KR20140038517A - 천연 또는 돌연변이 형태의 디프테리아 독소의 정제 방법 - Google Patents

천연 또는 돌연변이 형태의 디프테리아 독소의 정제 방법 Download PDF

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KR20140038517A
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Abstract

본 발명은 혼합물, 예를 들어 숙주 세포 단백질 및 DNA와 같은 불순물을 함유하는 숙주 세포 발효 혼합물로부터 디프테리아 독소 또는 그의 돌연변이 형태를 정제하기 위한, 히드록시아파타이트 크로마토그래피 및 다중모드 크로마토그래피의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 시험관내 및 생체내 적용에 적합한 다른 디프테리아 독소 정제용 분별 방법들과의 다-단계 절차에 상기 방법을 통합시키는 것에 관한 것이다.

Description

천연 또는 돌연변이 형태의 디프테리아 독소의 정제 방법 {METHODS OF PURIFICATION OF NATIVE OR MUTANT FORMS OF DIPHTHERIA TOXIN}
관련 출원에 대한 상호-참조
해당 없음
발명의 분야
본 발명은 히드록시아파타이트(hydroxyapatite) 크로마토그래피 및 다중모드(multimodal) 크로마토그래피를 사용하는, 천연 또는 돌연변이 형태의 디프테리아 독소의 정제 방법에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 디프테리아 독소의 돌연변이 형태는 CRM197이다.
디프테리아 독소는 코리네박테리움 디프테리아에(Corynebacterium diphtheriae)의 독소생성 균주에 의해 합성 및 분비되는 단백질성 독소이다. 디프테리아 독소 및 그의 돌연변이 형태는 담체 단백질로서의 백신 및 표적 요법으로서의 항암 약물 양자에서 적용분야가 발견되어 있다. 1920년대 이후, 포름알데히드-불활성화된 디프테리아 독소가 씨. 디프테리아에(C. diphtheriae)에 대한 백신접종에 사용되어 왔다. 디프테리아 독소의 돌연변이 형태를 사용한 접합 백신(conjugate vaccine)은 1980년대에 널리 가용해지기 시작하였다. 문헌 [Shinefield, 2010, Vaccine 28:4335-4339]을 참조하라. T-세포 면역을 자극하는 디프테리아 독소의 능력은 그를 T-세포 비의존성 항원 (예컨대 다당류)을 위한 매력적인 담체 단백질로 만들었다. 디프테리아 독소는 특이적으로 종양 세포상의 과발현된 표면 단백질을 표적으로 하는 리간드를 접합시키는 것에 의해, 암 요법으로도 사용된다. 문헌 [Michl et al ., 2004, Curr Cancer Drug Targets, 4:689-702]; 및 [Potala et al ., 2008, Drug Discovery Today 13:807-815]을 참조하라.
디프테리아 독소의 돌연변이 형태는 백신 및 항암제 모두에서 매우 바람직하다. 백신에서, 디프테리아 독소는 통상적으로 독성이 감소되도록 돌연변이된다. 그와 같은 돌연변이는 천연 독소에서 단백질 합성을 차단하는 ADP-리보실화 활성의 상실을 야기할 수 있다. 항암제에서는, 디프테리아 독소가 통상적으로 정상 세포상의 그의 천연 수용체에 대한 결합이 제거되도록 돌연변이된다. 문헌 [Potala et al., 2008, Drug Discovery Today 13:807-815]을 참조하라.
백신 적용분야에서, CRM197은 가장 널리 사용되고 있는 디프테리아 독소의 돌연변이이다. CRM197은 씨. 디프테리아에의 돌연변이 균주에 의해 생성되는데, 위치 52에서의 글리신 대신 글루탐산의 존재에서 디프테리아 독소와 구별되며, 본질적으로 비독성이다. 문헌 [Uchida et al ., 1973, J Biol Chem 248:3838-3844]을 참조하라. CRM197은 현재 소아과 용도의 백신을 위한 담체로서 널리 사용되고 있다. 문헌 [Shinefield, 2010, Vaccine 28:4335-4339]을 참조하라.
사용되어 오고 있는 디프테리아 독소 및 디프테리아 독소의 돌연변이 형태의 정제 방법에는 친화성 크로마토그래피 (문헌 [Cukor et al ., 1974, Biotech and Bioeng 16:925-931]; 및 [Antoni et al ., 1983, Experientia 39:885-886]), 소수성 크로마토그래피와 조합된 음이온-교환 (문헌 [Rappuoli et al ., 1983, J. Chromatog 268:543-548]), 및 접선 흐름 여과(tangential flow filtration) (문헌 [Sundaran et al ., 2002, J Biosci and Bioeng 94:93-98])가 포함된다.
임상 용도에는, 다량의 돌연변이 디프테리아 독소가 요구된다. 그러나, 씨. 디프테리아에의 디프테리아 독소 생성 균주로부터 디프테리아 독소를 생성시킴에 있어서 문제점들이 존재하며, 더구나 치료 용도로 충분한 양의 디프테리아 독소, 특히 디프테리아 독소의 돌연변이 형태를 제조하기 위하여 실험실 규모의 발효 조건을 대규모화할 때에는 어려움에 직면하곤 하였다. 따라서, 충분한 수율 및 순도로 디프테리아 독소를 수득하는 데에는 문제가 있으며, 대규모 제조는 비효율적인 경향이 있다. 예를 들어, 낮은 pH는 입체형태 변화를 유도하고 응집을 촉진함으로써 통상적인 양이온 교환기 (및 더 낮은 pH)의 사용을 어렵게 한다. 단백질분해 절단 (숙주 프로테아제 또는 자가촉매촉진에 의한 것) 역시 빈번하게 발생하여 대부분의 독소에서 비균질성을 야기한다. 비균질성은 예를 들어 생성물 동형, 생성물 변종, 생성물 단편 또는 글리코실화 패턴의 형태로 검출될 수 있다. 이러한 생성물 형태들은 제거되어야 하는데, 이는 일반적인 독소, 특히 디프테리아 독소에서의 독소 정제의 까다로운 특징으로 남아 있다. 소아과 백신에 있어서의 현재의 요구를 충족하고 표적화된 항암 약물의 가능성을 활용할 수 있기 위해서는, 이러한 어려움들이 극복되어야 한다.
효율적인 정제 및 고수율의 디프테리아 독소를 제공하는 정제 방법이 요구된다.
본 출원의 본 부문 또는 임의의 다른 부문에서의 모든 참고문헌의 인용 또는 확인은 해당 참고문헌이 본 발명에 대하여 선행 기술로 이용가능하다는 것을 표시하는 것으로 간주되어서는 안된다.
본 발명은 무손상 세포로부터의 돌연변이 디프테리아 독소 및 그의 돌연변이 형태, 예를 들어 CRM197의 정제 방법에 관한 것으로써, 높은 순도 및 수율을 제공한다. 본 방법의 결정적인 단계는 히드록시아파타이트 수지의 사용에 의한 내독소 및 잔류 단백질의 제거인 것으로 밝혀졌다. 다중모드 크로마토그래피 단계도 수행된다. 한 측면에서, 다중모드 크로마토그래피 수지의 사용은 히드록시아파타이트 수지에 바로 후속한다. 또 다른 측면에서, 다중모드 크로마토그래피 수지의 사용은 히드록시아파타이트 수지에 바로 선행한다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 발명은
a) 디프테리아 독소 또는 그의 돌연변이 형태를 함유하는 혼합물을, 디프테리아 독소 또는 그의 돌연변이 형태가 제1 분리제에 결합하도록 하는 조건하에서 제1 분리제와 접촉시키는 단계;
b) 제1 분리제로부터 디프테리아 독소 또는 그의 돌연변이 형태를 용리하는 단계;
c) 단계 a)로부터 수득된 용리 물질을, 디프테리아 독소 또는 그의 돌연변이 형태가 제2 분리제에 결합하도록 하는 조건하에서 제2 분리제와 접촉시키는 단계; 및
d) 제2 분리제로부터 상기 디프테리아 독소 또는 그의 돌연변이 형태를 용리하는 단계
를 포함하며, 여기서 1) 제1 분리제는 히드록시아파타이트이고 제2 분리제는 다중모드 수지이거나, 또는 2) 제1 분리제는 다중모드 수지이고 제2 분리제는 히드록시아파타이트이고, 제1 분리제 또는 제2 분리제가 히드록시아파타이트인 경우, 히드록시아파타이트로부터의 용리 전에, 히드록시아파타이트를 불순물이 제거되도록 하는 조건하에서 세척 단계에 적용하는 것인,
디프테리아 독소 또는 그의 돌연변이 형태를 함유하는 혼합물로부터 디프테리아 독소 또는 그의 돌연변이 형태를 정제하는 방법에 관한 것이다.
특정 측면에서, 제1 분리제는 히드록시아파타이트이며, 제2 분리제는 다중모드 수지이다.
특정 측면에서, 히드록시아파타이트의 세척은 pH 6.5 내지 8.0의 0.01 내지 1.0 M 칼륨 클로라이드 또는 나트륨 클로라이드를 포함하는 세척 용액을 사용한다. 세척 완충제는 0.1 내지 20 mM 칼륨 포스페이트 또는 나트륨 포스페이트를 추가로 포함할 수 있다.
특정 측면에서, 히드록시아파타이트로부터의 용리는 i) ≥ 약 30 mM 칼륨 클로라이드 또는 나트륨 클로라이드 또는 약 ≥ 15 mM 칼륨 포스페이트 또는 나트륨 포스페이트를 포함하는 용리 완충제를 사용하는 단계 용리; ii) 약 10 내지 약 25 mM 칼륨 포스페이트 또는 나트륨 포스페이트 또는 약 100 mM 내지 2 M 칼륨 클로라이드 또는 나트륨 클로라이드를 포함하는 구배 용리; 또는 iii) ≥ 0.3 pH 단위의 pH 변화를 포함한다.
특정 측면에서, 다중모드 수지와 접촉되는 혼합물은 트리스(Tris), MES, MOPS, HEPES, 포스페이트 (예컨대 칼륨), 클로라이드 (예컨대 칼륨 또는 나트륨) 또는 포스페이트 (예컨대 나트륨)를 포함한다.
특정 측면에서, 혼합물은 i) pH 6.8 내지 9.5의 ≥ 약 125 mM 칼륨 클로라이드 또는 나트륨 클로라이드를 포함하는 용리 완충제를 사용하는 단계 용리; ii) 약 0.2 내지 약 0.3 M 나트륨 클로라이드, 칼륨 클로라이드, 나트륨 술페이트, 암모늄 술페이트 또는 칼륨 클로라이드를 포함하는 구배 용리; iii) pH 6.5 내지 9.5 범위 내에서의 ≥ 0.5 pH 단위의 pH 변화; 또는 iv) 2 내지 30℃의 온도 내에서의 ≥ 1℃의 온도 변화에 의해 다중모드 수지로부터 용리된다.
본 발명의 특정 측면에서, 다중모드 수지는 하전된 부분 및 소수성 부분을 포함하는 리간드를 함유한다. 특정 측면에서, 하전된 부분은 양이온 교환을 위한 음으로 하전된 부분, 예를 들어 음이온성 카르복실레이트 기 또는 음이온성 술포 기이다. 그와 같은 다중모드 수지의 예는 캅토(Capto)-MMC™이다. 다른 측면에서, 하전된 부분은 양으로 하전된 부분, 예를 들어 아미노 기이다. 그와 같은 다중모드 수지의 예는 캅토 아드히어(Capto Adhere)™이다.
본 발명의 특정 측면에서, 다중모드 수지와 접촉되는 혼합물은 EDTA 또는 프로테아제 억제제를 포함한다. 본 발명의 다른 측면에서, 다중모드 수지로부터의 용리는 EDTA 또는 프로테아제 억제제의 존재하에 이루어진다.
다른 실시양태에서, 히드록시아파타이트 또는 다중모드 수지에의 혼합물의 적용에는, 무엇을 먼저 하는지에 관계없이, 하기 중 하나 이상이 선행할 수 있다: 원심분리, 응집(flocculation), 정화(clarification) 또는 음이온-교환 크로마토그래피. 본 발명의 특정 측면에서, 혼합물은 음이온-교환 크로마토그래피 상에서의 2 또는 3회 통과에 적용된다. 본 발명의 특정 측면에서, 혼합물의 적용에는 원심분리, 응집, 정화 및 음이온-교환 크로마토그래피가 선행한다. 정화는 원심분리 및 심층 여과를 통한 것일 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 개시 혼합물은 숙주 세포의 발효 배양물이다. 본 실시양태의 특정 측면에서, 배양된 숙주 세포가 수확된 후, 삼투 쇼크에 적용됨으로써 주변세포질로부터 디프테리아 독소 또는 그의 돌연변이 형태가 방출된다. 다른 측면에서, 원심분리 또는 마이크로여과에 의해 발효 세포가 회수된다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 개시 혼합물은 무-세포 생산 시스템으로부터 수득된다.
특정 실시양태에서, 디프테리아 독소 또는 그의 돌연변이 형태를 함유하는 혼합물은 히드록시아파타이트 수지와의 접촉 및 그로부터의 용리, 및 다중모드 수지와의 접촉 및 그로부터의 용리 후, 하기 중 하나 이상에 적용된다: 원심분리, 한외여과, 마이크로여과, 여과 및 음이온-교환 막 크로마토그래피. 특정 측면에서, 디프테리아 독소 또는 그의 돌연변이 형태를 함유하는 혼합물은 한외여과, 마이크로여과, 여과 및 음이온-교환 막 크로마토그래피에 적용된다.
특정 실시양태에서, 디프테리아 독소 또는 그의 돌연변이 버젼은 CRM197이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 방법을 사용하여, ≥ 90%의 숙주 세포 단백질 및 숙주 세포 불순물이 제거된 최종 액체 제제가 수득되며, 디프테리아 독소 또는 그의 돌연변이 형태의 수율은 ≥ 25% 또는 ≥ 35%이다. 특정 실시양태에서, 디프테리아 독소 또는 그의 돌연변이 형태는 겔 전기영동에 의해 평가하였을 때 ≥ 90%, ≥ 95% 또는 ≥ 98%의 순도로 정제된다. 순도는 무손상 디프테리아 독소 또는 그의 돌연변이 형태의 백분율만을 참조하여 계산된다 (디프테리아 독소 단편은 불순물임). 특정 실시양태에서, 디프테리아 독소 또는 그의 돌연변이 형태의 액체 제제는 약 ≥ 10 g/L 또는 ≥ 50 g/L의 농도를 가지며, 2℃에서 6개월 이상 동안 90%의 순도를 유지한다. 다른 실시양태에서, 겔 전기영동에 의해 평가하였을 때, 90%의 순도 수준은 25℃에서 5일 이상 또는 3주 이상 동안 유지된다. 비균질성은 겔 전기영동에 의해 평가하였을 때 생성물의 ≤ 1%이며, 내독소는 키네틱(Kinetic)-QCL 발색성 검정 키트에 의해 측정하였을 때 ≤ 1 EU/mg이고, 응집은 HPSEC/UV에 의해 ≤ 0.2% 또는 ≤ 0.1%이다.
도 1. 친화성-기반 크로마토그래피 공정 표준 (레인 3) 및 내부 표준 (레인 2)과 비교한 음이온-교환 및 히드록시아파타이트 크로마토그래피 (레인 4 및 5)를 사용한 CRM197 정제의 SDS-PAGE 결과. 1× MES 전개 완충제와 함께 4-12% 비스-트리스 NuPAGE 겔을 사용하였음.
