CN107163111A - 纯化白喉毒素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了纯化白喉毒素的方法。方法包括：(1)对含有白喉毒素的溶液进行粗提，以便得到白喉毒素粗品；(2)将所述白喉毒素粗品进行浓缩，以便得到浓缩后的粗品；(3)调节所述浓缩后的粗品的pH值至中性或碱性，以便得到调节pH后的粗品；(4)将所述调节pH后的粗品分别进行疏水层析和离子交换层析，以便获得纯化后的白喉毒素。该方法将离子交换层析和疏水层析相结合纯化白喉毒素，充分利用了离子交换层析和疏水层析分离的杂质性质互补的特点，即离子交换层析可以分离疏水层析很难或者不能分离的物质，获得高纯度的白喉毒素，并有效地避免了白喉毒素引起的变态反应。

Description

纯化白喉毒素的方法

技术领域

本发明涉及医药领域，具体地，涉及纯化白喉毒素的方法。

背景技术

白喉是由白喉棒状杆菌(以下简称白喉杆菌)引起的急性呼吸道传染病。人是白喉杆菌的唯一天然宿主，白喉仅通过飞沫和密切接触传播。白喉毒素可以引起产生上呼吸道阻塞性假膜(哮吼)或损伤心肌及其他组织，从而致病和致死。按其菌落形态的不同及对淀粉发酵的特点，白喉杆菌可分为4个生物型(重型、belfanti、轻型和中间型)[Funke G,vonGraevenitz A,Clarridge JE,Bernard KA.Clinical microbiology of coryneformbacteria.Clin Microbiol Rev 10:125-159,1997]。除细菌外毒素外，细胞壁成份如O和K抗原，在白喉的致病性中均具有重要作用。所有棒状菌属的热稳定性O抗原都相同，而热不稳定K抗原，则因菌株不同而有差异，因而可用于鉴别菌株。同时，K抗原对于粘膜吸附很重要，侵袭性是由索状因子(毒性糖脂)介导的。白喉杆菌最重要的毒力因子是外毒素，外毒素是由噬菌体介导、细菌染色体编码的高度保守性多肽。在宿主细胞外，外毒素的活性很低，但通过非毒性片段B粘附并进入细胞后，毒性片段A解离，通过抑制细胞蛋白合成杀死细胞。白喉外毒素可引起局部和全身细胞死亡[Diphtheria vaccine:WHO positionpaper.Geneva,World Health Organization,2006,81:24–32]。据估计在20世纪80年代大量使用白喉类毒素以前，在发展中国家每年约有100万病例，5万～6万例死亡。即使在近几年，在地方性流行区，白喉的报告病死率仍超过10％。

对于白喉疾病，最可靠的预防方法是注射白喉类毒素疫苗。通过疫苗的注射，人体内产生了抗体，并在较长时间内保持一定的浓度，可以中和进入体内的毒素，不致发病。

目前国内上市生产企业均采用硫酸铵二段盐析法纯化白喉毒素。盐析法是蛋白质纯化中一种较为粗糙的纯化方法，原理是在蛋白质溶液中加入中性盐，改变蛋白质的水化膜及表面电荷，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。实际上就是利用蛋白质溶解度的差异进行分离。其优点是成本低，且不会引起蛋白质变性；缺点是纯度低，注射后易产生不良反应，安全性有待提高。白喉类毒素的不良反应大多与培养基中的未完全水解蛋白有关，一般是由白喉毒素纯化后残留的未完全水解蛋白的致敏作用造成的。这些培养基中的非有效成分经甲醛脱毒后交联在白喉类毒素上，具有反应原性，从而引起变态反应。

因此，我们需要采用更有效的纯化手段，进一步提高白喉毒素的纯度。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点，利用离子交换层析和疏水层析分离的杂质性质互补的特点，即离子交换层析可以分离疏水层析很难或者不能分离的物质，采用离子交换层析和疏水层析相结合纯化白喉毒素粗品，获得高纯度的白喉毒素。

