BE1030362B1 - Extraction périplasmique automatisée - Google Patents
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Abstract
Procédé automatisé d’extraction d’un peptide d’intérêt localisé dans de l’espace périplasmique et/ou comprenant une étape d’acidification.
Description
EXTRACTION PÉRIPLASMIQUE AUTOMATISÉE
Domaine technigue
La présente invention concerne l'extraction automatisée d'un peptide d'intérêt dont la production a été induite dans l'espace périplasmique.
L'art antérieur
La production d'une protéine d'intérêt dans l'espace périplasmique est connue. Ceci présente l'avantage d'établir une première barrière avec les contaminants cytosoliques en ce compris l'ADN génomique.
En pratique, la membrane externe d'une bactérie Gram négatif, par exemple Escherichia coli, ou encore Pseudomonas sp. est rompue sélectivement, mais pas Ia membrane interne, ce qui permet de relarguer le contenu de l'espace périplasmique dans le milieu. Ensuite, une simple centrifugation permet de retirer les cellules avec tous les contaminants qui s’y trouvent. Le choc osmotique, où les cellules sont conditionnées dans un milieu hypertonique (ex. saccharose 20-25% en poids, à UN pH neutre ou alcalin), puis subitement mises au contact d'un grand volume d'eau, est couramment utilisé à cette fin, mais toujours en pH neutre ou alcalin.
Cette technique a, néanmoins, plusieurs inconvénients et limites. La première difficulté est qu'il ne faut pas rompre la membrane interne, ce qui impose des limites aux solutions qui peuvent être utilisées, aux durées de traitement, ainsi qu'aux contraintes mécaniques que l’on peut appliquer à ces cellules fragilisées. La seconde difficulté, réciproque, est que la membrane externe doit être suffisamment rompue, ce qui impose, au contraire, des conditions un peu sévères.
En outre, des peptides qui seraient absorbées aux membranes, voire y insérés, risquent de ne pas être bien récupérés, ou même pourraient fragiliser Ia membrane interne, ce qui a été rapporté comme problématique dans le cas de l'acidification lorsque la toxine diphtérique est produite dans l'espace périplasmique d'Escherichia coli (O'Keefe et Collier, PNAS Vol. 86, pp 343-346, 1989).
Une autre limitation est la difficulté de mise à l'échelle (scaling-Up) : en effet, certains peptides doivent être produits en masse, ce qui impose de pouvoir traiter des grosses quantités de cellules tout en
IO assurant des conditions de traitement substantiellement identiques pour toutes les cellules: les manques d'homogénéité ou des temps de traitement variables sont problématiques. Ainsi, l'utilisation de récipients plus grands favorise des innomogénéités locales, ce qui affecte directement (i) les rendements de récupération du peptide d'intérêt, du fait, par exemple, d'une mauvaise rupture de la membrane externe (choc osmotique trop faible), et (ii) la pureté, du fait de la rupture non- voulue de la membrane interne (ex. choc osmotique trop important). En outre, les moyens de mélange et d'agitation mécanique sont limités, au risque, sinon, de briser les membranes internes, voire de cisailler l'ADN génomique, ce qui rendrait le lot totalement inutilisable.
Parmi les améliorations, certains ont proposé l'addition de sels ou de molécules chaotropiques tels que, entre autres, des chlorures ou sulfates d'alcalins ou d'alcalino-terreux, le phosphate de sodium, l'acetate d'ammonium, le chlorure d'ammonium, divers détergents (désoxycholate de sodium, l'Octyl-glucoside, Tween®80, Triton X-100), le chlorure de guanidinium ou l'urée, de manière à fragiliser davantage la membrane externe. Cependant, comme mentionné ci-dessus, ces molécules risquent également de fragiliser davantage la membrane interne, surtout dans le contexte de solutions difficiles à homogénéiser.