도 2. SDS-PAGE에 의해 정량하였을 때의 시간 (주) 경과에 따른 CRM197의 % 무손상 단량체를 비교한 25℃에서의 CRM197 안정성 (또는 완전성) (촉진된 안정성). 친화성-기반 크로마토그래피 (정사각형) 공정, 히드록시아파타이트 크로마토그래피 (다이아몬드형) 공정, 그리고 실험실 (원형) 및 제조 규모 (삼각형)에서의 캅토-MMC™ 크로마토그래피 공정과 조합된 히드록시아파타이트 크로마토그래피에 의해 정제된 CRM197을 생성시켰음.
도 3. 내부 표준과 비교한 제조 규모 (배치 #1 및 #2)에서의 CRM197 정제의 SDS-PAGE 결과. 통상적인 정제 기술을 사용하여서는 제거하기가 어려운 CRM197 단편 (p37 및 p25)이 낮은 농도로 존재함. 1× MES 전개 완충제와 함께 4-12% 비스-트리스 NuPAGE 겔을 사용하였음.
도 4. 캅토 아드히어™을 수반한 히드록시아파타이트 (레인 4) 및 캅토-MMC™를 수반한 히드록시아파타이트 (레인 5)를 비교한 CRM197 정제의 SDS-PAGE 결과. 비균질성 제거를 보여주기 위하여, AXP (음이온-교환 생성물) 및 HAP (히드록시아파타이트 생성물) (레인 2 및 3)를 나타내었음. 1× MES 전개 완충제와 함께 4-12% 비스-트리스 NuPAGE 겔을 사용하였음.
본 발명은 디프테리아 독소 및 디프테리아 독소의 돌연변이 형태의 정제를 위한, 히드록시아파타이트 크로마토그래피 및 다중모드 크로마토그래피 (예컨대 캅토-MMC™)의 용도에 관한 것이다. 디프테리아아 독소는 디프테리아 독소, 예를 들어 숙주 세포에서 발현된 디프테리아 독소를 함유하는 혼합물, 또는 임의의 부분적으로 정제된 디프테리아 독소 혼합물로부터 정제될 수 있다. 히드록시아파타이트 크로마토그래피를 사용할 경우, 조건은 숙주 세포 단백질 및 기타 잔류 불순물의 ≥ 90%가 CRM197로부터 분리되는 동시에 한외여과 전에 ≥ 50-60%의 공정 수율이 유지되도록 결정된다. 히드록시아파타이트 및 다중모드 크로마토그래피를 사용할 경우, 조건은 숙주 세포 단백질 및 기타 잔류 불순물의 ≥ 95%가 CRM197로부터 분리되는 동시에 ≥ 20-40%의 공정 수율이 유지되도록 결정된다. 본원에서 기술되는 정제 방법은 대규모 제조에 적합해서, 250 및 1300-L 발효 브로스 공급물을 수용하도록 대규모화되어 있다.
본 발명의 방법은 견실하고 강력한 디프테리아 독소의 정제 방법을 제공하며, 고품질의 무손상 돌연변이 디프테리아 독소를 생성시킨다. 돌연변이 디프테리아 독소는 단백질 균질성을 유지하면서도 (예컨대 무손상 매스(mass) 및 단량체 형태), 최종 벌크(bulk)에서 고도로 농축될 수 있다 (> 100 g/L). 이는 향상된 순도로 인하여 가능하다. 따라서, 벌크가 동결건조될 필요가 있는 통상적인 방법과 달리, 액체의 형태로 벌크의 저장이 수행될 수 있다. 디프테리아 독소의 높은 농도는 다당류와의 접합 반응시에 특히 중요한데, 그것이 반응 동역학을 촉진하기 때문이다.
본원에서 논의되는 수지의 기능성, 예를 들어 히드록시아파타이트 및 다중모드 수지는 칼럼 크로마토그래피 및 막 크로마토그래피와 같은 어떠한 공지의 정제 기술로도 사용될 수 있다. 칼럼 크로마토그래피가 그의 재사용가능성으로 인하여 일반적으로 바람직하다. 본 발명의 방법이 막과 함께 사용되는 경우에는, 중합체 표면상에 흡수 특성이 제공된다. 칼럼에 충진된 수지를 사용하기보다는, 내부 표면 영역에 관능기를 가지는 미세다공성 막이 디프테리아 독소 포획을 가능케 하게 된다. 이러한 막은 예를 들어 편평 시트 또는 중공 섬유 배열구조의 셀룰로스 아세테이트 또는 폴리비닐리덴 디플루오라이드로 구성될 수 있다. 칼럼 크로마토그래피에 대비한 장점에는 더 짧은 작업 시간, 및 요구되는 칼럼 부피에 비해 더 작은 막 부피가 포함된다.
본원에서 사용될 때, "디프테리아 독소"라는 용어는 천연 발생 단백질을 지칭하는 데에 사용된다. 디프테리아 독소를 지칭할 때의 "그의 돌연변이 형태" 또는 "돌연변이 디프테리아 독소"는 디프테리아 독소와 ≥ 70%, ≥ 80%, ≥ 90%, ≥ 95%, ≥ 98% 또는 ≥ 99%의 동일성을 가지는 서열을 지칭하는데, 모든 공지의 돌연변이된 형태, 특히 비-독성인 돌연변이들, 예컨대 CRM107 및 CRM197, 그리고 U.S. 특허 제6,455,673호에 기술되어 있는 것들이 포함된다. 본원에서 "그의 돌연변이 형태"는 디프테리아 독소에 대한 어떠한 언급과도 함께 사용될 수 있다.
본원에서 사용될 때, pH 또는 pI 값과 함께 사용되는 경우, "약"은 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 또는 0.5 단위의 변동을 지칭한다. 온도 값과 함께 사용되는 경우, "약"은 1, 2, 3, 4 또는 5 도의 변동을 지칭한다. 길이 및 중량과 같은 다른 값과 함께 사용되는 경우, "약"은 1%, 2%, 3%, 4%, 5% 또는 10%의 변동을 지칭한다.
본원에서 사용될 때, "정화된"은 숙주 세포 및/또는 세포 잔사를 제거하기 위하여 원심분리, 마이크로여과, 여과 또는 침강/경사분리 절차 중 하나 이상을 수반하는 고체-액체 분리 단계에 샘플 (예컨대 생존성 또는 비-생존성 세포)이 적용되었음을 지칭한다. 정화된 발효 브로스는 발효 상청액일 수 있다. 정화는 때로는 일차 또는 개시 회수 단계로 지칭되며, 통상적으로 임의의 크로마토그래피 또는 유사 단계 전에 이루어진다.
본원에서 사용될 때, "혼합물"은 관심 단백질 (정제하기를 원하는 것), 및 하나 이상의 오염물, 즉 불순물을 포함한다. 혼합물은 무세포 생산 시스템, 숙주 세포, 또는 폴리펩티드를 생산하는 생물체로부터 직접 수득될 수 있다. 제한하고자 하는 것은 아니나, 본 발명의 방법에 따라 정제될 수 있는 혼합물의 예에는 수확된 세포 배양물/발효액 또는 상청액, 정화된 상청액, 및 컨디셔닝된 상청액이 포함된다. "부분적으로 정제된" 혼합물은 크로마토그래피 단계, 예컨대 비-친화성 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등에 이미 적용된 바 있는 것이다. "컨디셔닝된 혼합물"은 원하는 크로마토그래피 성능을 달성하기 위한 pH 및/또는 전도성 범위 및/또는 완충제 매트릭스(matrix)를 설정하기 위하여 완충제 교환, 희석, 염 첨가, pH 적정 또는 여과 중 하나 이상에 혼합물을 적용하는 것에 의해 본 발명의 방법에서 사용되는 크로마토그래피 단계용으로 조제된 혼합물, 예컨대 세포 배양물/발효 상청액이다. "컨디셔닝된 혼합물"은 제1 크로마토그래피 칼럼에의 로딩 조건을 표준화하기 위하여 사용될 수 있다. 일반적으로, 혼합물은 업계에 잘 알려져 있는 다양한 분리 수단을 통하여, 예를 들어 생물반응기 전개의 말단에서 여과 또는 원심분리를 사용하여 브로스의 다른 성분들로부터 세포를 물리적으로 분리하는 것에 의해, 또는 특정 범위의 pH, 전도성 및 완충제 종 농도로의 혼합물의 농축 및/또는 정용여과에 의해 수득될 수 있다.
본원에서 사용될 때, "연마(polishing) 크로마토그래피"는 포획 크로마토그래피에 이어지는 하나 이상의 추가적인 크로마토그래피 단계를 지칭하며, 잔류 숙주 세포 불순물 및 생성물-관련 불순물 (단편 및/또는 응집된 종들을 포함한 디프테리아 독소 비균질성)을 제거하는 데에 사용된다.
디프테리아 독소
디프테리아 단백질의 서열 및 구조에 대해서는 기술되어 있다. 문헌 [Delange et al ., 1976, Proc Nat Acad Sci USA 73:69-72]; 및 [Falmagne et al ., 1985, Biochim Biophys Acta 827:45-50]을 참조하라. 비제한적으로 CRM107 및 CRM197을 포함한 디프테리아 독소의 돌연변이 형태들이 본 발명의 방법을 사용하여 정제될 수 있다.
CRM107을 포함하여, 문헌 [Laird et al , 1976, J. Virology 19:220-227] 및 [Nicholls and Youle in Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Marcel Dekker, Inc, 1992]에 기술되어 있는 돌연변이 형태들과 같은 독소의 돌연변이 형태들은 업계에 알려져 있는 방법, 예를 들어 문헌 [Laird et al ., 1976, J. Virology 19:220-227]에 기술되어 있는 방법, 및 또한 코리네박테리오파지 β가 보유하는 디프테리아 독소에 대한 야생형 구조 유전자의 알려져 있는 뉴클레오티드 서열 (문헌 [Greenfield et al ., 1993, Proc Nat Acad Sci 50:6953-7])을 바탕으로 한 부위 지정 돌연변이유발에 의해 제조될 수도 있다.
본 발명의 방법은 바람직하게는 대상체에의 투여를 위하여 화학적 또는 유전학적 수단에 의해 안전화된 면역학적으로 효과적인 항원 또는 담체인 다른 박테리아 독소들의 정제에도 유용할 수 있다. 그 예에는 RTX-유사 독소 (MARTX 독소), 클로스트리듐 디피실레(Clostridium difficile) 독소, 및 클로스트리듐 종 글루코실화 독소 족, 테타누스 톡소이드, 보툴리눔 독소, 클로스트리듐 세포독소, 페르투씨스(pertussis) 톡소이드, 이. 콜라이(E. coli ) LT, 이. 콜라이 ST, 및 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 유래의 외독소 A와 같은 불활성화된 박테리아 독소들이 포함된다. 외막 복합체 c (OMPC), 포린, 트랜스페린 결합 단백질, 뉴몰리시스, 뉴모코쿠스 표면 단백질 A (PspA), 뉴모코쿠스 부착 단백질 (PsaA), 또는 뉴모코쿠스 표면 단백질 BVH-3 및 BVH-11과 같은 박테리아 외막 단백질들 역시 사용될 수 있다. 바실루스 안트라시스(Bacillus anthracis)의 보호 항원 (PA), 오발부민, 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin) (KLH), 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민 (BSA), 및 투베르쿨린의 정제된 단백질 유도체 (PPD)와 같은 기타 단백질들 역시 사용될 수 있다. 상기 단백질들은 바람직하게는 비-독성이며 비-반응원성인 단백질로써, 접합에 적합한 충분한 양 및 순도로 수득가능하다.
숙주 세포/무-세포 생산
디프테리아 독소 또는 그의 돌연변이 형태는 수많은 무세포 생산 시스템 또는 숙주 세포들로부터 제조될 수 있다. 예를 들어, 천연 발생 디프테리아 독소는 코리네박테리아 디프테리아에, 및 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)를 포함한 공적으로 가용한 다양한 공급처로부터의 기타 균주들의 배양물로부터 정제될 수 있다.
무-세포 생산 시스템에 대해서는 업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 한 시스템은 재조합 요소를 사용한 단백질 합성(Protein synthesis Using Recombinant Elements) (PURE)을 바탕으로 한다 (예컨대 문헌 [Shimizu et al ., 2001, Nat Biotechnol 19:751-755] 및 [Ohashi et al ., 2007, Biochem Biophys Res Commun 352:270-276] 참조). 다른 무-세포 생산 시스템들에 대해서는 문헌 [Voloshin et al., 2005, Biotechnol Bioeng 91:516-21], [Kim et al ., 2001, Biotechnol Bioeng 74:309-16], [Calhoun et al ., 2005, Biotechnol Bioeng 90(5):606-13], [Jewett et al ., 2004, Biotechnol Bioeng 86:19-26], [Jewett et al, 2004, Biotechnol Bioeng 87(4):465-72]에 기술되어 있다.
다프테리아 독소 및 그의 돌연변이 형태는 씨. 디프테리아에, 또는 단백질을 생산하도록 유전적으로 조작된 다른 미생물에서 발현될 수 있다. 단백질을 생산하도록 세포를 유전적으로 조작하는 방법에 대해서는 업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌 [Ausabel et al ., eds. (1990), Current Protocols in Molecular Biology (Wiley, New York)] 및 U.S. 특허 제5,534,615호 및 4,816,567호를 참조하라. 그와 같은 방법에는 단백을 코딩함으로써 그의 발현을 가능케 하는 핵산을 살아 있는 숙주 세포에 도입하는 것이 포함된다. 다른 박테리아 숙주 세포에는 이. 콜라이 세포가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. CRM197은 코리네박테리움 디프테리아에의 돌연변이 균주에 의해 생산된다. 문헌 [Uchida et al ., 1973, J Biol Chem 248:3838-3844]을 참조하라.
본 발명의 특정 실시양태에서, 돌연변이 디프테리아 독소는 숙주 발현 시스템으로서 피. 플루오레센스(P. fluorescens)를 이용하여 생산된다. 문헌 [H. Jin et al ., Soluble periplasmic production of human granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) in Pseudomonas fluorescens , Protein Expr. Purif. (2011), doi:10.1016/j.pep.2011.03.002] 및 U.S. 특허 출원 공개 제20090325230호를 참조하라.
디프테리아 독소의 생산
디프테리아 독소 또는 그의 돌연변이 형태는 업계에 알려져 있는 방법에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어 U.S. 특허 출원 공개 제20060270600호를 참조하라. 바람직하게는, 방법은 미생물, 예를 들어 씨. 디프테리아에와 같은 박테리아의 배양을 수반한다. 관심 단백질을 코딩하는 핵산을 사용하여 조작된 숙주 세포가 단백질의 발현을 가능케 하는 공지 조건하에서 배양될 수 있다.
CRM197은 문헌 [Park et al ., J Exp Med (1896) 1:164-185]에 기술되어 있는 방법론에 의해 생산될 수 있다.
피. 플루오레센스를 이용하는 한 발현 시스템에서, 발효 공정은 제1 단계 종자 진탕 플라스크 (냉동된 바이알 내지 플라스크), 제2 단계 종자 발효기, 및 성장 및 유도 상을 포함하는 생산 발효기로 구성된다. 탄소 공급원으로는 글리세롤이 사용되며, 이소프로필-베타-D-티오갈락토-피라노시드 (IPTG) 유도가능 프로모터가 단백질의 발현을 촉진한다. 이후, 냉장된 세포 현탁액이 회수 또는 정제 공정으로 전달된다.
독소 생산은 예를 들어 SDS PAGE, ELISA 또는 ADP-리보실화 검정 (문헌 [Blanke et al ., 1994, Biochemistry 33:5155] 참조)과 같은 다양한 공지의 방식으로, 또는 이러한 방법들의 조합에 의해 모니터링될 수 있다.
