CN113583148A - 一种低免疫原性甲壳素的制备方法及所得的甲壳素 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种低免疫原性甲壳素的制备方法及所得的甲壳素。本发明包括以下步骤：1)取碱金属氢氧化物、无机盐和二甲基亚砜，将碱金属氢氧化物和无机盐分别添加到二甲基亚砜中，混合，搅拌均匀，得碱性溶液；2)取甲壳素，添加到碱性溶液中，混合，搅拌均匀，得混合溶液；3)将混合溶液于0‑99℃下，处理0.1‑72h，得反应液；4)将反应液的pH值调节至中性，清洗，干燥，得低免疫原性甲壳素。本发明的甲壳素在碱性溶液中得到了高度溶胀和充分分散，隐藏于分子链内部的杂蛋白和内毒素充分暴露出来，并被彻底地分解和去除，保证了去除过程的均匀性和高效性，所得甲壳素中杂蛋白和内毒素含量均低于医药行业标准要求，应用前景好。
Description
技术领域
本发明属于甲壳素纯化的技术领域，特别是指一种低免疫原性甲壳素的制备方法及所得的甲壳素。
背景技术
甲壳素是自然界中储量仅次于纤维素的天然多糖，兼具抗肿瘤、促进伤口愈合、螯合重金属、抗菌和提高免疫力等多种优良特性，在食品、生物医药、环境处理以及化妆品等领域展现出巨大的应用潜力。然而，天然甲壳素主要来源于虾、蟹和昆虫等甲壳类动物的外骨骼，自身能够与无机盐、蛋白质、脂多糖等形成致密的复合结构，生成免疫原性物质，从而增加了后期使用过程中引起生物体免疫反应的风险。同时，由于甲壳素自身的分子链内部存在结晶区和复杂的氢键结构，使其无法溶解于常见的水性溶剂，从而导致上述引起生物体免疫反应的免疫原性物质很难被完全去除。
目前，甲壳素的纯化、去除杂蛋白以及内毒素的方法主要是基于非均相的处理体系，在处理过程中甲壳素以颗粒或片状形态参与整个反应，而非溶解状态，因此，无法保证其内部分子链结合杂蛋白和内毒素的有效去除，直接影响后续的应用，特别是在医药行业中的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种低免疫原性甲壳素的制备方法及所得的甲壳素，旨在解决现有技术中甲壳素的纯化方法不能有效去除其内部分子链结合杂蛋白和内毒素从而影响其在医药行业中的应用的问题。
为了解决上述技术问题，本发明主要是通过以下技术方案加以实现的：
在一个方面，本发明的一种低免疫原性甲壳素的制备方法，包括以下步骤：1)取碱金属氢氧化物、无机盐和二甲基亚砜，将碱金属氢氧化物和无机盐分别添加到二甲基亚砜中，混合，搅拌均匀，得碱性溶液；在碱性溶液中，碱金属氢氧化物的质量浓度为0.1-15wt％，无机盐的质量浓度为0.1-1wt％；2)取甲壳素，添加到步骤1)所得的碱性溶液中，混合，搅拌均匀，得混合溶液；在混合溶液中，甲壳素的质量浓度为0.1-15wt％；3)将步骤2)所得的混合溶液进行热处理，处理温度为0-99℃，处理时间为0.1-72h，得反应液；4)将步骤3)所得的反应液的pH值调节至中性，清洗，干燥，得低免疫原性甲壳素。
本发明首先将甲壳素分散于氢氧化物、无机盐和二甲基亚砜溶剂组成的混合体系中，氢氧化物在二甲基亚砜溶剂中显示出很强的碱性，从而分散和溶解甲壳素；无机盐提供金属阳离子，金属阳离子能够和甲壳素分子链内部羟基和氨基形成配位作用，破坏了原有的氢键结构，提高了甲壳素的溶胀性能，使甲壳素充分地分散并溶解到混合体系中，从而得到一种高度溶胀和分散的甲壳素纤维溶液；随后，本发明利用混合体系中的碱性物质分解甲壳素内部的杂蛋白和内毒素，处理过程中，甲壳素处于高度溶胀和分散状态，隐藏于其分子链内部的杂蛋白和内毒素能够被充分暴露出来，便于彻底的分解和去除，充分保证了去除过程的均匀性和高效性。本发明的制备方法简单，操作方便，效率高，对设备无特殊要求，易于实现产业化，所得的甲壳素在制备过程中无新增杂质引入，杂蛋白含量小于0.12％，内毒素小于0.11EU/mg，均低于医药行业标准的要求。
