JP5226697B2 - 浸透圧によって細胞にショックを与えるための装置および方法 - Google Patents
浸透圧によって細胞にショックを与えるための装置および方法 Download PDFInfo
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Description
本願は、2007年1月12日に出願された米国特許仮出願第60/880,195号、標題「APPARATUS AND METHODS FOR OSMOTICALLY SHOCKING CELLS」の利益を主張するものであり、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
の中に、関心対象の組換えポリペプチドを細胞のペリプラズムから放出することがさらに含まれ得る。細胞は、その後、第3の流体流から取り出すことができる。
(実施例)
ペリプラズム空間でヒト成長ホルモン(hGH)を発現しているシュードモナス・フルオレセンス(Pseudomonas fluoresescens)細菌株(DC456)を使用した。20Lのバイオリアクター規模での発酵の後、実験室のバッチ遠心機で培養液を遠心した。細胞ペースト(3811g)を3.5Lの浸漬バッファ(25%のスクロース、pH7.2)と30分間混合した。ショックバッファは、20mMのTris、pH7.2からなった。流体流の組合せによる浸透圧ショックのための構成は、2つの流れ(平衡化した細胞スラリーおよびショックバッファ)を連続的に流すための2つの蠕動ポンプ(Masterflex L/S、モデル#77200−62)からなり、2つの流れはT継手、それに続いて、液体抽出物から細胞を分離するための連続的ディスクスタック遠心機(Westfalia SC−6)に取り付けられている、2つの流れを急速に混合するためのスタティックミキサー(Conprotec、FM 08−10−36)を用いて混合される。平衡化された細胞スラリーとショックバッファの流速は、それぞれ200mL/分および800mL/分であった。供給および抽出物流からのサンプル中のhGHの量を、キャピラリー電気泳動(caliper LabChip 90)により測定した。この方法のこの工程の収率(抽出物中のhGHの量を発酵培養液中のhGHの量で除算した値)は約70%であった。
【実施例2】
本発明は、以下の態様を含むものである。
<1> 宿主細胞のペリプラズムの中へ関心対象のポリペプチドの分泌をもたらすことのできる組換え発現系で形質転換された宿主細胞を発酵させることであって、前記発酵が、関心対象の前記ポリペプチドが前記宿主細胞のペリプラズムの中に分泌されるような条件下、発酵培地で行われることと;
連続的な浸透圧ショックを前記発酵培地中に含まれる前記宿主細胞に加えることにより、関心対象のポリペプチドを前記ペリプラズムから抽出することと
を含む、関心対象の組換えポリペプチドを調製するための方法である。
<2> 連続的な浸透圧ショックを前記宿主細胞に加えることが、
細胞を含む第1の溶液を準備することと;
第2の溶液を準備することであって;
前記第1の溶液のモル浸透圧濃度が、前記第2の溶液の浸透圧よりも高いことと;
前記第1の溶液を含む第1の流体流を生成することと;
前記第2の溶液を含む第2の流体流を生成することと;
前記第1および第2の流体流を混合して第3の流体流とすることと
を含む、上記<1>に記載の方法である。
<3> 前記連続的な浸透圧ショックが、高モル濃度のスラリーと低モル濃度のショックバッファの連続混合を含む、上記<1>または<2>に記載の方法である。
<4> 前記高モル濃度のスラリーが、高い糖もしくは塩濃度からなる群より選択される、上記<3>に記載の方法である。
<5> 前記低モル濃度のショックバッファが、5〜9のpHを有する、上記<3>に記載の方法である。
<6> 前記細胞から浸透圧が放出される前または後に熱交換器を運用する(administering)ことをさらに含む、上記<1>から<5>のいずれかに記載の方法である。
<7> 前記細胞から浸透圧が放出される前または後に溶媒を投与する(administering)ことをさらに含む、上記<1>から<5>のいずれかに記載の方法である。
<8> 前記細胞から浸透圧が放出される前または後に化学的処置を施す(administering)ことをさらに含む、上記<1>から<5>のいずれかに記載の方法である。
