TW201309722A - 野生型或突變型白喉毒素之純化方法 - Google Patents

野生型或突變型白喉毒素之純化方法 Download PDF

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Abstract

本發明係關於羥基磷灰石層析及多元層析之用途，其係用於自混合物、例如含有諸如宿主細胞蛋白質及DNA之雜質的宿主細胞醱酵混合物中純化白喉毒素或其突變型。本發明進一步係關於使該方法與適用於活體外及活體內應用之純化白喉毒素之其他部分分離方法整合成多步程序。

Description

野生型或突變型白喉毒素之純化方法
本發明係關於使用羥基磷灰石層析及多元層析純化野生型或突變型白喉毒素之方法。在某些實施例中，突變型白喉毒素為CRM197。
相關申請案之交叉參考
不適用
白喉毒素為由白喉桿菌(Corynebacterium diphtheriae)之產毒素菌株合成及分泌之蛋白質毒素。白喉毒素及其突變型已在兩種疫苗中用作載體蛋白且在抗癌藥中用作目標療法。自20世紀20年代以來，甲醛不活化白喉毒素已用於接種疫苗對抗白喉桿菌。在二十世紀八十年代，使用突變型白喉毒素之結合疫苗開始廣泛使用。參見Shinefield,2010,Vaccine 28：4335-4339。白喉毒素刺激T細胞免疫之能力使其成為不依賴於T細胞之抗原(例如多醣)的引人注目之載體蛋白。白喉毒素亦藉由結合特異性靶向腫瘤細胞上過度表現之表面蛋白質之配位體而用作癌症療法。參見Michl等人，2004,Curr Cancer Drug Targets,4：689-702；及Potala等人，2008,Drug Discovery Today 13：807-815。
在兩種疫苗及抗癌劑中極其需要突變型白喉毒素。在疫苗中，白喉毒素通常經突變以降低毒性。該等突變可導致ADP核糖基化活性損失，由此阻斷野生型毒素中之蛋白質合成。在抗癌劑中，白喉毒素通常經突變以消除與正常細 胞上其野生型受體之結合。參見Potala等人，2008,Drug Discovery Today 13：807-815。
在疫苗應用中，CRM197為最廣泛使用之白喉毒素突變體。不同於白喉毒素，CRM197係由白喉桿菌之突變菌株在52位存在麩胺酸而非甘胺酸之情況下產生，且基本上無毒。參見Uchida等人，1973,J Biol Chem 248：3838-3844。CRM197目前廣泛用作供兒科使用之疫苗之載體。參見Shinefield,2010,Vaccine 28：4335-4339。
已使用之純化白喉毒素及突變型白喉毒素之方法包括親和層析(Cukor等人，1974,Biotech and Bioeng 16：925-931；及Antoni等人，1983,Experientia 39：885-886)、陰離子交換合併疏水性層析(Rappuoli等人，1983,J.Chromatog 268：543-548)及切向流過濾(Sundaran等人，2002,J Biosci and Bioeng 94：93-98)。
對於臨床使用，需要大量突變白喉毒素。然而，自白喉桿菌之白喉毒素產生菌株產生白喉毒素仍存在問題，且此外，在按比例放大實驗室規模醱酵條件以產生足量白喉毒素且詳言之突變型白喉毒素以用於治療性用途方面遇到了困難。因此，在獲得足夠產量及純度之白喉毒素方面存在問題，且大規模製備趨向於低效。舉例而言，低pH值會誘發構形變化且促進聚集，從而難於使用典型陽離子交換劑(及較低pH值)。大多數產生異質之毒素通常亦存在蛋白水解分裂(藉由宿主蛋白酶或自催化)。可偵測到例如產物同功異型物、產物變異體、產物片段或糖基化模式之形式之 異質。此等產物形式須移除，其一般且特異性針對白喉毒素保持毒素純化之攻擊特徵。需要克服此等困難以能夠用兒科疫苗滿足當前需要且開發目標抗癌藥之前景。
所需為提供白喉毒素之有效純化及高產率之純化方法。
本申請案之此章節或任何其他章節中任何參考文獻之引用或辨識不應視為指示該參考文獻可用作本發明之先前技術。
本發明係關於提供高純度及高產率之自完整細胞純化突變白喉毒素及其突變型(例如CRM197)之方法。已發現此製程中之關鍵步驟為藉由使用羥基磷灰石樹脂移除內毒素及殘餘蛋白質。亦執行多元層析步驟。在一個態樣中，在使用羥基磷灰石樹脂之後即刻使用多元層析樹脂。在另一態樣中，在即將使用羥基磷灰石樹脂之前使用多元層析樹脂。
因此，在一個實施例中，本發明係關於一種自含有白喉毒素或其突變型之混合物純化白喉毒素或其突變型之方法，其包含：a)使該混合物與第一分離劑在使得白喉毒素或其突變型結合於第一分離劑之條件下接觸；b)自第一分離劑溶離白喉毒素或其突變型；c)使自步驟a)獲得之溶離物質與第二分離劑在使得白喉毒素或其突變型結合於第二分離劑之條件下接觸；及d)自第二分離劑溶離該白喉毒素或其突變型； 其中1)第一分離劑為羥基磷灰石且第二分離劑為多元樹脂；或2)第一分離劑為多元樹脂且第二分離劑為羥基磷灰石；且在第一分離劑或第二分離劑為羥基磷灰石時，在自羥基磷灰石溶離之前，羥基磷灰石在使得移除雜質之條件下經歷洗滌步驟。
在某一態樣中，第一分離劑為羥基磷灰石且第二分離劑為多元樹脂。
在某些態樣中，在6.5至8.0之pH值下用包含0.01 M至1.0 M氯化鉀或氯化鈉之洗滌溶液洗滌羥基磷灰石。洗滌緩衝液可進一步包含0.1 mM至20 mM磷酸鉀或磷酸鈉。
在某些態樣中，自羥基磷灰石溶離包含i)用包含約30 mM氯化鉀或氯化鈉或約15 mM磷酸鉀或磷酸鈉之溶離緩衝液進行步進溶離，ii)包含約10 mM至約25 mM磷酸鉀或磷酸鈉或約100 mM至2 M氯化鉀或氯化鈉之梯度溶離；或iii)pH值變化0.3個pH值單位。
在某些態樣中，與多元樹脂接觸之混合物包含Tris、MES、MOPS、HEPES、磷酸鹽(例如磷酸鉀)、氯化物(例如氯化鉀或氯化鈉)或磷酸鹽(例如磷酸鈉)。
在某些態樣中，混合物如下自多元樹脂溶離：i)在pH 6.8至pH 9.5下用包含約125 mM氯化鉀或氯化鈉之溶離緩衝液進行步進溶離；ii)包含約0.2 M至約0.3 M氯化鈉、氯化鉀、硫酸鈉、硫酸銨或氯化鉀之梯度溶離；iii)在6.5至9.5之pH值範圍內pH值變化0.5個pH值單位；或iv)在2℃至30℃之溫度內溫度變化1℃。
在本發明之某些態樣中，多元樹脂含有包含帶電荷部分及疏水性部分之配位體。在某些態樣中，帶電荷部分為帶負電荷之部分，例如用於陽離子交換之陰離子羧酸根基團或陰離子磺基。該多元樹脂之實例為Capto-MMCTM。在其他態樣中，帶電荷部分為帶正電荷部分，例如胺基。該多元樹脂之實例為Capto AdhereTM。
在本發明之某些態樣中，與多元樹脂接觸之混合物包含EDTA或蛋白酶抑制劑。在本發明之其他態樣中，自多元樹脂溶離在EDTA或蛋白酶抑制劑存在下發生。
在不同實施例中，將混合物施加於羥基磷灰石或多元樹脂(無論何者首先實現)之前可進行以下一或多者：離心、絮凝、澄清或陰離子交換層析。在本發明之某些態樣中，使混合物經歷陰離子交換層析兩次或三次。在本發明之某些態樣中，在施加混合物之前進行離心、絮凝、澄清及陰離子交換層析。澄清可經由離心及深度過濾實現。
在本發明之某些實施例中，起始混合物為宿主細胞之醱酵培養物。在此實施例之某些態樣中，收集培養之宿主細胞且進行滲透衝擊以自周質釋放白喉毒素或其突變型。在其他態樣中，藉由離心或微過濾回收醱酵細胞。
在本發明之其他實施例中，起始混合物係獲自無細胞產生系統。
在某些實施例中，使含有白喉毒素或其突變型之混合物在接觸羥基磷灰石樹脂且自羥基磷灰石樹脂溶離及接觸多元樹脂且自多元樹脂溶離之後經歷以下一或多者：離心、 超濾、微過濾、過濾及陰離子交換薄膜層析。在某些態樣中，使含有白喉毒素或其突變型之混合物經歷超濾、微過濾、過濾及陰離子交換薄膜層析。
在某些實施例中，白喉毒素或其突變型式為CRM197。
在某些實施例中，最終液體調配物使用本發明之方法獲得，在該等方法中移除90%之宿主細胞蛋白質及宿主細胞雜質且白喉毒素或其突變型之產率25%或35%。在某些實施例中，如凝膠電泳所分析，純化白喉毒素或其突變型至純度90%、95%或98%。僅根據完整白喉毒素或其突變型(白喉毒素片段為雜質)之百分比計算純度。在某些實施例中，白喉毒素或其突變型之液體調配物具有約10 g/L或50 g/L之濃度且在2℃下維持90%純度至少6個月。在其他實施例中，如凝膠電泳所分析，在25℃下維持90%純度水準至少5天或至少3週。如凝膠電泳所分析，異質為1%之產物，如Kinetic-QCL顯色分析套組所量測，內毒素為1 EU/mg，且藉由HPSEC/UV發現，聚集為0.2%或0.1%。
本發明係關於羥基磷灰石層析及多元層析(例如Capto-MMCTM)之用途，其係用於純化白喉毒素及突變型白喉毒素。白喉毒素可自含有白喉毒素之混合物純化，例如表現於宿主細胞中之白喉毒素，或任何部分純化之白喉毒素混合物。使用羥基磷灰石層析確定條件，以便90%之宿主細胞蛋白質及其他殘餘雜質與CRM197分離，同時在超濾之 前維持製程產率50%至60%。使用羥基磷灰石及多元層析確定條件，以便95%之宿主細胞蛋白質及其他殘餘雜質與CRM197分離，同時維持製程產率20%至40%。本文所述之純化製程可經受大規模製造且已按比例放大以容納250及1300 L醱酵培養液饋料。