作为一种优选的实施方案，所述步骤3)中，所得的混合溶液在热处理之前进行超声处理，超声功率为5-50W，超声时间为0.1-6h。本发明在分解和去除甲壳素中杂蛋白和内毒素的过程中还可以增加超声处理，超声可以提高杂蛋白和内毒素的分解和去除效率。
作为一种优选的实施方案，所述超声处理的方式为超声3min停5min，依次反复。本发明的超声处理过程中可以是间歇超声，例如：超声3min停5min，再超声3min停5min，依次反复，直到超声结束；这种间歇超声可以降低能耗，节约成本。
作为一种优选的实施方案，所述步骤3)中，采用微波加热的方式进行热处理，处理温度为40-99℃。本发明在分解和去除甲壳素中杂蛋白和内毒素的过程中可以加热也可以不加热，可以直接加热，也可以采用微波加热，加热到40-99℃时，处理效果最佳。
作为一种优选的实施方案，所述无机盐为硝酸铁、硝酸锌、硝酸铝、硝酸铜、硫酸铁、硫酸锌、硫酸铝、硫酸铜、三氯化铁、氯化锌、三氯化铝、氯化铜中的任意一种或几种。本发明的无机盐可以提供金属阳离子，金属阳离子能够和甲壳素分子链内部羟基和氨基形成配位作用，破坏了原有的氢键结构，提高了甲壳素的溶胀性能，使甲壳素充分地分散并溶解。
作为一种优选的实施方案，所述碱金属氢氧化物可为氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化钠中的任意一种或几种。本发明的这些碱金属氢氧化物来源广，便于取得，使用方便，成本低。
作为一种优选的实施方案，所述甲壳素的脱乙酰度为1-99％。本发明的甲壳素还可以含有部分壳聚糖，本发明的方法不仅分解和去除甲壳素中的内毒素和杂蛋白，还可以分解和去除壳聚糖中的内毒素和杂蛋白。
作为一种优选的实施方案，所述步骤4)中，清洗为采用无热源超纯水透析3-5天。本发明的中性反应液中残留有机物、无机盐、杂蛋白和内毒素的降解产物，可以通过透析的方式进行清洗，以去除反应残留物。
作为一种优选的实施方案，所述步骤4)中，干燥为冷冻干燥或超临界干燥。本发明的冷冻干燥和超临界干燥，这种干燥温度低，干燥过程中不会对甲壳素的分子结构造成影响，也不会引入新的杂质，而且，干燥效率高。
在另一个方面，本发明的一种低免疫原性甲壳素，所述甲壳素是根据上面任意一项所述的低免疫原性甲壳素的制备方法制备而成。
本发明中反应液通常是通过无机酸调节pH值的，优选地，利用盐酸中和反应液，盐酸来源广，价廉易得，使用安全性能高；本发明的制备方法所得的低免疫原性甲壳素中杂蛋白含量小于0.12％(质量分数)，内毒素小于0.11EU/mg，这均低于医药行业标准YY/T0606.7-2008组织工程医疗产品第7部分：壳聚糖和医药行业标准YY0953-2015医用羧甲基壳聚糖中对于蛋白质含量和内毒素含量的要求。