본원에서 기술되는 생산 방법에서, pH는 업계 숙련자에게 잘 알려져 있는 절차에 따라 최적으로 조절된다.
예비-처리
히드록시아파타이트 및 다중모드 수지에 적용될 혼합물은 예를 들어 디프테리아 독소 함유 상청액, 디프테리아 독소 함유 세포 분획, 또는 발효/배양 상청액으로부터 유래하는 디프테리아 독소 함유 조제물, 예컨대 한외여과된 상청액 또는 정용여과된 상청액과 같은 농축 상청액일 수 있다. 적용될 혼합물은 바람직하게는 응집, 정화 및 음이온-교환 크로마토그래피와 같은 방법을 사용하여 처리된다. 일부 실시양태에서, 혼합물은 이들 방법 3종 모두를 사용하여 처리된다.
디프테리아 독소가 발효 상청액으로 분비되는 씨. 디프테리아에의 경우에는, 발효 상청액 또는 그로부터 유래하는 조제물상에서 바로 방법이 수행될 수 있다. 디프테리아 독소를 발현하도록 유전적으로 변형된 이. 콜라이와 같은 다른 미생물에서의 발현의 경우, 디프테리아 독소는 세포 내, 예를 들어 주변세포질 또는 세포질에서 발견될 수 있다. 그와 같은 경우, 일차적인 회수 단계는 세포의 위치에 따라 달라질 수 있다. 디프테리아 독소는 예를 들어 문헌 [Skopes in Protein Purification, Principles and Practice, 3rd edn, Pub: Springer Verlag]에 기술되어 있는 바와 같은 업계 공지의 방법에 이어지는 본 발명의 방법에 따른 정제에 의해 세포로부터 추출될 수 있다.
전체 세포가 사용되는 경우, 세포는 바람직하게는 삼투 쇼크에 적용된다. 삼투 쇼크 단계는 바람직하게는 세포 농축 후의 정제 공정에 포함된다. 이것은 일반적으로 삼투몰농도 변화 단계 및 응집 단계의 조합이다. 이러한 환경 변화는 최소한의 세포질 불순물이 방출되고 정화시 세포 잔사가 용이하게 제거되도록 한다. 박테리아 주변세포질 공간의 단백질 분자의 경우, 실험실 규모의 배치 삼투 쇼크 절차가 완전한 세포 파열 없이 주변세포질 내용물을 선택적으로 방출하는 데에 사용되고 있다. 그와 같은 과정은 통상적으로 발효 브로스를 높은 몰농도의 염 또는 당 용액 (침지 완충제)와 평형화함으로써 세포 내에 높은 삼투압을 구축하는 것으로 개시된다. 여기에 주변세포질 내용물의 방출을 위한 제한된 시간 기간 동안의 배치 모드에서의 낮은 삼투몰농도 완충제 (쇼크 완충제)와의 혼합이 후속한다. 방출 후에는 일반적으로 정화 방법에 의한 세포 잔사의 제거가 이어진다. 세포에 삼투 쇼크를 가하는 방법에 대해서는 U.S. 특허 출원 공개 제20080182295호에 기술되어 있다.
응집은 혼합물에 화학 작용제를 첨가함으로써 미세 입자를 응집시켜 그들이 침강되도록 하는 공정이다. 많은 응집제(flocculant)들이 알루미늄, 철, 칼슘 또는 마그네슘과 같은 다가의 양이온이다. 이렇게 양으로 하전된 분자들은 음으로 하전된 입자 및 분자와 상호작용하여 응집에 대한 장벽을 감소시킨다. 또한, 이러한 화학물질 중 많은 것들이 적절한 pH 및 기타 조건들 예컨대 온도 및 염도하에서 물과 반응하여 불용성인 수산화물을 형성하며, 그것은 침전시 함께 연결되어 긴 사슬 또는 메시(mesh)를 형성함으로써 작은 입자를 더 큰 응집물로 물리적으로 포획한다. 적합한 응집제에는 알룸, 알루미늄 클로로히드레이트, 알루미늄 술페이트, 산화 칼슘, 수산화 칼슘, 철(II) 술페이트, 철(III) 클로라이드, 폴리아크릴아미드, 폴리DADMAC, 나트륨 알루미네이트 및 나트륨 실리케이트가 포함된다. 응집을 위한 조건에 대해서는 업계 숙련자에게 잘 알려져 있다.
추가적인 응집제들이 U.S. 특허 제7,326,555호에 선택적 침전제 (SPA)로 기술되어 있다. 여기에는 아민 공중합체, 4급 암모늄 화합물 및 이들의 임의의 각 혼합물이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 작용제의 혼합물은 순수 형태와 유사한 성능을 제공하면서도 다중의 침전 메카니즘 (즉 일차 결합 부위)을 도입한다. 이들 작용제의 혼합물은 침전 완충제로서 혼합물에 첨가될 수 있거나, 또는 하이-컷/로우-컷(high-cut/low-cut) 첨가 방법론이 도입될 수 있다. 더 구체적으로, 많은 폴리에틸렌 이민 (PEI) 형태들이 특히 대략 중성인 pH 조건하에서 매우 효과적인 것으로 나타났다. 이론적으로는, 비교적 높은 분자량을 가지는 변형된 PEI 공중합체가 효율적일 수 있다.
4급 암모늄 화합물로는 하기의 종류 및 시중에서 구입가능한 제품의 예가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다: 모노알킬트리메틸 암모늄염 (시중에서 구입가능한 제품의 예에는 세틸트리메틸암모늄 브로마이드 (CTAB) 또는 세틸트리메틸암모늄 클로라이드, 테트라데실트리메틸암모늄 (TTA) 브로마이드 또는 클로라이드, 알킬트리메틸 암모늄 클로라이드, 알킬아릴트리메틸 암모늄 클로라이드, 도데실트리메틸암모늄 브로마이드 또는 클로라이드, 도데실디메틸-2-페녹시에틸암모늄 브로마이드, 헥사데실아민 클로라이드 또는 브로마이드염, 도데실 아민 또는 클로라이드염, 및 세틸디메틸에틸 암모늄 브로마이드 또는 클로라이드가 포함됨), 모노알킬디메틸벤질 암모늄염 (예에는 알킬디메틸벤질 암모늄 클로라이드 및 벤즈에토늄 클로라이드 (BTC)가 포함됨), 디알킬디메틸 암모늄염 (시중 제품에는 도미펜 브로마이드 (DB), 디데실디메틸 암모늄 할로겐화물 및 옥틸도데실디메틸 암모늄 클로라이드 또는 브로마이드가 포함됨), 헤테로방향족 암모늄염 (시중 제품에는 세틸피리듐 할로겐화물 (예컨대 CPC) 또는 브로마이드염 및 헥사데실피리디늄 브로마이드 또는 클로라이드가 포함됨), 시스-이성질체 1-[3-클로로알릴]-3,5,7-트리아자-1-아조니아아다만탄, 알킬-이소퀴놀리늄 브로마이드, 및 알킬디메틸나프틸메틸 암모늄 클로라이드 (BTC 1110), 다치환 4급 암모늄염 (시중에서 구입가능한 제품에는 알킬디메틸벤질 암모늄 사카리네이트 및 알킬디메틸에틸벤질 암모늄 시클로헥실술파메이트가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아님), 비스-4급 암모늄염 (제품의 예에는 1,10-비스(2-메틸-4-아미노퀴놀리늄 클로라이드)-데칸, 1,6-비스{1-메틸-3-(2,2,6-트리메틸 시클로헥실)-프로필디메틸 암모늄 클로라이드} 헥산 또는 트리클로비소늄 클로라이드, 및 버크만 브로셔스(Buckman Brochures) 사에 의해 CDQ로 지칭되는 비스-쿼트(bis-quat)가 포함됨), 및 중합체성 4급 암모늄염 (다중이온 예컨대 폴리[옥시에틸렌(디메틸이미노)에틸렌(디메틸이미노)에틸렌 디클로라이드], 폴리[N-3-디메틸암모니오)프로필]N-[3-에틸렌옥시에틸렌디메틸암모니오)프로필]우레아 디클로라이드, 및 알파-4-[1-트리스(2-히드록시에틸레)암모늄 클로라이드 포함).
브로스의 정화가 디프테리아 독소-함유 상청액을 수득하는 데에 사용될 수 있다. 박테리아는 업계에 알려져 있는 방법, 예컨대 원심분리, 침강/경사분리 또는 여과, 예를 들어 마이크로여과 및 정용여과에 의해 발효 브로스로부터 분리될 수 있다. 정화는 통상적으로 고체를 펠렛화하고 추가 처리를 위해 상청액을 회수하기 위한 원심분리를 수반한다. 다르게는, 마이크로여과, 심층 여과 또는 pH 기반 침전 (산 또는 염기)이 추가 정제를 위한 여과액 회수를 동반하여 고체를 여과 제거하는 데에 사용될 수 있다. 정화는 이러한 단계들의 조합, 예를 들어 마이크로여과 또는 심층 여과와 연계된 원심분리를 수반할 수도 있다. 예를 들어 문헌 [Wang et al ., 2006, Biotechnol Bioeng 94:91-104]을 참조하라.
임의로 응집된 브로스를 정화하기 위한 여과는 업계에 알려져 있는 방법, 예를 들어 중공 섬유 또는 나선형 권취 막과 같은 막을 사용하여, 예컨대 0.1 또는 0.2 ㎛ 필터, 예를 들어 중공 섬유 필터, 예컨대 A/G 테크놀로지(Technology) 사로부터 입수가능한 것, 또는 0.4 또는 0.65 ㎛ 중공 섬유 또는 나선형 권취 막, 또는 300K 또는 500K 필터에 의해 수행될 수 있다.
정용여과는 정용여과 막의 분자량 컷-오프 크기보다 더 작은 염 및 기타 이온들을 제거함으로써 이온 강도를 감소시키는 데에 사용될 수 있다. 이온 강도의 감소는 이어지는 이온 교환 단계에 도움이 되는데, 감소된 이온 강도에서는 이온 교환 매트릭스에 의해 더 적은 독소가 보유됨으로써 수율이 향상되기 때문이다. 또한, 정용여과 막에 의해 부분적인 정제가 달성된다. 예컨대 정용여과는 염, 저분자량 매질 성분, 및 분자량 30,000 달톤 미만인 분비 단백질의 제거를 초래하게 되는 예를 들어 30,000 달톤 공칭 분자량 컷 오프의 막을 사용하고, 낮은 이온 강도의 완충제, 예를 들어 약 6.5 내지 약 9.0, 바람직하게는 약 6.9 내지 약 8.0, 예컨대 약 7.4 내지 7.6의 pH를 가지는 약 0.1 mM 내지 약 100 mM, 바람직하게는 약 10 내지 약 50 mM, 예컨대 10 mM 농도의 트리스, 트리신, MES, 비스-트리스, TES, MOPS, 무기 염 (예컨대 술페이트 및 포스페이트)에 대하여 수행될 수 있다. 아닐 경우, 상기의 성분은 이온 교환 매트릭스에 결합하여 독소에 결합하는 그의 능력을 감소시킬 수 있다.
정용여과와 한외여과의 조합은 이온 강도를 감소시킬 뿐만 아니라, 개시 정제로도 작용하여 부피가 감소되는 것을 가능케 한다. 이는 더 작은 칼럼이 사용될 수 있음으로써 수행되어야 할 크로마토그래피 단계에 요구되는 시간이 감소된다는 것을 의미한다.
특히 제약 목적의 산업 규모 정제의 경우가 그러하듯이 대규모 부피가 관련되는 경우에는, 취급의 용이성을 위하여, 이온 교환 단계 전에 어느 정도의 상청액 농축이 수행될 수 있다. 무세포 상청액은 일반적으로 업계에 알려져 있는 단백질 농축 방법, 예를 들어 필터, 막 또는 중공 섬유 형태의 다공성 물질을 사용한 예컨대 한외여과에 의한 것을 사용하여, 5 내지 50배, 바람직하게는 15 내지 25배, 예컨대 20배 농축될 수 있다. 취급의 용이성을 위해서는, 필터가 바람직하다. 한외여과/농축에는, 디프테리아 독소에 비해 더 작은, 바람직하게는 20% 더 작은 분자량 컷 오프를 가지는 필터, 바람직하게는 30 KDa의 필터 (즉, 30,000 달톤의 공칭 분자량을 가지는 필터)가 바람직하다. 그와 같은 필터에 적합한 물질에 대해서는 업계에 알려져 있는데, 혼합 셀룰로스, 폴리에테르 술폰 또는 PVDF와 같은 중합체 물질, 예를 들어 다당류 예컨대 셀룰로스 및 폴리술폰이 포함된다. 바람직한 물질은 더 낮은 디프테리아 독소 흡수 용량 또는 능력을 가지는 것들이다. 셀룰로스 필터, 예를 들어 재생 셀룰로스로 제조되는 필터, 예컨대 YM 기재 필터, 및 단백질 결합 능력을 거의 가지지 않는 다른 막, 예를 들어 아미콘(Amicon) 사에 의해 제조되는 편평 판 접선 흐름 생물농축기가 특히 바람직하다.
음이온-교환 크로마토그래피는 단독으로, 또는 음이온-교환 치환기들의 조합으로 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 크로마토그래피를 위한 음이온성 지지체를 형성하기 위해, 다양한 음이온계 치환기들이 매트릭스에 부착될 수 있다. 음이온 교환 치환기에는 디에틸아미노에틸 (DEAE), 트리메틸아미노에틸 아크릴아미드 (TMAE), 4급 아미노에틸 (QAE) 및 4급 아민 (Q) 기가 포함된다. DE23, DE32, DE52, CM-23, CM-32 및 CM-52와 같은 셀룰로스계 이온 교환 수지가 영국 켄트 메이드스톤 소재 와트만 리미티드(Whatman Ltd.) 사로부터 구입가능하다. 세파덱스(Sephadex)-기재 및 가교-결합 이온 교환기 역시 알려져 있다. 예를 들어, DEAE- 및 QAE-세파덱스, 그리고 DEAE- 및 Q-세파로스(Sepharose)가 모두 뉴저지 피스카타웨이 소재 지이 헬스케어(GE Healthcare) 사로부터 구입가능하다.
통상적인 이온 교환 수지가 사용될 수 있다. 그 예에는 Q 세파로스 및 디에틸아미노에틸 (DEAE), 그리고 4급 아민 수지가 포함된다. 음이온-교환 물질은 칼럼에 충진될 수 있는데, 그 크기는 사용될 배양 상청액의 부피에 따라 달라지게 된다. 적절한 칼럼 크기는 농축된 매질 중 총 단백질에 따라 업계 숙련자에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로, 40-50 리터 수준의 대규모 발효의 경우에는, 약 1 L 부피의 칼럼에 적용될 수 있다. 칼럼은 먼저 완충제, 예를 들어 낮은 이온 강도의 완충제, 예컨대 약 5 내지 약 8, 바람직하게는 약 6.5 내지 약 9.0, 예를 들어 약 6.9 내지 7.6의 pH를 가지는 약 0.1 mM 내지 약 100 mM, 바람직하게는 약 10 내지 약 50 mM, 예컨대 10 mM 농도의 HEPES, 트리스, 트리신, MES, 비스-트리스, TES, MOPS, 무기 염 (예컨대 술페이트 또는 포스페이트), 예를 들자면 10 mM의 트리스, 20 mM의 KCl, pH 7.0과 같이 농축된 상청액을 정용여과하는 데에 사용되는 완충제를 사용하여 평형화될 수 있다. 다음에, 임의의 비결합 단백질을 세척 제거하기 위하여 낮은 이온 강도 및 평형화 완충제와 동일한 pH를 가지는 완충제, 예를 들어 평형화 완충제를 사용하여 세척된 칼럼에 발효 상청액 또는 농축물이 로딩될 수 있다.