<9> 浸透圧によって細胞にショックを与えるための装置であって、前記装置が、
第1および第2のリザーバと;
第1の溶液中の細胞を含有する前記第1のリザーバと;
第2の溶液を含有する前記第2のリザーバとを備え;
前記第1の溶液は、前記第2の溶液の浸透圧よりも高く;
前記第1の溶液および前記細胞を含む第1の流体流を生成するための手段と;
前記第2の溶液を含む第2の流体流を生成するための手段と;
前記第1および第2の流体流を混合して第3の流体流とするための手段と
を備える、装置である。
<10> 前記第1のリザーバが、バイオリアクターである、上記<9>に記載の装置である。
<11> 前記細胞が、微生物細胞、植物細胞、動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、細菌細胞、哺乳類細胞、および酵母細胞からなる群より選択される、上記<9>または<10>に記載の装置である。
<12> 前記細胞が、シュードモナス属の種(Pseudomonas sp.)、大腸菌(E. coli)、クレブシエラ属の種(Klebsialla sp.)、サッカロマイセス属の種(Saccharomyces sp.)、ピキア属の種(Pichia sp.)、およびハンゼヌラ属の種(Hansenuela sp.)からなる群より選択される、上記<9>または<10>に記載の装置である。
<13> 前記細胞が、ペリプラズム空間を有する、上記<9>または<10>に記載の装置である。
<14> 前記細胞が、関心対象のタンパク質を産生する、上記<9>または<10>に記載の装置である。
<15> 前記第1の溶液が、前記第1の溶液中に0.5M〜10Mのモル濃度で存在する第1の溶質セットを含み、前記第1の溶質セットが少なくとも1種類の溶質を含む、上記<9>から<14>のいずれかに記載の装置である。
<16> 前記第2の溶液が、前記第2の溶液中に0M〜1Mのモル濃度で存在する第2の溶質セットを含み、前記第2の溶質セットが少なくとも1種類の溶質を含む、上記<9>から<15>のいずれかに記載の装置である。
<17> 前記第2の溶質セットが、グリセロール、糖、または塩を含む、上記<16>に記載の装置である。
<18> 前記糖または前記塩が、グルコース、スクロース、ナトリウムクロライド、ナトリウムスルフェート、ナトリウムホスフェート、ナトリウムニトラート、カリウムクロライド、カリウムスルフェート、カリウムホスフェート、カリウムニトラート、マグネシウムクロライド、マグネシウムスルフェート、マグネシウムホスフェート、マグネシウムニトラート、カルシウムクロライド、カルシウムスルフェート、カルシウムホスフェート、カルシウムニトラート、アンモウニウムスルフェート、およびそれらの組合せからなる群より選択される、上記<17>に記載の装置である。
<19> 前記第2の溶質セットが、スクロースまたはナトリウムクロライドを含む、上記<16>に記載の装置である。
<20> 第1の流体流を生成するための前記手段および第2の流体流を生成するための前記手段が、前記第1のリザーバおよび/または第2のリザーバ中の孔に付加された管および/またはパイプを含む、上記<9>から<19>のいずれかに記載の装置である。
<21> 前記第1および第2の流体流を混合するための前記手段が、T継手を含む、上記<9>から<20>のいずれかに記載の装置である。
<22> 前記T継手が、
第1の入口、第2の入口および出口を備え;
前記第1の入口および前記出口が、実質的に一直線の流路を形成し;
前記第2の入口が、前記実質的に一直線の流路に対してほぼ直角に、前記実質的に一直線の流路への入口をもたらし;
前記第1の流体流が、前記第2の入口を通って前記T継手に入り;かつ
前記第2の流体流が、前記第1の入口を通って入る、上記<21>に記載の装置である。
<23> 混合器をさらに含む、上記<9>から<22>のいずれかに記載の装置である。
<24> 前記混合器がスタティックミキサーを含む、上記<23>に記載の装置である。
<25> 遠心機、フィルター、または熱交換器をさらに含む、上記<9>から<24>のいずれかに記載の装置である。
<26> 化学的処置の溶媒を添加するための場所をさらに含む、上記<9>から<25>のいずれかに記載の装置である。