本發明方法提供一種一致且穩固之白喉毒素純化製程，且產生高品質之完整突變白喉毒素。在半成品(final bulk)中突變白喉毒素能夠高度濃縮(>100 g/L)，同時維持蛋白質均質性(例如完整的質量及單體形式)。此情況可得到提高之純度。因而，與需要將原液凍乾之習知方法相對，原液可以液體形式儲存。高濃度之白喉毒素在與多醣發生結合反應期間尤其重要，此係因為其會加速反應動力學。
本文所討論之樹脂官能基，例如羥基磷灰石及多元樹脂，可用於任何已知純化技術，諸如管柱層析及薄膜層析。管柱層析因其可再用性而通常較佳。當本發明方法與薄膜一起使用時，吸收特性呈現於聚合表面上。不使用填充於管柱中之樹脂，內表面區域上具有官能基之微孔薄膜將用於白喉毒素捕捉。此等薄膜可包含例如呈平板或中空纖維組態之乙酸纖維素或聚偏二氟乙烯。優於管柱層析之優點包括操作時間較短且與所需管柱體積相比薄膜體積較小。
如本文所用，術語「白喉毒素」用於以指天然存在之蛋白質。提及白喉毒素時之「其突變型」或「突變白喉毒素」係指與白喉毒素之一致性70%、80%、90%、 95%、98%或99%之序列，且包括任何已知突變型，尤其無毒突變體，諸如CRM107及CRM197及美國專利第6,455,673號中所述者。本文中任一次提及白喉毒素時均可使用「其突變型」。
如本文所用，在與pH值或pI值一起使用時，「約」係指0.1、0.2、0.3、0.4或0.5個單位之偏差。在與溫度值一起使用時，「約」係指1、2、3、4或5度之偏差。在與諸如長度及重量之其他值一起使用時，「約」係指1%、2%、3%、4%、5%或10%之偏差。
如本文所用，「澄清」係指樣品(例如活細胞或非活細胞)經歷涉及離心、微過濾、過濾或沈降/傾析程序中之一或多者的固液分離步驟以移除宿主細胞及/或細胞碎片。澄清醱酵培養液可為醱酵上清液。澄清有時稱為首要或初始回收步驟且通常發生在任何層析或類似步驟之前。
如本文所用，「混合物」包含相關蛋白質(對該蛋白質而言，需要純化)，及一或多種污染物，亦即雜質。混合物可自產生多肽之無細胞產生系統、宿主細胞或生物體直接獲得。不意欲具有限制性，可根據本發明方法純化之混合物之實例包括收集之細胞培養/醱酵液或上清液、澄清上清液及條件上清液。已「部分純化」之混合物已經歷層析步驟，例如非親和層析、親和層析等。「條件混合物」為藉由使混合物經歷緩衝液交換、稀釋、鹽加成、pH滴定或過濾中之一或多者而用於本發明方法中以便設定pH值及/或電導率範圍及/或緩衝液基質以實現所需層析效能的混 合物，例如已製備用於層析步驟之細胞培養/醱酵上清液。「條件混合物」可用於使第一層析管柱上之裝載條件標準化。一般而言，混合物可經由此項技術中熟知之各種分離方式獲得，例如藉由在生物反應器運作結束時使用過濾或離心以物理方式分離細胞與培養液中之其他組分，或藉由將混合物濃縮及/或透濾至特定pH值、電導率及緩衝液物質濃度範圍來獲得。
如本文所用，「精製層析(polishing chromatography)」係指捕捉層析後之一或多個其他層析步驟且用於移除殘餘宿主細胞雜質及產物相關雜質(白喉毒素異質，包括片段及/或聚集物質)。
白喉毒素
已描述白喉蛋白質之序列及結構。參見Delange等人，1976,Proc Nat Acad Sci USA 73：69-72；及Falmagne等人，1985,Biochim Biophys Acta 827：45-50。包括(但不限於)CRM107及CRM197之突變型白喉毒素可使用本發明方法純化。
突變型毒素，諸如由Laird等人，1976,J.Virology 19：220-227及由Nicholls及Youle,Genetically Engineered Toxins,Frankel編，Marcel Dekker,Inc,1992所述之突變型(包括CRM107)亦可藉由此項技術中已知之方法，例如藉由Laird等人，1976,J.Virology 19：220-227中所述之方法以及基於棒狀桿菌噬菌體β所攜帶之白喉毒素之野生型結構基因之已知核苷酸序列藉由定點突變誘發(Greenfield等 人，1993,Proc Nat Acad Sci 50：6953-7)來製備。
本發明方法亦可適用於純化其他細菌毒素，其較佳為已藉由化學或遺傳方式變得可安全投與個體之免疫學有效抗原或載體。實例包括不活化細菌毒素，諸如RTX樣毒素(MARTX毒素)、難養芽胞梭菌毒素(clostridium difficile toxin)及芽胞梭菌屬葡萄糖基化毒素家族、破傷風類毒素、肉毒桿菌毒素、梭菌細胞毒素、百日咳類毒素、大腸桿菌LT(E.coli LT)、大腸桿菌ST及來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa)之外毒素A。亦可使用細菌外膜蛋白，諸如外膜複合物c(OMPC)、孔蛋白、運鐵蛋白結合蛋白、肺鬆解術(pneumolysis)、肺炎球菌表面蛋白A(PspA)、肺炎球菌黏附蛋白(PsaA)或肺炎球菌表面蛋白BVH-3及BVH-11。亦可使用其他蛋白質，諸如炭疽桿菌(Bacillus anthracis)之保護性抗原(PA)、卵白蛋白、匙孔螺血氰蛋白(KLH)、人血清白蛋白、牛血清白蛋白(BSA)及結核菌素之經純化蛋白質衍生物(PPD)。蛋白質較佳為無毒且非致反應發生且可以可經受結合反應之足夠量及純度獲得之蛋白質。
宿主細胞/無細胞產生
白喉毒素或其突變型可由許多無細胞產生系統或宿主細胞製備。舉例而言，天然存在之白喉毒素可自白喉桿菌(Corynebacteria diphtheriae)之培養物及來自包括美國菌種保存中心(American Type Culture Collection)之多個公開可用來源之其他菌株純化。
無細胞產生系統在此項技術中熟知。舉例而言，一種系統係基於使用重組要素之蛋白質合成(Protein synthesis Using Recombinant Elements，PURE)(參見例如Shimizu等人，2001,Nat Biotechnol 19：751-755及Ohashi等人，2007,Biochem Biophys Res Commun 352：270-276)。其他無細胞產生系統描述於Voloshin等人，2005,Biotechnol Bioeng 91：516-21；Kim等人，2001,Biotechnol Bioeng 74：309-16；Calhoun等人，2005,Biotechnol Bioeng 90(5)：606-13；Jewett等人，2004,Biotechnol Bioeng 86：19-26；Jewett等人，2004,Biotechnol Bioeng 87(4)：465-72中。
白喉毒素及其突變型可表現於白喉桿菌或經遺傳工程改造以產生蛋白質之其他微生物中。遺傳工程改造細胞以產生蛋白質之方法在此項技術中熟知。參見例如Ausabel等人編，(1990),Current Protocols in Molecular Biology(Wiley,New York)及美國專利第5,534,615號及第4,816,567號。該等方法包括引入編碼蛋白質且使其表現於活宿主細胞中之核酸。其他細菌宿主細胞包括(但不限於)大腸桿菌細胞。CRM197係由白喉桿菌之突變菌株產生。參見Uchida等人，1973,J Biol Chem 248：3838-3844。
在本發明之某些實施例中，利用螢光假單孢菌(P.fluorescens)作為宿主表現系統產生突變白喉毒素。參見H.Jin等人，Soluble periplasmic production of human granulocyte colony-stimulating factor(G-CSF)in Pseudomonas fluorescens,Protein Expr.Purif.(2011), doi：10.1016/j.pep.2011.03.002及美國專利申請公開案第20090325230號。
白喉毒素之產生
白喉毒素或其突變型可藉由此項技術中已知之方法產生。參見例如美國專利申請公開案第20060270600號。該方法較佳涉及培養微生物，例如細菌，諸如白喉桿菌。已經編碼相關蛋白質之核酸工程改造之宿主細胞可在此項技術中熟知之允許表現該蛋白質之條件下培養。
CRM197可藉由Park等人，J Exp Med(1896)1：164-185所述之方法產生。
在一種利用螢光假單孢菌之表現系統中，醱酵製程由第一階段接種震盪燒瓶(冷凍小瓶比燒瓶)、第二階段接種醱酵器及包括生長期及誘導期之產生醱酵器組成。甘油用作碳源且異丙基-β-D-硫代哌喃半乳糖苷(IPTG)誘導性啟動子驅動蛋白質表現。接著將冷卻之細胞懸浮液轉移至回收或純化製程。
毒素產生可以多種已知方法，諸如SDSPAGE、ELISA或ADP核糖基化分析(參見Blanke等人，1994,Biochemistry 33：5155)或藉由此等方法之組合來監測。
在本文所述之產生方法中，pH值最佳根據熟習此項技術者熟知之程序來控制。
預加工
欲施加於羥基磷灰石及多元樹脂上之混合物可例如為含有白喉毒素之上清液、含有白喉毒素之細胞部分或由醱酵/ 培養上清液(例如濃縮上清液，諸如超濾上清液或透濾上清液)獲得之含有白喉毒素之製劑。欲施加之混合物較佳藉由使用諸如絮凝、澄清及陰離子交換層析之方法來加工。在一些實施例中，使用所有三種此等方法加工混合物。
