳无波动后归零；
将重组角蛋白样品注入Q柱内，流速调为3.0，观察吸光度数值变化，当数值快速上升至一定数值时，接收出液管流出的液体即为穿透液，当吸光度数值开始下降至一定数值时停止接受，并记录下降值；
S11、洗脱：重组角蛋白样品上样完后，向Q柱内继续注入上样平衡液，待穿透液接收完成后，至吸光度数值再次平衡稳定后，将上样平衡液换成洗脱液3，当吸光度数值上升至一定值后开始下降，下降至一定数值即停止接收，并记录下峰值；洗脱液3上样完毕后，继续上样平衡液，待洗脱液3接收完毕后，将出液管放入废液桶内，至吸光度数值再次平衡稳定后，继续上样洗脱液4，待吸光度数值快速上升至一定数值时将出液管放入干净的锥形瓶中接收液体即为洗脱液4，当吸光度数值上升至一定值后开始下降，下降至一定数值即停止接收，并记录下峰值；
S12、清洗Q柱并封口保存。
按质量计算，所述S1步骤中种子液培养基按照每升种子液精准称取YeastExtract 10g、Tryptone 20g，NaCl 20g，葡萄糖10g用蒸馏水溶解并定容至2L，并且在121℃下灭菌30min。
按质量计算，所述S1步骤中发酵罐盐培养基1的配置方法：按照每升种子液精准称取磷酸氢二钠十二水500g，磷酸二氢钾50g，氯化铵20g，氯化钠15g，消泡剂1ml，酵母粉80g，蛋白胨100g，用纯水溶解并定容至18L，并且在121℃下灭菌30min。
按质量计算，所述S5步骤中发酵罐盐培养基2的配置方法：按照每升种子液精准称取七水硫酸镁20g，葡萄糖100g加蒸馏水配制为0.2L。
所述步骤S2中多阶段灭菌包括如下步骤：灭菌第一阶段，打开夹套排水阀门，蒸汽进入夹套，罐体升温至98℃后，进入下一阶段；灭菌第二阶段，关闭夹套排水阀门，打开罐顶排气阀，保持罐内压力为正，打开排冷凝水阀，打开蒸汽进入空气管路的阀门，当蒸汽进入罐体后，打开罐底蒸汽进入阀门，再打开罐底阀，加快升温，当升至121℃后，进入下一阶段；灭菌第三阶段，关闭罐底阀，打开取样阀，保温30min后进入下一阶段；灭菌第四阶段，打开空气进气阀门与空气流量计，依次关闭蒸汽进入空气管路的阀门、取样阀和罐底蒸汽进入阀门，停止运行蒸汽发生器，排空蒸汽发生器内的蒸汽，当温度降至110℃进入下一阶段；灭菌第五阶段，继续降温至45℃进入下一阶段。灭菌第六阶段，继续降温至设定温度，灭菌结束；灭菌结束后，先关闭排气阀，等压力达到0.06～0.07Mpa后再关空气进气阀门与空气流量计。所述步骤S3中补料包括补料1和补料2，所述补料1的配置方法按照每升补料1称取甘油或者葡萄糖500g用纯水溶解并定容至700ml，121℃灭菌30min；按照每升补料1称取YeastExtract 100g、Tryptone 60g用纯水溶解并定容至300ml，然后将700ml与300ml溶液混合均匀作为补料1；所述补料2的配置方法为按照每升补料2称取IPTG50g并用纯水配制在无菌环境中过滤得到补料2。所述步骤S8中配制平衡液的方法为配制5L 8mol/L的尿素，按25mM/L的量加入PB，溶解过滤，调节PH至7.8。
所述步骤S8中的洗脱液1为加了50mM咪唑的平衡液，洗脱液2为加了100mM咪唑的平衡液。
所述步骤S10中上样平衡液的配制方法为配制8mol/L的尿素，按25mM/L的量加入PB，溶解过滤，调PH至9.0。
所述步骤S10中洗脱液3的制备方法为在上样平衡液中按0.1mol/L的量NaCl；洗脱液4的制备方法为在上样平衡液中按0.3mol/L的量加入NaCl。
实施例3
一种重组角蛋白生产方法，包括如下步骤：
S1、发酵准备：配置需要用灭菌锅灭菌的种子培养液，灭菌锅灭菌，配置发酵罐盐培养基1，清洗发酵罐；
S2、空罐灭菌：灭菌前关闭发酵罐所有阀门，打开蒸汽发生器，25min后，在控制面板点击灭菌操作，进行多阶段灭菌；
S3、实罐灭菌：取出灭菌锅灭菌的溶液，混合补料，排水，加入发酵罐盐培养基1后进行灭菌；
S4、接种，将重组角蛋白种子液接种在冷却至室温的种子液培养基中；