사용되는 평형화 또는 세척 염은 예를 들어 이온-교환 크로마토그래피용 무기 염, 예컨대 리튬 클로라이드, 나트륨 클로라이드, 칼륨 클로라이드, 마그네슘 클로라이드, 칼슘 클로라이드, 바륨 클로라이드, 나트륨 아세테이트, 리튬 퍼클로레이트, 나트륨 술페이트, 마그네슘 술페이트, 칼륨 포스페이트 및 칼륨 술페이트, 또는 업계 숙련자에게 알려져 있는 기타 용리 염 중에서 선택될 수 있다.
혼합물은 디프테리아 독소가 칼럼에 고정되도록 하는 조건하에서 음이온-교환 크로마토그래피 칼럼에 적용될 수 있다. 어떠한 음이온-교환 물질도 사용될 수 있지만, 유리하게는 예를 들어 아미노에틸, 디에틸아미노에틸, 디메틸아미노에틸, 폴리에틸렌이민, 트리메틸아미노메틸, 트리메틸아미노히드록시프로필, 디에틸-(2-히드록시프로필)아미노에틸, 4급화 폴리에틸렌이민, 트리에틸아미노에틸, 트리메틸아미노에틸 및 3-트리메틸아미노-2-히드록시프로필로 구성되는 군에서 선택되는 관능기를 가지는 칼럼과 같은 시중에서 구입가능한 강하거나 약한 음이온-교환 크로마토그래피 칼럼이 사용된다. 이들 중, 4급 아민을 포함하는 관능기, 예를 들어 트리메틸아미노메틸, 트리메틸아미노히드록시프로필, 디에틸-(2-히드록시프로필)아미노에틸, 4급화 폴리에틸렌이민, 트리에틸아미노에틸, 트리메틸아미노에틸 및 3-트리메틸아미노-2-히드록시프로필을 가지는 강한 음이온-교환기가 바람직하다. 디프테리아 독소가 칼럼에 고정되는 조건은 과도한 실험 없이도 숙련자에 의해 용이하게 확인될 수 있다.
고정된 독소의 용리는 일반적으로 공지의 크로마토그래피 절차에 따라 용리 염 용액의 농도 구배를 사용하여 수행된다. 사용되는 용리 염은 예를 들어 이온-교환 크로마토그래피용 무기 용리 염, 예컨대 리튬 클로라이드, 나트륨 클로라이드, 칼륨 클로라이드, 마그네슘 클로라이드, 칼슘 클로라이드, 바륨 클로라이드, 나트륨 아세테이트, 리튬 퍼클로레이트, 나트륨 술페이트, 마그네슘 술페이트, 칼륨 포스페이트 및 칼륨 술페이트, 또는 업계 숙련자에게 알려져 있는 기타 용리 염 중에서 선택될 수 있다.
다음에, 결합된 독소는 다양한 방식으로 용리될 수 있다. 여기에는 pH를 변경하는 것, 또는 완충제의 이온 강도를 증가시키는 것이 포함된다. 따라서, 독소는 약 0.1 M 내지 1.0 M의 농도로 NaCl, KCl 또는 암모늄 술페이트와 같은 염을 함유하는 약 10 mM 내지 약 1.0 M, 바람직하게는 약 10 mM 내지 약 500 mM 농도의 HEPES, 트리스, 트리신, MES, 비스-트리스, TES, MOPS 또는 포스페이트와 같이 높은 이온 강도를 가지는 완충제의 구배 증가에 의해 용리될 수 있다. 이러한 완충제는 약 6.5 내지 약 8.5, 바람직하게는 약 6.5 내지 약 8, 예를 들어 약 6.9 내지 7.6의 pH를 가질 수 있다. 바람직한 완충제의 한 예는 pH 7.0의 100 mM의 KCl을 함유하는 10 mM 트리스, 1 mM 칼륨 포스페이트이다. 단백질은 완충제 중 KCl 약 60 내지 90 mM의 사이에서 용리되게 된다.
특정 실시양태에서, 혼합물은 음이온-교환 크로마토그래피 상에서의 1회 통과에 적용된다. 다른 실시양태에서, 혼합물은 음이온-교환 크로마토그래피 상에서의 1회를 초과하는 통과, 예컨대 2, 3 또는 4회 통과에 적용된다. 음이온-교환 크로마토그래피 상에서의 1회를 초과하는 통과가 수행되는 경우, 동일한 칼럼 또는 막, 또는 상이한 칼럼 또는 막에서 통과가 이루어질 수 있다.
칼럼 크로마토그래피
본 발명은 히드록시아파타이트 크로마토그래피 단계 및 다중모드 크로마토그래피 단계를 포함하는, 디프테리아 독소 (또는 그의 돌연변이 버젼) 생성 박테리아의 배양물로부터 디프테리아 독소 또는 그의 돌연변이 형태를 정제하는 방법을 제공한다. 어느 하나의 단계가 먼저 수행되고, 다른 단계가 이어질 수 있다.
크로마토그래피 단계들은 경우에 따라 배치 또는 칼럼 형태인 매트릭스를 사용하여 수행될 수 있는데, 속도 및 편의성 모두에 있어서 후자가 바람직하다. 매트릭스는 업계에 알려져 있는 바와 같은 통상적인 지지체, 예를 들어 셀룰로스, 폴리스티렌, 아크릴아미드, 실리카, 플루오로탄소, 가교-결합 덱스트란 또는 가교-결합 아가로스 기재의 불활성 지지체일 수 있다.
히드록시아파타이트
히드록시아파타이트 크로마토그래피는 매트릭스 및 리간드 모두를 형성하는 불용성의 히드록실화된 칼슘 포스페이트 [Ca10(PO4)6(OH)2 또는 Ca5(PO4)3(OH)2]를 이용하는 단백질 정제 방법이다. 관능기는 양으로 하전된 칼슘 이온의 쌍들 (C-부위) 및 음으로 하전된 포스페이트 기들의 단(cluster) (P-부위)으로 구성된다. 히드록시아파타이트와 단백질 사이의 상호작용은 복잡한 혼합-양식이다. 그러나, 한 상호작용 방법에서는, 단백질상의 양으로 하전된 아미노 기가 음으로 하전된 P-부위와 결합되며, 단백질 카르복실 기는 배위 착물화에 의해 C-부위와 상호작용한다. 문헌 [Shepard, 2000, J. of Chromatography 891:93-98]을 참조하라.
수많은 크로마토그래피 지지체들이 HA 칼럼의 제조에 사용될 수 있는데, 가장 광범위하게 사용되는 것은 유형 I 및 유형 II 히드록시아파타이트이다. 유형 I은 높은 단백질 결합 능력 및 산성 단백질에 대한 더 우수한 능력을 가진다. 그러나, 유형 II는 더 낮은 단백질 결합 능력을 가지기는 하지만, 더 우수한 핵산 및 특정 단백질의 해상도를 가지고 있다. 구체적인 히드록시아파타이트 유형의 선택은 숙련 기술자에 의해 결정될 수 있다.
다양한 히드록시아파타이트 크로마토그래피 수지들이 시중에서 구입가능한데, 어떠한 가용한 물질 형태도 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 히드록시아파타이트는 결정질 형태이다. 본 발명에서 사용하기 위한 히드록시아파타이트는 응집되어 입자를 형성하며 고온에서 안정한 다공성 세라믹 매스로 소결되는 것들일 수 있다.
히드록시아파타이트의 입자 크기는 광범위하게 달라질 수 있으나, 통상적인 입자 크기는 직경 1 ㎛ 내지 1,000 ㎛의 범위로써, 10 ㎛ 내지 100 ㎛일 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 상기 입자 크기는 20 ㎛이다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 상기 입자 크기는 40 ㎛이다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 상기 입자 크기는 80 ㎛이다.
본 발명은 흩어져 있거나 칼럼에 충진된 히드록시아파타이트 수지를 사용할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 세라믹 히드록시아파타이트 수지가 칼럼에 충진되어 있다. 칼럼 치수의 선택은 숙련 기술자에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 약 20 cm의 상 높이와 함께 0.5 cm 이상의 칼럼 직경이 소규모 정제에 사용될 수 있다. 본 발명의 추가적인 실시양태에서, 약 35 cm 내지 약 60 cm의 칼럼 직경이 사용될 수 있다. 본 발명의 또 다른 실시양태에서, 60 cm 내지 85 cm의 칼럼 직경이 사용될 수 있다.
완충제 조성 및 로딩 조건
히드록시아파타이트 수지를 혼합물과 접촉시키기 전에, pH, 이온 강도 및 온도와 같은 파라미터들을 조정하는 것, 및 일부 경우에서는 상이한 종류의 물질의 첨가가 필요할 수 있다. 예컨대 디프테리아 독소 혼합물의 정제에 필요한 특성들을 초래하는 용액 (예컨대 pH, 이온 강도 등을 조정하기 위한 것이거나 세제의 도입을 위한 완충제)을 사용하여 그것을 세척하는 것에 의해 히드록시아파타이트 매트릭스의 평형화를 수행하는 것이 필요할 수 있다.
결합/유통 조합 모드의 히드록시아파타이트 크로마토그래피에서, 히드록시아파타이트 매트릭스는 용액을 사용하여 평형화 및 세척됨으로써, 디프테리아 독소 조제물의 정제를 위한 필요한 특성들을 초래한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 매트릭스는 약염기성 내지 약산성 pH에서 0.01 내지 2.0 M 칼륨 클로라이드 또는 나트륨 클로라이드를 함유하는 용액을 사용하여 평형화될 수 있다. 평형화 완충제는 또한 0 내지 20 mM 칼륨 포스페이트 또는 나트륨 포스페이트를 함유할 수 있으며, 또 다른 실시양태에서 1 내지 10 mM 칼륨 포스페이트를 함유할 수 있고, 또 다른 실시양태에서 2 내지 5 mM 칼륨 포스페이트를 함유할 수 있으며, 또 다른 실시양태에서 0 mM 칼륨 포스페이트를 함유할 수 있고, 또 다른 실시양태에서 3 mM 칼륨 포스페이트를 함유할 수 있다. 평형화 완충제는 0.01 내지 2.0 M 칼륨 클로라이드 또는 나트륨 클로라이드를 함유할 수 있는데, 한 실시양태에서 0.025 내지 0.5 M 칼륨 클로라이드 또는 나트륨 클로라이드를, 또 다른 실시양태에서 0.05 M 칼륨 클로라이드 또는 나트륨 클로라이드를, 또 다른 실시양태에서 0.1 M 칼륨 클로라이드 또는 나트륨 클로라이드를 함유할 수 있다. 로딩 완충제의 pH는 6.5 내지 8.0의 범위일 수 있다. 한 실시양태에서, pH는 6.8 내지 7.6일 수 있으며, 또 다른 실시양태에서 pH가 7.0일 수 있다. 평형화 완충제는 비제한적으로 CaCl2, MgCl2, 술페이트, 아세테이트, 글리신, 아르기닌, 이미다졸, 숙시네이트 및 CaEDTA PO4를 포함한 다른 성분들을 함유할 수 있다. 구체적으로, 한 실시양태에서 0 내지 10 mM 칼슘 클로라이드를, 또 다른 실시양태에서 0 mM CaCl2를 함유할 수 있으며, 또 다른 실시양태에서 1 mM CaCl2를 함유할 수 있다. 평형화 완충제는 5 내지 200 mM MOPS를 함유할 수 있으며, 또 다른 실시양태에서 20 mM MOPS를 함유할 수 있고, 또 다른 실시양태에서 50 mM MOPS를 함유할 수 있다.
디프테리아 독소 혼합물은 결합/유통 모드 히드록시아파타이트 크로마토그래피용 조제물 중에서 적절한 완충제 또는 적제 완충제로 완충제 교환되거나 희석될 수도 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 디프테리아 독소 조제물은 약산성 내지 약염기성 pH에서 0.01 내지 2.5 M 칼륨 클로라이드 또는 나트륨 클로라이드를 함유하는 로딩 완충제로 완충제 교환될 수 있다. 상기 로딩 완충제는 추가로 1 내지 10 mM 칼륨 포스페이트 또는 나트륨 포스페이트를 함유할 수 있으며, 또 다른 실시양태에서 2 내지 8 mM 칼륨 포스페이트 또는 나트륨 포스페이트를 함유할 수 있고, 또 다른 실시양태에서 3 내지 7 mM 칼륨 포스페이트 또는 나트륨 포스페이트를 함유할 수 있으며, 또 다른 실시양태에서 5 mM 칼륨 포스페이트 또는 나트륨 포스페이트를 함유할 수 있다. 로딩 완충제는 0.2 내지 2.5 M NaCl을 함유할 수 있는데, 한 실시양태에서 0.2 내지 1.5 M NaCl을, 또 다른 실시양태에서 0.3 내지 1.0 M NaCl을, 또 다른 실시양태에서 110 mM NaCl을 함유할 수 있다. 로딩 완충제의 pH는 6.5 내지 8.0의 범위일 수 있다. 한 실시양태에서, pH는 6.5 내지 7.6일 수 있으며, 또 다른 실시양태에서 pH가 7.1일 수 있다.
결합 모드, 유통 모드 또는 이들의 조합 중 어느 하나에서의 히드록시아파타이트 수지에 대한 독소 혼합물의 접촉은 충진된 상 칼럼, 고체 상 매트릭스를 함유하는 유동화/팽창 상 칼럼에서, 및/또는 고체 상 매트릭스가 특정 시간 동안 용액과 혼합되는 단순 배치 작업으로 수행될 수 있다.
히드록시아파타이트 수지를 독소 혼합물과 접촉시킨 후에는, 세척 절차가 수행된다. 사용되는 세척 완충제는 히드록시아파타이트 수지의 특성, 사용되는 히드록시아파타이트 크로마토그래피의 모드에 따라 달라지게 되는데, 약염기성 내지 약산성 pH에서 0.01 내지 1 M 칼륨 클로라이드 또는 나트륨 클로라이드를 함유하는 용액을 사용하여 수지가 세척될 수 있다. 예를 들어, 세척 완충제는 0.1 내지 20 mM 칼륨 포스페이트 또는 나트륨 포스페이트를 함유할 수 있으며, 또 다른 실시양태에서 0.1 내지 10 mM 칼륨 포스페이트 또는 나트륨 포스페이트를 함유할 수 있고, 또 다른 실시양태에서 0.1 내지 5 mM 칼륨 포스페이트 또는 나트륨 포스페이트를 함유할 수 있으며, 또 다른 실시양태에서 0.5 mM 칼륨 포스페이트 또는 나트륨 포스페이트를 함유할 수 있고, 또 다른 실시양태에서 3 mM 칼륨 포스페이트 또는 나트륨 포스페이트를 함유할 수 있다. 세척 완충제는 0 내지 1 M 칼륨 클로라이드 또는 나트륨 클로라이드를 함유할 수 있는데, 한 실시양태에서 0.025 내지 0.5 M 칼륨 클로라이드 또는 나트륨 클로라이드를, 또 다른 실시양태에서 0.4 M 칼륨 클로라이드 또는 나트륨 클로라이드를, 또 다른 실시양태에서 0.06 M 칼륨 클로라이드 또는 나트륨 클로라이드를 함유할 수 있다. 세척 완충제의 pH는 6.5 내지 8.0의 범위일 수 있다. 한 실시양태에서, pH는 6.8 내지 7.6일 수 있으며, 또 다른 실시양태에서 pH가 7.2, 또 다른 실시양태에서 7.4일 수 있다. 세척 완충제는 비제한적으로 CaCl2, MgCl2, 술페이트, 아세테이트, 글리신, 아르기닌, 이미다졸, 숙시네이트 또는 CaEDTA PO4를 포함한 다른 성분들을 함유할 수 있다.