在將白喉毒素分泌至醱酵上清液中之白喉桿菌之情況下，該方法可對醱酵上清液或由其獲得之製劑直接進行。在表現於其他微生物(諸如經遺傳修飾以表現白喉毒素之大腸桿菌)之情況下，白喉毒素可見於細胞內，例如周質或細胞質中。在該等情況中，首要回收步驟可視細胞位置而定。白喉毒素可藉由此項技術中已知之方法，例如如Skopes,Protein Purification,Principles and Practice，第3版，Pub：Springer Verlag所述之方法自細胞萃取，隨後根據本發明之方法純化。
在使用全細胞之情況下，細胞較佳經歷滲透衝擊。滲透衝擊步驟較佳包括在細胞濃縮之後之純化製程內。此舉通常為容積莫耳滲透濃度步驟變化與絮凝步驟之組合。此等環境變化產生極少所釋放之細胞質雜質及澄清時輕易移除之細胞碎片。對於細菌周質間隙中之蛋白質分子，已使用實驗室規模分批滲透衝擊程序以在無完全細胞破環之情況下選擇性釋放周質內含物。該製程通常藉由用高莫耳濃度鹽或糖溶液(浸泡緩衝液)平衡醱酵培養液以在細胞內建立高滲透壓開始。此後與低容積莫耳滲透濃度緩衝液(衝擊緩衝液)以分批方式混合有限之一段時間以釋放周質內含 物。通常在釋放之後藉由澄清方法移除細胞碎片。滲透衝擊細胞之方法描述於美國專利申請公開案第20080182295號中。
絮凝為一種將化學試劑添加至混合物中以聚結微粒使其沈降之製程。許多絮凝劑為多價陽離子，諸如鋁、鐵、鈣或鎂。此等帶正電荷分子與帶負電荷粒子及分子相互作用以減少聚集之障壁。另外，許多此等化學製品在適當pH值及諸如溫度及鹽度之其他條件下與水反應形成不可溶氫氧化物，該等氫氧化物在沈澱時連接在一起形成長鏈或網，從而以物理方式截獲小粒子成為較大聚集體。適當絮凝劑包括礬、水合氯化鋁(aluminium chlorohydrate)、硫酸鋁、氧化鈣、氫氧化鈣、硫酸鐵(II)、氯化鐵(III)、聚丙烯醯胺、聚二甲基二烯丙基氯化銨(polyDADMAC)、鋁酸鈉及矽酸鈉。絮凝條件為熟習此項技術者所熟知。
其他絮結劑作為選擇性沈澱劑(SPA)描述於美國專利第7,326,555號中。此等絮結劑包括(但不限於)胺共聚物、四級銨化合物及其任何各別混合物。此等試劑之混合物為純形式提供類似效能，同時併入多種沈澱機制(亦即首要結合位點)。此等試劑之混合物可作為沈澱緩衝劑添加至混合物中，或可併入高截/低截添加方法。更特定言之，許多形式之聚乙烯亞胺(PEI)已顯示其極其有效，在約中性pH條件下尤其有效。理論上，具有相對較高分子質量之經修飾PEI共聚物可同樣有效。
四級銨化合物包括(但不限於)市售產品之以下類別及實 例：單烷基三甲基銨鹽(市售產品之實例包括溴化十六烷基三甲基銨(CTAB)或氯化十六烷基三甲基銨、溴化十四烷基三甲基銨(TTA)或氯化十四烷基三甲基銨、氯化烷基三甲基銨、氯化烷基芳基三甲基銨、溴化十二烷基三甲基銨或氯化十二烷基三甲基銨、溴化十二烷基二甲基-2-苯氧基乙基銨、氯化十六烷基胺鹽或溴化十六烷基胺鹽、氯化十二烷基胺鹽及溴化十六烷基二甲基乙基銨或氯化十六烷基二甲基乙基銨)、單烷基二甲基苄基銨鹽(實例包括氯化烷基二甲基苄基銨及苄索氯銨(BTC))、二烷基二甲基銨鹽(商業產品包括溴化度米芬(domiphen bromide，DB)、鹵化二癸基二甲基銨及氯化辛基十二烷基二甲基銨或溴化辛基十二烷基二甲基銨)、雜芳族銨鹽(商業產品包括鹵化十六烷基吡啶鎓(例如CPC)或溴化十六烷基吡啶鎓鹽、及溴化十六烷基吡錠或氯化十六烷基吡錠)、順式異構體1-[3-氯烯丙基]-3,5,7-三氮-1-氮鎓金剛烷、溴化烷基-異喹啉鎓及氯化烷基二甲基萘基甲基銨(BTC 1110)、經多取代四級銨鹽(市售產品包括(但不限於)葡糖二酸烷基二甲基苄基銨及環己基胺基苯磺酸烷基二甲基乙基苄基銨)、雙四級銨鹽(產品實例包括1,10-雙(氯化2-甲基-4-胺基喹啉鎓)-癸烷、1,6-雙{氯化1-甲基-3-(2,2,6-三甲基環己基)-丙基二甲基銨}己烷或曲比氯銨(triclobisonium chloride)及由Buckman Brochures稱為CDQ之雙季銨鹽)及聚合四級銨鹽(包括主鏈型聚四級銨鹽(polyionene)，諸如聚[二氯氧伸乙基(二甲基亞胺基)乙烯(二甲基亞胺基)乙烯]、二氯化聚[N-3-二甲基 銨基)丙基]N-[3-伸乙基氧基伸乙基二甲基銨基)丙基]脲及α-4-[氯化1-參(2-羥基乙基)銨)。
培養液澄清可用於獲得含有白喉毒素之上清液。細菌可藉由此項技術中已知之方法，諸如離心、沈降/傾析或過濾(例如微過濾及透濾)自醱酵培養液分離。澄清通常涉及離心以使固體成為離心塊且回收上清液用於進一步加工。或者，可使用微過濾、深度過濾或基於pH值之沈澱(酸或鹼)以過濾出因體，其中回收濾液用於進一步純化。澄清亦可涉及此等步驟之組合，例如離心合併微過濾或深度過濾。參見例如Wang等人，2006,Biotechnol Bioeng 94：91-104。
過濾以澄清視情況絮凝之培養液可藉由此項技術中已知之方法，例如用薄膜，諸如中空纖維或螺旋纏繞式薄膜，諸如藉助於0.1或0.2 μm過濾器，例如中空纖維過濾器，諸如可獲自A/G Technology之過濾器，或0.4或0.65 μm中空纖維或螺旋纏繞式薄膜，或300 K或500 K過濾器來實現。
可使用透濾以藉由移除鹽及小於透濾薄膜之分子量截斷尺寸之其他離子降低離子強度。離子強度降低有益於後續離子交換步驟，因為在低離子強度下，離子交換基質保留較少毒素且因此改良產率。此外，藉由透濾薄膜實現部分純化。因此可針對低離子強度緩衝液，例如濃度為約0.1 mM至約100 mM，較佳約10 mM至約50 mM，例如10 mM，pH值為約6.5至約9.0，較佳約6.9至約8.0，例如約7.4至7.6之Tris、Tricine、MES、Bis-Tris、TES、MOPS、無 機鹽(例如硫酸鹽及磷酸鹽)，使用例如將移除小於30 000道爾頓分子量之鹽、低分子量介質組分及分泌之蛋白質之30,000道爾頓標稱分子量截斷薄膜進行透濾。該等組分可另外結合於離子交換基質且降低其結合毒素之能力。
透濾及超濾之組合不僅降低離子強度，而且充當初始純化且使體積減小。此意謂可使用較小管柱，由此減少待進行之層析步驟所需之時間。
為便於處理，尤其在關注大體積之情況下，諸如在為醫藥目的進行工業規模純化之情況下，可在離子交換步驟之前實現一定程度之上清液濃縮。使用此項技術中已知之蛋白質濃縮方法，例如藉助於用例如呈過濾器、薄膜或中空纖維形式之多孔材料超濾可將無細胞上清液濃縮通常5至50倍，較佳15至25倍，諸如20倍。為便於處理，過濾器為較佳。對於超濾/濃縮，分子量截斷小於白喉毒素，較佳小於白喉毒素20%之過濾器為較佳，較佳為30 KDa過濾器(亦即具有30,000道爾頓標稱分子量之過濾器)。適用於該等過濾器之物質在此項技術中已知且包括聚合材料，諸如混合纖維素、聚醚碸或PVDF，例如多醣(諸如纖維素)及聚碸。較佳物質為吸收白喉毒素之能力較低之物質。纖維素過濾器尤其較佳，例如由再生纖維素製造之過濾器，諸如基於YM之過濾器及具有極低蛋白結合能力之其他薄膜，例如由Amicon製造之平板切向流生物濃縮器(Flat plate tangential flow bioconcentrator)。
陰離子交換層析可單獨或與陰離子交換取代基組合採 用。就此而言，可將各種陰離子取代基連接至基質以形成用於層析之陰離子支撐物。陰離子交換取代基包括二乙胺基乙基(DEAE)、三甲胺基乙基丙烯醯胺(TMAE)、四級胺基乙基(QAE)及四級胺(Q)基團。諸如DE23、DE32、DE52、CM-23、CM-32及CM-52之纖維素離子交換樹脂可獲自Whatman Ltd.Maidstone,Kent,U.K。亦已知基於葡聚糖凝膠且交聯之離子交換劑。舉例而言，DEAE-葡聚糖凝膠及QAE-葡聚糖凝膠及DEAE-瓊脂糖凝膠及Q-瓊脂糖凝膠全部獲自GE Healthcare,Piscataway,N.J。
可使用習知離子交換樹脂。實例包括Q瓊脂糖凝膠及二乙胺基乙基(DEAE)及四級胺樹脂。可將陰離子交換物質填充至管柱中，管柱尺寸將取決於待使用之培養上清液之體積。熟習此項技術者可根據濃縮介質中之總蛋白質確定適當管柱尺寸。一般而言，對於大規模醱酵，可將約40至50公升施加至體積約1 L之管柱中。首先可用緩衝液平衡管柱，例如低離子強度緩衝液，諸如濃度為約0.1 mM至約100 mM，較佳約10 mM至約50 mM，例如10 mM，pH值為約5至約8，較佳約6.5至約9.0，例如約6.9至7.6之HEPES、Tris、Tricine、MES、Bis-Tris、TES、MOPS、無機鹽(例如硫酸鹽或磷酸鹽)，例如用以透濾濃縮上清液之緩衝液，諸如10 mM Tris、20 mM KCl(pH 7.0)。接著可裝載醱酵上清液或濃縮物，管柱用離子強度低且pH值與平衡緩衝液相同的緩衝液洗滌以洗去任何非結合蛋白質，例如平衡緩衝液。
所用平衡或洗滌鹽可例如選自用於離子交換層析之無機鹽，諸如氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、氯化鈣、氯化鋇、乙酸鈉、過氯酸鋰、硫酸鈉、硫酸鎂、磷酸鉀及硫酸鉀，或熟習此項技術者已知之其他溶離鹽。
可在使得白喉毒素固定於管柱中之條件下將混合物施加於陰離子交換層析管柱中。可使用任何陰離子交換物質，但宜使用市售強或弱陰離子交換層析管柱，諸如具有選自由以下組成之群的官能基之管柱：胺基乙基、二乙胺基乙基、二甲胺基乙基、聚伸乙基亞胺、三甲胺基甲基、三甲胺基羥丙基、二乙基-(2-羥丙基)胺基乙基、四級銨化聚伸乙基亞胺、三乙胺基乙基、三甲胺基乙基及3-三甲胺基-2-羥丙基。其中，具有包含四級胺之官能基之強陰離子交換劑為較佳，例如三甲胺基甲基、三甲胺基羥丙基、二乙基-(2-羥丙基)胺基乙基、四級銨化聚伸乙基亞胺、三乙胺基乙基、三甲胺基乙基及3-三甲胺基-2-羥丙基。使白喉毒素固定於管柱中之條件可由熟習此項技術者在無不當實驗之情況下輕易地確定。