S5、发酵：发酵罐准备，打开发酵罐的搅拌开关，将发酵罐的转速、温度、流速由手动设置为自动；在发酵罐罐顶阀处点燃酒精棉，再打开罐顶阀，加入接种的种子液培养基，再加入发酵罐盐培养基2，关闭罐顶阀，开始发酵；
S6、取样：调节转速为700rpm，加碱调节PH值为7.5，加补料，诱导，诱导后取样检测，将发酵罐的温度、转速、压力、流速、PH值由自动设置为手动，然后将发酵液进行离心操作，收集沉淀得到菌体在冰箱中保存，发酵结束；
S7、破菌：从冰箱中取出菌体，按照1：20加入25mmol/L磷酸氢二钠十二水溶液，搅拌溶解，用高压匀浆机破菌，将高压匀浆机的压力设置为1200Bar，温度设置为6℃，破菌5次，离心收集菌体沉淀；
S8、纯化：配置平衡缓冲液，配制8mol/L的尿素，按25Mm/L的量加入PB溶液，溶解过滤，PH值调至7.8，用1mol/L尿素溶液洗涤菌体沉淀，离心收集菌体沉淀，用8mol/L尿素溶液溶解菌体沉淀，加入适量的PB溶液，用磁力搅拌器搅拌，然后离心后取上清液，用平衡缓冲液稀释后过滤，调节其PH值为7.8，作为上样样品；
打开紫外检测仪和蠕动泵，将蠕动泵的数值调到8.0用纯水将1L层析柱填料中的20％酒精冲洗干净，纯水冲洗后，用平衡缓冲液冲洗层析柱，使得紫外检测仪数值稳定，将紫外检测仪的光量值调到零；
将上样样品注入到层析柱内，然后用平衡缓冲液冲洗层析柱后，用洗脱液1和洗脱液2依次进行洗脱，同时分别收集样品；
S9、透析：选取透析袋，将样品装入透析袋内并封闭透析袋，将装入样品的透析袋放入25mmol/L磷酸氢二钠十二水溶液的透析液中过夜，取出，抽滤得到重组角蛋白样品；
S10、Q柱纯化：将保存好的Q柱连接到纯化仪上，调节流速为5.0，打开纯化仪电源进行清洗；
配置上样平衡液、洗脱液3和洗脱液4；
用纯水冲洗Q柱，然后上样平衡液，观察紫外吸收度数值，直至其数值平稳无波动后归零；
将重组角蛋白样品注入Q柱内，流速调为3.0，观察吸光度数值变化，当数值快速上升至一定数值时，接收出液管流出的液体即为穿透液，当吸光度数值开始下降至一定数值时停止接受，并记录下降值；
S11、洗脱：重组角蛋白样品上样完后，向Q柱内继续注入上样平衡液，待穿透液接收完成后，至吸光度数值再次平衡稳定后，将上样平衡液换成洗脱液3，当吸光度数值上升至一定值后开始下降，下降至一定数值即停止接收，并记录下峰值；洗脱液3上样完毕后，继续上样平衡液，待洗脱液3接收完毕后，将出液管放入废液桶内，至吸光度数值再次平衡稳定后，继续上样洗脱液4，待吸光度数值快速上升至一定数值时将出液管放入干净的锥形瓶中接收液体即为洗脱液4，当吸光度数值上升至一定值后开始下降，下降至一定数值即停止接收，并记录下峰值；
S12、清洗Q柱并封口保存。
按质量计算，所述S1步骤中种子液培养基按照每升种子液精准称取YeastExtract 10g、Tryptone 20g，NaCl 20g，葡萄糖10g用蒸馏水溶解并定容至2L，并且在121℃下灭菌30min。
按质量计算，所述S1步骤中发酵罐盐培养基1的配置方法：按照每升种子液精准称取磷酸氢二钠十二水500g，磷酸二氢钾50g，氯化铵20g，氯化钠15g，消泡剂1ml，酵母粉80g，蛋白胨100g，用纯水溶解并定容至18L，并且在121℃下灭菌30min。
按质量计算，所述S5步骤中发酵罐盐培养基2的配置方法：按照每升种子液精准称取七水硫酸镁20g，葡萄糖100g加蒸馏水配制为0.2L。