구체적으로, 그것은 한 실시양태에서 0 내지 10 mM 칼슘 클로라이드를, 또 다른 실시양태에서 0 mM CaCl2를 함유할 수 있으며, 또 다른 실시양태에서 1 mM CaCl2를 함유할 수 있다. 세척 완충제는 5 내지 200 mM MOPS를 함유할 수 있으며, 또 다른 실시양태에서 20 mM MOPS를 함유할 수 있고, 또 다른 실시양태에서 50 mM MOPS를 함유할 수 있다. 세척 완충제는 단계 또는 구배 모드로 적용될 수 있다.
결합 모드에서, 독소는 단일 또는 다중의 세척 절차 후 칼럼으로부터 용리될 수 있다. 용리는 i) 용리 완충제를 사용하는 단계 용리; ii) 용리 완충제를 사용한 구배 용리; iii) 용리 완충제를 사용한 단계 및 구배 모두; 또는 iv) 용리 완충제를 사용한 다중 구배 및 단계 용리에 의해 이루어진다. 한 실시양태에서, 칼럼으로부터의 디프테리아 독소의 용리를 위하여, 본 발명은 약염기성 내지 약산성 pH에서 0 내지 1 M 칼륨 클로라이드 또는 나트륨 클로라이드를 함유하는 높은 이온 강도의 포스페이트 완충제를 사용한다. 상기 용리 완충제는 추가로 20 내지 100 mM 칼륨 포스페이트 또는 나트륨 포스페이트를 함유할 수 있으며, 또 다른 실시양태에서 20 내지 80 mM 칼륨 포스페이트 또는 나트륨 포스페이트를 함유할 수 있고, 또 다른 실시양태에서 30 내지 60 mM 칼륨 포스페이트 또는 나트륨 포스페이트를 함유할 수 있으며, 또 다른 실시양태에서 40 mM 칼륨 포스페이트 또는 나트륨 포스페이트를 함유할 수 있고, 또 다른 실시양태에서 50 mM 칼륨 포스페이트 또는 나트륨 포스페이트를 함유할 수 있다. 용리 완충제는 0 내지 1 M 칼륨 클로라이드 또는 나트륨 클로라이드를 함유할 수 있는데, 한 실시양태에서 0.025 내지 0.5 M 칼륨 클로라이드 또는 나트륨 클로라이드를, 또 다른 실시양태에서 0.5 M 칼륨 클로라이드 또는 나트륨 클로라이드를, 또 다른 실시양태에서 0.06 M 칼륨 클로라이드 또는 나트륨 클로라이드를 함유할 수 있다. 용리 완충제의 pH는 6.5 내지 8.0의 범위일 수 있다. 한 실시양태에서, pH는 6.8 내지 7.6일 수 있으며, 또 다른 실시양태에서 pH가 7.2, 또 다른 실시양태에서 7.0일 수 있다. 용리 완충제는 비제한적으로 CaCl2, MgCl2, 아세테이트, 글리신, 아르기닌, 이미다졸, 숙시네이트 또는 CaEDTA PO4를 포함한 다른 성분들을 함유할 수 있다. 구체적으로, 그것은 한 실시양태에서 0 내지 1 M 마그네슘 클로라이드, 칼슘 클로라이드, 나트륨 술페이트 또는 암모늄 술페이트를, 또 다른 실시양태에서 0 mM CaCl2를 함유할 수 있으며, 또 다른 실시양태에서 1 mM CaCl2를 함유할 수 있고, 또 다른 실시양태에서 1 M MgCl2를 함유할 수 있다. 용리 완충제는 5 내지 200 mM MOPS를 함유할 수 있으며, 또 다른 실시양태에서 20 mM MOPS를 함유할 수 있고, 또 다른 실시양태에서 50 mM MOPS를 함유할 수 있다. 용리 완충제는 연속 또는 단계적 구배로 칼럼으로부터 독소를 용리하도록 변경될 수 있다.
유통 모드 및 결합/유통 조합 모드에서, 칼럼의 세척 후 수득되는 정제된 디프테리아 독소는 다른 정제된 디프테리아 독소 분획들과 합쳐질 수 있다.
특정 실시양태에서, 용리는 i) ≥ 약 30 mM 칼륨 클로라이드 또는 나트륨 클로라이드 또는 약 ≥ 15 mM 칼륨 포스페이트 또는 나트륨 포스페이트를 포함하는 용리 완충제를 사용하는 단계 용리; ii) 약 10 내지 약 25 mM 칼륨 포스페이트 또는 나트륨 포스페이트 또는 약 100 mM 내지 2 M 칼륨 클로라이드 또는 나트륨 클로라이드를 포함하는 구배 용리; 또는 iii) ≥ 0.3 pH 단위의 pH 변화에 의해 이루어진다.
사용 후, 히드록시아파타이트 칼럼은 임의로 세척되고, 위생처리된 후, 적절한 작용제 중에서 저장될 수 있으며, 임의로 재-사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 히드록시아파타이트는 업계에 알려져 있는 수많은 형태들 중 하나의 것일 수 있다. 히드록시아파타이트는 결정, 겔 또는 수지의 형태일 수 있다. 정상적인 결정질 형태는 다르게는 그것을 세라믹 형태 (바이오-래드(Bio-Rad) 사)로 변형시키기 위하여 고온에서 소결될 수 있다. 바람직하게는, 히드록시아파타이트는 겔의 형태이다. 바람직하게는, 겔은 통상적으로 크로마토그래피 정제에서 사용되는 바와 같이 칼럼에 충진된다.
히드록시아파타이트가 미립자 형태인 경우, 바람직하게는 미립자는 20 ㎛ 이상, 바람직하게는 40 ㎛ 이상, 바람직하게는 80 ㎛ 이상의 직경을 가진다.
결정질 히드록시아파타이트는 크로마토그래피에 사용된 히드록시아파타이트의 최초 유형이었으나, 그것은 구조적 어려움에 의해 제한되었다. 제한된 유량과 같이 결정질 히드록시아파타이트와 연관된 일부 어려움을 극복하기 위하여, 세라믹 히드록시아파타이트 (cHA) 크로마토그래피가 개발되었다. 세라믹 히드록시아파타이트는 고도의 내구성, 우수한 단백질 결합 능력을 가지며, 결정질 히드록시아파타이트에 비해 더 높은 유량 및 압력에서 사용될 수 있다. 문헌 [Vola et al ., BioTechniques 14:650-655 (1993)]을 참조하라.
히드록시아파타이트는 단백질, 핵산은 물론 항체의 크로마토그래피 분리에 사용되어 왔다. 히드록시아파타이트 크로마토그래피에서는, 보통 칼럼이 평형화되고, 저농도의 포스페이트 완충제 중에서 샘플이 적용된 다음, 포스페이트 완충제의 농도 구배에서 흡착된 단백질이 용리된다. 문헌 [Giovannini, 2000, Biotechnology and Bioengineering 73:522-529]을 참조하라. 때로는, 나트륨 포스페이트의 얕은 구배가 단백질을 용리하는 데에 성공적으로 사용되기는 하지만, 다른 경우에는 나트륨 포스페이트 400 mM까지의 농도 구배가 성공적으로 사용되고 있다. 예를 들어 문헌 [Stanker, 1985, J. Immunological Methods 76:157-169] (10 mM 내지 30 mM 나트륨 포스페이트 용리 구배); [Shepard, 2000, J. Chromatography 891:93-98] (10 mM 내지 74 mM 나트륨 포스페이트 용리 구배); [Tarditi, 1992, J. Chromatography 599:13-20] (10 mM 내지 350 mM 나트륨 포스페이트 용리 구배)을 참조하라.
다중모드 크로마토그래피 지지체
다중모드 크로마토그래피는 단백질 또는 다른 용질을 흡착하는 다중의 화학적 메카니즘을 사용하는 고체 상 크로마토그래피 지지체의 사용을 수반한다. 때로는 또한 혼합 모드 크로마토그래피를 사용하여 그와 같은 크로마토그래피를 기술하는데, 본원에서 이들 용어는 호환가능하게 사용된다. 다중모드 크로마토그래피 지지체의 예에는 하기 메카니즘들 중 2종 이상의 조합을 이용하는 크로마토그래피 지지체가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다: 음이온-교환, 양이온 교환, 소수성 상호작용, 친수성 상호작용, 수소 결합, 파이-파이 결합 및 금속 친화성. 그와 같은 다중모드 이온 교환 흡착제 2종이 지이 헬스케어 사로부터 시중에서 구입가능한데, 캅토 아드히어™ 및 캅토-MMC™ 매질이다. 이들은 강한 음이온 (예컨대 아미노 기) 및 약한 양이온 교환 기를 각각 소수성의 방향족 기와 조합한다.
다중모드 크로마토그래피 지지체는 이온 교환과 같은 단일 모드 크로마토그래피법에 의해서는 재현될 수 없는 독특한 선택성을 제공한다. 친화성 기반의 방법과 비교할 때, 다중모드 크로마토그래피는 잠재적인 비용 절감, 더 긴 칼럼 수명, 및 작업 유연성을 제공한다. 그러나, 다중모드 크로마토그래피 프로토콜의 개발은 공정 개발에 있어서 무거운 짐을 부과할 수 있는데, 그의 전체 잠재력을 달성하는 데에 다중-파라미터의 스크리닝이 요구되기 때문이다. 방법 개발은 복잡하고, 예상불가능하며, 크로마토그래피 메카니즘의 복잡성으로 인하여 적정한 회수율을 달성하는 데에 광범위한 수단들이 요구될 수 있다.
다중모드 크로마토그래피는 실질적으로 2종 이상 화학적 메카니즘의 조합을 수반하는 크로마토그래피를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 상기 조합은 단일 모드 지지체에 의해서는 달성될 수 없는 독특한 선택성을 초래한다. 특정 실시양태에서, 다중모드 수지는 음으로 하전된 부분 및 소수성 부분을 포함한다. 한 실시양태에서, 음으로 하전된 부분은 양이온 교환을 위한 음이온성 카르복실레이트 기 또는 음이온성 술포 기이다. 그와 같은 지지체의 예에는 캅토-MMC™ (지이 헬스케어 사)가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 표 1을 참조하라.
다양한 다른 다중모드 크로마토그래피 매질들이 시중에서 구입가능하다. 음으로 하전된 부분 및 소수성 부분을 포함하지 않는 다중모드 수지는 캅토-MMC™와 유사하게 거동할 것으로 예상되지 않지만, 본원에서 기술되는 방법을 사용하는 다른 다중모드 수지를 위하여 최적의 조건이 결정될 수 있다. 시중에서 구입가능한 예에는 세라믹 히드록시아파타이트 (CHT) 또는 세라믹 플루오르아파타이트 (CFT), MEP-하이퍼셀(Hypercel)™, 캅토-아드히어™, 베이커본드(Bakerbond)™ 카르복시-술폰™ 및 베이커본드™ ABx™ (뉴저지 필립스버그 소재 어드밴터 퍼포먼스 머티어리얼즈 인크.(Advantor Performance Materials Inc.) 사)가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 표 1을 참조하라.
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크로마토그래피 지지체는 충진 상 칼럼, 유동화/팽창 상 칼럼, 및/또는 다중모드 지지체가 특정 시간 동안 디프테리아 독소 혼합물과 혼합되는 배치 작업으로 실행될 수 있다. 고체 상 크로마토그래피 지지체는 다공성 입자, 비다공성 입자, 막 또는 모노리스(monolith)일 수 있다. "고체 상"이라는 용어는 하나 이상의 리간드가 부착될 수 있는 임의의 비-수성 매트릭스를 의미하는 데에 사용되거나, 또는 다르게는 크기 배제 크로마토그래피의 경우 그것은 수지의 겔 구조를 지칭할 수 있다. 고체 상은 이와 같은 방식으로 리간드를 부착시킬 수 있는 임의의 매트릭스, 예컨대 정제 칼럼, 별개 입자들의 불연속 상, 막, 필터, 겔 등일 수 있다. 고체 상을 형성시키는 데에 사용될 수 있는 물질의 예에는 다당류 (예컨대 아가로스 및 셀룰로스) 및 기타 기계적으로 안정한 매트릭스 예컨대 실리카 (예컨대 조절된 세공의 유리), 폴리(스티렌디비닐)벤젠, 폴리아크릴아미드, 세라믹 입자 및 이들 중 어느 것의 유도체가 포함된다.
일부 실시양태에서, 다중모드 지지체는 5 mm 이상의 내부 직경 및 25 mm 이상의 높이를 가지는 칼럼, 예컨대 액체 조작 로봇에 도입되어 있는 것들에 충진된다. 그와 같은 실시양태는 예를 들어 다양한 조건들의 효과를 평가하는 데에 유용하다.
또 다른 실시양태는 정제 적용을 지지하는 데에 필요한 임의의 치수를 가지는 칼럼에 충진된 다중모드 지지체를 사용한다. 구체적인 적용분야의 요건에 따라, 칼럼 직경은 1 cm 미만에서 1 미터 초과까지의 범위일 수 있으며, 칼럼 높이는 1 cm 미만에서 50 cm 초과까지의 범위일 수 있다. 상업용 규모의 적용분야는 통상적으로 20 cm 이상의 칼럼 직경 (ID) 및 25 cm 이상의 높이를 가지게 된다.
적절한 칼럼 치수는 숙련 기술자에 의해 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 다중모드 수지는 칼럼 내에 존재한다. 칼럼은 저압 (≤ 3 bar의 배압)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 칼럼에는 약 > 30 ㎛, 예를 들어 약 30 내지 약 100 ㎛의 입자 직경을 가지는 매질이 충진된다. 일부 실시양태에서, 칼럼은 약 100 내지 약 4000 옹스트롬, 예를 들어 약 150 내지 약 300 옹스트롬의 세공 크기를 가진다. 일부 실시양태에서, 칼럼의 길이는 약 10 내지 약 50 cm, 예를 들어 약 25 내지 약 35 cm이다. 바람직하게는, 칼럼은 정제용 규모 및/또는 정제용 로딩량을 의미하는 정제용 칼럼이다. 정제용-규모의 칼럼은 약 15 cm, 약 60 cm 이상까지를 포함하여, 통상적으로 약 1 cm 이상, 예를 들어 약 6 cm 이상의 직경을 가진다. 칼럼의 매질은 중합체-기재 매질, 실리카-기재 매질 또는 메타크릴레이트 매질을 포함한, 임의의 적합한 물질일 수 있다. 한 실시양태에서, 매질은 아가로스-기재이다.
칼럼은 분석용 또는 정제용 칼럼일 수 있다. 칼럼에 로딩되는 디프테리아 독소의 양은 일반적으로 약 0.01 내지 약 40 g 디프테리아 독소/ℓ 베드 부피, 예를 들어 약 0.02 내지 약 30 g 디프테리아 독소/ℓ 베드 부피, 약 1 내지 약 15 g 디프테리아 독소/ℓ 베드 부피, 또는 약 3 내지 약 10 g 디프테리아 독소/ℓ 베드 부피이다. 정제용-로딩 칼럼은 적어도 약 0.1 g 디프테리아 독소/ℓ 베드 부피, 예를 들어 적어도 약 1 g 디프테리아 독소/ℓ의 분자 로딩량을 가진다.