固定之毒素的溶離一般根據已知層析程序使用溶離鹽溶液之濃度梯度執行。所用溶離鹽可例如選自用於離子交換層析之無機溶離鹽，諸如氯化鋰、氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、氯化鈣、氯化鋇、乙酸鈉、過氯酸鋰、硫酸鈉、硫酸鎂、磷酸鉀及硫酸鉀，或熟習此項技術者已知之其他溶離鹽。
接著可以多種方法溶離結合之毒素。此等方法包括改變 緩衝液之pH值或增加緩衝液之離子強度。因此，毒素可藉由梯度增加之具有高離子強度之緩衝液來溶離，諸如含有如濃度為約0.1 M至1.0 M之NaCl、KCl或硫酸銨之鹽的濃度為約10 mM至約1.0 M，較佳約10 mM至約500 mM之HEPES、Tris、Tricine、MES、Bis-Tris、TES、MOPS或磷酸鹽。此等緩衝液可具有約6.5至約8.5，較佳約6.5至約8，例如約6.9至7.6之pH值。較佳緩衝液之一個實例為含有100 mM KCl之10 mM Tris、1 mM磷酸鉀(pH 7.0)。蛋白質將在含約60 mM至90 mM KCl之緩衝液中溶離。
在某些實施例中，使混合物經歷陰離子交換層析一次。在其他實施例中，使混合物經歷陰離子交換層析一次以上，例如2、3或4次。在經歷陰離子交換層析一次以上之情況下，每次可通過相同管柱或薄膜或不同管柱或薄膜。
管柱層析
本發明提供一種自產生白喉毒素(或其突變型式)之細菌之培養物純化白喉毒素或其突變型之方法，該方法包含羥基磷灰石層析步驟及多元層析步驟。可首先執行任一步驟，隨後執行另一步驟。
適當時可使用基質以分批或管柱形式進行層析步驟，就迅速且方便性而言管柱形式為較佳。基質可為如此項技術中已知之習知支撐物，例如基於纖維素、聚苯乙烯、丙烯醯胺、二氧化矽、氟碳化合物、交聯聚葡萄糖或交聯瓊脂糖之惰性支撐物。
羥基磷灰石
羥基磷灰石層析為一種利用形成基質與配位體之不可溶羥基化磷酸鈣[Ca10(PO4)6(OH)2或Ca5(PO4)3OH)2]純化蛋白質之方法。官能基由帶正電荷鈣離子(C位點)對及帶負電荷磷酸根基團(P位點)簇組成。羥基磷灰石與蛋白質之間的相互作用為複雜且混合模式。然而，在一種相互作用方法中，蛋白質上之帶正電荷胺基與帶負電荷P位點締合，且蛋白質羧基藉由與C位點配位錯合而相互作用。參見Shepard,2000,J.of Chromatography 891：93-98。
許多層析支撐物可用於製備HA管柱，最廣泛使用者為I型及II型羥基磷灰石。I型具有高蛋白質結合能力及較佳酸性蛋白質結合能力。然而，II型具有較低蛋白質結合能力，但對核酸及某些蛋白質具有較佳解析度。熟練技術者可確定特定羥基磷灰石類型之選擇。
多種羥基磷灰石層析樹脂為市售的，且該物質之任何可用形式均可用於實施本發明。在本發明之一個實施例中，羥基磷灰石呈結晶形式。用於本發明之羥基磷灰石可為聚結形成粒子且在高溫下燒結成穩定多孔陶瓷物質之羥基磷灰石。
羥基磷灰石之粒度可廣泛不同，但典型粒度介於1 μm至1,000 μm直徑之範圍內，且可為10 μm至100 μm。在本發明之一個實施例中，粒度為20 μm。在本發明之另一實施例中，粒度為40 μm。在本發明之又一實施例中，粒度為80 μm。
本發明可用於疏鬆或填充於管柱中之羥基磷灰石樹脂。 在本發明之一個實施例中，將陶瓷羥基磷灰石樹脂填充於管柱中。熟練技術者可確定管柱尺寸之選擇。在本發明之一個實施例中，至少0.5 cm之管柱直徑及約20 cm之床高可用於小規模純化。在本發明之另一實施例中，可使用約35 cm至約60 cm之管柱直徑。在本發明之又一實施例中，可使用60 cm至85 cm之管柱直徑。
緩衝液組合物及裝載條件
在使羥基磷灰石樹脂與混合物接觸之前，可能必需調節諸如pH值、離子強度及溫度之參數且在一些情況下必需添加不同種類之物質。因此，可必需藉由用溶液(例如用於調節pH值、離子強度等或用於引入清潔劑之緩衝液)洗滌來平衡羥基磷灰石基質，從而產生針對純化白喉毒素混合物之必需特徵。
在組合結合/流通模式羥基磷灰石層析中，用溶液平衡且洗滌羥基磷灰石基質，由此產生針對純化白喉毒素製劑之必需特徵。在本發明之一個實施例中，基質可使用在略微鹼性至略微酸性pH值下之含有0.01 M至2.0 M氯化鉀或氯化鈉之溶液平衡。平衡緩衝液亦可含有0 mM至20 mM磷酸鉀或磷酸鈉，在另一實施例中，其可含有1 mM至10 mM磷酸鉀，在另一實施例中，其可含有2 mM至5 mM磷酸鉀，在另一實施例中，其可含有0 mM磷酸鉀，且在另一實施例中可含有3 mM磷酸鉀。平衡緩衝液可含有0.01 M至2.0 M氯化鉀或氯化鈉，在一個實施例中可含有0.025 M至0.5 M氯化鉀或氯化鈉，在另一實施例中可含有0.05 M氯 化鉀或氯化鈉，且在另一實施例中可含有0.1 M氯化鉀或氯化鈉。裝載緩衝液之pH值可在6.5至8.0之範圍內。在一個實施例中，pH值可為6.8至7.6，且在另一實施例中，pH值可為7.0。平衡緩衝液可含有其他組分，包括(但不限於)CaCl2、MgCl2、硫酸鹽、乙酸鹽、甘胺酸、精胺酸、咪唑、丁二酸鹽及CaEDTA PO4。特定言之，在一個實施例中其可含有0 mM至10 mM氯化鈣，在另一實施例中其可含有0 mM CaCl2，且在另一實施例中其可含有1 mM CaCl2。平衡緩衝液可含有5 mM至200 mM MOPS，在另一實施例中其可含有20 mM MOPS，且在另一實施例中其可含有50 mM MOPS。
白喉毒素混合物亦可經緩衝液交換或稀釋於適當緩衝液或裝載緩衝液中，以準備用於結合/流通模式羥基磷灰石層析。在本發明之一個實施例中，白喉毒素製劑可經緩衝液交換進入在略微酸性至略微鹼性pH值下之含有0.01 M至2.wM氯化鉀或氯化鈉之裝載緩衝液中。裝載緩衝液可進一步含有1 mM至10 mM磷酸鉀或磷酸鈉，在另一實施例中，其可含有2 mM至8 mM磷酸鉀或磷酸鈉，在另一實施例中，其可含有3 mM至7 mM磷酸鉀或磷酸鈉，且在另一實施例中可含有5 mM磷酸鉀或磷酸鈉。裝載緩衝液可含有0.2 M至2.5 M NaCl，在一個實施例中可含有0.2 M至1.5 M NaCl，在另一實施例中可含有0.3 M至1.0 M NaCl，且在另一實施例中可含有110 mM NaCl。裝載緩衝液之pH值可在6.5至8.0之範圍內。在一個實施例中，pH值可為6.5至 7.6，且在另一實施例中，pH值可為7.1。
在結合模式、流通模式或其組合中使毒素混合物與羥基磷灰石樹脂接觸可在填充床管柱、含有固相基質之流體化/膨脹床管柱中及/或以簡單分批操作來執行，在分批操作中固相基質與溶液混合一定時間。
在羥基磷灰石樹脂與毒素混合物接觸之後，執行洗滌程序。所用洗滌緩衝液將取決於羥基磷灰石樹脂之性質、所用羥基磷灰石層析之模式，樹脂可使用在略微鹼性至略微酸性pH值下之含有0.01 M至1 M氯化鉀或氯化鈉之溶液洗滌。例如，洗滌緩衝液可含有0.1 mM至20 mM磷酸鉀或磷酸鈉，在另一實施例中，其可含有0.1 mM至10 mM磷酸鉀或磷酸鈉，在另一實施例中，其可含有0.1 mM至5 mM磷酸鉀或磷酸鈉，在另一實施例中，其可含有0.5 mM磷酸鉀或磷酸鈉，且在另一實施例中可含有3 mM磷酸鉀或磷酸鈉。洗滌緩衝液可含有0 M至1 M氯化鉀或氯化鈉，在一個實施例中可含有0.025 M至0.5 M氯化鉀或氯化鈉，在另一實施例中可含有0.4 M氯化鉀或氯化鈉，且在另一實施例中可含有0.06 M氯化鉀或氯化鈉。洗滌緩衝液之pH值可在6.5至8.0之範圍內。在一個實施例中，pH值可為6.8至7.6，且在另一實施例中，pH值可為7.2，在另一實施例中可為7.4。洗滌緩衝液可含有其他組分，包括(但不限於)CaCl2、MgCl2、硫酸鹽、乙酸鹽、甘胺酸、精胺酸、咪唑、丁二酸鹽或CaEDTA PO4。
特定言之，在一個實施例中其可含有0 mM至10 mM氯化 鈣，在另一實施例中其可含有0 mM CaCl2，且在另一實施例中其可含有1 mM CaCl2。洗滌緩衝液可含有5 mM至200 mM MOPS，在另一實施例中其可含有20 mM MOPS，且在另一實施例中其可含有50 mM MOPS。洗滌緩衝液可以步進或梯度模式施加。
在結合模式中，在單次或多次洗滌程序之後，毒素可自管柱溶離。溶離如下發生：i)用溶離緩衝液進行步進溶離；ii)用溶離緩衝液進行梯度溶離；iii)用溶離緩衝液進行步進溶離與梯度溶離；或iv)用溶離緩衝液進行多個梯度及步進溶離。在一個實施例中，對於自管柱溶離白喉毒素，本發明使用在略微鹼性至略微酸性pH值下之含有0 M至1 M氯化鉀或氯化鈉之高離子強度磷酸鹽緩衝液。溶離緩衝液可進一步含有20 mM至100 mM磷酸鉀或磷酸鈉，在另一實施例中，其可含有20 mM至80 mM磷酸鉀或磷酸鈉，在另一實施例中，其可含有30 mM至60 mM磷酸鉀或磷酸鈉，在另一實施例中，其可含有40 mM磷酸鉀或磷酸鈉，且在另一實施例中可含有50 mM磷酸鉀或磷酸鈉。溶離緩衝液可含有0 M至1 M氯化鉀或氯化鈉，在一個實施例中可含有0.025 M至0.5 M氯化鉀或氯化鈉，在另一實施例中可含有0.5 M氯化鉀或氯化鈉，且在另一實施例中可含有0.06 M氯化鉀或氯化鈉。溶離緩衝液之pH值可在6.5至8.0之範圍內。在一個實施例中，pH值可為6.8至7.6，且在另一實施例中，pH值可為7.2，在另一實施例中可為7.0。溶離緩衝液可含有其他組分，包括(但不限於)CaCl2、 MgCl2、乙酸鹽、甘胺酸、精胺酸、咪唑、丁二酸鹽或CaEDTA PO4。特定言之，在一個實施例中其可含有0 M至1 M氯化鎂、氯化鈣、硫酸鈉或硫酸銨，在另一實施例中其可含有0 mM CaCl2，且在另一實施例中其可含有1 mM CaCl2，且在另一實施例中其可含有1 M MgCl2。溶離緩衝液可含有5 mM至200 mM MOPS，在另一實施例中其可含有20 mM MOPS，且在另一實施例中其可含有50 mM MOPS。對於以連續或階式梯度自管柱溶離毒素，可改變溶離緩衝液。