所述步骤S2中多阶段灭菌包括如下步骤：灭菌第一阶段，打开夹套排水阀门，蒸汽进入夹套，罐体升温至98℃后，进入下一阶段；灭菌第二阶段，关闭夹套排水阀门，打开罐顶排气阀，保持罐内压力为正，打开排冷凝水阀，打开蒸汽进入空气管路的阀门，当蒸汽进入罐体后，打开罐底蒸汽进入阀门，再打开罐底阀，加快升温，当升至121℃后，进入下一阶段；灭菌第三阶段，关闭罐底阀，打开取样阀，保温30min后进入下一阶段；灭菌第四阶段，打开空气进气阀门与空气流量计，依次关闭蒸汽进入空气管路的阀门、取样阀和罐底蒸汽进入阀门，停止运行蒸汽发生器，排空蒸汽发生器内的蒸汽，当温度降至110℃进入下一阶段；灭菌第五阶段，继续降温至45℃进入下一阶段。灭菌第六阶段，继续降温至设定温度，灭菌结束；灭菌结束后，先关闭排气阀，等压力达到0.06～0.07Mpa后再关空气进气阀门与空气流量计。所述步骤S3中补料包括补料1和补料2，所述补料1的配置方法按照每升补料1称取甘油或者葡萄糖500g用纯水溶解并定容至700ml，121℃灭菌30min；按照每升补料1称取YeastExtract 100g、Tryptone 60g用纯水溶解并定容至300ml，然后将700ml与300ml溶液混合均匀作为补料1；所述补料2的配置方法为按照每升补料2称取IPTG50g并用纯水配制在无菌环境中过滤得到补料2。所述步骤S8中配制平衡液的方法为配制5L 8mol/L的尿素，按25mM/L的量加入PB，溶解过滤，调节PH至7.8。
所述步骤S8中的洗脱液1为加了50mM咪唑的平衡液，洗脱液2为加了100mM咪唑的平衡液。
所述步骤S10中上样平衡液的配制方法为配制8mol/L的尿素，按25mM/L的量加入PB，溶解过滤，调PH至9.0。
所述步骤S10中洗脱液3的制备方法为在上样平衡液中按0.1mol/L的量NaCl；洗脱液4的制备方法为在上样平衡液中按0.3mol/L的量加入NaCl。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种重组角蛋白生产方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、发酵准备：配置需要用灭菌锅灭菌的种子培养液，灭菌锅灭菌，配置发酵罐盐培养基1，清洗发酵罐；
S2、空罐灭菌：灭菌前关闭发酵罐所有阀门，打开蒸汽发生器，15～25min后，在控制面板点击灭菌操作，进行多阶段灭菌；
S3、实罐灭菌：取出灭菌锅灭菌的溶液，混合补料，排水，加入发酵罐盐培养基1后进行灭菌；
S4、接种，将重组角蛋白种子液接种在冷却至室温的种子液培养基中；
S5、发酵：发酵罐准备，打开发酵罐的搅拌开关，将发酵罐的转速、温度、流速由手动设置为自动；在发酵罐罐顶阀处点燃酒精棉，再打开罐顶阀，加入接种的种子液培养基，再加入发酵罐盐培养基2，关闭罐顶阀，开始发酵；
S6、取样：调节转速为300～700rpm，加碱调节PH值为7.0～7.5，加补料，诱导，诱导后取样检测，将发酵罐的温度、转速、压力、流速、PH值由自动设置为手动，然后将发酵液进行离心操作，收集沉淀得到菌体在冰箱中保存，发酵结束；
S7、破菌：从冰箱中取出菌体，按照1：20加入25mmol/L磷酸氢二钠十二水溶液，搅拌溶解，用高压匀浆机破菌，将高压匀浆机的压力设置为800～1200Bar，温度设置为4～6℃，破菌5次，离心收集菌体沉淀；
S8、纯化：配置平衡缓冲液，配制8mol/L的尿素，按25Mm/L的量加入PB溶液，溶解过滤，PH值调至7.8，用1mol/L尿素溶液洗涤菌体沉淀，离心收集菌体沉淀，用8mol/L尿素溶液溶解菌体沉淀，加入适量的PB溶液，用磁力搅拌器搅拌，然后离心后取上清液，用平衡缓冲液稀释后过滤，调节其PH值为7.8，作为上样样品；
打开紫外检测仪和蠕动泵，将蠕动泵的数值调到8.0用纯水将1L层析柱填料中的20％酒精冲洗干净，纯水冲洗后，用平衡缓冲液冲洗层析柱，使得紫外检测仪数值稳定，将紫外检测仪的光量值调到零；
将上样样品注入到层析柱内，然后用平衡缓冲液冲洗层析柱后，用洗脱液1和洗脱液2依次进行洗脱，同时分别收集样品；
S9、透析：选取透析袋，将样品装入透析袋内并封闭透析袋，将装入样品的透析袋放入25mmol/L磷酸氢二钠十二水溶液的透析液中过夜，取出，抽滤得到重组角蛋白样品；
S10、Q柱纯化：将保存好的Q柱连接到纯化仪上，调节流速为5.0，打开纯化仪电源进行清洗；
配置上样平衡液、洗脱液3和洗脱液4；
用纯水冲洗Q柱，然后上样平衡液，观察紫外吸收度数值，直至其数值平稳无波动后归零；