需要说明的是，本发明是基于发明人的下列工作而完成的：

层析技术是分析领域一种常用的技术。其中，疏水层析是利用盐—水体系中样品组分的疏水基团和固定相的疏水配基之间的疏水力不同，而使样品组分得以分离的一种层析方法。该方法基于的是蛋白质的疏水差异，在高盐溶液中，蛋白质会与疏水配基相结合，而其他的杂蛋白则没有此种性质进行分离的。利用此种性质，因蛋白质疏水性不同，可以逐个地先后被洗脱而纯化。该方法可用于分离其它方法不易纯化的蛋白质。而离子交换层析是以离子交换剂作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的层析方法。发明人将离子交换层析和疏水层析相结合纯化白喉毒素，充分利用了离子交换层析和疏水层析分离的杂质性质互补的性质，即离子交换层析可以分离疏水层析很难或者不能分离的物质，获得高纯度的白喉毒素，并有效地避免了白喉毒素引起的变态反应。

因而，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种纯化白喉毒素的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：(1)对含有白喉毒素的溶液进行粗提，以便得到白喉毒素粗品；(2)将所述白喉毒素粗品进行浓缩，以便得到浓缩后的粗品；(3)调节所述浓缩后的粗品的pH值至中性或碱性，以便得到调节pH后的粗品；(4)将所述调节pH后的粗品分别进行疏水层析和离子交换层析，以便获得纯化后的白喉毒素。

发明人发现，将离子交换层析和疏水层析相结合纯化获得的高纯度白喉毒素，可有效减少过敏原，减轻注射后的不良反应。

另外，根据本发明上述实施例的纯化白喉毒素的方法，还可以具有如下附加的技术特征：

根据本发明的实施例，步骤(1)中，利用盐析法对所述含有白喉毒素的溶液进行粗提，优选地，利用10％-50％(w/v)硫酸铵溶液进行所述粗提，更优选地，为25％(w/v)硫酸铵溶液。由此，利用盐析法进行粗提，盐析后样品含有高浓度的盐，可以不经过或者经过很少处理，直接上样进行疏水层析。

根据本发明的实施例，步骤(1)中，所述粗提是在pH4.0-7.0的条件下进行的，优选地，pH值为pH5.0。由此，将盐析法和等电点沉淀法相结合，使粗提的效果更好。

根据本发明的实施例，步骤(2)中，所述浓缩为超滤浓缩，优选地，利用10-50kD膜进行所述超滤浓缩，优选地，为30kD膜。由此，超滤效果好。

根据本发明的实施例，步骤(3)中，调节所述浓缩后的粗品的pH值至7.0-9.0，优选地，pH值为8.0。

根据本发明的实施例，步骤(4)中，所述疏水层析的疏水基团选自苯基、辛基和丁基的至少一种，优选地，为苯基。由此，疏水层析效果好。

根据本发明的实施例，所述疏水层析是利用Phenyl Sepharose 6FF层析介质进行的。由此，疏水层析效果好。

根据本发明的实施例，所述疏水层析利用含(NH₄)₂SO₄的第一缓冲液进行第一步梯度洗脱。由此，洗脱效果好。

根据本发明的实施例，所述第一缓冲液为选自Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液和醋酸盐缓冲液的至少一种。由此，洗脱效果更佳。

根据本发明的实施例，所述第一缓冲液的浓度为1-5mol/L。由此，洗脱液浓度适宜。

根据本发明的实施例，所述含(NH₄)₂SO₄的第一缓冲液的pH值为7.0-9.0，优选地，pH值为8.0，(NH₄)₂SO₄的浓度为1-2mol/L。由此，洗脱效果好。

根据本发明的实施例，所述离子交换层析是阴离子交换层析。由此，适用于分离白喉毒素。

根据本发明的实施例，所述离子交换层析的层析介质为选自DEAE纤维素、DEAESepharose FF、Q-FF和Capto Q的至少一种，优选地，层析介质为DEAE纤维素，更优选地，层析介质为DEAE Sepharose FF层析介质。由此，离子交换层析的效果好。