在流通模式及組合結合/流通模式中，管柱洗滌之後所獲得之經純化白喉毒素可與其他經純化白喉毒素部分彙集。
在某些實施例中，溶離如下發生：i)用包含約30 mM氯化鉀或氯化鈉或約15 mM磷酸鉀或磷酸鈉之溶離緩衝液進行步進溶離，ii)包含約10 mM至約25 mM磷酸鉀或磷酸鈉或約100 mM至2 M氯化鉀或氯化鈉之梯度溶離；或iii)pH值變化0.3個pH值單位。
使用之後，羥基磷灰石管柱可視情況於適當試劑中清潔、消毒及儲存，且視情況再使用。
本發明中所用之羥基磷灰石可呈此項技術中已知之許多形式之一。羥基磷灰石可呈晶體、凝膠或樹脂形式。或者，正常結晶形式可在高溫下燒結以使其改質為陶瓷形式(Bio-Rad)。羥基磷灰石較佳呈凝膠形式。如層析純化中通常所用，較佳將凝膠填充至管柱中。
若羥基磷灰石呈微粒形式，則粒子之直徑較佳為20 μm或20 μm以上，較佳為40 μm或40 μm以上，較佳為80 μm或80 μm以上。
結晶羥基磷灰石為第一類用於層析之羥基磷灰石，但其受結構困難限制。開發陶瓷羥基磷灰石(cHA)層析以克服一些與結晶羥基磷灰石相關之困難，諸如限定流速。陶瓷羥基磷灰石具有高耐久性、良好蛋白質結合能力且可以高於結晶羥基磷灰石之流速及壓力使用。參見Vola等人，BioTechniques 14：650-655(1993)。
羥基磷灰石已用於蛋白質、核酸以及抗體之層析分離。在羥基磷灰石層析中，管柱通常於低濃度磷酸鹽緩衝液中平衡且施加樣品，且接著用濃度梯度之磷酸鹽緩衝液溶離吸附之蛋白質。參見Giovannini,2000,Biotechnology and Bioengineering 73：522-529。有時淺梯度之磷酸鈉成功地用於溶離蛋白質，而在其他情況下，已成功使用高達400 mM磷酸鈉之濃度梯度。參見例如Stanker,1985,J.Immunological Methods 76：157-169(10 mM至30 mM磷酸鈉溶離梯度)；Shepard,2000,J.Chromatography 891：93-98(10 mM至74 mM磷酸鈉溶離梯度)；Tarditi,1992,J.Chromatography 599：13-20(10 mM至350 mM磷酸鈉溶離梯度)。
多元層析支撐物
多元層析涉及使用固相層析支撐物，該等支撐物採用多種化學機制以吸附蛋白質或其他溶質。有時亦使用混合模 式層析以描述該層析，且本文中該等術語可互換使用。多元層析支撐物之實例包括(但不限於)利用兩種或兩種以上以下機制之組合的層析支撐物：陰離子交換、陽離子交換、疏水性相互作用、親水性相互作用、氫鍵結、π-π鍵結及金屬親和力。兩種該多元離子交換吸附劑可購自GE Healthcare，即Capto AdhereTM及Capto-MMCTM介質。此等介質分別使強陰離子(例如胺基)及弱陽離子交換基團與疏水性芳族基組合。
多元層析支撐物提供不能藉由諸如離子交換之單模式層析方法再現之獨特選擇性。與基於親和力之方法相比，多元層析提供潛在成本節省、較長管柱壽命及操作靈活性。然而，多元層析方案之開發可對製程開發施加沉重負擔，因為需要多參數篩檢以實現其全部潛力。由於層析機制之複雜性，故方法開發較為複雜、不可預見且可能需要大量資源以實現適當恢復。
多元層析係指實質上涉及兩種或兩種以上化學機制之組合的層析。在一些實施例中，組合產生不能藉由單模式支撐物實現之獨特選擇性。在某些實施例中，多元樹脂包含帶負電荷部分及疏水性部分。在一個實施例中，對於陽離子交換，帶負電荷部分為陰離子羧酸根基團或陰離子磺基。該等支撐物之實例包括(但不限於)Capto-MMCTM(GE Healthcare)。參見表1。
多種其他多元層析介質為市售的。儘管不期望不包含帶負電荷部分及疏水性部分之多元樹脂之表現與Capto- MMCTM類似，但仍可使用本文所述之方法測定其他多元樹脂之最佳條件。市售實例包括(但不限於)陶瓷羥基磷灰石(CHT)或陶瓷氟磷灰石(CFT)、MEP-HypercelTM、Capto-AdhereTM、BakerbondTM Carboxy-SulfonTM及BakerbondTM ABxTM(Advantor Performance Materials Inc.,Phillipsburg,NJ)。參見表1。
層析支撐物可在填充床管柱中、流體化/膨脹床管柱中及/或以分批操作實施，在分批操作中使多元支撐物與白喉毒素混合物混合一定時間。固相層析支撐物可為多孔粒子、無孔粒子、薄膜或單石。術語「固相」用於意謂可黏著一或多種配位體之任何非水性基質，或者在尺寸排阻層析之情況下，其可指樹脂之凝膠結構。固相可為能夠以此方式黏著配位體之任何基質，例如純化管柱、個別粒子之不連續相、薄膜、過濾器、凝膠等。可用於形成固相之物質之實例包括多醣(諸如瓊脂糖及纖維素)及其他機械穩定性基質，諸如二氧化矽(例如控制微孔玻璃)、聚(苯乙烯二乙烯基)苯、聚丙烯醯胺、陶瓷粒子及此等基質中任一者之衍生物。
在一些實施例中，將多元支撐物填充於內徑為至少5 mm且高度為至少25 mm之管柱中，諸如併入液體處理機器 人中之管柱。該等實施例適用於例如評估各種條件之效應。
另一實施例採用填充於支撐製備型應用所需之任何尺寸之管柱中之多元支撐物。視特定應用之需要而定，管柱直徑可在小於1 cm至大於1 m之範圍內，且管柱高度可在小於1 cm至大於50 cm之範圍內。工業規模應用通常將具有20 cm或20 cm以上之管柱直徑(ID)及至少25 cm之高度。
適當管柱尺寸可由熟練技術者確定。
在一些實施例中，多元樹脂位於管柱中。管柱可為低壓管柱(3巴之背壓)。在一些實施例中，管柱填充有粒徑為約>30 μm，例如約30 μm至約100 μm之介質。在一些實施例中，管柱之孔徑為約100 Å至約4000 Å，例如約150 Å至約300 Å。在一些實施例中，管柱長度為約10 cm至約50 cm，例如約25 cm至約35 cm。管柱較佳為製備型管柱，意謂製備規模及/或製備型負載。製備規模管柱之直徑通常為至少約1 cm，例如至少約6 cm，高達且包括約15 cm、約60 cm或約60 cm以上。管柱之介質可為任何適當物質，包括基於聚合物之介質、基於二氧化矽之介質或甲基丙烯酸酯介質。在一個實施例中，介質係基於瓊脂糖。
管柱可為分析型或製備型管柱。裝載於管柱上之白喉毒素之量一般為每公升床體積約0.01 g至約40 g白喉毒素，例如每公升床體積約0.02 g至約30 g白喉毒素、每公升床體積約1 g至約15 g白喉毒素或每公升床體積約3 g至約10 g白喉毒素。製備型負載管柱之分子負載為每公升床體積至 少約0.1 g白喉毒素，例如每公升至少約1 g白喉毒素。
視管柱幾何形狀而定，流速一般為約50公分/小時至約600公分/小時，或約4管柱體積(CV)/小時至約20管柱體積(CV)/小時。適當流速可由熟練技術者確定。
溫度可在約2℃至約30℃之範圍內，諸如室溫。
在一些實施例中，在準備使白喉毒素製劑與多元支撐物接觸時，使管柱內之化學環境平衡。此舉通常藉由使與裝載緩衝條件相等或類似之平衡緩衝液，諸如有或無無機鹽(例如氯化鈉或氯化鉀)之Tris、MES、MOPS、HEPES、磷酸鉀或磷酸鈉緩衝溶液流經管柱以產生適當pH值、電導率及其他相關變數來實現。平衡緩衝液等張且電導率30 mS/cm，且pH值通常在約6.5至約8之範圍內。或者，由於平衡緩衝液之多元結構，平衡緩衝液之電導率可能30 mS/cm且pH值通常在約6.2至7.8之範圍內。
在本發明之一個實施例中，基質可使用在略微鹼性至略微酸性pH值下之含有0.01 M至0.5 M氯化鉀或氯化鈉之溶液平衡。平衡緩衝液亦可含有0 mM至100 mM磷酸鉀或磷酸鈉，在另一實施例中，其可含有10 mM至25 mM磷酸鉀或磷酸鈉，在另一實施例中，其可含有10 mM磷酸鉀或磷酸鈉，在另一實施例中，其可含有20 mM磷酸鉀或磷酸鈉，且在另一實施例中可含有25 mM磷酸鉀或磷酸鈉。平衡緩衝液可含有0.01 M至0.5 M氯化鉀或氯化鈉，在一個實施例中可含有0.025 M至0.2 M氯化鉀或氯化鈉，在另一實施例中可含有0.05 M氯化鉀或氯化鈉，且在另一實施例 中可含有0.1 M氯化鉀或氯化鈉。裝載緩衝液之pH值可在6.5至8.0之範圍內。在一個實施例中，pH值可為6.8至7.3，且在另一實施例中，pH值可為7.0。平衡緩衝液可含有其他組分，例如蛋白酶抑制劑或包括(但不限於)以下之混合液：AEBSF、抗纖維蛋白溶酶肽(Leupeptin)、EDTA、抑肽酶(Aprotinin)、胃酶抑素(Pepstatin)、PMSF、抑凝乳蛋白酶素(Chymostatin)、2-巰基乙醇、苄脒、EGTA、亞硫酸氫鈉、乙二胺四乙酸、蛋白酶抑制劑混合液(例如SigmaFASTTM)及乳胞素。平衡緩衝液可含有5 mM至200 mM MOPS，在另一實施例中，其可含有20 mM MOPS，且在另一實施例中，其可含有50 mM MOPS。