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明首先将甲壳素分散于氢氧化物、无机盐和二甲基亚砜溶剂组成的混合体系中，氢氧化物在二甲基亚砜溶剂中显示出很强的碱性，从而分散和溶解甲壳素；无机盐提供金属阳离子，金属阳离子能够和甲壳素分子链内部羟基和氨基形成配位作用，破坏了原有的氢键结构，提高了甲壳素的溶胀性能，使甲壳素充分地分散并溶解到混合体系中，从而得到一种高度溶胀和分散的甲壳素纤维溶液；随后，本发明利用混合体系中的碱性物质分解甲壳素内部的杂蛋白和内毒素，处理过程中，甲壳素处于高度溶胀和分散状态，隐藏于其分子链内部的杂蛋白和内毒素能够被充分暴露出来，便于彻底的分解和去除，充分保证了去除过程的均匀性和高效性；本发明的制备方法简单，操作方便，效率高，对设备无特殊要求，易于实现产业化，所得的甲壳素在制备过程中无新增杂质引入，杂蛋白含量小于0.12％，内毒素小于0.11EU/mg，均低于医药行业标准的要求。
具体实施方式
下面将结合本发明的具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的一种低免疫原性甲壳素的制备方法，包括以下步骤：
1)取碱金属氢氧化物、无机盐和二甲基亚砜，将碱金属氢氧化物和无机盐分别添加到二甲基亚砜中，混合，搅拌均匀，得碱性溶液；在碱性溶液中，碱金属氢氧化物的质量浓度为0.1-15wt％，无机盐的质量浓度为0.1-1wt％；
2)取甲壳素，添加到步骤1)所得的碱性溶液中，混合，搅拌均匀，得混合溶液；在混合溶液中，甲壳素的质量浓度为0.1-15wt％；
3)将步骤2)所得的混合溶液进行热处理，处理温度为0-99℃，处理时间为0.1-72h，得反应液；
4)将步骤3)所得的反应液的pH值调节至中性，清洗，干燥，得低免疫原性甲壳素。
优选地，所述步骤3)中，所得的混合溶液在热处理之前进行超声处理，超声功率为5-50W，超声时间为0.1-6h。
进一步地，所述超声处理的方式为超声3min停5min，依次反复。
优选地，所述步骤3)中，采用微波加热的方式进行热处理，处理温度为40-99℃。
优选地，所述无机盐为硝酸铁、硝酸锌、硝酸铝、硝酸铜、硫酸铁、硫酸锌、硫酸铝、硫酸铜、三氯化铁、氯化锌、三氯化铝、氯化铜中的任意一种或几种。
优选地，所述碱金属氢氧化物可为氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化钠中的任意一种或几种。
优选地，所述甲壳素的脱乙酰度为1-99％。
优选地，所述步骤4)中，清洗为采用无热源超纯水透析3-5天。
优选地，所述步骤4)中，干燥为冷冻干燥或超临界干燥。
本发明的一种低免疫原性甲壳素，所述甲壳素是根据上面任意一项所述的低免疫原性甲壳素的制备方法制备而成。
实施例一
本发明的一种低免疫原性甲壳素的制备方法，包括以下步骤：
1)取氢氧化钠0.1份、氯化铁0.1份和二甲基亚砜99.7份，将氢氧化钠和氯化铁分别添加到二甲基亚砜中，混合，搅拌均匀，得碱性溶液；
2)取脱乙酰度为1％的甲壳素粉末0.1份，添加到99.9份步骤1)所得的碱性溶液中，混合，搅拌均匀，得混合溶液，混合溶液为浓度是0.1wt％的甲壳素分散溶液；
3)将步骤2)所得的混合溶液在功率为5W的超声条件下处理0.1h，然后，置于99℃的环境中热处理24h，得反应液；
4)使用盐酸将步骤3)所得的反应液的pH值调节至中性，于无热源超纯水中透析3天，冷冻干燥，得低免疫原性甲壳素。
实施例二
本发明的一种低免疫原性甲壳素的制备方法，包括以下步骤：
1)取氢氧化钾2份、硫酸铜0.85份和二甲基亚砜82.15份，将氢氧化钾和硫酸铜分别添加到二甲基亚砜中，混合，搅拌均匀，得碱性溶液；
2)取脱乙酰度为10％的甲壳素粉末15份，添加到85份步骤1)所得的碱性溶液中，混合，搅拌均匀，得混合溶液，混合溶液为浓度是15wt％的甲壳素分散溶液；