根据本发明的实施例根据本发明的实施例，所述离子交换层析是利用含NaCl的第二缓冲液进行第二步梯度洗脱的。由此，洗脱效果好。

根据本发明的实施例，所述第二缓冲液为选自Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液和醋酸盐缓冲液的至少一种，优选地，为磷酸盐缓冲液。由此，洗脱效果更佳。

根据本发明的实施例，所述第二缓冲液的浓度为1-100mmol/L。由此，洗脱效果好。

根据本发明的实施例，所述含NaCl的第二缓冲液的pH值为6.0-8.0，优选地，pH值为7.0，NaCl的浓度为不高于3mol/L。由此，洗脱效果好。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例的纯化白喉毒素的方法的流程示意图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种纯化白喉毒素的方法。参考图1，根据本发明的实施例，对该方法进行解释说明，该方法包括：

S100粗提处理

根据本发明的实施例，对含有白喉毒素的溶液进行粗提，得到白喉毒素粗品。由此，通过粗提初步去除白喉毒素溶液中的杂质，便于后续进一步纯化。

其中，需要说明的是，本文中的“白喉毒素”应做广义理解，即包含狭义的白喉毒素，也包含白喉毒素突变体。术语“狭义的白喉毒素”用于指天然发生的蛋白。“白喉毒素突变体”指与白喉毒素具有≥70％、≥80％、≥90％、≥95％、≥98％或≥99％的同一性的序列，并且包括任何已知突变体形式，尤其对于非毒性突变体。“白喉毒素突变体”可以关于任何本文的白喉毒素使用。

根据本发明的实施例，利用盐析法对含有白喉毒素的溶液进行粗提。由此，利用盐析法进行粗提，盐析后样品含有高浓度的盐，可以不经过或者经过很少处理，直接上样进行疏水层析。

根据本发明的实施例，进行粗提的硫酸铵溶液的浓度不受特别的限制，只要是培养基中的蛋白，充分析出白喉毒素损失小即可，可以根据溶液的性质进行调节。根据本发明的一些实施例，利用10％-50％(w/v)硫酸铵溶液进行粗提。由于硫酸铵的温度系数小，而溶解度大，硫酸溶液的浓度为10％-50％(w/v)，有利于培养基中的蛋白充分盐析出来。并且硫酸铵的价廉易得，分段效果好，不易引起白喉毒素蛋白质变性。根据本发明的优选实施例，利用25％(w/v)硫酸铵溶液进行粗提。如表1所示，分别采用15％、25％和35％的硫酸铵对相同的含有白喉毒素的溶液进行粗提，虽然这三组硫酸铵的白喉毒素的收和纯度都不错，但相对而言，这三组硫酸铵的白喉毒素的收率逐渐下降，且第3组显著降低，而白喉毒素的纯度逐渐升高，并且第2和3组相对于第1组明显提高，组合考虑上述粗提结果，采用浓度为25％(w/v)的硫酸铵溶液进行粗提，培养基中的大部分蛋白杂质被析出，白喉毒素收率和纯度均较高。

表1、不同硫酸铵浓度对收率和纯度的对比

编号	硫酸铵浓度(％)	白喉毒素收率(％)	白喉毒素纯度(Lf/mg PN)
				1	15	83	237
2	25	76	552
				3	35	41	683

根据本发明的实施例，粗提是在pH4.0-7.0条件下进行的。白喉毒素的等电点为pH5.0，在白喉毒素的等电点附近下进行粗提，同时利用盐析法和等电点沉淀法进行粗提，不同蛋白质具有不同等电点，白喉毒素的等电点在pH4.0-7.0范围内，在该pH值范围内，白喉毒素的溶解度低，便于与其它杂质蛋白分离。并且，等电点法与盐析法均属于沉淀蛋白质的方法，当两种同时使用时，显著促进蛋白沉淀，使粗提效果更好。