白喉毒素混合物亦可經緩衝液交換或稀釋於適當緩衝液或裝載緩衝液中，以準備用於多元層析。在本發明之一個實施例中，白喉毒素製劑可經緩衝液交換進入在略微酸性至略微鹼性pH值下之含有0.01 M至0.5 M氯化鉀或氯化鈉之裝載緩衝液中。裝載緩衝液可進一步含有0 mM至100 mM磷酸鉀或磷酸鈉，在另一實施例中，其可含有10 mM至25 mM磷酸鉀或磷酸鈉，在另一實施例中，其可含有10 mM磷酸鉀或磷酸鈉，且在另一實施例中可含有25 mM磷酸鉀或磷酸鈉。裝載緩衝液可含有0.01 M至0.5 M氯化鉀或氯化鈉，在一個實施例中可含有0.025 M至0.2 M氯化鉀或氯化鈉，在另一實施例中可含有0.05 M氯化鉀或氯化鈉，且在另一實施例中可含有0.1 M氯化鉀或氯化鈉。裝載緩衝液之pH值可在6.5至8.0之範圍內。在一個實施例 中，pH值可為6.8至7.3，且在另一實施例中，pH值可為7.2。裝載緩衝液可含有其他組分，例如蛋白酶抑制劑或包括(但不限於)以下之混合液：AEBSF、抗纖維蛋白溶酶肽、EDTA、抑肽酶、胃酶抑素、PMSF、抑凝乳蛋白酶素、2-巰基乙醇、苄脒、EGTA、亞硫酸氫鈉、乙二胺四乙酸、蛋白酶抑制劑混合液(例如SigmaFASTTM)及乳胞素。裝載緩衝液可含有5 mM至200 mM MOPS，在另一實施例中，其可含有20 mM MOPS，且在另一實施例中，其可含有50 mM MOPS。
溶離緩衝液用於自混合模式樹脂溶離毒素。適合之溶離緩衝液包括(但不限於)含有約0.005 M至約1 M氯化鈉、磷酸鉀、硫酸鈉或硫酸銨、氯化鉀、氯化鎂、氯化鈣、硫酸鋰、氯化鋰、乙酸鈉、氯化銨、乙醇、脲丙二醇、精胺酸、胍、檸檬酸鈉或其組合之HEPES、MOPS、TRIS、磷酸鹽、BICINE或三乙醇胺，在pH 7至pH 9下緩衝。在某些實施例中，溶離緩衝液含有至少0.1 M氯化鉀或氯化鈉。白喉毒素可藉由步進溶離用鹽濃度高於或低於溶離鹽濃度的溶離緩衝液溶離，或藉由梯度溶離用任何以低於或高於溶離鹽濃度之鹽濃度起始之梯度溶離。在特定實施例中，溶離如下發生：i)由含有約0.005 M氯化鈉、或0 mM至0.1 mM氯化鉀至約1 M氯化鈉、或1 M至約0.1 M氯化鈉、或約0.5 M至約1.0 M硫酸鈉之溶離緩衝液進行步進溶離；或ii)由約0.1 M至約0.5 M氯化鈉或0.5 M至約0.1 M氯化鈉進行梯度溶離；或iii)由pH值7.5之溶離緩衝液進行步進 溶離；或iv)由約pH 6.5至約pH 9.0進行梯度溶離。溶離方法之任何組合或擾動均適用。溶離緩衝液可含有其他組分，例如蛋白酶抑制劑混合液或包括(但不限於)以下之混合液：AEBSF、抗纖維蛋白溶酶肽、EDTA、抑肽酶、胃酶抑素、PMSF、抑凝乳蛋白酶素、2-巰基乙醇、苄脒、EGTA、亞硫酸氫鈉、乙二胺四乙酸、蛋白酶抑制劑混合液(例如SigmaFASTTM)及乳胞素。用於步進溶離之溶離緩衝液可含有約0.1 M至約1.0 M NaCl，例如0.1±0.1 M NaCl或KCl，在pH 8.5±0.1下緩衝。用於梯度溶離之溶離緩衝液可為任何梯度，涵蓋例如約0.1 M至約0.5 M NaCl或0.5 M至約0.1 M KCl，包括(但不限於)0 M至約1.0 M、0.1 M至約0.5 M NaCl。溶離緩衝液通常在pH 7至pH 9下緩衝。溶離通常用約5至約20管柱體積進行。
在某些實施例中，溶離如下進行：i)在pH 6.8至pH 9.5下用包含約125 mM氯化鉀或氯化鈉之溶離緩衝液進行步進溶離；ii)包含約0.2 M至約0.3 M氯化鈉、氯化鉀、硫酸鈉、硫酸銨或氯化鉀之梯度溶離；iii)在6.5至9.5之pH值範圍內pH值變化0.5個pH值單位；或(iv)在2℃至30℃之溫度內溫度變化1℃。
使用之後，多元管柱可視情況於適當試劑中清潔、消毒及儲存，且視情況再使用。
在某些實施例中，裝載之後視情況洗滌層析支撐物。可洗滌管柱以1)在溶離之前自管柱移除非結合裝載樣品，及2)移除微弱結合之雜質。舉例而言，若裝載在pH 7下發 生，則在pH 7.5下無NaCl之洗滌液可洗去一些結合雜質，由此增強用於產物溶離之鹽強度。在工業規模下通常使用洗滌策略替代梯度溶離，此係因為其實施簡單。在初級陽離子模式及次級HIC模式中運作時，洗滌緩衝液通常含有Tris、HEPES、MOPS、磷酸鹽、BICINE或三乙醇胺，pH值在約7.5與約8.0之間且電導率<30 mS/cm。
多元層析較佳用作精製步驟，且因此用於純化白喉毒素，詳言之用以減少、降低或消除宿主細胞蛋白質、聚集體及產物片段。
在提及組分或部分時，經純化指示其相對濃度(組分或部分之重量除以混合物中所有組分或部分之重量)增加至少約20%。如本文所用，根據完整產物計算純度，亦即將白喉毒素片段視為雜質。在一系列實施例中，相對濃度增加至少約40%、約50%、約60%、約75%、約100%、約150%或約200%。當純化分離得到特定組分或部分之組分之相對濃度(純化分離得到特定組分或部分之組分或部分之重量除以混合物中所有組分或部分之重量)降低至少約20%、約40%、約50%、約60%、約75%、約85%、約95%、約98%或100%時，亦可認為特定組分或部分經純化。在另一系列實施例中，將組分或部分純化至相對濃度為至少約50%、約65%、約75%、約85%、約90%、約97%、約98%或約99%。
在較佳實施例中，使用本發明方法，移除90%、95%或98%之宿主細胞蛋白質及其他蛋白質雜質，且白喉毒 素或其突變型式之產率為30%、40%、更佳50%。在某些實施例中，存在<0.001%、<0.0001%、<0.00001%之宿主細胞DNA。
在較佳實施例中，如凝膠SDS電泳所分析，純化白喉毒素或其突變型式至純度90%、95%、97%或99%。
電泳一般在變性及還原條件下，在諸如來自Invitrogen(Carlsbad,CA)之NuPAGE或Tris-甘胺酸凝膠系統中，使用聚丙烯醯胺凝膠，諸如4%至12%、4%至20%、10%或12%凝膠進行。用適當染色劑(例如來自Invitrogen之Sypro Ruby螢光蛋白質染色劑或Simply Blue Safe染色劑)染色凝膠隔夜，且接著用雷射誘導之螢光掃描儀(諸如Molecular Dynamics螢光影像器595)成像。
本發明之純化方法會引起高白喉毒素純度(亦即無大量污染蛋白質)、高毒素穩定性及低異質性，而不會損害產率。因此發現藉由進行羥基磷灰石步驟，隨後使用多元樹脂，在按比例擴大時可再現地實現高達約98%之純度。在本發明之某些實施例中，如凝膠電泳所分析，用本發明方法純化之白喉毒素在2℃及-60℃下維持純度目標至少6個月或在25℃下維持至少5天或至少3週。在本發明之某些實施例中，異質性為1%。在本發明之某些實施例中，如使用標準方法所分析，內毒素濃度為<20 EU/mg、<10 EU/mg或<1 EU/mg。在本發明之某些實施例中，如由HPSEC/UV所分析，聚集為<1%、<0.5%、<0.2%或<0.1%。
其他步驟
在羥基磷灰石及多元層析之後獲得之所回收白喉毒素可視情況經歷以下一或多者：超濾、微過濾、陰離子交換薄膜層析及絕對過濾。在本發明之一個態樣中，使所回收之白喉毒素經歷超濾、陰離子交換層析及絕對過濾。
在某些實施例中，進一步純化及過濾步驟在自多元樹脂溶離之後發生。該純化較佳地涉及一或多個精製層析步驟(諸如陽離子或陰離子交換層析、疏水性相互作用層析或羥基磷灰石層析)以移除殘餘宿主細胞蛋白質、核酸及內毒素以及加工賦形劑，諸如瀝濾之多元配位體。過濾步驟較佳涉及超濾以便移除低分子量雜質及加工賦形劑及以便交換至最終產物調配物緩衝液中。EDTA為純化製程中所包括之小分子。進行無菌過濾以移除任何微粒及控制生物負荷(視需要)。
其他視情況選用之步驟
溶離之蛋白質製劑可在羥基磷灰石及多元層析步驟之前或之後經歷其他純化或過濾步驟。除上文所述步驟之外，其他例示性純化步驟包括透析；親和層析；疏水性相互作用層析(HIC)；其他多元層析；硫酸銨沈澱；陽離子交換層析；乙醇沈澱；逆相HPLC；二氧化矽層析；層析聚焦；及凝膠過濾。
在本發明之一個實施例中，完整製程包括回收及濃縮宿主細胞，隨後滲透衝擊以自周質釋放CRM197，及隨後使細胞碎片絮凝。接著，兩階段澄清模組(離心+深度過濾)移 除細胞碎片。接著，使用陰離子交換層析自蛋白質雜質、殘餘介質及緩衝液組分捕捉CRM197。藉由後續羥基磷灰石層析步驟進一步移除內毒素及殘餘蛋白質。使用超濾來濃縮批料且交換至100 mM磷酸鉀(pH 7.2)。流通陰離子交換薄膜層析用作最終精製步驟，且生物負荷降低過濾完成該製程。
下文展示一種相繼使用羥基磷灰石、多元層析之本發明製程。
可使用熟習此項技術者熟知之方法將根據本發明方法獲得之白喉毒素或其突變型式用於液體調配物中。
本文所述之特定實施例僅以實例方式提供，且本發明僅 欲由隨附申請專利範圍之條款及該等申請專利範圍所授權之等效物之全部範疇限定。實際上，除本文所展示及描述者外，本發明之各種修改對熟習此項技術者而言將自先前描述及隨附圖式顯而易知。該等修改意欲在隨附申請專利範圍之範疇內。
實例 純化試劑
硫酸銨、氯化鈣、乙二胺四乙酸二鈉、鎂鹽、磷酸二氫鉀、氯化鉀、氫氧化鉀、氯化鈉、蔗糖、MOPS、Tris、氫氧化鈉及鹽酸係獲自Advantor Performance Materials(Phillipsburg,NJ)。甘油、IPTG、聚伸乙基亞胺及磷酸氫二鉀係購自Sigma-Aldrich Co.(St.Louis,MO)。羥基磷灰石層析介質係獲自Bio-Rad Laboratories Inc.(Hercules,CA)。Tris鹽酸鹽係獲自Amresco Inc.(Solon,OH)。Capto Q、Capto-MMCTM及Capto Adhere層析介質係獲自GE Healthcare(Upsala,Sweden)。