3)将步骤2)所得的混合溶液在功率为50W的超声条件下处理6h，然后，置于65℃的微波加热环境中热处理72h，得反应液；
4)使用盐酸将步骤3)所得的反应液的pH值调节至中性，于无热源超纯水中透析5天，超临界干燥，得低免疫原性甲壳素。
实施例三
本发明的一种低免疫原性甲壳素的制备方法，包括以下步骤：
1)取氢氧化锂6份、硝酸锌0.5份和二甲基亚砜85.5份，将氢氧化锂和硝酸锌分别添加到二甲基亚砜中，混合，搅拌均匀，得碱性溶液；
2)取脱乙酰度为25％的甲壳素粉末8份，添加到92份步骤1)所得的碱性溶液中，混合，搅拌均匀，得混合溶液，混合溶液为浓度是8wt％的甲壳素分散溶液；
3)将步骤2)所得的混合溶液在功率为25W的超声条件下处理3h，超声处理的方式为超声3min停5min，再超声3min停5min，依次反复，然后，置于25℃的微波加热环境中热处理48h，得反应液；
4)使用盐酸将步骤3)所得的反应液的pH值调节至中性，于无热源超纯水中透析4天，冷冻干燥，得低免疫原性甲壳素。
实施例四
本发明的一种低免疫原性甲壳素的制备方法，包括以下步骤：
1)取氢氧化钾10份、氢氧化锂4.55份、氯化铝0.6份和二甲基亚砜81.85份，将氢氧化钾、氢氧化锂和氯化铝分别添加到二甲基亚砜中，混合，搅拌均匀，得碱性溶液；
2)取脱乙酰度为45％的甲壳素粉末3份，添加到97份步骤1)所得的碱性溶液中，混合，搅拌均匀，得混合溶液，混合溶液为浓度是3wt％的甲壳素分散溶液；
3)将步骤2)所得的混合溶液在功率15W的超声条件下处理1h，然后，置于0℃的环境中处理5h，得反应液；
4)使用盐酸将步骤3)所得的反应液的pH值调节至中性，于无热源超纯水中透析3天，冷冻干燥，得低免疫原性甲壳素。
实施例五
本发明的一种低免疫原性甲壳素的制备方法，包括以下步骤：
1)取氢氧化钾5份、氢氧化钠5份、硫酸铁0.4份和二甲基亚砜88.6份，将氢氧化钾、氢氧化钠和硫酸铁分别添加到二甲基亚砜中，混合，搅拌均匀，得碱性溶液；
2)取脱乙酰度为80％的甲壳素粉末1份，添加到99份步骤1)所得的碱性溶液中，混合，搅拌均匀，得混合溶液，混合溶液为浓度是1wt％的甲壳素分散溶液；
3)将步骤2)所得的混合溶液在功率30W的超声条件下处理2h，然后，置于40℃的微波加热环境中热处理12h，得反应液；
4)使用盐酸将步骤3)所得的反应液的pH值调节至中性，于无热源超纯水中透析3天，超临界干燥，得低免疫原性甲壳素。
实施例六
本发明的一种低免疫原性甲壳素的制备方法，包括以下步骤：
1)取氢氧化钠5份、氢氧化锂5份、硫酸铁0.2份和二甲基亚砜89.5份，将氢氧化钠、氢氧化锂和硫酸铁分别添加到二甲基亚砜中，混合，搅拌均匀，得碱性溶液；
2)取脱乙酰度为99％的甲壳素粉末0.3份，添加到99.7份步骤1)所得的碱性溶液中，混合，搅拌均匀，得混合溶液，混合溶液为浓度是0.3wt％的甲壳素分散溶液；
3)将步骤2)所得的混合溶液在功率45W的超声条件下处理5h，然后，置于10℃的微波加热环境中热处理2h，得反应液；
4)使用盐酸将步骤3)所得的反应液的pH值调节至中性，于无热源超纯水中透析5天，冷冻干燥，得低免疫原性甲壳素。
实施例七
本发明的一种低免疫原性甲壳素的制备方法，包括以下步骤：
1)取氢氧化钠15份、氯化铁0.3份和二甲基亚砜84.4份，将氢氧化钠和氯化铁分别添加到二甲基亚砜中，混合，搅拌均匀，得碱性溶液；
2)取脱乙酰度为50％的甲壳素粉末5份，添加到99.7份步骤1)所得的碱性溶液中，混合，搅拌均匀，得混合溶液，混合溶液为浓度是5wt％的甲壳素分散溶液；
