JPWO2018030499A1 - 不溶性組換えタンパク質凝集体の製造方法 - Google Patents
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Abstract
Description
[1] 組換えタンパク質を不溶体として細胞内に発現している組換え細胞から、当該組換えタンパク質の不溶体を凝集体として分離し、組換えタンパク質凝集体を製造する方法であって、
組換え細胞を破砕後に、組換えタンパク質の不溶体を凝集させ、得られた凝集体を分離することを含む、組換えタンパク質凝集体の製造方法。
[2] 上記組換えタンパク質凝集体を、10,000×g以下の遠心力で分離することを含む、[1]に記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
[3] 上記組換えタンパク質凝集体を、分離板型遠心分離機、バスケット型遠心分離機及びデカンタ型遠心分離機からなる群より選ばれる遠心分離機で分離することを含む、[1]又は[2]に記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
[4] 上記組換えタンパク質凝集体を、自然沈降又は濾過により分離することを含む、[1]に記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
[5] 上記組換えタンパク質の不溶体の凝集が、金属塩、酸及びアニオン性凝集剤からなる群から選ばれる1種以上を添加することにより行われる、[1]〜[4]のいずれかに記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
[6] 以下(A)〜(C)の工程を含む、組換えタンパク質凝集体の製造方法。
(A)目的とする組換えタンパク質を不溶体として細胞内に発現している組換え細胞を破砕して、組換えタンパク質の不溶体を含む破砕懸濁液を得る工程
(B)(A)工程で得られた破砕懸濁液に金属塩、酸及びアニオン性凝集剤からなる群から選ばれる1種以上を添加し、組換えタンパク質の不溶体を凝集させ、組換えタンパク質凝集体を得る工程
(C)(B)工程で得られた凝集体を懸濁液から分離する工程
[7] 上記(B)工程において、さらに加熱することを含む、[6]に記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
[8] 上記(B)工程において、さらに撹拌することを含む、請求項7記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
[9] 上記金属塩が、アルカリ土類金属塩及び土類金属塩からなる群から選ばれる金属塩である、[5]〜[8]のいずれかに記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
[10] 上記金属塩が、アルカリ土類金属ハロゲン化物、アルカリ土類金属硝酸塩、アルカリ土類金属硫酸塩、土類金属ハロゲン化物、土類金属硝酸塩及び土類金属硫酸塩からなる群から選ばれる金属塩である、[9]に記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
[11] 上記酸が、オキソ酸である、[5]〜[10]のいずれかに記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
[12] 上記オキソ酸が、酢酸、硫酸及びクエン酸からなる群から選ばれるオキソ酸である、[11]に記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
[13] 上記アニオン性凝集剤が、ポリアクリル酸塩、アニオン性ポリアクリルアミド及びアクリルアミド・アクリル酸塩共重合体からなる群より選ばれるアニオン性凝集剤である、[5]〜[12]のいずれかに記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
[14] 上記組換え細胞の破砕が機械的破砕である、[1]〜[13]のいずれかに記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