WO 2008/088757 a proposé une extraction en continu du contenu périplasmique, où, comme en mode batch, les cellules sont équiliorées dans une solution hypertonique. Cette suspension est ensuite pompée et, grâce à un système en T, de l'eau y est ajoutée en grande quantité via une seconde pompe, de manière à provoquer un choc osmotique, avant centrifugation du mélange. Le mélange des deux flux se fait exclusivement par des moyens siatiques, et le pH des solutions est de 7,2. En outre le temps où les cellules sont en contact de l'eau n'est pas décrit.
Bref résumé de l'invention
La présente invention se rapporte à un procédé d'extraction automatisé d'un peptide d'intérêt artificiellement sécrété dans l'espace périplasmique d'une bactérie Gram négatif comprenant les étapes successives de : - placer lesdites bactéries en suspension dans une solution hypertonique, - pomper dans une première chambre de mélange ladite suspension dans un mileu hypertonique, à un débit constant et calibré QI ; - simultanément pomper à un débit constant et calibré Q2 une solution hypotonique dans ladite chambre de mélange, de manière à ce que le mélange contenant lesdites cellules, la solution hypertonique et la solution hypotonique reste au moins 10 secondes dans ladite chambre de mélange, de manière à assurer une rupture de la membrane externe desdites bactéries par choc osmotique tout en préservant l'intégralité de la membrane interne desdites bactéries ; - pomper ledit mélange pour le soutirer de ladite chambre de mélange vers une tuyauterie, à un débit constant et calibré Q3, de manière à ce que le volume dans ladite première chambre de mélange permette d'assurer le temps de résidence voulu dans ladite première chambre de mélange, ladite tuyauterie ayant une longueur et un diamètre de manière à assurer un temps de contact d'au moins 10 secondes additionnelles au temps de contact dans ladite première chambre de mélange ; - collecter ledit mélange, puis - centrifuger ledit mélange collecté de manière à récupérer le surnageant clarifié, comprenant ledit peptide d'intérêt.
Brève description des dessins
La Figure 1 reprend le procédé d'extraction automatisé selon la version la plus simple.
La Figure 2 reprend le procédé d'extraction automatisé comprenant une étape d'acidification via une connexion en T.
La Figure 3 reprend le procédé d'extraction automatisé comprenant une étape d'acidification via une seconde chambre de mélange.
Description détaillée d'une réalisation de l'invention
Un premier aspect de la présente invention porte sur un procédé d'extraction automatisé d'un peptide d'intérêt artificiellement sécrété dans l'espace périplasmique d'une bactérie Gram négatif 5 comprenant les étapes successives de : - placer les bactéries en suspension dans une solution hypertonique, - pomper 2 dans une première chambre de mélange 1 la suspension dans un milieu hypertonique, à un débit constant et calibré
QI: - simultanément pomper à un débit constant et calibré
Q2 une solution hypotonique 3 dans la chambre de mélange 1, de manière à ce que le mélange contenant les cellules, la solution hypertonique et la solution hypotonique reste au moins 10 secondes dans la chambre de mélange 1, de manière à assurer une rupture de la membrane externe des bactéries par choc osmotique tout en préservant l'intégralité de la membrane interne des bactéries ; - pomper le mélange pour le soutirer de la chambre de mélange 1] vers Une tuyauterie 4, à un débit constant et calibré Q3, de manière à ce que le volume du mélange dans la chambre de mélange 1 permette d'assurer le temps de résidence voulu dans la chambre de mélange 1, la tuyauterie 4 ayant une longueur et un diamètre de manière à assurer Un temps de contact d'au moins 10 secondes additionnelles au temps de contact dans la chambre de mélange 1; - collecter le mélange 7, puis - centrifuger le mélange collecté de manière à récupérer le surnageant clarifié, comprenant le peptide d'intérêt.
Ceci permet de traiter de grandes quantités de cellules tout en assurant l'intégrité de la membrane interne et en assurant une pureté au moins équivalente à celle obtenue par un procédé en batch, même pratiqué à une échelle nettement plus modeste.
Le temps de résidence dans la chambre de mélange 1 est de préférence compris entre 10 secondes et 10 minutes, de manière avantageuse entre 30 secondes et 5 minutes, par exemple entre Ì et 3 minutes, tel qu'environ 2 minutes.