3)将步骤2)所得的混合溶液在置于80℃环境中热处理0.1h，得反应液；
4)使用盐酸将步骤3)所得的反应液的pH值调节至中性，于无热源超纯水中透析4天，冷冻干燥，得低免疫原性甲壳素。
对比例一
根据现有的方法纯化甲壳素，包括以下步骤：
1)取脱乙酰度为10％的甲壳素粉末15份，添加到85份氢氧化钠水溶液中，氢氧化钠水溶液的浓度为30％w/v，得混合溶液；
2)将步骤1)所得的混合溶液在功率为50W的超声条件下处理6h，然后，置于65℃的微波加热环境中搅拌处理72h，得反应液；
3)使用盐酸将步骤2)所得的反应液的pH值调节至中性，于无热源超纯水中透析5天，超临界干燥，得纯化甲壳素，即对照样一。
对比例二
根据现有的方法纯化甲壳素，包括以下步骤：
1)取氢氧化钠3份加入和二甲基亚砜82份，混合，搅拌均匀，得碱性溶液；
2)取脱乙酰度为10％的甲壳素粉末15份，添加到85份步骤1)所得的碱性溶液中，混合，搅拌均匀，得混合溶液，混合溶液为浓度是15wt％的澄清甲壳素溶液；
3)将步骤2)所得的混合溶液在功率为50W的超声条件下处理6h，然后，置于65℃的微波加热环境中处理72h，得反应液；
4)使用盐酸将步骤3)所得的反应液的pH值调节至中性，于无热源超纯水中透析5天，超临界干燥，得纯化甲壳素，即对照样二。
将本发明实施例一至实施例七所得的七份低免疫原性甲壳素、对比例一所得的对照样一以及对比例二所得的对照样二，分别采用双缩脲法测定甲壳素中杂蛋白残留量，并分别采用鲎试剂法测定甲壳素中内毒素残留量，实验结果列入表1。
表1不同方法所得甲壳素中杂蛋白和内毒素残留量测定结果
| 样品名称 | 杂蛋白残留量(％) | 内毒素残留量(EU/mg) |
| 实施例一 | 0.05 | 0.08 |
| 实施例二 | 0.03 | 0.05 |
| 实施例三 | 0.04 | 0.08 |
| 实施例四 | 0.10 | 0.10 |
| 实施例五 | 0.08 | 0.09 |
| 实施例六 | 0.12 | 0.11 |
| 实施例七 | 0.09 | 0.10 |
| 对照样一 | 1.20 | 0.80 |
| 对照样二 | 1.30 | 0.75 |
由表1可以看出，本发明的方法所得的低免疫原性甲壳素中，杂蛋白残留量均在0.03-0.12％之间，这明显低于对照样一和对照样二中杂蛋白残留量；并且，医药行业标准YY/T 0606.7-2008组织工程医疗产品第7部分：壳聚糖中规定，蛋白质含量小于等于0.2％(质量分数)，同时，医药行业标准YY0953-2015医用羧甲基壳聚糖中规定，羧甲基壳聚糖蛋白质残留量应不大于0.3％(质量分数)；因此，本发明的方法所得的低免疫原性甲壳素中杂蛋白残留量满足了医药行业标准YY/T 0606.7-2008组织工程医疗产品第7部分：壳聚糖以及医药行业标准YY0953-2015医用羧甲基壳聚糖的要求。另外，本发明的方法所得的低免疫原性甲壳素中，内毒素残留量均在0.05-0.11EU/mg之间，这明显低于对照样一和对照样二中内毒素残留量；并且，医药行业标准YY/T 0606.7-2008组织工程医疗产品第7部分：壳聚糖中规定，细菌内素含量小于0.5EU/mg，同时，医药行业标准YY0953-2015医用羧甲基壳聚糖中规定，细菌内毒素含量应小于0.25EU/mg；因此，本发明的方法所得的低免疫原性甲壳素中杂蛋白残留量满足了医药行业标准YY/T 0606.7-2008组织工程医疗产品第7部分：壳聚糖以及医药行业标准YY0953-2015医用羧甲基壳聚糖的要求。