[15] 上記組換えタンパク質凝集体の分離が、濾過により行われる、[1]及び[6]〜[14]のいずれかに記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
[16] 上記組換え細胞が、細菌、酵母、糸状真菌、昆虫細胞、植物細胞及び動物細胞からなる群から選ばれる宿主を形質転換した組換え細胞である、[1]〜[15]のいずれかに記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
[17] 上記組換えタンパク質が、構造タンパク質である、[1]〜[16]のいずれかに記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
[18] 上記構造タンパク質が、ケラチン、コラ−ゲン、エラスチン、レシリン、カイコシルク及びスパイダーシルクからなる群から選ばれるタンパク質由来のタンパク質である、[17]に記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
[19] 得られた組換えタンパク質凝集体の、電気的検知帯法によって測定した粒子径が4μm以上50μm以下である、[1]〜[18]のいずれかに記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
[20] [1]〜[18]のいずれかに記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法によって得られた組換えタンパク質凝集体であって、電気的検知帯法によって測定した粒子径が4μm以上50μm以下である、組換えタンパク質凝集体。
[21] 組換えタンパク質を不溶体として細胞内に発現している組換え細胞から、当該組換えタンパク質の不溶体を分離する方法であって、
組換え細胞を破砕後に、組換えタンパク質の不溶体を凝集させ、得られた凝集体を分離することを含む、組換えタンパク質の分離方法。
[22] 上記組換えタンパク質凝集体を、10,000×g以下の遠心力で分離することを含む、[21]に記載の組換えタンパク質の分離方法。
[23] 上記組換えタンパク質凝集体を、分離板型遠心分離機、バスケット型遠心分離機及びデカンタ型遠心分離機からなる群より選ばれる遠心分離機で分離することを含む、[21]又は[22]に記載の組換えタンパク質の分離方法。
[24] 上記組換えタンパク質凝集体を、自然沈降又は濾過により分離することを含む、[21]に記載の組換えタンパク質の分離方法。
[25] 上記組換えタンパク質の不溶体の凝集が、金属塩、酸及びアニオン性凝集剤からなる群から選ばれる1種以上を添加することにより行われる、[21]〜[24]のいずれかに記載の組換えタンパク質の分離方法。
[26] 以下(A)〜(C)の工程を含む、組換えタンパク質の分離方法。
(A)目的とする組換えタンパク質を不溶体として細胞内に発現している組換え細胞を破砕して、組換えタンパク質の不溶体を含む破砕懸濁液を得る工程
(B)(A)工程で得られた破砕懸濁液に金属塩、酸及びアニオン性凝集剤からなる群から選ばれる1種以上を添加し、組換えタンパク質の不溶体を凝集させ、組換えタンパク質凝集体を得る工程
(C)(B)工程で得られた凝集体を懸濁液から分離する工程
[27] (B)工程において、さらに加熱することを含む[26]に記載の組換えタンパク質の分離方法。
[28] (B)工程において、さらに撹拌することを含む[27]に記載の組換えタンパク質の分離方法。
[29] 上記金属塩が、アルカリ土類金属塩及び土類金属塩からなる群から選ばれる金属塩である[25]〜[28]のいずれかに記載の組換えタンパク質の分離方法。
[30] 上記金属塩が、アルカリ土類金属ハロゲン化物、アルカリ土類金属硝酸塩、アルカリ土類金属硫酸塩、土類金属ハロゲン化物、土類金属硝酸塩及び土類金属硫酸塩からなる群から選ばれる金属塩である、[29]に記載の組換えタンパク質の分離方法。
[31] 上記酸が、オキソ酸である、[25]〜[30]のいずれかに記載の組換えタンパク質の分離方法。
[32] 上記オキソ酸が、酢酸、硫酸及びクエン酸からなる群から選ばれるオキソ酸である、[31]に記載の組換えタンパク質の分離方法。
[33] 上記アニオン性凝集剤が、ポリアクリル酸塩、アニオン性ポリアクリルアミド及びアクリルアミド・アクリル酸塩共重合体からなる群より選ばれるアニオン性凝集剤である、[25]〜[32]のいずれかに記載の組換えタンパク質の分離方法。