De manière similaire, le temps de résidence dans la tuyauterie 4 est de préférence compris entre 10 secondes et 10 minutes, de manière avantageuse entre 30 secondes et 5 minutes, par exemple entre Ì et 3 minutes, tel qu'environ 2 minutes.
De préférence, ce procédé comprend en outre l'étape d'ajouter une solution acide 5 à la solution comprenant la suspension cellulaire, la solution hypertonique et la solution hypotonique (avant l'étape de centrifugation), tout en conservant la solubilité du peptide d'intérêt.
En effet, bien que les procédés habituels soient communément pratiqués à des pH neutre ou alcalins (en tout cas rarement à des pH < 6,5, voire <6), qui sont compatibles avec ceux des étapes chromatographiques en aval, ce qui est considéré comme avantageux, les inventeurs ont remarqué que l'acidification permettait d'augmenter facilement le niveau de pureté du peptide à isoler, ce qui est très avantageux.
Cette étape n'est avantageuse que pour les peptides restant solubles en milieu acide. Ainsi, le procédé comporte de préférence une étape préliminaire de détermination de la solubilité du peptide en milieu acide. Ceci permet de conserver le peptide d'intérêt en solution tout en appliquant une acidification la plus marquée possible, qui permet la précipitation du plus de contaminants possibles. Ainsi, de préférence, la solution acide est ajoutée de manière à obotenir un pH final compris entre 3.0 et 6,0, de préférence entre 4,0 et 5,0, de manière encore plus préférée entre 4,2 et 48 (selon le pH qui soit compatible avec la solubilité du peptide d'intérêt à purifier, un pH le plus acide possible étant préféré). Le pH, de préférence, est suivi en continu par une sonde, et est ajusté à la valeur voulue en modulant le débit Q4.
Selon une alternative (Figure 2), l'étape d'acidifier la solution se réalise directement au niveau de la tuyauterie 4 recevant le débit Q3 via l'addition en continu audit débit Q3 d'un débit Q4 d'une solution acide 5, de préférence de manière à obtenir un pH final compris entre 3,0 et 6,0, de préférence entre 4,0 et 5,0, de manière encore plus préférée entre 4,2 et 4,8. Ainsi le débit Q4 n'est pas nécessairement constant, mais peut (légèrement) varier ; en d'autres termes, le contrôle fin du pH est, selon l'invention, plus important qu'une légère variation du volume final 7.
Selon une autre alternative (Figure 3), l'étape d'ajouter la solution acide 5 se réalise dans une seconde chambre de mélange 6, la seconde chambre de mélange 6 recevant le débit Q3 et un débit Q4 de la solution acide 5, de manière à réaliser un mélange homogène, ce mélange étant soutiré de la seconde chambre de mélange 6 à un débit constant, de manière à assurer un volume permettant le temps de résidence voulu dans la seconde chambre de mélange 6.
Comme dans la première alternative, de préférence la solution acide a un pH compris entre 3,0 et 6,0, tel qu'enire 4,0 et 5,0, de manière encore plus préférée entre 4,2 et 4,8.
De préférence, la solution d'acidification comprend (consiste essentiellement en) de l'acide acétique, de préférence à une concentration comprise enire 0,2 M et 3,0 M, telle qu'environ 0,5 M. Une solution concentrée est avantageuse parce qu'elle évite d'augmenter trop les volumes. Cependant, le pH est plus difficile à ajuster dans ce cas et la viscosité de la solution augmente, ce qui complique le mélange.
De préférence, les solutions sont ajoutées et soutirées par le bas de la première et/ou de la seconde chambre de mélange.
Avantageusement, les flux Q1 et Q2 sont mélangés via les turbulences induites par l'arrivée du flux Q1 et/ou Q2 dans la chambre de mélange 1.
De préférence, les flux Q1 et Q2 sont mélangés via une agitation mécanique 9 dans la première chambre de mélange 1, cette agitation mécanique étant calibrée de manière à ne pas causer la rupture des membranes internes des bactérie.