<27> 連続的な浸透圧ショックを発酵培地中に含まれる宿主細胞に加える手段をさらに含む、上記<9>から<26>のいずれかに記載の装置である。
<28> 浸透圧によって細胞にショックを与える方法であって、前記方法が、
細胞を含む第1の溶液を準備することと;
第2の溶液を準備することとを含み;
前記第1の溶液のモル浸透圧濃度は前記第2の溶液のモル浸透圧濃度よりも高く;
前記第1の溶液を含む第1の流体流を生成することと;
前記第2の溶液を含む第2の流体流を生成することと;
前記第1および第2の流体流を連続的に混合して第3の流体流とすることと
を含む、方法である。
<29> 前記細胞が、微生物細胞、植物細胞、真菌細胞、細菌細胞、哺乳類細胞、および酵母細胞からなる群より選択される、上記<28>に記載の方法である。
<30> 前記細胞が、シュードモナス属の種(Pseudomonas sp.)、大腸菌(E. coli)、クレブシエラ属の種(Klebsialla sp.)、サッカロマイセス属の種(Saccharomyces sp):、ピキア属の種(Pichia sp.)、およびハンゼヌラ属の種(Hansenuela sp.)からなる群より選択される、上記<29>に記載の方法である。
<31> 前記細胞が、ペリプラズム空間を有し、前記細胞が、関心対象のタンパク質を産生する、上記<28>に記載の方法である。
<32> 前記第1の溶液が、前記第1の溶液中に0.5M〜10Mのモル濃度で存在する第1の溶質セットを含み、前記第1の溶質セットが少なくとも1種類の溶質を含む、上記<28>から<31>のいずれかに記載の方法である。
<33> 前記第2の溶液が、前記第2の溶液中に0M〜1Mのモル濃度で存在する第2の溶質セットを含み、前記第2の溶質セットが少なくとも1種類の溶質を含む、上記<28>から<32>のいずれかに記載の方法である。
<34> 前記第1の溶質セットまたは前記第2の溶質セットが、糖または塩を含む、上記<32>または<33>に記載の方法である。
<35> 前記糖または前記塩が、グルコース、スクロース、グリセロール、ナトリウムクロライド、ナトリウムスルフェート、ナトリウムホスフェート、ナトリウムニトラート、カリウムクロライド、カリウムスルフェート、カリウムホスフェート、カリウムニトラート、マグネシウムクロライド、マグネシウムスルフェート、マグネシウムホスフェート、マグネシウムニトラート、カルシウムクロライド、カルシウムスルフェート、カルシウムホスフェート、カルシウムニトラートアンモウニウムスルフェート、およびそれらの組合せからなる群より選択される、上記<34>に記載の方法である。
<36> 前記第1および第2の流体流を前記第3の流体流に混合することが、
前記第1の流体流の流路に沿って第1の流路を規定することと;
前記第1の流路と交差し、これまでの前記第1の流路に進まない、前記第1の流路に対してほぼ直角に第2の流路を規定して、前記第1および第2の流路の交点を形成することと;
前記第1および第2の流路の前記交点に接続された第3の流路を規定することであって、前記第3の流路と前記第1の流路が実質的に一直線の流路を形成する、ことと;
前記第1の溶液を前記第2の流路にもたらすことと;
前記第2の溶液を前記第1の流路にもたらすことと;
前記第1および第2の流路の前記交点で、前記第3の流体流が前記第3の流路から出るように、前記第1および第2の溶液を混合することと
を含む、上記<28>から<35>のいずれかに記載の方法である。
<37> 前記第2の溶液が、前記第1の溶液が前記第1および第2の流路の前記交点にもたらされるよりもより速い速度で、前記第1および第2の流路の前記交点にもたらされる、上記<36>に記載の方法である。
<38> スタティックミキサーで前記第3の流体流を混合することをさらに含む、上記<36>または<37>に記載の方法である。
<39> 前記細胞が、関心対象のポリペプチドを産生し、前記細胞のペリプラズム空間の中に前記関心対象のポリペプチドを分泌する、上記<28>から<38>のいずれかに記載の方法である。
Claims (32)
- 宿主細胞のペリプラズムの中へ関心対象のポリペプチドの分泌がもたらされ、発酵培養液が形成される組換え発現系で形質転換された宿主細胞を発酵培地で発酵させることと;
溶液を準備することと;ここで、該溶液は、糖または塩を含み、
前記溶液を前記細胞と混合して高モル濃度のスラリーを形成することと;