[34] 上記組換え細胞の破砕が機械的破砕である、[21]〜[33]のいずれかに記載の組換えタンパク質の分離方法。
[35] 上記組換えタンパク質凝集体の分離が、濾過により行われる、[21]及び[26]〜[34]のいずれかに記載の組換えタンパク質の分離方法。
[36] 上記組換え細胞が、細菌、酵母、糸状真菌、昆虫細胞、植物細胞及び動物細胞からなる群から選ばれる宿主を形質転換した組換え細胞である、[21]〜[35]のいずれかに記載の組換えタンパク質の分離方法。
[37] 上記組換えタンパク質が、構造タンパク質である、[21]〜[36]のいずれかに記載の組換えタンパク質の分離方法。
[38] 上記構造タンパク質がケラチン、コラ−ゲン、エラスチン、レシリン、カイコシルク及びスパイダーシルクからなる群から選ばれるタンパク質由来のタンパク質である、[37]に記載の組換えタンパク質の分離方法。
[39] [1〜38]のいずれかに記載の分離方法を用いて組換えタンパク質凝集体を製造する方法であって、該分離方法によって得られた組換えタンパク質凝集体の、電気的検知帯法によって測定した粒子径が4μm以上50μm以下である組換えタンパク質凝集体の製造方法。
(A)目的とする組換えタンパク質を不溶体として細胞内に発現している組換え細胞を破砕して、組換えタンパク質の不溶体を含む破砕懸濁液を得る工程
(B)(A)工程で得られた破砕懸濁液に金属塩、酸及びアニオン性凝集剤からなる群から選ばれる1種以上を添加し、組換えタンパク質の不溶体を凝集させ、組換えタンパク質凝集体を得る工程
(C)(B)工程で得られた凝集体を懸濁液から分離する工程
本実施形態に係る組換えタンパク質凝集体の製造方法によって分離する不溶性組換えタンパク質(本明細書において、「目的とするタンパク質」という場合がある。)は、不溶体として下記の組換え細胞内にて発現される。組換えタンパク質としては、工業規模での製造が好ましい任意の不溶性タンパク質を挙げることができ、例えば、工業用に利用できるタンパク質、医療用に利用できるタンパク質、構造タンパク質等を挙げることができる。工業用又は医療用に利用できるタンパク質の具体例としては、酵素、制御タンパク質、受容体、ペプチドホルモン、サイトカイン、膜及び輸送タンパク質、予防接種に使用する抗原、ワクチン、抗原結合タンパク質、免疫刺激タンパク質、アレルゲン、完全長抗体及び抗体フラグメント並びにこれらの誘導体を挙げることができる。構造タンパク質の具体例としては、ケラチン、コラ−ゲン、エラスチン、レシリン、カイコシルク及びスパイダーシルク、並びにこれら由来のタンパク質等を挙げることができる。
本実施形態における組換え細胞は、組換えタンパク質を不溶体として細胞内に発現している組換え細胞であり、遺伝子工学的手法を用いた一般的な方法を用いて取得できる。
目的とするタンパク質を発現するための上記発現ベクターで形質転換された組換え細胞において、組換えタンパク質は、不溶体として細胞内に発現されている。組換えタンパク質は、組換え細胞を培養培地中で培養することにより発現させることができる。組換え細胞を培養培地中で培養する方法は、宿主の培養に通常用いられる方法に従って行うことができる。
工程(A)は、目的とする組換えタンパク質を不溶体として細胞内に発現している組換え細胞を破砕して、組換えタンパク質の不溶体を含む破砕懸濁液を得る工程である。
工程(B)は、上記(A)工程で得られた破砕懸濁液に金属塩、酸及びアニオン性凝集剤からなる群から選ばれる1種以上を添加し、組換えタンパク質の不溶体を凝集させ、組換えタンパク質凝集体を得る工程である。工程(B)において、必要に応じて、加熱及び/又は撹拌することを行ってもよい。
(C)工程は、(B)工程で得られた凝集体を懸濁液から分離する工程である。破砕懸濁液への金属塩、酸及びアニオン性凝集剤からなる群から選ばれる1種以上の添加と同時に組換えタンパク質不溶体の凝集が始まり、その後適宜な分離手段、例えば、自然沈降、遠心分離又は濾過を用いて凝集体を分離することができる。金属塩、酸及びアニオン性凝集剤からなる群から選ばれる1種以上の添加後、加熱し、必要に応じてさらに撹拌することにより凝集が促進され凝集体が大型となり、より分離が容易となる。