Alternativement, ou en outre, les flux Q3 et Q4 sont mélangés via une agitation mécanique 8 dans la seconde chambre de mélange 6, cette agitation mécanique 8 étant caliorée de manière à ne pas causer la rupture des membranes internes des bactéries.
Lorsqu'il n’y a pas recours à la seconde chambre de mélange, les flux Q3 et Q4 sont mélangés par les turbulences induites au niveau de la jonction.
De préférence, et en particulier en lien avec l'ajout d'une solution d'acidification, la solution hypertonique et/ou la solution hypotonique du procédé sont à un pH compris entre 3,0 et 5,0, de préférence entre 3,5 et 4,0.
Si le peptide à purifier est compatible avec une telle acidification, l’utilisation des solutions causant le choc osmotique étant acides simplifie l'effort d'acidification en aval.
En outre, de manière surprenante, les inventeurs ont remarqué que les membranes internes des bactéries étaient mieux préservées en conditions acides, voire fortement acides, alors que les membranes externes restaient tout aussi sensibles au choc osmotique, peu importe les pH testés.
De manière avantageuse, le pH de la solution hypertonique et/ou le pH de la solution hypotonique est fixé par un tampon de concentration entre 10 et 100 MM, de préférence entre 15 et 50 MM, de manière avantageuse aux environ de 20 MM, par exemple un tampon d'acide acétique (acétate) 20 MM.
Ainsi, ce tampon est relativement faible et le pH du milieu, après rupture de la membrane externe des bactéries, pourra être supérieur, mais ceci pourra être corrigé et le pH voulu pourra avantageusement être finement fixé lors de l'acidification ultérieure, si elle a lieu.
Un aspect lié de la présente invention est un procédé de purification de peptides artificiellement sécrétés dans l'espace périplasmique de bactéries Gram négatif comprenant les étapes successives de : - pratiquer un choc osmotique auxdites bactéries, de manière à relarguer spécifiquement l'espace périplasmique, - appliquer une acidification dudit espace périplasmique relargué, de manière à précipiter spécifiquement les contaminants bactériens, mais pas le peptide d'intérêt et
- obtenir le peptide purifié par sédimentation et/ou par centrifugation.
Comme mentionné ci-dessus, ce procédé comprend avantageusement l'étape préliminaire de déterminer la solubilité du peptide d'intérêt dans différentes solutions acides et d'utiliser une solution suffisamment acide pour précipiter les contaminants bactériens tout en maintenant le peptide d'intérêt en solution.
De préférence, le pH de la solution d'acidification dans ce procédé est compris entre 3,0 et 6,0, de préférence entre 4,0 et 5,0 (le pH est le plus acide possible tout en assurant la solubilité du peptide d'intérêt).
De préférence, la solution acide ajoutée dans ce procédé comprend de l'acide acétique à une concentration de préférence comprise entre 0,2 M et 3 M, de préférence entre 0,3 M et 1,5 M, de manière encore plus préférée entre 0,4 M et 10 M.
En synergie avec ce qui précède, de préférence, les solutions hypertoniques et/ou hypotoniques utilisées pour le choc osmotique de ce procédé sont acides, de préférence à un pH compris entre 3,0 et 5,0, de manière plus préférée entre 3,5 et 4,0.
De manière avantageuse, le pH de la solution hypertonique et/ou le pH de la solution hypotonique est fixé par un tampon de concentration entre 10 et 100 MM, de préférence entre 15 et 50 MM, de manière avantageuse aux environ de 20 MM, par exemple un tampon d'acide acétique (acétate) 20 MM.
Les deux procédés ci-dessus ont été appliqués avec succès au CRM197, ainsi qu'à d'autres peptides restant solubles en conditions acides.
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention seront tirés de la description non limitative qui suit, et en faisant référence aux dessins et aux exemples.
Exemples.-
Il est bien entendu que la présente invention n'est en aucune façon limitée aux formes de réalisations décrites ci-dessus et que bien des modifications peuvent y être apportées sans sortir du cadre des revendications annexées.