将重组角蛋白样品注入Q柱内，流速调为3.0，观察吸光度数值变化，当数值快速上升至一定数值时，接收出液管流出的液体即为穿透液，当吸光度数值开始下降至一定数值时停止接受，并记录下降值；
S11、洗脱：重组角蛋白样品上样完后，向Q柱内继续注入上样平衡液，待穿透液接收完成后，至吸光度数值再次平衡稳定后，将上样平衡液换成洗脱液3，当吸光度数值上升至一定值后开始下降，下降至一定数值即停止接收，并记录下峰值；洗脱液3上样完毕后，继续上样平衡液，待洗脱液3接收完毕后，将出液管放入废液桶内，至吸光度数值再次平衡稳定后，继续上样洗脱液4，待吸光度数值快速上升至一定数值时将出液管放入干净的锥形瓶中接收液体即为洗脱液4，当吸光度数值上升至一定值后开始下降，下降至一定数值即停止接收，并记录下峰值；
S12、清洗Q柱并封口保存。
2.根据权利要求1所述的重组角蛋白生产方法，其特征在于，按质量计算，所述S1步骤中种子液培养基按照每升种子液精准称取Yeast Extract 10g、Tryptone 20g，NaCl 20g，葡萄糖10g用蒸馏水溶解并定容至2L，并且在121℃下灭菌30min。
3.根据权利要求1所述的重组角蛋白生产方法，其特征在于，按质量计算，所述S1步骤中发酵罐盐培养基1的配置方法：按照每升种子液精准称取磷酸氢二钠十二水500g，磷酸二氢钾50g，氯化铵20g，氯化钠15g，消泡剂1ml，酵母粉80g，蛋白胨100g，用纯水溶解并定容至18L，并且在121℃下灭菌30min。
4.根据权利要求1所述的重组角蛋白生产方法，其特征在于，按质量计算，所述S5步骤中发酵罐盐培养基2的配置方法：按照每升种子液精准称取七水硫酸镁20g，葡萄糖100g加蒸馏水配制为0.2L。
5.根据权利要求1所述的重组角蛋白生产方法，其特征在于，所述步骤S2中多阶段灭菌包括如下步骤：灭菌第一阶段，打开夹套排水阀门，蒸汽进入夹套，罐体升温至98℃后，进入下一阶段；灭菌第二阶段，关闭夹套排水阀门，打开罐顶排气阀，保持罐内压力为正，打开排冷凝水阀，打开蒸汽进入空气管路的阀门，当蒸汽进入罐体后，打开罐底蒸汽进入阀门，再打开罐底阀，加快升温，当升至121℃后，进入下一阶段；灭菌第三阶段，关闭罐底阀，打开取样阀，保温30min后进入下一阶段；灭菌第四阶段，打开空气进气阀门与空气流量计，依次关闭蒸汽进入空气管路的阀门、取样阀和罐底蒸汽进入阀门，停止运行蒸汽发生器，排空蒸汽发生器内的蒸汽，当温度降至110℃进入下一阶段；灭菌第五阶段，继续降温至45℃进入下一阶段。灭菌第六阶段，继续降温至设定温度，灭菌结束；灭菌结束后，先关闭排气阀，等压力达到0.06～0.07Mpa后再关空气进气阀门与空气流量计。
6.根据权利要求1所述的重组角蛋白生产方法，其特征在于，所述步骤S3中补料包括补料1和补料2，所述补料1的配置方法按照每升补料1称取甘油或者葡萄糖500g用纯水溶解并定容至700ml，121℃灭菌30min；按照每升补料1称取Yeast Extract 100g、Tryptone 60g用纯水溶解并定容至300ml，然后将700ml与300ml溶液混合均匀作为补料1；所述补料2的配置方法为按照每升补料2称取IPTG50g并用纯水配制在无菌环境中过滤得到补料2。
7.根据权利要求1所述的重组角蛋白生产方法，其特征在于，所述步骤S8中的洗脱液1为加了50mM咪唑的平衡液，洗脱液2为加了100mM咪唑的平衡液。
8.根据权利要求1所述的重组角蛋白生产方法，其特征在于，所述步骤S10中上样平衡液的配制方法为配制8mol/L的尿素，按25mM/L的量加入PB，溶解过滤，调PH至9.0。
9.根据权利要求1所述的重组角蛋白生产方法，其特征在于，所述步骤S10中洗脱液3的制备方法为在上样平衡液中按0.1mol/L的量NaCl；洗脱液4的制备方法为在上样平衡液中按0.3mol/L的量加入NaCl。
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