低モル濃度のショックバッファを準備することであって、前記高モル濃度のスラリーの浸透圧が該低モル濃度のショックバッファの浸透圧よりも高いことと;
前記高モル濃度のスラリーを含み第1の流速を有する第1の流体流を生成することと;
前記低モル濃度のショックバッファを含み第2の流速を有する第2の流体流を生成することと;
前記第1および第2の流体流を連続的に混合して第3の流体流とすることであって、第2の流速は第1の流速よりも大きいことと;
関心対象のポリペプチドを第3の流体流から抽出することであって、ポリペプチド抽出物が、形成された発酵培養液と比較して関心対象のポリペプチドを少なくとも70%有することと
を含む、関心対象の組換えポリペプチドを調製するための方法。 - 前記低モル濃度のショックバッファが、5〜9のpHを有する、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞に含まれる液体成分から浸透圧が放出される前または後に熱交換器を運用する(administering)ことをさらに含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記細胞に含まれる液体成分から浸透圧が放出される前または後に溶媒を投与する(administering)ことをさらに含む、請求項1または2に記載の方法。
- 前記細胞に含まれる液体成分から浸透圧が放出される前または後に化学的処置を施す(administering)ことをさらに含む、請求項1または2に記載の方法。
- 浸透圧によって細胞にショックを与えるための装置であって、前記装置が、
細胞を含有する第1の溶液を含む第1のリザーバと;
第2の溶液を含む第2のリザーバと;ここで、前記第1の溶液は、前記第2の溶液の浸透圧よりも高く、
前記細胞を含有する前記第1の溶液を含み第1の流速を有する第1の流体流を生成するための手段と;
前記第2の溶液を含み第2の流速を有する第2の流体流を生成するための手段と;
前記第1および第2の流体流を連続的に混合して第3の流体流とするための手段と;ここで、前記第2の流速が前記第1の流速より大きい、を備え、
該装置により、連続的な浸透圧ショックを発酵培地中に含まれる宿主細胞に加える、装置。 - 前記第1のリザーバが、バイオリアクターである、請求項6に記載の装置。
- 前記細胞が、微生物細胞、植物細胞、動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞、細菌細胞、哺乳類細胞、および酵母細胞からなる群より選択される、請求項6または7に記載の装置。
- 前記細胞が、シュードモナス属の種(Pseudomonas sp.)、大腸菌(E. coli)、クレブシエラ属の種(Klebsialla sp.)、サッカロマイセス属の種(Saccharomyces sp.)、ピキア属の種(Pichia sp.)、およびハンゼヌラ属の種(Hansenuela sp.)からなる群より選択される、請求項6または7に記載の装置。
- 前記細胞が、ペリプラズム空間を有する、請求項6または7に記載の装置。
- 前記細胞が、関心対象のタンパク質を産生する、請求項6または7に記載の装置。
- 前記第1の溶液が、前記第1の溶液中に0.5M〜10Mのモル濃度で存在する第1の溶質セットを含み、前記第1の溶質セットが少なくとも1種類の溶質を含む、請求項6から11のいずれかに記載の装置。
- 前記第2の溶液が、前記第2の溶液中に0M〜1Mのモル濃度で存在する第2の溶質セットを含み、前記第2の溶質セットが少なくとも1種類の溶質を含む、請求項6から12のいずれかに記載の装置。
- 前記第2の溶質セットが、グリセロール、糖、または塩を含む、請求項13に記載の装置。
- 前記糖または前記塩が、グルコース、スクロース、ナトリウムクロライド、ナトリウムスルフェート、ナトリウムホスフェート、ナトリウムニトラート、カリウムクロライド、カリウムスルフェート、カリウムホスフェート、カリウムニトラート、マグネシウムクロライド、マグネシウムスルフェート、マグネシウムホスフェート、マグネシウムニトラート、カルシウムクロライド、カルシウムスルフェート、カルシウムホスフェート、カルシウムニトラート、アンモウニウムスルフェート、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項14に記載の装置。