유량은 일반적으로 칼럼 형상구조에 따라 약 50 내지 약 600 cm/시간, 또는 약 4 내지 약 20 칼럼 부피 (CV)/시간이다. 적절한 유량은 숙련 기술자에 의해 결정될 수 있다.
온도는 약 2 내지 약 30℃의 범위, 예컨대 실온일 수 있다.
일부 실시양태에서, 디프테리아 독소 조제물을 다중모드 지지체와 접촉시키기 위한 준비로, 칼럼 내부의 화학적 환경이 평형화된다. 이는 통상적으로 로딩 완충제 조건과 등가이거나 유사한 평형화 완충제, 예컨대 나트륨 클로라이드 또는 칼륨 클로라이드와 같은 무기 염이 있거나 없는 트리스, MES, MOPS, HEPES, 칼륨 포스페이트 또는 나트륨 포스페이트 완충제 용액을 칼럼으로 유통시킴으로써 적절한 pH; 전도성; 및 기타 적절한 변수를 확립시키는 것에 의해 실행된다. 평형화 완충제는 ≤ 30 mS/cm의 전도성을 가지는 등장성이며, 통상적으로 약 6.5 내지 약 8 범위의 pH를 가진다. 평형화 완충제는 다르게는 ≥ 30 mS/cm의 전도성을 가지며, 그의 다중모드 구조로 인하여 통상적으로 약 6.2 내지 7.8 범위의 pH를 가질 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서, 매트릭스는 약염기성 내지 약산성인 pH에서 0.01 내지 0.5 M 칼륨 클로라이드 또는 나트륨 클로라이드를 함유하는 용액을 사용하여 평형화될 수 있다. 상기 평형화 완충제는 또한 0 내지 100 mM 칼륨 포스페이트 또는 나트륨 포스페이트를 함유할 수 있으며, 또 다른 실시양태에서 10 내지 25 mM 칼륨 포스페이트 또는 나트륨 포스페이트를 함유할 수 있고, 또 다른 실시양태에서 10 mM 칼륨 포스페이트 또는 나트륨 포스페이트를 함유할 수 있으며, 또 다른 실시양태에서 20 mM 칼륨 포스페이트 또는 나트륨 포스페이트를 함유할 수 있고, 또 다른 실시양태에서 25 mM 칼륨 포스페이트 또는 나트륨 포스페이트를 함유할 수 있다. 평형화 완충제는 0.01 내지 0.5 M 칼륨 클로라이드 또는 나트륨 클로라이드를 함유할 수 있는데, 한 실시양태에서 0.025 내지 0.2 M 칼륨 클로라이드 또는 나트륨 클로라이드를, 또 다른 실시양태에서 0.05 M 칼륨 클로라이드 또는 나트륨 클로라이드를, 또 다른 실시양태에서 0.1 M 칼륨 클로라이드 또는 나트륨 클로라이드를 함유할 수 있다. 로딩 완충제의 pH는 6.5 내지 8.0의 범위일 수 있다. 한 실시양태에서, pH는 6.8 내지 7.3일 수 있으며, 또 다른 실시양태에서 pH가 7.0일 수 있다. 평형화 완충제는 다른 성분, 예컨대 비제한적으로 AEBSF, 류펩틴, EDTA, 아프로티닌, 펩스타틴, PMSF, 키모스타틴, 2-메르캅토에탄올, 벤즈아미딘, EGTA, 나트륨 비술파이트, 에틸렌디아민테트라아세트산, 프로테아제 억제제 칵테일 (예컨대 시그마패스트(SigmaFAST)™) 및 락타시스틴을 포함한 프로테아제 억제제 또는 칵테일을 함유할 수 있다. 평형화 완충제는 5 내지 200 mM MOPS를 함유할 수 있으며, 또 다른 실시양태에서 20 mM MOPS를 함유할 수 있고, 또 다른 실시양태에서 50 mM MOPS를 함유할 수 있다.
디프테리아 독소 혼합물은 또한 다중모드 크로마토그래피를 위한 준비에서 적절한 완충제 또는 로딩 완충제로 완충제 교환되거나 희석될 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 디프테리아 독소 조제물은 약산성 내지 약염기성인 pH에서 0.01 내지 0.5 M 칼륨 클로라이드 또는 나트륨 클로라이드를 함유하는 로딩 완충제로 완충제 교환될 수 있다. 상기 로딩 완충제는 추가로 0 내지 100 mM 칼륨 포스테이트 또는 나트륨 포스페이트를 함유할 수 있으며, 또 다른 실시양태에서 10 내지 25 mM 칼륨 포스테이트 또는 나트륨 포스페이트를 함유할 수 있고, 또 다른 실시양태에서 10 mM 칼륨 포스테이트 또는 나트륨 포스페이트를 함유할 수 있으며, 또 다른 실시양태에서 25 mM 칼륨 포스테이트 또는 나트륨 포스페이트를 함유할 수 있다. 로딩 완충제는 0.01 내지 0.5 M 칼륨 클로라이드 또는 나트륨 클로라이드를 함유할 수 있는데, 한 실시양태에서 0.025 내지 0.2 M 칼륨 클로라이드 또는 나트륨 클로라이드를, 또 다른 실시양태에서 0.05 M 칼륨 클로라이드 또는 나트륨 클로라이드를, 또 다른 실시양태에서 0.1 M 칼륨 클로라이드 또는 나트륨 클로라이드를 함유할 수 있다. 로딩 완충제의 pH는 6.5 내지 8.0의 범위일 수 있다. 한 실시양태에서, pH는 6.8 내지 7.3일 수 있으며, 또 다른 실시양태에서 pH가 7.2일 수 있다. 로딩 완충제는 다른 성분, 예컨대 비제한적으로 AEBSF, 류펩틴, EDTA, 아프로티닌, 펩스타틴, PMSF, 키모스타틴, 2-메르캅토에탄올, 벤즈아미딘, EGTA, 나트륨 비술파이트, 에틸렌디아민테트라아세트산, 프로테아제 억제제 칵테일 (예컨대 시그마패스트™) 및 락타시스틴을 포함한 프로테아제 억제제 또는 칵테일을 함유할 수 있다. 로딩 완충제는 5 내지 200 mM MOPS를 함유할 수 있으며, 또 다른 실시양태에서 20 mM MOPS를 함유할 수 있고, 또 다른 실시양태에서 50 mM MOPS를 함유할 수 있다.
용리 완충제는 혼합 모드 수지로부터 독소를 용리하는 데에 사용된다. 적합한 용리 완충제에는 pH 7 내지 9로 완충된 약 0.005 내지 약 1 M 나트륨 클로라이드, 칼륨 포스페이트, 나트륨 술페이트, 또는 암모늄 술페이트, 칼륨 클로라이드, 마그네슘 클로라이드, 칼슘 클로라이드, 리튬 술페이트, 리튬 클로라이드, 나트륨 아세테이트, 암모늄 클로라이드, 에탄올, 우레아 프로필렌 글리콜, 아르기닌, 구아니딘, 나트륨 시트레이트 또는 이들의 조합을 함유하는 HEPES, MOPS, 트리스, 포스페이트, BICINE 또는 트리에탄올아민이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 특정 실시양태에서, 용리 완충제는 0.1 M 이상의 칼륨 클로라이드 또는 나트륨 클로라이드를 함유한다. 디프테리아 독소는 용리의 염 농도보다 더 높거나 더 낮은 염 농도를 가지는 용리 완충제를 사용하는 단계 용리에 의해, 또는 용리의 염 농도를 하회 또는 상회하는 염 농도로 시작하는 임의의 구배를 사용한 구배 용리에 의해 용리될 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 용리는 i) ≥ 약 0.005 M 나트륨 클로라이드 또는 0 내지 0.1 mM 칼륨 클로라이드 내지 약 1 M 나트륨 클로라이드 또는 1 내지 약 0.1 M 나트륨 클로라이드 또는 약 0.5 내지 약 1.0 M 나트륨 술페이트를 함유하는 용리 완충제를 사용하는 단계 용리; 또는 ii) 약 0.1 내지 약 0.5 M 나트륨 클로라이드 또는 0.5 내지 약 0.1 M 나트륨 클로라이드의 구배 용리; 또는 iii) ≥ pH 7.5에서의 용리 완충제를 사용하는 단계 용리; 또는 iv) 약 pH 6.5 내지 약 9.0의 구배 용리에 의해 이루어진다. 어떠한 용리 방법들의 조합 또는 교란도 적용가능하다. 용리 완충제는 다른 성분, 예컨대 비제한적으로 AEBSF, 류펩틴, EDTA, 아프로티닌, 펩스타틴, PMSF, 키모스타틴, 2-메르캅토에탄올, 벤즈아미딘, EGTA, 나트륨 비술파이트, 에틸렌디아민테트라아세트산, 프로테아제 억제제 칵테일 (예컨대 시그마패스트™) 및 락타시스틴을 포함한 프로테아제 억제제 칵테일 또는 칵테일들을 함유할 수 있다. 단계 용리용 용리 완충제는 pH 8.5 ± 0.1로 완충된 약 0.1 내지 약 1.0 M NaCl, 예를 들어 0.1 ± 0.1 M NaCl 또는 KCl을 함유할 수 있다. 구배 용리용 용리 완충제는 예를 들어 비제한적으로 0 내지 약 ≥ 1.0 M, 0.1 내지 약 0.5 M NaCl을 포함하여, 약 0.1 내지 약 0.5 M NaCl 또는 0.5 M 내지 약 0.1 M의 KCl을 포괄하는 임의의 구배일 수 있다. 용리 완충액은 통상적으로 pH 7 내지 9로 완충된다. 용리는 통상적으로 약 5 내지 약 20 칼럼 부피에 걸쳐 이루어진다.
특정 실시양태에서, 용리는 i) pH 6.8 내지 9.5에서 ≥ 약 125 mM 칼륨 클로라이드 또는 나트륨 클로라이드를 포함하는 용리 완충제를 사용하는 단계 용리; ii) 약 0.2 내지 약 0.3 M 나트륨 클로라이드, 칼륨 클로라이드, 나트륨 술페이트, 암모늄 술페이트 또는 칼륨 클로라이드를 포함하는 구배 용리; iii) pH 6.5 내지 9.5 범위 내에서의 ≥ 0.5 pH 단위의 pH 변화; 또는 iv) 2 내지 30℃의 온도 내에서의 ≥ 1℃의 온도 변화에 의한다.
사용 후, 다중모드 칼럼은 임의로 세척되고, 위생처리된 후, 적절한 작용제 중에서 저장될 수 있으며, 임의로 재-사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 크로마토그래피 지지체는 임의로 로딩 후 세척된다. 칼럼은 1) 용리 전에 칼럼으로부터 비결합 로딩 샘플을 제거하기 위하여, 그리고 2) 약하게 결합된 불순물을 제거하기 위하여 세척될 수 있다. 예를 들어, 로딩이 pH 7에서 이루어지는 경우, NaCl 없이 pH 7.5에서의 세척이면, 생성물 용리를 위해 염 강도를 증가시키기 전에 일부 결합 불순물을 세척 제거할 수 있다. 세척 전략은 종종 공정 규모에서 구배 용리 대신 사용되는데, 그것이 실행하기가 간단하기 때문이다. 세척 완충제는 통상적으로 일차 양이온 및 이차 HIC 모드로 전개할 때 약 7.5 내지 약 8.0 사이의 pH 및 < 30 mS/cm의 전도성을 가지는 트리스, HEPES, MOPS, 포스페이트, BICINE 또는 트리에탄올아민을 함유한다.
다중모드 크로마토그래피는 바람직하게는 연마 단계로 사용됨으로써, 디프테리아 독소의 정제, 특히 숙주 세포 단백질, 응집물 및 생성물 단편의 감축, 감소 또는 제거를 위한 작용을 한다.
성분 또는 분획을 말할 때의 정제된다는 것은 그의 상대 농도 (성분 또는 분획의 중량을 혼합물 중 모든 성분 또는 분획의 중량으로 나눈 것)가 약 20% 이상 증가된다는 것을 나타낸다. 본원에서 사용될 때, 순도는 무손상 생성물을 참조하여 계산되는데, 즉 디프테리아 독소 단편은 불순물인 것으로 간주된다. 일련의 실시양태에서, 상대 농도는 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 75%, 약 100%, 약 150% 또는 약 200% 이상 증가된다. 성분 또는 분획은 또한 그로부터 그것이 정제되는 성분의 상대 농도 (그로부터 그것이 정제되는 성분 또는 분획의 중량을 혼합물 중 모든 성분 또는 분획의 중량으로 나눈 것)가 약 20%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 75%, 약 85%, 약 95%, 약 98% 또는 100% 이상 감소되는 경우에 정제된 것이라고 말할 수 있다. 또 다른 일련의 실시양태에서, 성분 또는 분획은 약 50%, 약 65%, 약 75%, 약 85%, 약 90%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 이상의 상대 농도로 정제된다.
본 발명의 방법을 사용하는 바람직한 실시양태에서, 숙주 세포 단백질 및 기타 단백질 불순물의 ≥ 90%, ≥ 95% 또는 ≥ 98%가 제거됨으로써, 디프테리아 독소 또는 그의 돌연변이 버젼의 수율이 ≥ 30%, ≥ 40%, 더욱 바람직하게는 ≥ 50%이다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포 DNA의 < 0.001%, < 0.0001%, < 0.00001%가 존재한다.
바람직한 실시양태에서, 디프테리아 독소 또는 그의 돌연변이 버젼은 겔 SDS 전기영동에 의해 평가하였을 때 ≥ 90%, ≥ 95%, ≥ 97% 또는 ≥ 99%의 순도까지 정제된다.
전기영동은 일반적으로 NuPAGE 또는 트리스-글리신 겔 시스템 예컨대 인비트로겐(Invitrogen) 사 (캘리포니아 칼스배드 소재)의 것에서 4-12%, 4-20%, 10% 또는 12% 겔과 같은 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 변성 및 환원 조건하에 수행된다. 겔은 적합한 염료, 예를 들어 인비트로겐 사의 시프로 루비(Sypro Ruby) 형광 단백질 염료 또는 심플리 블루 세이프(Simply Blue Safe) 염료를 사용하여 밤새 염색된 다음, 몰레큘라 다이내믹스 플루오로이매저(Molecular Dynamics fluoroimager) 595와 같은 레이저-유도 형광 스캐너를 사용하여 영상화된다.
본 발명에 따른 정제 방법은 수율의 희생 없이 높은 디프테리아 독소 순도 (즉 상당 수준의 오염 단백질 없음), 독소 안정성 및 낮은 비균질성을 초래한다. 따라서, 히드록시아파타이트 단계 후 이어서 다중모드 수지를 수행함으로써 대규모화시 98% 가량까지의 순도가 재현성 있게 달성될 수 있음이 발견되었다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 본 발명의 방법을 사용하여 정제되는 디프테리아 독소는 겔 전기영동에 의해 평가하였을 때 2℃ 및 -60℃에서 6개월 이상 동안, 또는 25℃에서 5일 이상 또는 3주 이상 동안 순도 목표를 유지한다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 비균질성은 ≤ 1%이다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 표준의 방법을 사용하여 검정하였을 때 내독소 농도는 < 20 EU/mg, < 10 EU/mg 또는 < 1 EU/mg이다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 응집은 HPSEC/UV에 의해 검정하였을 때 < 1%, < 0.5%, < 0.2% 또는 < 0.1%이다.