根据本发明的优选实施例，粗提是在pH5.0条件下进行的。由此，粗提是在白喉毒素的等电点下进行的，使等电点沉淀法得到的白喉毒素的纯度更高，并且盐析法和等电点沉淀法相结合，粗提效果更好。

S200浓缩处理

根据本发明的实施例，将白喉毒素粗品进行浓缩，得到浓缩后的粗品。由此，通过浓缩处理，提高白喉毒素粗品的浓度，减小后续的层析处理的样本体积，从而，使层析柱的体积减小，并简化了层析的步骤，缩短了层析时间。

根据本发明的实施例，浓缩为超滤浓缩。由此，操作简便，浓缩效果好。根据本发明的优选实施例，利用10-50kD膜进行超滤浓缩。由此，超滤膜截留的物质的分子量与白喉毒素的分子量相近，保证白喉毒素充分截留，减少白喉毒素在浓缩过程中的损失。进一步地，发明人分别采用孔径为10、30和50kD的超滤膜进行超滤浓缩，第1和2组的白喉毒素的收率相同，但第2组的用时仅为第1组的一半左右，而第3组虽然用时较少，但其白喉毒素的收率相对也降低。进而，根据本发明的优选实施例，利用30kD膜进行超滤浓缩。由此，截留得到的白喉毒素的不仅收率较高，并且用时较少。

表2、不同超滤膜包孔径的对比

编号	超滤膜包孔径(kD)	白喉毒素收率(％)	15L用时(min)
				1	10	94	139
2	30	94	73
				3	50	83	65

S300调pH值

根据本发明的实施例，调节浓缩后的粗品的pH值至中性或碱性，得到调节pH后的粗品。由此，通过调节粗品的pH值，使粗品中的白喉毒素和杂质分别带不同的电荷，便于后续的离子交换层析。

根据本发明的一些实施例，调节浓缩后的粗品的pH值至7.0-9.0。由此，粗品中的白喉毒素和杂质分别带不同的电荷，便于后续的离子交换层析。根据本发明的优选实施例，调节浓缩后的粗品的pH值至8.0。由此，粗品中的白喉毒素和杂质分携带的电荷差异大，离子交换层析的效果好。

S400层析处理

根据本发明的实施例，将调节pH后的粗品分别进行疏水层析和离子交换层析，获得纯化后的白喉毒素。其中，疏水层析和离子交换层析不受特别的限制，可以先进行疏水层析再进行离子交换层析，也可以先进行离子交换层析，再进行疏水层析。发明人发现将离子交换层析和疏水层析相结合纯化白喉毒素，充分利用了离子交换层析和疏水层析分离的杂质性质互补的性质，即离子交换层析可以分离疏水层析很难或者不能分离的物质，获得高纯度的白喉毒素，根据本发明的实施例，纯化后的白喉毒素的纯度达到不低于4000Lf/mgPN，减少过敏原，减轻注射后的不良反应，提高疫苗的安全性。

疏水层析

根据本发明的实施例，疏水层析的疏水基团不受特别的限制，只要能将白喉毒素与杂质蛋白分离即可。根据本发明的一些实施例，疏水基团选自苯基、辛基和丁基的至少一种。由此，依据疏水配基苯基、辛基、丁基、丁基(低密度)，疏水性依次减弱的特点，为了具有较高载量，优选疏水性强的苯基配基。依据对白喉毒素与其它杂蛋白的结合能力差异大，便于将白喉毒素与其它杂质蛋白分离。根据本发明的优选实施例，层析介质为PhenylSepharose 6Fast Flow(high sub)(即Phenyl Sepharose 6FF)，疏水基团为苯基，疏水层析的效率更高。