- 前記第2の溶質セットが、スクロースまたはナトリウムクロライドを含む、請求項13に記載の装置。
- 第1の流体流を生成するための前記手段および第2の流体流を生成するための前記手段が、前記第1のリザーバおよび/または第2のリザーバ中の孔に付加された管および/またはパイプを含む、請求項6から16のいずれかに記載の装置。
- 前記第1および第2の流体流を混合するための前記手段が、T継手を含む、請求項6から17のいずれかに記載の装置。
- 前記T継手が、
第1の入口、第2の入口および出口を備え;
前記第1の入口および前記出口が、実質的に一直線の流路を形成し;
前記第2の入口が、前記実質的に一直線の流路に対してほぼ直角に、前記実質的に一直線の流路への入口をもたらし;
前記第1の流体流が、前記第2の入口を通って前記T継手に入り;かつ
前記第2の流体流が、前記第1の入口を通って入る、請求項18に記載の装置。 - 混合器をさらに含む、請求項6から19のいずれかに記載の装置。
- 前記混合器がスタティックミキサーを含む、請求項20に記載の装置。
- 遠心機、フィルター、または熱交換器をさらに含む、請求項6から21のいずれかに記載の装置。
- 化学的処置の溶媒を添加するための場所をさらに含む、請求項6から22のいずれかに記載の装置。
- 浸透圧によって細胞にショックを与える方法であって、前記方法が、
細胞を含む第1の溶液を準備することと;
第2の溶液を準備することと;ここで、前記第1の溶液のモル浸透圧濃度は前記第2の溶液のモル浸透圧濃度よりも高く;
前記第1の溶液を含み第1の流速を有する第1の流体流を生成することと;
前記第2の溶液を含み第2の流速を有する第2の流体流を生成することと;
前記第1および第2の流体流を連続的に混合して第3の流体流とすることと
を含み、
前記第2の流速が前記第1の流速より大きく、前記細胞のペリプラズム空間中のタンパク質が、バッチ処理によって浸透圧ショックを与えられた細胞から放出されるタンパク質より30%多い収率で放出される、方法。 - 前記細胞が、微生物細胞、植物細胞、真菌細胞、細菌細胞、哺乳類細胞、および酵母細胞からなる群より選択される、請求項24に記載の方法。
- 前記細胞が、シュードモナス属の種(Pseudomonas sp.)、大腸菌(E. coli)、クレブシエラ属の種(Klebsialla sp.)、サッカロマイセス属の種(Saccharomyces sp):、ピキア属の種(Pichia sp.)、およびハンゼヌラ属の種(Hansenuela sp.)からなる群より選択される、請求項25に記載の方法。
- 前記細胞が、ペリプラズム空間を有し、前記細胞が、関心対象のタンパク質を産生する、請求項24に記載の方法。
- 前記第1の溶液が、前記第1の溶液中に0.5M〜10Mのモル濃度で存在する第1の溶質セットを含み、前記第1の溶質セットが少なくとも1種類の溶質を含む、請求項24から27のいずれかに記載の方法。
- 前記第2の溶液が、前記第2の溶液中に0M〜1Mのモル濃度で存在する第2の溶質セットを含み、前記第2の溶質セットが少なくとも1種類の溶質を含む、請求項24から28のいずれかに記載の方法。
- 前記第1の溶質セットまたは前記第2の溶質セットが、糖または塩を含む、請求項29に記載の方法。
- 前記糖または前記塩が、グルコース、スクロース、グリセロール、ナトリウムクロライド、ナトリウムスルフェート、ナトリウムホスフェート、ナトリウムニトラート、カリウムクロライド、カリウムスルフェート、カリウムホスフェート、カリウムニトラート、マグネシウムクロライド、マグネシウムスルフェート、マグネシウムホスフェート、マグネシウムニトラート、カルシウムクロライド、カルシウムスルフェート、カルシウムホスフェート、カルシウムニトラートアンモウニウムスルフェート、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項30に記載の方法。
- 前記細胞が、関心対象のポリペプチドを産生し、前記細胞のペリプラズム空間の中に前記関心対象のポリペプチドを分泌する、請求項24から31のいずれかに記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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