配列番号1(PRT410)、配列番号2(PRT853)、配列番号3(PRT647)、配列番号4(PRT699)及び配列番号5(PRT698)で示されるアミノ酸配列を有するクモ糸由来の配列を有するフィブロインをコードする核酸、GEN495、GEN971、GEN740、GEN797及び、GEN796をそれぞれ合成した。当該核酸には、5’末端にNdeIサイト及び終止コドン下流にEcoRIサイトを付加した。各タンパク質のハイドロパシー インデックス(HI)及び分子量は表1に示した通りである。
上記形質転換大腸菌を、アンピシリンを含む2mLのLB培地で15時間培養した。当該培養液を、アンピシリンを含む100mLのシード培養用培地(表2)にOD600が0.005となるように添加した。培養液温度を30℃に保ち、OD600が5になるまでフラスコ培養を行い(約15時間)、シード培養液を得た。
不溶体としてPRT853(HI:−0.68)を発現している大腸菌BLR(DE3)のRO水懸濁液にDNase(SIGMA−ALDRICH)1.8μg/g湿菌体、及びLysozyme(Thermo Fisher Scientific)を164μg/g湿菌体添加し、高圧ホモジナイザー(GEA, Panda plus)を用い室温、600バールの圧力で4回処理し、菌体を破砕した。破砕後、遠心分離機(TOMY MX−305)を用い、11,000×g、5分間処理し、不溶体を取得した。当該不溶体はこのように、取得するためにはかなりの時間をかけて遠心分離する必要のある、比較的小さな不溶性顆粒であった。当該不溶性顆粒を水に懸濁後、0.5Mとなるように表4に示す金属塩を添加した。図1は、金属塩の添加後、2,680×gで10秒間遠心分離したときの各サンプルの写真である。
実施例1で凝集効果が優れていた金属塩(塩化マグネシウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム及び硝酸マグネシウム)について、PRT853の不溶体を用いて、低濃度での凝集効果を確認した(表5参照)。図2は、金属塩の添加後、2,680×gで10秒間遠心分離したときの各サンプルの写真である。
疎水性度の異なるタンパク質における金属塩の添加効果を確認した。実施例1と同様の方法で、PRT410(HI:−0.81)、PRT647(HI:0.04)、PRT699(HI:0.17)、PRT698(HI:0.43)の4種類の不溶体について金属塩(塩化カルシウム及び塩化マグネシウム)の添加による凝集効果を確認した。
PRT410、PRT647、PRT699、PRT698の4種類の不溶体は、11,000×g、20℃の遠心分離であれば、5分間で沈降させることができた。遠心分離で得られた当該沈殿画分を再度RO水に懸濁し、当該懸濁液(遠沈再懸濁液)への金属塩の添加効果を確認した。
不溶体としてPRT853(HI:−0.68)を発現している大腸菌BLR(DE3)のRO水懸濁液にDNase(SIGMA−ALDRICH)1.8μg/g湿菌体、及びLysozyme(Thermo Fisher Scientific)を164μg/g湿菌体添加し、高圧ホモジナイザー(GEA, Panda plus)を用い室温、600バールの圧力で4回処理し、菌体の破砕懸濁液を取得した。
疎水性度の異なるPRT410(HI:−0.81)、PRT647(HI:0.04)、PRT699(HI:0.17)、PRT698(HI:0.43)の4種類の不溶体について、実施例5と同様の方法で、5〜30mMのクエン酸を添加し、不溶体の凝集効果を以下のように確認した。
宿主細胞として用いた大腸菌には、グラム陰性菌特有の細胞壁由来の内毒素と呼ばれるLPSが存在する。当該内毒素は過剰に存在すると発熱、多臓器不全、頻脈等の作用を有することが知られており、低減下することが好ましい。本発明の金属塩又は酸添加により凝集させた不溶体中のLPS含量を測定し、LPSの低減下効果を確認した。
すなわち、PRT853を発現している大腸菌BLR(DE3)のRO水懸濁液にDNase(SIGMA-ALDRICH)1.8μg/g湿菌体、及びLysozyme(Thermo Fisher Scientific)を164μg/g湿菌体添加し、高圧ホモジナイザー(GEA, Panda plus)を用い室温、600バールの圧力で4回処理し、菌体を破砕した。破砕後、遠心分離機(TOMY MX−305)を用い、11,000×g、20分間処理した。沈殿画分を再度RO水に懸濁し、11,000×g、30分間処理した。この洗浄操作を2回行った。得られた沈殿画分を再度RO水に懸濁し、11,000×g、60分間処理し、沈殿画分として不溶体(1)を取得した。当該不溶体(1)の取得は20℃で行った。