Exemple comparatif :
Les inventeurs ont utilisé 2 x 30g de pâte cellulaire congelée d'Escherichia coli exprimant une protéine d'intérêt (CRM197 ; SEQ ID
NO :1) dans l’espace périplasmique. La pâte a été décongelée à température ambiante et ensuite re-suspendue dans deux flacons avec à chaque fois 60 ml d'un tampon hypertonique (Acétate de sodium 20
MM, EDTA 5 MM; saccharose 20% (ww); pH 3,6) et mélangée délicatement (manuellement) pendant environ 10 minutes, jusqu'à disparition des agrégats.
Dans chaque flacon contenant la suspension, celle-ci a ensuite été diluée avec 210 ML d'un tampon hypotonique (MgCL» 5mM, acétate de sodium 20 mM, pH 3,6) froid et mélangée délicatement (manuellement) pendant 30 secondes. Ensuite, dans une des conditions, le pH de la suspension a été ajusté par l'ajout d’une solution d'acide acétique, de manière à obtenir un pH final de 4,5. Les deux conditions ont alors été centrifugées pendant 20 minutes à 8000 rom à 4°C dans une centrifugeuse Avanti.
Le surnageant, qui contient l'extrait périplasmique, est récupéré et filtré à 0,2 um.
Les inventeurs ont observé à leur surprise que ce bref temps de choc osmotique était suffisant et que l'acidification augmentait la pureté de la protéine d'intérêt (de 50% à 65%) en induisant la précipitation de protéines contaminantes de E. coli. La protéine d'intérêt ne précipitait pasäcephH.
Exemple 1
Extraction périplasmique en mode automatisé. Un autre lot de la pâte cellulaire d’Escherichia coli exprimant une protéine d'intérêt (CRM197 ; SEQ ID NO :1) dans l'espace périplasmique a été utilisée, cette fois-ci pour une extraction périplasmique de manière automatisée.
La pâte décongelée (450 g) à température ambiante a été incubée pendant 15 minutes dans 900 ml d'une solution hypertonique (Acétate de sodium 20 MM, EDTA 5 MM ; saccharose 20% (w:w) ; pH 3,6) sous agitation mécanique délicate.
L’échantillon est ensuite pompé dans une chambre de mélange à un débit fixé et constant QT et, au même moment, la solution hypotonique froide est ajoutée à un autre débit fixé et constant Q2, de manière à ce que l'ensemble de la solution hypotonique (3,1 |) soit pompé durant le même temps que la suspension hypertonique comprenant les cellules. La solution hypotonique est MgCL2 5MM, acétate de sodium 20
MM, pH 3,6. Ensuite, lorsqu'un volume permettant un temps de contact voulu est atteint dans la chambre de mélange, le mélange est pompé à un flux constant Q3 qui est la somme des flux Q1 et Q2 (le volume dans la chambre de mélange reste donc substantiellement constant, jusqu'à la vidange de la chambre de mélange) et ce mélange passe dans une tuyauterie de diamètre et de longueur déterminés, de manière à y assurer un temps de résidence de 30 secondes. La tuyauterie aboutit dans une seconde chambre de mélange où une solution d'acide acétique (HAc 0,5M ; pH=4,5) y est pompée avec un débit adapté, de manière à assurer un pH de 4,5. Le pH est suivi en continu. Le temps de résidence du mélange dans la chambre d'acidification est de 30 secondes et, une fois que le volume permettant ce temps de résidence est atteint, une pompe extrait le mélange contenant l'échantillon acidifié à un débit Q5 (Q5=Q3+Q4). Ensuite, le mélange est centrifugé et le surnageant, qui contient l'extrait périplasmique clarifié, est conservé. Une pureté aussi bonne que dans le procédé manuel avec acidification, 65%, a été obtenue. La présente méthode permet toutefois de traiter des quantités nettement plus importantes, 15 fois plus dans le présent exemple, tout en assurant un contrôle du procédé, ce qui garantit sa reproductibilité, même lorsque des très grandes quantités sont traitées.