醱酵
除非按比例擴大，否則約200 L或1300 L螢光假單孢菌醱酵培養液在250 L或1500 L生物反應器中使用熟習此項技術者熟知之方法來製備(例如，如H.Jin等人，Soluble periplasmic production of human granulocyte colony-stimulating factor(G-CSF)in Pseudomonas fluorescens,Protein Expr.Purif.(2011),doi：10.1016/j.pep.2011.03.002所揭示)。1300 L整體純化製程一般產生約9 L濃度50 g/L 之經純化CRM197。此可轉換成製程回收率30%或生產率0.3 g CRM197/L醱酵物。
實例1：使用羥基磷灰石層析進行純化
測試羥基磷灰石層析之適用性。在羥基磷灰石層析之前包括標準陰離子交換層析步驟以使蛋白質純度增至>90%且減少內毒素。
如上所述製備200 L醱酵培養液。
細胞回收及收集
螢光假單孢菌細胞之回收及濃縮使用連續離心來實現。首先在生物反應器中在攪動下將200 L醱酵批料冷卻至<8℃。在冷卻下，使Westfalia離心機之碗達到全速。將醱酵培養液饋入離心機中以維持Q/Σ為約5 E-5 L/(min m2))。運作該步驟以收集細胞漿料，其中離心濾液為廢料。
控制整個收集步驟之溫度以維持碗(<8℃)溫度。每次排出之後，將收集之細胞漿料轉移至貯槽中。
滲透衝擊及絮凝
在此步驟中，藉由滲透衝擊自螢光假單孢菌周質釋放CRM197蛋白質且添加絮凝劑以有助於澄清。設置攪動以在添加再懸浮緩衝液(50% w/v蔗糖、200 mM Tris、100 mM EDTA，pH 7.5)以使收集之細胞漿料再懸浮時產生強力混合。接著藉由在快速攪動下將再懸浮批料添加至4倍體積之滲透衝擊緩衝液(50 mM Tris，pH 7.5)中來滲透衝擊再懸浮之細胞，由此釋放CRM197蛋白質。在降低之攪動下，添加聚乙基亞胺(PEI)絮凝劑(10% w/v)以實現最終濃度為 0.2% w/v PEI。
澄清離心及深度過濾
細胞碎片之整體移除藉由離心及深度過濾來實現。類似地運作離心機以進行澄清，然而使用離心緩衝液(10 mM Tris，pH 7.5)收集離心濾液作為產物且排出固體作為廢料。同時，經由Cuno 120ZA08A深度過濾器轉移收集之離心濾液以降低混濁度(200 L/ft2過濾器面積)。
陰離子交換
用陰離子交換層析(AEX)執行自蛋白質雜質、內毒素、核酸及醱酵雜質捕捉CRM197之第一捕捉步驟。在恆定線性速度(287 cm/hr)及室溫下使用緩衝液(<8℃)執行AEX。在層析滑架(chromatography skid)上使用在線稀釋用冷製程水稀釋深度過濾器產物約3倍，以在經稀釋之製程流中實現2.5 mS/cm之電導率。接著將經稀釋之饋料流直接裝載於已用20 mM KCl、10 mM Tris、0.5 mM KPi(磷酸鉀)(pH 7.1)平衡之AEX管柱(Capto Q,GE Healthcare)上。用10 mM Tris、20 mM KCl、0.5 mM KPi(pH 7.1)洗滌管柱，直至獲得基線吸光度。使用50 mM MOPS、110 mM KCl(pH 7.0)緩衝液步進式溶離產物至110 mM KCl。產物收集在步進溶離開始之後在0.5 CV下開始，且在11.5 CV下結束。
羥基磷灰石層析
羥基磷灰石(HA)層析為增加蛋白質純度且進一步降低內毒素含量之精製步驟。HA製程在恆定流速下運作(10分鐘滯留時間)且除管柱裝載<8℃外，在室溫下執行。用I型 CHT陶瓷HA(BioRad)、40 μm樹脂填充之HA管柱用110 mM KCl、50 mM MOPS(pH 7.0)平衡。每公升裝載約9 g白喉毒素。如表2所述洗滌該管柱。
表2. #1批料及#2批料之羥基磷灰石層析洗滌方案。管柱體積(CV)及緩衝液組合物如所述，其中所有緩衝液均含有50 mM MOPS(pH 7.0)。
以10 CV線性梯度至110 mM KCl、30 mM KPi、50 mM MOPS(pH 7.0)，隨後5 CV固持，自管柱溶離CRM197。在15 CV、20 CV或直至吸光度達到基線下收集產物。
此實例引起可重現純化(不限於200 L培養物/醱酵饋料)，其中在超濾之前，移除90%之宿主細胞蛋白質及宿主細胞雜質，且藉由UV發現白喉毒素之製程產率50%(#1批料：55%及#2批料：50%)。在某些實施例中，純化白喉毒素至94%純度，如凝膠電泳所分析。
結果顯示於圖1中。AEX及羥基磷灰石層析系列產生與標準物及親和層析產生之產物(Mimetic blue樹脂，來自Prometic Life Sciences Inc.(Laval,Quebec))相比具有類似或改良之純度之物質。4%至12% Bis-Tris NuPAGE凝膠與1x MES電泳緩衝液一起使用。濃度為50 g/L之白喉毒素 在25℃下維持純度目標5天(更糟糕之情況加速穩定性)。經純化白喉毒素通常儲存於-70℃下。
實例2：使用CAPTO-MMC TM 之工業規模純化
細胞回收及收集
螢光假單孢菌細胞之回收及濃縮使用連續離心來實現。首先在生物反應器中在攪動下將1300 L醱酵批料冷卻至<8℃。在冷卻下，使Westfalia離心機之碗達到全速。將醱酵培養液饋入離心機中以維持Q/Σ為約1.25 E-4 L/(min m2))。運作該步驟以收集細胞漿料，其中離心濾液為廢料。
控制整個收集步驟之溫度以維持碗(<8℃)溫度。每次排出之後，將收集之細胞漿料轉移至貯槽中。
滲透衝擊及絮凝
在此步驟中，藉由滲透衝擊自螢光假單孢菌周質釋放CRM197蛋白質且添加絮凝劑以有助於澄清。設置攪動以在添加再懸浮緩衝液(50% w/v蔗糖、200 mM Tris、100 mM EDTA，pH 7.5)以使收集之細胞漿料再懸浮時產生強力混合。接著藉由在快速攪動下將再懸浮批料添加至4倍體積之滲透衝擊緩衝液(50 mM Tris，pH 7.5)中來滲透衝擊再懸浮之細胞，由此釋放CRM197蛋白質。在降低之攪動下，添加聚乙基亞胺(PEI)絮凝劑(10% w/v)以實現最終濃度為0.2% w/v PEI。
澄清離心及深度過濾
細胞碎片之整體移除藉由離心及深度過濾來實現。與細 胞回收類似地運作離心機以進行澄清，然而使用離心緩衝液(10 mM Tris，pH 7.5)收集離心濾液作為產物且排出固體作為廢料。同時，經由平行之6×1.84 m2 CUNO Z16E08 AA120ZA08A深度過濾器堆疊轉移收集之離心濾液。
陰離子交換層析
用陰離子交換層析(AEX)執行自蛋白質雜質、內毒素、核酸及醱酵雜質捕捉CRM197之第一捕捉步驟。在恆定線性速度(287 cm/hr)及室溫下使用緩衝液(<8℃)執行AEX。在層析滑架上使用在線稀釋用冷WFI稀釋深度過濾器產物約3倍，以在經稀釋之製程流中實現2.5 mS/cm之電導率。接著將經稀釋之饋料流直接裝載於已用20 mM KCl、10 mM Tris、0.5 mM KPi(pH 7.1)平衡之AEX管柱(Capto Q,GE Healthcare)上。用10 mM Tris、20 mM KCl、0.5 mM KPi(pH 7.1)洗滌管柱，直至獲得基線吸光度。使用50 mM MOPS、110 mM KCl(pH 7.0)緩衝液步進式溶離產物至110 mM KCl。產物收集在步進溶離開始之後在1 CV下開始，且在8 CV下結束。
羥基磷灰石層析
羥基磷灰石(HA)層析為增加蛋白質純度且進一步降低內毒素含量之精製步驟。HA製程在恆定流速下運作(10分鐘滯留時間)且除管柱裝載<8℃外，在室溫下執行。用I型CHT陶瓷HA(BioRad)、40 μm樹脂填充之HA管柱用55 mM KCl、50 mM MOPS(pH 7.0)平衡。將已用<8℃、50 mM MOPS(pH 7.0)分批稀釋2倍之冷AEX產物裝載於管柱上。 每公升裝載約10 g白喉毒素。管柱追加平衡緩衝液且用8 CV 55 mM KCl、50 mM MOPS、3 mM磷酸鉀(pH 7.2)洗滌。用8 CV梯度溶離至40 mM KPi、50 mM MOPS、55 mM KCl(pH 7.0)來溶離主要產物峰。在溶離梯度開始時收集HA溶離液。梯度持續8 CV，隨後6 CV 50 mM MOPS、55 mM KCl、40 mM KPi(pH 7.0)。產品收集在峰最大值之10%下結束。
多元陽離子層析
多元陽離子層析(Capto-MMC TM ,GE Healthcare)為增加蛋白質純度且移除聚集體之精製步驟。首先用50 mM MOPS、400 mM KCl、25 mM KPi、25 mM EDTA(pH 7.0)稀釋MMC饋料0.25倍。MMC製程在恆定流速下運作(等於10分鐘滯留時間)且在室溫下執行。管柱用50 mM MOPS、125 mM KCl、25 mM KPi、5 mM EDTA(pH 7.1)平衡且HA產物裝載於管柱上。每公升裝載約5 g白喉毒素。接著用5 CV平衡緩衝液洗滌管柱且經由2.5 CV步進梯度溶離至50 mM Tris、200 mM KCl、5 mM EDTA(pH 8.5)，隨後10 CV線性梯度溶離至50 mM Tris、500 mM KCl、5 mM EDTA(pH 8.5)。溶離液收集在pH步進梯度起始之後即刻開始，且在以多個管柱體積實現基線解析度之後結束。