すなわち、高圧ホモジナイザーで4回処理し、菌体を破砕するまでは上記と同様の方法で行なった。破砕後、10mMの塩化カルシウムを添加し、不溶体を凝集させ、2,500×gで10分間処理した。得られた沈殿画分を、再度RO水に懸濁し、2,500×gで10分間処理した。この洗浄操作を2回行い、沈殿画分として金属塩添加による不溶体(2)を取得した。
すなわち、金属塩を添加する代わりに、10mMのクエン酸を添加する以外は上記金属塩添加の不溶体(2)の取得と同じ方法で、酸添加による不溶体(3)を取得した。
(ア)測定サンプルの調製
上記3種類の不溶体サンプル約75mg(不溶体(1)75.5mg,不溶体(2)75.1mg,不溶体(3)75.0mg)を秤量し、50mg/mLになるように注射用蒸留水(大塚製薬工場株式会社)を加え懸濁液を調製した。ボルテックスミキサーで攪拌後、pHを確認し、5N水酸化ナトリウム水溶液(和光純薬工業株式会社)を加えて中性となるように調整した。当該不溶体サンプルを、ブロックヒーターを用い、90で、20分間加熱処理した。放熱後、10,000rpm、10分間遠心分離を行い、上清を回収し、測定原液とした。
リムルスES−ilシングルテストワコー(和光純薬工業株式会社)を用い、添付の説明資料に従って、トキシノメーター(ET−6000/J、和光純薬工業株式会社)を用いた比濁時間分析を行った。測定には、エンドトキシン標準品として、キットに添付されているCSE(E.coli UKT−B)を用いた。各検体についてはじめに測定原液を1,000希釈して測定した。不溶体(1)及び不溶体(2)は1,000倍希釈により測定値が得られたが、不溶体(3)は検出限度以下(く0.01EU/mL)であったため、希釈倍率を変え、10倍希釈で測定値を得ることができた。結果を表11に示す。
不溶性顆粒としてPRT853(HI:−0.68)を発現している大腸菌BLR(DE3)のRO水懸濁液にDNase1.8μg/g湿菌体、及びLysozymeを164μg/g湿菌体添加し、高圧ホモジナイザーを用いて室温にて600バールの圧力で4回処理し、菌体を破砕し、破砕懸濁液を得た。破砕後、当該破砕懸濁液に、0.05%となるように、表12に示す凝集剤を添加し、静置あるいは遠心分離(2,680×gで10秒間)により当該不溶性顆粒の沈降状況を確認した。結果を図10に示す。
アニオン性ポリアクリル酸塩系凝集剤(クリファーム PA−896)のみが、静置及び遠心分離のいずれの場合も、不溶性顆粒を効果的に沈降させることができた。
実施例8で凝集効果が確認されたアニオン性凝集剤クリファーム PA−896について、菌体の破砕懸濁液及び遠沈再懸濁液への添加効果を確認した。この遠沈再懸濁液は、破砕懸濁液を11,000×g、20℃で5分間遠心分離し、得られた沈殿画分をRO水に再度懸濁した懸濁液である。菌体の破砕懸濁液は、不溶性顆粒としてPRT410(HI:−0.81)を発現している大腸菌BLR(DE3)を用いた以外は実施例8と同様の方法で得た。
PRT410の不溶体を用いて、加熱による凝集効果を確認した。PRT410を発現している大腸菌BLR(DE3)のRO水懸濁液にDNase1.8μg/g湿菌体、及びLysozymeを164μg/g湿菌体添加し、高圧ホモジナイザーを用い室温、600バールの圧力で4回処理し、菌体を破砕した。破砕後、2,500×gで10分間遠心分離し、上澄み液を廃棄して2.5倍濃縮に調整した後、濃縮液をRO水で2.5倍希釈した。当該破砕懸濁液に、20mMとなるように、クエン酸を添加し、その後、必要に応じて、加熱及び撹拌を行い、凝集体を得た。それぞれのサンプルは表14に記載の条件によって処理した。加熱は、温浴槽を用い、加熱時間は温浴槽が80℃に達した時点からの維持時間であった。撹拌は200rpmで行った。得られた凝集体について、粒子径数分析装置CDA−1000(シスメックス株式会社)を用い、粒子濃度及びメジアン径を測定した。結果は表14に示した。また、図12はメジアン径の頻度分布及び累積分布を示す。