根据本发明的实施例，疏水层析是利用Phenyl Sepharose 6FF层析介质进行层析纯化。Phenyl Sepharose 6FF层析介质，采用高度交联的6％的琼脂糖作为基架，该基质形成球形颗粒(90微米大小)，用疏水配基通过不带电的化学稳定的氧醚键或硫醚键取代而成。该基架类型的介质，具有高流速、大通量的特点，适合用于疫苗的生产规模。由此，采用Phenyl Sepharose 6FF层析介质用于白喉毒素的层析纯化。

第一步梯度洗脱用于将白喉毒素从层析柱上冲洗下来。根据本发明的实施例，疏水层析利用含(NH₄)₂SO₄的第一缓冲液进行第一步梯度洗脱。由于(NH₄)₂SO₄的分辨率高，利用含(NH₄)₂SO₄的第一缓冲液进行洗脱，使白喉毒素与杂蛋白的分离效果更好。

根据本发明的实施例，第一缓冲液包括但不限于Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液和醋酸盐缓冲液，缓冲液可以是其中的一种或几种。由此，缓冲液的稳定性好，洗脱效果更佳。

进一步地，根据本发明的实施例，第一缓冲液的浓度为1-5mol/L。由于疏水相互作用层析是根据蛋白表面疏水性的不同，利用蛋白和疏水层析介质疏水表面可逆的相互作用来分离蛋白。其中缓冲液里盐的存在会显著影响蛋白和疏水层析介质的相互作用。高浓度的盐会增强相互作用，而低浓度的盐减弱相互作用。具有最低程度疏水性的蛋白最先被洗脱，具有最强相互作用的蛋白最后被洗脱。由此，该浓度的第一缓冲液有利于将白喉毒素和杂蛋白有区分地洗脱下来，使得到的白喉毒素的纯度更高。

更进一步地，根据本发明的实施例，含(NH₄)₂SO₄的第一缓冲液的pH值为7.0-9.0。由此，在该pH值范围内，缓冲液对疏水层析的选择性和分辨率的影响小。根据本发明的优选实施例，含(NH₄)₂SO₄的第一缓冲液的pH值为8.0，(NH₄)₂SO₄的浓度为1-2mol/L。由此，硫酸铵的分辨率更佳，并且缓冲液的盐浓度对疏水层析的选择性和分辨率都有重要影响。

离子交换层析

根据本发明的一些实施例，离子交换层析可以是阴离子交换层析。由此，适用于分离白喉毒素。

根据本发明的一些实施例，离子交换层析的层析介质可以选自DEAE纤维素、DEAESepharose FF、Q-FF和Capto Q的至少一种。由此，层析介质的性质适于分离白喉毒素。根据本发明的优选实施例，层析柱为DEAE纤维素柱。由此，白喉毒素的纯化效果好，效率高。根据本发明更优选的实施例，层析介质为DEAE Sepharose FF层析介质。由此，白喉毒素的纯化效果佳，效率高，纯化的白喉毒素纯度高。

第二步梯度洗脱用于将白喉毒素从离子交换层析柱上冲洗下来，根据本发明的实施例，离子交换层析可以是利用含NaCl的第二缓冲液进行第二步梯度洗脱的。由此，随着盐浓度的增大，钠离子和氯离子会同结合的白喉毒素竞争填料表面的电荷，并且对白喉毒素蛋白有一定的稳定作用，避免白喉毒素变性。

根据本发明的实施例，第二缓冲液包括但不限于Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液和醋酸盐缓冲液，且可以是其中的一种或多种。由此，缓冲液的缓冲能力好，保持pH值稳定。根据本发明的优选实施例，第二缓冲液为磷酸盐缓冲液。由此，缓冲液的缓冲能力强，洗脱效果更佳。