추가적인 단계
히드록시아파타이트 및 다중모드 크로마토그패피 후 수득되는 회수된 디프테리아 독소는 임의로 하기 중 하나 이상에 적용될 수 있다: 한외여과, 마이크로여과, 음이온-교환 막 크로마토그래피 및 절대 여과(absolute filtration). 본 발명의 한 측면에서, 회수된 디프테리아 독소는 한외여과, 음이온-교환 크로마토그래피 및 절대 여과에 적용된다.
특정 실시양태에서, 다중모드 수지로부터의 용리 후, 추가적인 정제 및 여과 단계가 이루어진다. 그와 같은 정제는 바람직하게는 잔류 숙주 세포 단백질, 핵산 및 내독소는 물론, 공정 부형제 예컨대 걸러진 다중모드 리간드를 제거하기 위한 하나 이상의 연마 크로마토그래피 단계 (예컨대 양이온 또는 음이온-교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 또는 히드록시아파타이트 크로마토그래피)를 수반한다. 여과 단계는 바람직하게는 저분자량 불순물 및 공정 부형제의 제거, 그리고 최종 생성물 배합 완충제로의 교환을 위한 한외여과를 수반한다. EDTA는 정제 공정에 포함되는 소형 분자이다. 임의의 미립자를 제거하고 생물존재량을 제어하기 위해서는 (필요할 경우) 멸균 여과가 이루어진다.
추가적인 임의 단계
용리된 단백질 조제물은 히드록시아파타이트 및 다중모드 크로마토그래피 단계 전 또는 후 중 어느 하나에 추가적인 정제 또는 여과 단계에 적용될 수 있다. 상기한 것들 이외의 대표적인 추가 정제 단계에는 투석; 친화성 크로마토그래피; 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC); 추가적인 다중모드 크로마토그래피; 암모늄 술페이트 침전; 양이온 교환 크로마토그래피; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카상 크로마토그래피; 크로마토포커싱(chromatofocusing); 및 겔 여과가 포함된다.
본 발명의 한 실시양태에서, 완전한 방법에는 숙주 세포의 회수 및 농축 후 이어지는 주변세포질로부터 CRM197을 방출시키기 위한 삼투 쇼크 및 이후의 세포 잔사의 응집이 포함된다. 다음에는, 2-단계 정화 모듈 (원심분리 + 심층 여과)이 세포 잔사를 제거한다. 다음에, 단백질 불순물, 잔류 매질 및 완충제 성분으로부터 CRM197을 포획하기 위하여 음이온-교환 크로마토그래피가 사용된다. 내독소 및 잔류 단백질의 추가적인 제거는 이후의 히드록시아파타이트 크로마토그래피 단계에 의해 달성된다. 한외여과가 사용됨으로써 배치를 농축하고, 100 mM 칼륨 포스페이트 pH 7.2로 교환된다. 유통 음이온-교환 막 크로마토그래피가 최종 연마 단계로서 사용되며, 생물존재량 감소 여과로써 방법이 종료된다.
히드록시아파타이트 후 이어지는 다중모드 크로마토그래피를 사용한 본 발명의 한 방법을 하기에 나타내었다.
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본 발명의 방법에 따라 수득된 디프테리아 독소 또는 그의 돌연변이 버젼은 업계 숙련자에게 잘 알려져 있는 방법을 사용하는 액체 제제에 사용될 수 있다.
본원에서 기술되는 구체적인 실시양태들은 단지 예로 제공되는 것으로써, 본 발명은 해당 청구범위에 속하는 전체 등가물 영역과 함께 첨부된 청구범위와 관련하여서만 제한될 수 있다. 전기한 상세한 설명 및 첨부된 도면으로부터, 업계 숙련자라면, 본원에서 나타내고 기술된 것들 이외에도 본 발명의 실로 다양한 변형들이 떠오르게 될 것이다. 그와 같은 변형들은 첨부된 청구범위의 영역에 속하는 것으로 하고자 한다.
실시예
정제 시약
암모늄 술페이트, 칼슘 클로라이드, 에덴테이트 디나트륨, 마그네슘염, 1염기성 칼륨 포스페이트, 칼륨 클로라이드, 수산화 칼륨, 나트륨 클로라이드, 수크로스, MOPS, 트리스, 수산화 나트륨 및 염산은 어드밴터 퍼포먼스 머티어리얼즈 사 (뉴저지 필립스버그 소재)로부터 입수하였다. 글리세롤, IPTG, 폴리에틸렌이민 및 2염기성 칼륨 포스페이트는 시그마-알드리치 컴퍼니(Sigma-Aldrich Co.) 사 (미주리 세인트루이스 소재)로부터 구매하였다. 히드록시아파타이트 크로마토그래피 매질은 바이오-래드 래보래토리즈 인크. 사 (캘리포니아 허큘리스 소재)로부터 입수하였다. 트리스 히드로클로라이드는 암레스코 인크.(Amresco Inc.) 사 (오하이오 솔론 소재)로부터 입수하였다. 캅토 Q, 캅토-MMC™ 및 캅토 아드히어 크로마토그래피 매질은 지이 헬스케어 사 (스웨덴 웁살라 소재)로부터 입수하였다.
발효
250-L 또는 1500-L 생물반응기에서, 대규모화하였다는 것 이외에는 업계 숙련자에게 잘-알려져 있는 방법 (예컨대 문헌 [H. Jin et al ., Soluble periplasmic production of human granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) in Pseudomonas fluorescens, Protein Expr. Purif. (2011), doi:10.1016/j.pep.2011.03.002]에 개시되어 있는 바와 같은 것)을 사용하여, 대략 200 L 또는 1300 L의 피. 플루오레센스 발효 브로스를 제조하였다. 1300 L 벌크 정제 공정은 일반적으로 ≥ 50 g/L의 농도로 ~9 L의 정제된 CRM197을 생성시킨다. 이는 ≥ 30%의 공정 회수율 또는 ≥ 0.3 g CRM197/L 발효의 생산성에 해당한다.
실시예 1: 히드록시아파타이트 크로마토그래피를 사용한 정제
히드록시아파타이트 크로마토그래피의 적합성을 시험하였다. 단백질 순도를 > 90%까지 증가시키고 내독소를 감소시키기 위하여, 히드록시아파타이트 크로마토그래피 전에 표준 음이온-교환 크로마토그래피 단계를 포함시켰다.
상기한 바와 같이 200 L의 발효 브로스를 제조하였다.
세포 회수 및 수확
연속 원심분리를 사용하여 피. 플루오레센스 세포의 회수 및 농축을 실행하였다. 200 L 발효 배치를 먼저 생물반응기에서 교반에 의해 < 8℃로 냉각시켰다. 웨스트팔리아(Westfalia) 원심분리기의 용기(bowl)를 냉각하면서 최대 속도로 하였다. 발효 브로스를 원심분리기에 공급하여 약 5 E-5 L/(분 m2)의 Q/Σ를 유지하였다. 단계를 전개하여 폐기 예정인 센트레이트(centrate)와 함께 세포 슬러리를 수확하였다.
온도는 수확 단계 전체에 걸쳐 용기 (< 8℃) 온도를 유지하도록 조절하였다. 각 배출 후, 수확된 세포 슬러리를 탱크로 옮겼다.
삼투 쇼크 및 응집
이 단계에서는, 삼투 쇼크에 의해 피. 플루오레센스 주변세포질로부터의 CRM197 단백질의 방출을 실행하고, 정화를 돕기 위하여 응집제를 첨가하였다. 수확된 세포 슬러리를 재현탁시키기 위하여 재현탁 완충제 (50% w/v 수크로스, 200 mM 트리스, 100 mM EDTA pH 7.5)를 첨가할 때에는 강력한 혼합이 생성되도록 교반을 설정하였다. 다음에, 빠르게 교반하면서 재현탁된 배치를 4× 부피의 삼투 쇼크 완충제 (50 mM 트리스 pH 7.5)에 첨가하는 것에 의해 재현탁된 세포에 삼투 쇼크를 가함으로써, CRM197 단백질을 방출시켰다. 교반을 감소시키면서, 0.2% w/v의 PEI 최종 농도를 달성하도록 폴리에틸이민 (PEI) 응집제 (10% w/v)를 첨가하였다.
정화 원심분리 및 심층 여과
원심분리 및 심층 여과에 의해 세포 잔사의 대량 제거를 실행하였다. 원심분리는 정화에서와 유사하게 전개하였으나, 센트레이트를 생성물로서 수집하였으며, 원심분리 완충제 (10 mM 트리스, pH 7.5)를 사용하여 폐기물로서 고체를 배출하였다. 동시에, 수집된 센트레이트를 큐노(Cuno) 120ZA08A 심층 필터로 이동 통과시킴으로써 탁도를 감소시켰다 (200 L/ft2 필터 면적).
음이온-교환
음이온-교환 크로마토그래피 (AEX)를 사용하여, 단백질 불순물, 내독소, 핵산 및 발효 불순물로부터의 CRM197의 일차 포획 단계를 수행하였다. AEX는 < 8℃에서 완충제를 사용하여 일정한 선형 속도 (287 cm/시간) 및 실온으로 수행하였다. 심층 필터 생성물을 크로마토그래피 스키드(skid)에서의 인-라인 희석을 사용하여 저온 공정수로 대략 3-배 희석함으로써, 희석된 공정 스트림 중에서의 2.5 mS/cm의 전도성을 달성하였다. 다음에, 희석된 공급 스트림을 20 mM KCl, 10 mM 트리스, 0.5 mM KPi (칼륨 포스페이트), pH 7.1을 사용하여 평형화된 AEX 칼럼 (캅토 Q, 지이 헬스케어 사)에 직접 로딩하였다. 10 mM 트리스, 20 mM KCl, 0.5 mM KPi, pH 7.1을 사용하여 기준선 흡광도가 수득될 때까지 칼럼을 세척하였다. 50 mM MOPS, 110 mM KCl, pH 7.0 완충제를 사용하여 110 mM KCl까지 한번에 생성물을 용리하였다. 단계 용리의 개시 후 0.5 CV에서 생성물 수집을 개시하고, 11.5 CV에서 종료하였다.
히드록시아파타이트 크로마토그래피
히드록시아파타이트 (HA) 크로마토그래피는 단백질 순도를 증가시키고 내독소 농도를 추가로 감소시키는 연마 단계이다. HA 공정은 일정한 유량 (10분 체류 시간)으로 전개하였으며, < 8℃인 칼럼 로딩을 제외하고는 실온에서 실행하였다. 110 mM KCl, 50 mM MOPS pH 7.0을 사용하여, CHT 세라믹 HA 유형 I (바이오래드 사), 40 ㎛ 수지가 충진된 HA 칼럼을 평형화하였다. 로딩량은 약 9 g 디프테리아 독소/L이었다. 하기 표 2에 기술되어 있는 바와 같이 칼럼을 세척하였다.
Figure pct00004
110 mM KCl, 30 mM KPi, 50 mM MOPS, pH 7.0까지의 10 CV 선형 구배 후 이어지는 5 CV의 유지로, CRM197을 칼럼으로부터 용리하였다. 15 CV, 20 CV에서, 또는 흡광도가 기준선에 도달할 때까지 생성물을 수집하였다.
본 실시예는 200-L 배양물/발효 공급물에 제한되지 않는 재현가능한 정제를 초래하였는데, 한외여과 전에 숙주 세포 단백질 및 숙주 세포 불순물 중 ≥ 90%가 제거되었으며, 디프테리아 독소의 공정 수율은 UV에서 ≥ 50% (배치 #1: 55% 및 배치 #2: 50%)이었다. 특정 실시양태에서, 디프테리아 독소는 겔 전기영동에 의해 평가하였을 때 ≥ 94%의 순도로 정제되었다.
결과는 도 1에 나타내었다. AEX 및 히드록시아파타이트 크로마토그래피 열(train)은 표준 및 친화성 크로마토그래피 생성 생성물 (프로메틱 라이프 사이언시즈 인크.(Prometic Life Sciences Inc.) 사 (퀘벡 라발 소재)로부터의 미메틱 블루(Mimetic blue) 수지)과 비교할 때 유사하거나 향상된 순도를 가지는 물질을 생성시킨다. 1× MES 전개 완충제와 함께 4-12% 비스-트리스 NuPAGE 겔을 사용하였다. ≥ 50 g/L 농도의 디프테리아 독소는 ≥ 25℃에서 ≥ 5일 동안 (촉진된 안정성 중 좋지 않은 경우) 순도 목표를 유지하였다. 정제된 디프테리아 독소는 통상적으로 -70℃에서 저장하였다.
실시예 2: 캅토 - MMC ™을 사용한 상업적 규모의 정제
세포 회수 및 수확
연속 원심분리를 사용하여 피. 플루오레센스 세포의 회수 및 농축을 실행하였다. 1300 L 발효 배치를 먼저 생물반응기에서 교반에 의해 < 8℃로 냉각시켰다. 웨스트팔리아 원심분리기의 용기를 냉각하면서 최대 속도로 하였다. 발효 브로스를 원심분리기에 공급하여 약 1.25 E-4 L/(분 m2)의 Q/Σ를 유지하였다. 단계를 전개하여 폐기 예정인 센트레이트와 함께 세포 슬러리를 수확하였다.
온도는 수확 단계 전체에 걸쳐 용기 (< 8℃) 온도를 유지하도록 조절하였다. 각 배출 후, 수확된 세포 슬러리를 탱크로 옮겼다.
삼투 쇼크 및 응집
이 단계에서는, 삼투 쇼크에 의해 피. 플루오레센스 주변세포질로부터의 CRM197 단백질의 방출을 실행하고, 정화를 돕기 위하여 응집제를 첨가하였다. 수확된 세포 슬러리를 현탁시키기 위하여 재현탁 완충제 (50% w/v 수크로스, 200 mM 트리스, 100 mM EDTA pH 7.5)를 첨가할 때에는 강력한 혼합이 생성되도록 교반을 설정하였다. 다음에, 빠르게 교반하면서 재현탁된 배치를 4× 부피의 삼투 쇼크 완충제 (50 mM 트리스 pH 7.5)에 첨가하는 것에 의해 재현탁된 세포에 삼투 쇼크를 가함으로써, CRM197 단백질을 방출시켰다. 교반을 감소시키면서, 0.2% w/v의 폴리에틸이민 (PEI) 최종 농도를 달성하도록 PEI 응집제 (10% w/v)를 첨가하였다.
정화 원심분리 및 심층 여과
원심분리 및 심층 여과에 의해 세포 잔사의 대량 제거를 실행하였다. 원심분리는 정화를 위한 세포 회수와 유사하게 전개하였으나, 센트레이트를 생성물로서 수집하였으며, 원심분리 완충제 (10 mM 트리스, pH 7.5)를 사용하여 폐기물로서 고체를 배출하였다. 동시에, 수집된 센트레이트를 6×1.84 m2 큐노 Z16E08AA120ZA08A 심층 필터 적층체 (병렬)로 이동 통과시켰다.
음이온-교환 크로마토그래피
음이온-교환 크로마토그래피 (AEX)를 사용하여, 단백질 불순물, 내독소, 핵산 및 발효 불순물로부터의 CRM197의 일차 포획 단계를 수행하였다. AEX는 < 8℃에서 완충제를 사용하여 일정한 선형 속도 (287 cm/시간) 및 실온으로 수행하였다. 심층 필터 생성물을 크로마토그래피 스키드에서의 인-라인 희석을 사용하여 저온 WFI로 대략 3-배 희석함으로써, 희석된 공정 스트림 중에서의 2.5 mS/cm의 전도성을 달성하였다. 다음에, 희석된 공급 스트림을 20 mM KCl, 10 mM 트리스, 0.5 mM KPi, pH 7.1을 사용하여 평형화된 AEX 칼럼 (캅토 Q, 지이 헬스케어 사)에 직접 로딩하였다. 10 mM 트리스, 20 mM KCl, 0.5 mM KPi, pH 7.1을 사용하여 기준선 흡광도가 수득될 때까지 칼럼을 세척하였다. 50 mM MOPS, 110 mM KCl, pH 7.0 완충제를 사용하여 110 mM KCl까지 한번에 생성물을 용리하였다. 단계 용리의 개시 후 1 CV에서 생성물 수집을 개시하고, 8 CV에서 종료하였다.