PRT410の不溶体を用いて、酸の添加による濾過性の向上効果を確認した。酸添加により濾過することが可能であることを確認したため、酸の種類による濾過性向上効果をクエン酸、塩酸、硫酸の3種類の酸について比較した。実験方法は、酸が異なる以外、実施例10と同じであった。酸処理は、80℃にて2時間、加熱・撹拌し、最大濾過量及び、濾過時間と透過流束の関係に関する結果の一例を表15、及び表16に示す。比較の結果、クエン酸の最大濾過量が最も大きく、透過流束が安定していることから、工業的にはクエン酸が優れていることが確認された。
加熱されたPRT799(配列番号11、200kDa)及び、PRT587(配列番号12、100kDa)の不溶体の純度をSDS−PAGEにより解析した。図13、及び図14は、PRT799及び、PRT587の各処理液をSDS−PAGEで解析した結果(泳動結果)を示す写真である。各処理液は、クエン酸を添加し、pHを3.75に調整した。図13は、レーン1には、80℃、3時間加熱した破砕懸濁液をアプライし、レーン2には、加熱していない破砕懸濁液をアプライした。レーン1の破砕懸濁液は加熱により夾雑タンパク質が分解されていることを確認した。図14のレーン1には加熱をしていない破砕懸濁液をアプライし、レーン2には、80℃、2時間加熱した破砕懸濁液をアプライした。40kDaの分子マーカ付近のバンドが分解されていることが確認され、レーン2の100kDaの分子マーカ付近に検出されているバンド(目的タンパク質)の検出強度が加熱していないレーン1のバンドと比較し1.2倍で検出されていることから、加熱により目的タンパク質の純度向上が確認された。
PRT799の不溶体を用いて、連続加熱による凝集効果を確認した。PRT799を発現している大腸菌BLR(DE3)のRO水懸濁液に、DNaseを1.8μg/g湿菌体、Lysozymeを164μg/g湿菌体で添加し、高圧ホモジナイザーを用いて、室温、600バールの圧力で4回処理し、菌体を破砕した。破砕後、遠心分離機(TOMY MX−305)を用い、2,500×gで10分間遠心分離し、上澄み液を廃棄して、2.5倍濃縮に調整した後、濃縮液をRO水で2.5倍希釈した。当該破砕懸濁液に、20mMとなるように、クエン酸を添加し、その後、加熱を行い、凝集体を得た。それぞれのサンプルは表17に記載の条件によって処理した。加熱は、液体連続殺菌装置MINI UHT T−20(パワーポイント・インターナショナル社製)を用い、加熱温度は80℃、85℃、90℃、又は95℃であり、当該破砕懸濁液の加熱時間は、30秒又は60秒で行った。得られた凝集体について、粒子径数分析装置CDA−1000(シスメックス株式会社)を用い、粒子濃度及びメジアン径を測定した。結果は表17に示した。また、図14及び図15はメジアン径の頻度分布及び累積分布を示す。
サンプルX、5、6、7、及び8の濾過面積及び最大濾過量の結果は表18に示した。表18よれば、液体連続殺菌装置を用いて高温、短時間で加熱する場合の濾過性は、温浴槽を用いて2時間加熱した場合と同程度又は同程度以上であり、当該破砕懸濁液の加熱を高温、短時間とすることで濾過性が向上することを確認した。
Claims (20)
- 組換えタンパク質を不溶体として細胞内に発現している組換え細胞から、当該組換えタンパク質の不溶体を凝集体として分離し、組換えタンパク質凝集体を製造する方法であって、
組換え細胞を破砕後に、組換えタンパク質の不溶体を凝集させ、得られた凝集体を分離することを含む、組換えタンパク質凝集体の製造方法。 - 前記組換えタンパク質凝集体を、10,000×g以下の遠心力で分離することを含む、請求項1に記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
- 前記組換えタンパク質凝集体を、分離板型遠心分離機、バスケット型遠心分離機及びデカンタ型遠心分離機からなる群より選ばれる遠心分離機で分離することを含む、請求項1又は2に記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
- 前記組換えタンパク質凝集体を、自然沈降又は濾過により分離することを含む、請求項1に記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
- 前記組換えタンパク質の不溶体の凝集が、金属塩、酸及びアニオン性凝集剤からなる群から選ばれる1種以上を添加することにより行われる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