超濾
濃縮CRM197蛋白質且藉由超濾將其透濾至最終調配物緩衝液中。10 kDa NMWC再生纖維素薄膜(Millipore,Billerica,MA)用於該操作且使用恆定流速執行。整個製程 在<8℃下執行。首先將MMC產物濃縮至約5至10 g CRM197/L(基於固定體積)，隨後用20透濾體積(diavolume，DV)之調配物緩衝液(0.1 M KPi，pH 7.2)透濾。將產物過度濃縮至80至100 g CRM197/L，隨後將保留物沖洗至對於透濾產物(DFP)達到約65 g CRM197/L之目標濃度。
預過濾及薄膜層析
混濁度降低藉由預過濾器(0.5/0.2 μm PES薄膜，Millipore Corp.)實施，且在流通模式中藉由薄膜層析(Q薄膜，Sartorius)提供額外內毒素清除。在室溫下使濃縮之超濾物質平衡，接著執行預過濾及薄膜層析。濃縮產物經由已經調配物緩衝液預先消毒(0.5 N NaOH)且平衡之0.5/0.2 μm PES薄膜膠囊及Sartobind Q薄膜過濾。使一股回收之調配物緩衝液流經過濾器/薄膜裝置以對於薄膜層析產物(MCP)達到約60 g/L之目標最終濃度。
生物負荷降低或無菌過濾
使MCP流經第二0.5/0.2 μm PES薄膜膠囊，接著分配。整體在無菌條件下分配且冷凍於-70℃。
此製程引起可重現純化(不限於1 L、15 L、30 L、250 L及1300 L培養物/醱酵饋料)，其中移除95%之宿主細胞蛋白質及宿主細胞雜質且藉由UV發現白喉毒素之產率為30%。在某些實施例中，純化白喉毒素至根據完整產物計算之98%純度，如凝膠電泳所分析。白喉毒素在約50 g/L或60 g/L之濃度下，且如凝膠電泳所分析，在<8℃及<-60℃下維持該純度目標至少6個月且在25℃下(更糟糕 之情況加速穩定性)維持3週。
如由Kinetic-QCL顯色分析套組所量測，製造規模下之平均內毒素為1 EU/mg，且藉由HPSEC(分析型高效尺寸排阻層析法)/UV發現聚集0.1%。異質性未偵測到或為1%，實例為不可偵測之p37及p25 CRM197片段，因此藉由層析樹脂移除。
結果顯示於表3、圖2及圖3中。AEX、羥基磷灰石及Capto-MMC TM 層析系列產生與AEX及羥基磷灰石及親和層析產生之產物(Mimetic blue樹脂，來自Prometic Life Sciences(Laval,Quebec))相比具有改良之純度(完整單體及宿主細胞雜質之百分比)、均質性及穩定性之白喉毒素。4%至12% Bis-Tris NuPAGE凝膠與1x MES電泳緩衝液一起使用。數據點及誤差條表示3至5次重複之平均值及標準差。
實例3：多元樹脂之比較
將一批羥基磷灰石產物分開且在Capto Adhere及Capto-MMC TM 上運作以有助於在兩種樹脂之間進行評估。
Capto Adhere製程之製程步驟概述於表4中。使用滯留時間為8分鐘之370 mL管柱。對於此批料，每毫升裝載約8 mg白喉毒素。所有步驟均在室溫下執行，例外為在裝載之前冷卻羥基磷灰石產物。所用平衡緩衝液經選擇以匹配羥基磷灰石溶離緩衝液。
層析產物之純度結果顯示於圖4中。如所示，MMC產物之純度略高於Adhere產品。兩種管柱之層析步驟產率對於Capto Adhere為107%且對於Capto-MMC TM 為56%。用以計算產率之濃度係藉由毛細管等電聚焦(多元饋料)及UV(Adhere/MMC產物)得到。該比較清楚地表明至少對於此批料中所用之加工.流程，MMC與Adhere之間的選擇歸結為產率對純度。4%至12% Bis-Tris NuPAGE凝膠與1x MES電 泳緩衝液一起使用。
圖1. 與基於親和力之層析製程標準物(泳道3)及內部標準物(泳道2)相比，使用陰離子交換及羥基磷灰石層析(泳道4及5)進行之CRM197純化之SDS-PAGE結果。4%至12% Bis-Tris NuPAGE凝膠與1 X MES電泳緩衝液一起使用。
圖2. 在25℃下之CRM197穩定性(或完整性)(加速穩定性)，比較隨著時間推移(週)CRM197之完整單體百分比，如SDS-PAGE所定量。經純化CRM197藉由基於親和力之層析(正方形)製程、羥基磷灰石層析(菱形)製程及羥基磷灰石層析合併在實驗室規模(圓形)及製造規模(三角形)下之Capto-MMCTM層析製程而產生。
圖3. 與內部標準物相比，在製造規模下(#1及#2批料)之CRM197純化之SDS-PAGE結果。使用常用純化技術難以移除之CRM197片段(p37及p25)之含量較低。4%至12% Bis-Tris NuPAGE凝膠與1 X MES電泳緩衝液一起使用。
圖4. CRM197純化之SDS-PAGE結果，比較含Capto AdhereTM之羥基磷灰石(泳道4)與含Capto-MMCTM之羥基磷灰石(泳道5)。已顯示，AXP(陰離子交換產物)及HAP(羥基磷灰石產物)(泳道2及3)呈現異質性清除。4%至12% Bis-Tris NuPAGE凝膠與1 X MES電泳緩衝液一起使用。

Claims (28)

  1. 一種自含有白喉毒素或其突變型之混合物純化白喉毒素或其突變型之方法，其包含：a)在使得該白喉毒素或其突變型結合於第一分離劑之條件下使該混合物與該第一分離劑接觸；b)自該第一分離劑溶離該白喉毒素或其突變型；c)在使得該白喉毒素或其突變型結合於第二分離劑之條件下使自步驟a)獲得之溶離物質與該第二分離劑接觸；及d)自該第二分離劑溶離該白喉毒素或其突變型；其中1)該第一分離劑為羥基磷灰石且該第二分離劑為多元樹脂；或2)該第一分離劑為多元樹脂且該第二分離劑為羥基磷灰石；且在該第一分離劑或第二分離劑為羥基磷灰石時，在自該羥基磷灰石溶離之前，該羥基磷灰石在使得移除雜質之條件下經歷洗滌步驟。
  2. 如請求項1之方法，其中該洗滌係用在6.5至8.0之pH值下包含0.01 M至1.0 M氯化鉀或氯化鈉之洗滌溶液進行。
  3. 如請求項2之方法，其中該洗滌緩衝液進一步包含0.1 mM至20 mM磷酸鉀或磷酸鈉。
  4. 如請求項1之方法，其中該自羥基磷灰石溶離包含：a)用包含約30 mM氯化鉀或氯化鈉或約15 mM磷酸鉀或磷酸鈉之溶離緩衝液進行步進溶離；b)包含約10 mM至約25 mM磷酸鉀或磷酸鈉或約100 mM至2 M氯化鉀或氯化鈉之梯度溶離；或 c)pH值變化0.3個pH值單位。
  5. 如請求項1之方法，其中與該多元樹脂接觸之該混合物或溶離物質包含Tris、MES、MOPS、HEPES、磷酸鹽、乙酸鹽、氯化物或硫酸鹽。
  6. 如請求項1之方法，其中該自該多元樹脂溶離包含：a)用在pH 6.8至pH 9.5下包含約125 mM氯化鉀或氯化鈉之溶離緩衝液進行步進溶離；b)包含約0.2 M至約0.3 M氯化鈉、氯化鉀、硫酸鈉、硫酸銨、硫酸鋰、氯化鋰或氯化銨之梯度溶離；c)在6.5至9.5之pH值範圍內，pH值變化0.5個pH值單位；或d)在2℃至30℃之溫度內，溫度變化1℃。
  7. 如請求項5之方法，其中與該多元樹脂接觸之該混合物或溶離物質包含EDTA或蛋白酶抑制劑。
  8. 如請求項6之方法，其中該溶離在EDTA或蛋白酶抑制劑存在下發生。
  9. 如請求項1之方法，其中該第一分離劑為羥基磷灰石且該第二分離劑為多元樹脂。
  10. 如請求項1之方法，其中該多元樹脂含有包含帶電荷部分及疏水性部分之配位體。
  11. 如請求項10之方法，其中該帶電荷部分為帶負電荷部分。
  12. 如請求項11之方法，其中對於陽離子交換，該帶負電荷部分為陰離子羧酸根基團或陰離子磺基。
  13. 如請求項12之方法，其中該多元樹脂為Capto-MMCTM。
  14. 如請求項10之方法，其中該帶電荷部分為帶正電荷部分。
  15. 如請求項14之方法，其中該多元樹脂為Capto AdhereTM。
  16. 如請求項1之方法，其中在執行步驟(a)之前，使該混合物經歷以下一或多者：離心、絮凝、澄清或陰離子交換層析。
  17. 如請求項16之方法，其中使該混合物經歷陰離子交換層析兩次或三次。
  18. 如請求項16之方法，其中使該混合物經歷離心、絮凝、澄清及陰離子交換層析。
  19. 如請求項18之方法，其中該澄清係經由離心及深度過濾進行。
  20. 如請求項1之方法，其中該混合物係獲自培養之宿主細胞。
  21. 如請求項20之方法，其中該等培養之宿主細胞經滲透衝擊。
  22. 如請求項20之方法，其中該等醱酵細胞藉由離心或微過濾回收。
  23. 如請求項1之方法，其中該混合物係獲自無細胞產生系統。
  24. 如請求項1之方法，其中使該白喉毒素或其突變型經歷以下步驟(d)中之一或多者：離心、超濾、微過濾、過濾 及陰離子交換薄膜層析。
  25. 如請求項24之方法，其中使該白喉毒素或其突變型經歷超濾、微過濾、過濾及陰離子交換薄膜層析。
  26. 如請求項1之方法，其中該突變白喉毒素為CRM197。
  27. 一種調配物，其包含根據如請求項1之方法獲得且呈液體形式之白喉毒素或其突變型。
  28. 如請求項27之調配物，其中當在2℃下維持10 g/L或10 g/L以上之濃度至少6個月時，該白喉毒素或其突變型之純度大於90%。
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