Les inventeurs ont également testé le même système d'extraction périplasmique, mais sans l'addition d'acide acétique après le choc osmotique. La pureté était nettement moins bonne, inférieure à 50%. Cependant, à nouveau, ce procédé automatisé permet de traiter de grandes quantités. La protéine d'intérêt peut, au besoin, être purifiée via Une ou plusieurs chromatographies.
Exemple 2
Selon une variante, la seconde chambre de mélange est omise, et la solution d'acidification (HAc 0,5 M) est ajoutée directement à la fin de la tubulure contenant le mélange des solutions hypertoniques et hypotoniques où passe le flux Q3, de manière à obtenir un pH final de 4,5; ceci se fait via un raccord en «T» et l'homogénéité du mélange est assurée en adaptant le diamètre des canalisations, le temps de contact étant assuré en adaptant en outre la longueur de la tuyauterie.
Claims (17)
1. Procédé d'extraction automatise d'un peptide d'intérêt artificiellement sécrété dans l'espace périplasmique d'une bactérie Gram négatif comprenant les étapes successives de : - placer lesdites bactéries en suspension dans une solution hypertonique, - pomper dans une première chambre de mélange ladite suspension dans un milieu hypertonique, à un débit constant et calibré QI ; - simultanément pomper à un débit constant et calibré Q2 une solution hypotonique dans ladite chambre de mélange, de manière à ce que le mélange contenant lesdites cellules, la solution hypertonique et la solution hypotonique reste au moins 10 secondes dans ladite chambre de mélange, de manière à assurer une rupture de la membrane externe desdites bactéries par choc osmotique tout en préservant l'intégralité de Ia membrane interne desdites bactéries ; - pomper ledit mélange pour le soutirer de ladite chambre de mélange vers une tuyauterie, à un débit constant et calibré Q3, de manière à ce que le volume dans ladite première chambre de mélange permette d'assurer le temps de résidence voulu dans ladite première chambre de mélange, ladite tuyauterie ayant une longueur et un diamètre de manière à assurer UN temps de contact d'au moins 10 secondes additionnelles au temps de contaci dans ladite première chambre de mélange ; - collecter ledit mélange, puis
- centrifuger ledit mélange collecté de manière à récupérer le surnageant clarifié, comprenant ledit peptide d'intérêt.
2. Le procédé selon la revendication 1 comprenant en outre l'étape d'ajouter une solution acide à la solution comprenant la suspension cellulaire, Ia solution hypertonique et la solution hypotonique tout en conservant la solubilité du peptide d'intérêt, de préférence dans lequel la solubilité du peptide en milieu acide a été prédéterminée.
3. Le procédé selon la revendication 2 dans lequel l'étape d'acidifier la solution se réalise directement au niveau de la tuyauterie recevant le débit Q3 via l'addition en continu audit débit Q3 d'un débit Q4 d'une solution acide, de préférence de manière à obtenir à UN pH final compris entre 3,0 et 6,0, de préférence entre 4,0 et 5,0, de manière encore plus préférée entre 4,2 et 4,8.
4. Le procédé selon la revendication 2 dans lequel l'étape d'ajouter une solution acide se réalise dans une seconde chambre de mélange, ladite seconde chambre de mélange (6) recevant le débit Q3 et un débit Q4 de ladite solution acide, de manière à réaliser un mélange homogène, ledit mélange étant soutiré de ladite seconde chambre de mélange (6) à un débit constant, de manière à assurer un volume permettant le temps de résidence voulu dans ladite seconde chambre de mélange (6), de préférence ladite solution acide ayant un pH compris entre 3,0 et 6,0, tel qu'entre 4,0 et 5,0, de manière encore plus préférée entre 4,2 et 4,8.
5. Le procédé selon une quelconque des revendications 2 à 4 dans lequel la solution acide est l'acide acétique, de préférence à une concentration comprise entre 0,2 M et 3,0 M, telle que environ 0,5 M.