根据本发明的一些实施例，第二缓冲液的浓度为1-100mmol/L。由此，在该浓度范围内，保证缓冲液具有较强的缓冲能力，使溶液的pH保持稳定。

在离子交换层析中，缓冲液的pH和离子强度必须同白喉毒素的稳定性和活性相兼容。最适合的pH应该允许白喉毒素结合，但又尽可能的靠近蛋白洗脱下来的pH值。如果该pH值太高或太低，洗脱将会变得更加困难。根据本发明的实施例，含NaCl的第二缓冲液的pH值为6.0-8.0。该pH允许白喉毒素结合，但又靠近白喉毒素洗脱下来的pH值，使白喉毒素易于洗脱，并且白喉毒素在该pH值范围内的稳定性和活性不受影响。根据本发明的优选实施例，含NaCl的第二缓冲液的pH值为7.0。由此，白喉毒素的洗脱效果好，并且白喉毒素的稳定性好，活性高。相应的，根据本发明的实施例，NaCl的浓度为不高于3mol/L。由此，NaCl的离子强度适宜，与前述的pH值范围相匹配，洗脱效果好，并有效保证了白喉毒素的稳定性和活性不受洗脱的影响。

下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Sigma公司。

实施例1白喉毒素的制备

将工作种子批菌种(CMCC38007，来源自中国食品药品检定研究院)启开后，接种于吕氏血清培养基上，于34.5～35.0℃培养24～48小时。第2代至第4代接种于改良林氏培养基，分别于34.5～35.0℃培养24～48小时，然后接种于白喉产毒培养基。

白喉产毒培养采用培养罐液体培养。产毒培养的温度控制在34.5～35.0℃，产毒培养的时间为24～48小时。培养过程中，根据pH的变化，适当补加碳源、氮源，调控pH。

培养物絮状单位不再升高后停止培养，加入甲醛溶液使其最终浓度为0.1％(v/v)，搅拌。

毒素制造过程中应严格控制杂菌污染，凡经镜检或纯菌试验发现污染者应废弃。将培养物离心取上清液，毒素效价不低于150Lf/ml时收获。

实施例2白喉毒素的纯化

将实施例1获得的含白喉毒素的上清液进行纯化，具体方法如下：

1、粗提：采用盐析法和等电点沉淀法共同进行粗提，具体步骤如下

(1)在实施例1获得的含白喉毒素的上清液中加入25％(w/v)硫酸铵，待硫酸铵完全溶解后，将溶液pH调至5.0，2℃～8℃，静置过夜。

(2)过夜后，离心，弃去沉淀，收获上清，过滤。

(3)利用30kD膜包超滤浓缩步骤(2)获得的上清液，浓缩至15倍，获得浓缩后的白喉毒素。

2、疏水层析

采用Phenyl Sepharose 6FF疏水层析柱进行疏水层析，具体步骤如下：

(1)将浓缩后的白喉毒素pH调节至8.0，得到调pH后的白喉毒素。

(2)以平衡液(平滑液成份：10mmol Tris+2mol/L(NH₄)₂SO₄，pH8.0)平衡PhenylSepharose 6FF疏水层析柱，其中，A泵为平衡液，B泵为缓冲液10mmol/L Tris，pH8.0。

(3)将调pH后的白喉毒素上样，根据白喉毒素在高盐环境下的疏水性质，使其与层析介质的疏水配基相结合，挂在柱子上。

(4)A泵的平衡液冲洗层析柱，将未与疏水层析介质结合的杂蛋白洗下来；45％B泵洗脱与疏水层析介质结合不紧密的杂蛋白，100％B泵洗脱目标蛋白白喉毒素，得到疏水层析后白喉毒素。

3、离子交换层析

利用DEAE Sepharose FF离子交换层析柱进行离子交换层析，具体步骤如下：

(1)将上一步骤得到的疏水层析后的白喉毒素pH调至7.0，得到中性白喉毒素。

(2)以平衡液(平衡液成份：10mmol/L PB,pH7.0)平衡DEAE Sepharose FF离子交换层析柱，其中，A泵为平衡液，B泵为缓冲液10mmol/L PB+1mol/L NaCl,pH7.0。