因此，与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明首先将甲壳素分散于氢氧化物、无机盐和二甲基亚砜溶剂组成的混合体系中，氢氧化物在二甲基亚砜溶剂中显示出很强的碱性，从而分散和溶解甲壳素；无机盐提供金属阳离子，金属阳离子能够和甲壳素分子链内部羟基和氨基形成配位作用，破坏了原有的氢键结构，提高了甲壳素的溶胀性能，使甲壳素充分地分散并溶解到混合体系中，从而得到一种高度溶胀和分散的甲壳素纤维溶液；随后，本发明利用混合体系中的碱性物质分解甲壳素内部的杂蛋白和内毒素，处理过程中，甲壳素处于高度溶胀和分散状态，隐藏于其分子链内部的杂蛋白和内毒素能够被充分暴露出来，便于彻底的分解和去除，充分保证了去除过程的均匀性和高效性；本发明的制备方法简单，操作方便，效率高，对设备无特殊要求，易于实现产业化，所得的甲壳素在制备过程中无新增杂质引入，杂蛋白含量小于0.12％，内毒素小于0.11EU/mg，均低于医药行业标准的要求。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种低免疫原性甲壳素的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)取碱金属氢氧化物、无机盐和二甲基亚砜，将碱金属氢氧化物和无机盐分别添加到二甲基亚砜中，混合，搅拌均匀，得碱性溶液；在碱性溶液中，碱金属氢氧化物的质量浓度为0.1-15wt％，无机盐的质量浓度为0.1-1wt％；
2)取甲壳素，添加到步骤1)所得的碱性溶液中，混合，搅拌均匀，得混合溶液；在混合溶液中，甲壳素的质量浓度为0.1-15wt％；
3)将步骤2)所得的混合溶液进行热处理，处理温度为0-99℃，处理时间为0.1-72h，得反应液；
4)将步骤3)所得的反应液的pH值调节至中性，清洗，干燥，得低免疫原性甲壳素。
2.根据权利要求1所述的低免疫原性甲壳素的制备方法，其特征在于：
所述步骤3)中，所得的混合溶液在热处理之前进行超声处理，超声功率为5-50W，超声时间为0.1-6h。
3.根据权利要求2所述的低免疫原性甲壳素的制备方法，其特征在于：
所述超声处理的方式为超声3min停5min，依次反复。
4.根据权利要求1所述的低免疫原性甲壳素的制备方法，其特征在于：
所述步骤3)中，采用微波加热的方式进行热处理，处理温度为40-99℃。
5.根据权利要求1所述的低免疫原性甲壳素的制备方法，其特征在于：
所述无机盐为硝酸铁、硝酸锌、硝酸铝、硝酸铜、硫酸铁、硫酸锌、硫酸铝、硫酸铜、三氯化铁、氯化锌、三氯化铝、氯化铜中的任意一种或几种。
6.根据权利要求1所述的低免疫原性甲壳素的制备方法，其特征在于：
所述碱金属氢氧化物可为氢氧化钾、氢氧化锂、氢氧化钠中的任意一种或几种。
7.根据权利要求1所述的低免疫原性甲壳素的制备方法，其特征在于：
所述甲壳素的脱乙酰度为1-99％。
8.根据权利要求1所述的低免疫原性甲壳素的制备方法，其特征在于：
所述步骤4)中，清洗为采用无热源超纯水透析3-5天。
9.根据权利要求1所述的低免疫原性甲壳素的制备方法，其特征在于：
所述步骤4)中，干燥为冷冻干燥或超临界干燥。
10.一种低免疫原性甲壳素，其特征在于：
所述甲壳素是根据权利要求1-9中任意一项所述的低免疫原性甲壳素的制备方法制备而成。
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