6. Le procédé selon une quelconque des revendications précédentes dans lequel les solutions sont ajoutées et soutirées par le bas dela première (1) et/ou de la seconde (6) chambre de mélange.
7. Le procédé selon une quelconque des revendications précédentes 1 à 6 dans lequel les flux Q1 et Q2 sont mélangés via les turbulences induites par l'arrivée du flux Q1 et/ou Q2 dans la chambre de mélange.
8. Le procédé selon une quelconque des revendications précédentes 1 à 7 dans lequel la première (1) et/ou la seconde (2) chambre de mélange comprend une agitation mécanique (8, 9), ladite agitation mécanique (8, 9) étant calibrée de manière à ne pas causer la rupture des membranes internes des bactéries.
9. Le procédé selon une quelconque des revendications précédentes dans lequel la solution hypertonique et/ou la solution hypotonique sont à un pH compris entre 3,0 et 5,0, de préférence entre 3,5 et 4,0.
10. Le procédé selon la revendication 9, dans lequel le pH de la solution hypertonique et/ou le pH de la solution hypotonique est fixé par un tampon de concentration entre 10 et 100 MM, de préférence entre 15 et 50 MM, de manière avantageuse aux environ de 20 MM.
11. Le procédé selon la revendication 9 ou 10 dans lequel la solution hypertonique et/ou hypotonique comprend un tampon d'acide acétique (acétate) 20 MM.
12. Procédé de purification de peptides artificiellement sécrétés dans l'espace périplasmique de bactéries Gram négatif comprenant les étapes successives de : - pratiquer un choc osmotique auxdites bactéries, de manière à relorguer spécifiquement = l'espace périplasmique, - appliquer une acidification dudit espace périplasmique relargué, de manière à précipiter spécifiquement les contaminants bactériens, mais pas le peptide d'intérêt et
- obtenir le peptide purifié par sédimentation et/ou par centrifugation.
13. Procédé selon la revendication 12 comprenant l'étape préliminaire de déterminer la solubilité du peptide d'intérêt dans différentes solutions acides et d'utiliser une solution suffisamment acide pour précipiter les contaminants bactériens tout en maintenant le peptide d'intérêt en solution.
14. Procédé selon la revendication 12 ou 13 dans lequel le pH de la solution d'acidification est compris entre 3,0 et 6,0, de préférence entre 4,0 et 5,0.
15. Procédé selon la revendication 14, dans lequel la solution acide comprend de l'acide acétique, à une concentration de préférence comprise entre 0,2 M et 3 M, de préférence entre 0,3 M et 1,5 M, de manière encore plus préférée entre 0,4 M et 1,0 M.
16. Procédé selon une quelconque des revendications précédentes 12 à 15 dans lequel les solutions hypertoniques et/ou hypotoniques utilisées pour le choc osmotique sont acides, de préférence à UN pH compris entre 3,0 et 5,0, de manière plus préférée entre 3,5 et 4,0 et/ou de préférence via un tampon acide de concentration comprise entre 10 et 100 MM, de préférence entre 15 et 50 MM.
17. Procédé selon une quelconque des revendications précédentes dans lequel le peptide est CRM197.
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| WO2008088757A2 (fr) * | 2007-01-12 | 2008-07-24 | Dow Global Technologies Inc. | Appareil et procédés pour appliquer un choc osmotique à des cellules |
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-
2023
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008088757A2 (fr) * | 2007-01-12 | 2008-07-24 | Dow Global Technologies Inc. | Appareil et procédés pour appliquer un choc osmotique à des cellules |
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| SCHIMEK CLEMENS ET AL: "Extraction of recombinant periplasmic proteins under industrially relevant process conditions: Selectivity and yield strongly depend on protein titer and methodology", BIOTECHNOLOGY PROGRESS, vol. 36, no. 5, 1 September 2020 (2020-09-01), XP055967636, ISSN: 8756-7938, Retrieved from the Internet <URL:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7685146/pdf/BTPR-36-e2999.pdf> DOI: 10.1002/btpr.2999 * |
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