- 以下(A)〜(C)の工程を含む、組換えタンパク質凝集体の製造方法。
(A)目的とする組換えタンパク質を不溶体として細胞内に発現している組換え細胞を破砕して、組換えタンパク質の不溶体を含む破砕懸濁液を得る工程
(B)(A)工程で得られた破砕懸濁液に金属塩、酸及びアニオン性凝集剤からなる群から選ばれる1種以上を添加し、組換えタンパク質の不溶体を凝集させ、組換えタンパク質凝集体を得る工程
(C)(B)工程で得られた凝集体を懸濁液から分離する工程 - 前記(B)工程において、さらに加熱することを含む、請求項6に記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
- 前記(B)工程において、さらに撹拌することを含む、請求項7に記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
- 前記金属塩が、アルカリ土類金属塩及び土類金属塩からなる群から選ばれる金属塩である、請求項5〜8のいずれか一項に記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
- 前記金属塩が、アルカリ土類金属ハロゲン化物、アルカリ土類金属硝酸塩、アルカリ土類金属硫酸塩、土類金属ハロゲン化物、土類金属硝酸塩及び土類金属硫酸塩からなる群から選ばれる金属塩である、請求項9に記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
- 前記酸が、オキソ酸である、請求項5〜10のいずれか一項に記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
- 前記オキソ酸が、酢酸、硫酸及びクエン酸からなる群から選ばれるオキソ酸である、請求項11に記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
- 前記アニオン性凝集剤が、ポリアクリル酸塩、アニオン性ポリアクリルアミド及びアクリルアミド・アクリル酸塩共重合体からなる群より選ばれるアニオン性凝集剤である、請求項5〜12のいずれか一項に記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
- 前記組換え細胞の破砕が機械的破砕である、請求項1〜13のいずれか一項に記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
- 前記組換えタンパク質凝集体の分離が、濾過により行われる、請求項1及び6〜14のいずれか一項に記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
- 前記組換え細胞が、細菌、酵母、糸状真菌、昆虫細胞、植物細胞及び動物細胞からなる群から選ばれる宿主を形質転換した組換え細胞である、請求項1〜15のいずれか一項に記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
- 前記組換えタンパク質が、構造タンパク質である、請求項1〜16のいずれか一項に記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
- 前記構造タンパク質が、ケラチン、コラ−ゲン、エラスチン、レシリン、カイコシルク及びスパイダーシルクからなる群から選ばれるタンパク質由来のタンパク質である、請求項17に記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
- 得られた組換えタンパク質凝集体の、電気的検知帯法によって測定した粒子径が4μm以上50μm以下である、請求項1〜18のいずれか一項に記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法。
- 請求項1〜18のいずれか一項に記載の組換えタンパク質凝集体の製造方法によって得られた組換えタンパク質凝集体であって、電気的検知帯法によって測定した粒子径が4μm以上50μm以下である、組換えタンパク質凝集体。
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