히드록시아파타이트 크로마토그래피
히드록시아파타이트 (HA) 크로마토그래피는 단백질 순도를 증가시키고 내독소 농도를 추가로 감소시키는 연마 단계이다. HA 공정은 일정한 유량 (10분 체류 시간)으로 전개하였으며, < 8℃인 칼럼 로딩을 제외하고는 실온에서 실행하였다. HA 칼럼은 CHT 세라믹 HA 유형 I (바이오래드 사), 40 ㎛ 수지로 충진하였으며, 55 mM KCl, 50 mM MOPS pH 7.0을 사용하여 평형화하였다. < 8℃에서 50 mM MOPS pH 7.0으로 2-배 배치 희석된 저온 AEX 생성물을 칼럼에 로딩하였다. 로딩량은 약 10 g 디프테리아 독소/L이었다. 칼럼을 평형화 완충제로 체이싱하고(chased), 8 CV의 55 mM KCl, 50 mM MOPS, 3 mM 칼륨 포스페이트 pH 7.2로 세척하였다. 주 생성물 피크는 8 CV의 구배 용리로 40 mM KPi, 50 mM MOPS, 55 mM KCl, pH 7.0까지 용리하였다. 용리 구배의 개시시에 HA 용출액을 수집하였다. 8 CV 동안 구배를 계속한 후, 6 CV의 50 mM MOPS, 55 mM KCl, 40 mM KPi, pH 7.0을 후속하였다. 피크 최대치의 10%에서 생성물 수집을 종료하였다.
다중모드 양이온 크로마토그래피
다중모드 양이온 크로마토그래피 (캅토-MMC™, 지이 헬스케어 사)는 단백질 순도를 증가시키고 응집물을 제거하는 연마 단계이다. 50 mM MOPS, 400 mM KCl, 25 mM KPi, 25 mM EDTA, pH 7.0을 사용하여, MMC 공급물을 먼저 0.25-배 희석하였다. MMC 공정은 일정한 유량 (10분의 체류 시간과 등가)으로 전개하였으며, 실온에서 실행하였다. 50 mM MOPS, 125 mM KCl, 25 mM KPi, 5 mM EDTA, pH 7.1을 사용하여 칼럼을 평형화하고, HA 생성물을 칼럼에 로딩하였다. 로딩량은 약 5 g 디프테리아 독소/L이었다. 다음에, 칼럼을 5 CV의 평형화 완충제로 세척하고, 50 mM 트리스, 200 mM KCl, 5 mM EDTA, pH 8.5까지의 2.5 CV의 단계 구배 후 이어지는 50 mM 트리스, 500 mM KCl, 5 mM EDTA, pH 8.5까지의 10 CV의 선형 구배 용리를 통하여 용리하였다. pH 단계 구배의 개시 후 즉시 용출액 수집을 개시하고, 수많은 칼럼 부피에 대하여 기준선 해상도가 달성되고난 후 종료하였다.
한외여과
CRM197 단백질을 농축하고, 한외여과에 의해 최종 제제 완충제로 정용여과하였다. 작업에는 10 kDa NMWC 재생 셀룰로스 막 (밀리포어(Millipore) 사, 매사추세츠 빌레리카 소재)을 사용하였는데, 일정한 유량을 사용하여 수행하였다. 전체 공정을 < 8℃에서 수행하였다. MMC 생성물을 먼저 약 5 내지 10 g CRM197/L (고정된 부피 기준)으로 농축한 후, 제제 완충제 (0.1 M KPi, pH 7.2)에 대비한 20 다이아볼륨(diavolume) (DV)의 정용여과가 이어졌다. 생성물을 ≥ 80 내지 100 g CRM197/L로 과-농축한 후, 정용여과 생성물 (DFP)을 위한 대략 ≥ 65 g CRM197/L의 목표 농도까지의 보유액 세정(retentate rinse)이 이어졌다.
예비여과 및 막 크로마토그래피
예비여과 (0.5/0.2 ㎛ PES 막, 밀리포어 코포레이션 사)에 의해 탁도 감소를 수행하고, 유통 모드에서 막 크로마토그래피 (Q 막, 사르토리우스(Sartorius) 사)에 의해 추가적인 내독소 제거를 제공하였다. 예비여과 및 막 크로마토그래피를 수행하기 전에, 농축된 한외여과 물질을 실온에서 평형화시켰다. 사전-위생처리되고 (0.5 N NaOH) 제제 완충제를 사용하여 평형화된 0.5/0.2 ㎛ PES 막 캡슐 및 사르토바인드(Sartobind) Q 막을 통하여, 농축된 생성물을 여과하였다. 막 크로마토그래피 생성물 (MCP)를 위한 대략 60 g/L의 목표 최종 농도까지 제제 완충제의 회수 플러시를 필터/막 설비로 통과시킨다.
생물존재량 감소 또는 멸균 여과
분배 전에, MCP를 제2의 0.5/0.2 ㎛ PES 막 캡슐로 통과시켰다. 무균으로 벌크를 분배하고, -70℃에서 냉동시켰다.
이와 같은 공정은 1 L, 15 L, 30 L, 250 L 및 1300 L 배양물/발효 공급물에 제한되지 않는 재현가능한 정제를 초래하였는데, 숙주 세포 단백질 및 숙주 세포 불순물 중 ≥ 95%이 제거되고, 디프테리아 독소의 수율이 UV로 ≥ 30%이었다. 특정 실시양태에서, 디프테리아 독소는 겔 전기영동에 의해 평가하였을 때 ≥ 98%인 무손상 생성물을 참조하여 계산된 순도까지 정제되었다. 디프테리아 독소는 농도가 약 ≥ 50 g/L 또는 ≥ 60 g/L이었으며, 겔 전기영동에 의해 평가하였을 때 < 8℃ 및 < -60℃에서 적어도 ≥ 6개월 동안, ≥ 25℃ (촉진된 안정성 중 좋지 않은 경우)에서 ≥ 3 주 동안 순도 목표를 유지하였다.
제조 규모에서의 평균 내독소는 키네틱(Kinetic)-QCL 발색성 검정 키트에 의해 측정하였을 때 ≤ 1 EU/mg이었으며, 응집은 HPSEC (분석용 고성능 크기 배제 크로마토그래피)/UV에서 ≤ 0.1%이었다. 비균질성은 검출되지 않거나 ≤ 1%이었는데, 그 예는 검출불가능한 p37 및 p25 CRM197 단편으로써, 크로마토그래피 수지에 의한 제거를 나타내었다.
결과를 표 3, 도 2 및 도 3에 나타내었다. AEX, 히드록시아파타이트 및 캅토-MMC™ 크로마토그래피 열은 AEX 및 히드록시아파타이트 및 친화성 크로마토그래피 생성 생성물 (프로메틱 라이프 사이언시즈 사 (퀘벡 라발 소재)로부터의 미메틱 블루 수지)에 비해 개선된 순도 (% 무손상 단량체 및 숙주 세포 불순물), 비균질성 및 안정성을 가지는 디프테리아 독소를 생성시켰다. 1× MES 전개 완충제와 함께 4-12% 비스-트리스 NuPAGE 겔을 사용하였다. 데이터 점 및 오차 막대들은 3-5 반복에 대한 평균 및 표준 편차를 나타낸다.
Figure pct00005
실시예 3: 다중모드 수지들의 비교
히드록시아파타이트 생성물의 배치를 분할하여, 캅토 아드히어 및 캅토-MMC™ 양자상에서 전개함으로써, 2종 수지들 사이의 평가를 수행하였다.
캅토 아드히어 공정을 위한 공정 단계는 표 4에 요약하였다. 8분의 체류 시간을 가지는 370 mL 칼럼을 사용하였다. 이 배치에 있어서, 로딩량은 ~8 mg 디프테리아 독소/mL이었다. 로딩 전에 히드록시아파타이트 생성물을 냉장시켰다는 사실 이외에는, 모든 단계를 실온에서 수행하였다. 사용된 평형화 완충제는 히드록시아파타이트 용리 완충제와 어울리도록 선택하였다.
Figure pct00006
크로마토그래피 생성물에 대한 순도 결과는 도 4에 나타내었다. 나타낸 바와 같이, 순도는 아드히어 생성물에 비해 MMC 생성물에서 약간 더 높았다. 2종 칼럼에 있어서의 크로마토그래피 단계 수율은 캅토 아드히어가 107%, 캅토-MMC™가 56%이었다. 수율을 계산하기 위하여 사용된 농축은 모세관 등전 집속(Capillary Isoelectric Focusing) (다중모드 공급물) 및 UV (아드히어/MMC 생성물)에 의하였다. 비교로써, 적어도 이와 같은 배치에서 사용되는 처리 전략에 있어서는, MMC와 아드히어 사이의 선택이 수율 대 순도로 귀착된다는 것이 분명해졌다. 1× MES 전개 완충제와 함께 4-12% 비스-트리스 NuPAGE 겔을 사용하였다.

Claims (28)

  1. a) 디프테리아 독소 또는 그의 돌연변이 형태를 함유하는 혼합물을, 디프테리아 독소 또는 그의 돌연변이 형태가 제1 분리제에 결합하도록 하는 조건하에서 제1 분리제와 접촉시키는 단계;
    b) 제1 분리제로부터 디프테리아 독소 또는 그의 돌연변이 형태를 용리하는 단계;
    c) 단계 a)로부터 수득된 용리 물질을, 디프테리아 독소 또는 그의 돌연변이 형태가 제2 분리제에 결합하도록 하는 조건하에서 제2 분리제와 접촉시키는 단계; 및
    d) 제2 분리제로부터 상기 디프테리아 독소 또는 그의 돌연변이 형태를 용리하는 단계
    를 포함하며, 여기서 1) 제1 분리제는 히드록시아파타이트이고 제2 분리제는 다중모드 수지이거나, 또는 2) 제1 분리제는 다중모드 수지이고 제2 분리제는 히드록시아파타이트이고, 제1 분리제 또는 제2 분리제가 히드록시아파타이트인 경우, 히드록시아파타이트로부터의 용리 전에, 히드록시아파타이트를 불순물이 제거되도록 하는 조건하에서 세척 단계에 적용하는 것인,
    디프테리아 독소 또는 그의 돌연변이 형태를 함유하는 혼합물로부터 디프테리아 독소 또는 그의 돌연변이 형태를 정제하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 세척이 pH 6.5 내지 8.0의 0.01 내지 1.0 M 칼륨 클로라이드 또는 나트륨 클로라이드를 포함하는 세척 용액을 사용하는 것인 방법.
  3. 제2항에 있어서, 세척 완충제가 0.1 내지 20 mM 칼륨 포스페이트 또는 나트륨 포스페이트를 추가로 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 히드록시아파타이트로부터의 용리가
    a) ≥ 약 30 mM 칼륨 클로라이드 또는 나트륨 클로라이드 또는 약 ≥ 15 mM 칼륨 포스페이트 또는 나트륨 포스페이트를 포함하는 용리 완충제를 사용하는 단계 용리;
    b) 약 10 내지 약 25 mM 칼륨 포스페이트 또는 나트륨 포스페이트 또는 약 100 mM 내지 2 M 칼륨 클로라이드 또는 나트륨 클로라이드를 포함하는 구배 용리; 또는
    c) ≥ 0.3 pH 단위의 pH 변화
    를 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 다중모드 수지와 접촉되는 혼합물 또는 용리 물질이 트리스, MES, MOPS, HEPES, 포스페이트, 아세테이트, 클로라이드 또는 술페이트를 포함하는 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 다중모드 수지로부터의 용리가
    a) pH 6.8 내지 9.5의 ≥ 약 125 mM 칼륨 클로라이드 또는 나트륨 클로라이드를 포함하는 용리 완충제를 사용하는 단계 용리;
    b) 약 0.2 내지 약 0.3 M 나트륨 클로라이드, 칼륨 클로라이드, 나트륨 술페이트, 암모늄 술페이트, 리튬 술페이트, 리튬 클로라이드 또는 암모늄 클로라이드를 포함하는 구배 용리;
    c) pH 6.5 내지 9.5 범위 내에서의 ≥ 0.5 pH 단위의 pH 변화; 또는
    d) 2 내지 30℃의 온도 내에서의 ≥ 1℃의 온도 변화
    를 포함하는 것인 방법.
  7. 제5항에 있어서, 다중모드 수지와 접촉되는 혼합물 또는 용리 물질이 EDTA 또는 프로테아제 억제제를 포함하는 것인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 용리가 EDTA 또는 프로테아제 억제제의 존재하에 이루어지는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 제1 분리제가 히드록시아파타이트이고, 제2 분리제가 다중모드 수지인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 다중모드 수지가 하전된 부분 및 소수성 부분을 포함하는 리간드를 함유하는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 하전된 부분이 음으로 하전된 부분인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 음으로 하전된 부분이 양이온 교환을 위한 음이온성 카르복실레이트 기 또는 음이온성 술포 기인 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 다중모드 수지가 캅토(Capto)-MMC™인 방법.
  14. 제10항에 있어서, 하전된 부분이 양으로 하전된 부분인 방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 다중모드 수지가 캅토 아드히어(Capto Adhere)™인 방법.
  16. 제1항에 있어서, 단계 (a)를 수행하기 전에, 혼합물을 원심분리, 응집, 정화 또는 음이온-교환 크로마토그래피 중 하나 이상에 적용하는 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 혼합물을 음이온-교환 크로마토그래피 상에서의 2회 또는 3회 통과에 적용하는 것인 방법.
  18. 제16항에 있어서, 혼합물을 원심분리, 응집, 정화 및 음이온-교환 크로마토그래피에 적용하는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 정화가 원심분리 및 심층 여과를 통한 것인 방법.
  20. 제1항에 있어서, 혼합물을 배양된 숙주 세포로부터 수득하는 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 배양된 숙주 세포를 삼투 쇼크에 적용하는 것인 방법.
  22. 제20항에 있어서, 상기 발효 세포를 원심분리 또는 마이크로여과에 의해 회수하는 것인 방법.
  23. 제1항에 있어서, 혼합물을 무-세포 생산 시스템으로부터 수득하는 것인 방법.
  24. 제1항에 있어서, 디프테리아 독소 또는 그의 돌연변이 형태를 하기의 단계 (d): 원심분리, 한외여과, 마이크로여과, 여과 및 음이온-교환 막 크로마토그래피 중 하나 이상에 적용하는 것인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 디프테리아 독소 또는 그의 돌연변이 형태를 한외여과, 마이크로여과, 여과 및 음이온-교환 막 크로마토그래피에 적용하는 것인 방법.
  26. 제1항에 있어서, 돌연변이 디프테리아 독소가 CRM197인 방법.
  27. 제1항에 따른 방법에 따라 수득된 디프테리아 독소 또는 그의 돌연변이 형태를 포함하며 액체 형태인 제제.
  28. 제27항에 있어서, 10 g/L 이상의 농도로 2℃에서 6개월 이상 동안 유지되었을 때 디프테리아 독소 또는 그의 돌연변이 형태의 순도가 90%를 초과하는 것인 제제.
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