(3)将中性白喉毒素上样。

(4)洗脱：15％B泵洗脱高纯度白喉毒素，100％B泵洗脱杂蛋白，得到纯化后的白喉毒素。

实施例3白喉毒素的脱毒

将实施例2得到的纯化后的白喉毒素进行脱毒处理，具体方法如下：

(1)用PBS缓冲盐水将实施例得到的纯化后白喉毒素稀释为1000～1500Lf/ml。

(2)将步骤(1)得到的白喉毒素稀释液依次加入终浓度为20mmol/L的盐酸赖氨酸和终浓度为0.25％的甲醛溶液。

(3)利用0.45+0.2μm除菌滤器将步骤(2)得到的溶液进行过滤后，置室温2-3天、37℃环境中10-15天进行脱毒，制成类毒素。

实施例4白喉类毒素的检定

本发明方法制备的白喉类毒素原液与国内普遍采用的二段盐析方法制备的白喉类毒素原液的比较：

表3、白喉类毒素原液的比较

结果显示，本发明实施例制备的白喉类毒素原液的纯度高度4000Lf/mg PN意思，远高于传统的盐析方法的纯度，同时也远高于《中华人民共和国药典》(2010年版三部)本品种纯度不低于1500Lf/mg PN的要求。

综上所述，本发明将离子交换层析和疏水层析相结合纯化白喉毒素，充分利用了离子交换层析和疏水层析分离的杂质性质互补的性质，即离子交换层析可以分离疏水层析很难或者不能分离的物质，获得高纯度的白喉毒素，纯化后的白喉毒素的纯度达到不低于4000Lf/mg PN，有效地减少过敏原，减轻注射后的不良反应，疫苗的安全性显著提高。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种纯化白喉毒素的方法，其特征在于，包括：

(1)对含有白喉毒素的溶液进行粗提，以便得到白喉毒素粗品；

(2)将所述白喉毒素粗品进行浓缩，以便得到浓缩后的粗品；

(3)调节所述浓缩后的粗品的pH值至中性或碱性，以便得到调节pH后的粗品；

(4)将所述调节pH后的粗品分别进行疏水层析和离子交换层析，以便获得纯化后的白喉毒素。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，利用盐析法对所述含有白喉毒素的溶液进行粗提，优选地，利用10％-50％(w/v)硫酸铵溶液进行所述粗提，更优选地，为25％(w/v)硫酸铵溶液。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述粗提是在pH4.0-7.0条件下进行的，优选地，为pH5.0。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述浓缩为超滤浓缩，优选地，利用10-50kD膜进行所述超滤浓缩，更优选地，为30kD膜。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，调节所述浓缩后的粗品的pH值至7.0-9.0，优选地，为8.0。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述疏水层析的疏水基团选自苯基、辛基和丁基的至少一种，优选地，为苯基。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述疏水层析是利用Phenyl Sepharose6FF层析介质进行的。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述疏水层析利用含(NH₄)₂SO₄的第一缓冲液进行第一步梯度洗脱，

任选地，所述第一缓冲液为选自Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液和醋酸盐缓冲液的至少一种，

任选地，所述第一缓冲液的浓度为1-5mol/L，

任选地，所述含(NH₄)₂SO₄的第一缓冲液的pH值为7.0-9.0，优选地，为8.0，且(NH₄)₂SO₄的浓度为1-2mol/L。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离子交换层析是阴离子交换层析，

任选地，所述离子交换层析的层析介质为选自DEAE纤维素、DEAE Sepharose FF、Q-FF和Capto Q的至少一种，优选地，为DEAE纤维素，更优选地，为DEAE Sepharose FF层析介质。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述离子交换层析是利用含NaCl的第二缓冲液进行第二步梯度洗脱的，

任选地，所述第二缓冲液为选自Tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液和醋酸盐缓冲液的至少一种，优选地，为磷酸盐缓冲液，

任选地，所述第二缓冲液的浓度为1-100mmol/L，

任选地，所述含NaCl的第二缓冲液的pH值为6.0-8.0，优选地，为7.0，NaCl的浓度为不高于3mol/L。