WO2016163336A1 - 極性溶媒溶液及びその製造方法 - Google Patents

極性溶媒溶液及びその製造方法 Download PDF

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WO2016163336A1
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polar solvent
solution
solvent solution
viscosity
mass
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PCT/JP2016/061025
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石田花菜
山本博規
鈴村寛昭
関山和秀
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Ｓｐｉｂｅｒ株式会社
小島プレス工業株式会社
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    • C08J2389/00—Characterised by the use of proteins; Derivatives thereof

Definitions

  • the present invention relates to a polar solvent solution capable of keeping the viscosity of the solution high and a method for producing the same.
  • polar solvents such as dimethyl sulfoxide (DMSO) are easy to dissolve substances such as polymers, they are used as acrylic fiber polymerization, spinning solution, or polyimide polymerization solvent.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the present applicant has proposed the application of the polar solvent as a solvent for polypeptides such as spider silk protein and silk protein in Patent Documents 1 and 2.
  • a polar solvent solution such as dimethyl sulfoxide (DMSO) in which polypeptides such as spider silk protein and silk protein are dissolved may decrease in viscosity depending on the management method, and is used as a dope solution for spinning or film.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the present invention provides a polar solvent solution capable of stable spinning and casting without lowering the viscosity when used as a dope solution for spinning or film, and a method for producing the same.
  • the present invention is a polar solvent solution in which a solute containing a polyamino acid is dissolved in a polar solvent, and the water content (water content) in the solution is less than 5% by mass when the solution is 100% by mass.
  • the present invention relates to a polar solvent solution.
  • the present invention is also a method for producing a polar solvent solution in which a solute containing a polyamino acid is dissolved in a polar solvent, wherein the viscosity of the solution is adjusted by changing the water content in the solution.
  • the present invention relates to a method for producing a polar solvent solution.
  • the present invention is also a method for producing a polar solvent solution in which a solute containing a polyamino acid is dissolved in a polar solvent, wherein the viscosity of the solution is increased by reducing the water content in the solution.
  • the present invention relates to a method for producing a polar solvent solution.
  • the water content of the polar solvent solution obtained by dissolving a solute containing a polyamino acid in a polar solvent is less than 5% by mass, so that a significant decrease in viscosity is prevented. Stable spinning and casting is possible when used as a dope solution for film and film. Further, in the production method of the present invention, by changing the water content in a polar solvent solution in which a solute containing a polyamino acid is dissolved in a polar solvent, and adjusting the viscosity of the solution, the polarity enables stable spinning and casting. A solvent solution can be obtained. In the production method of the present invention, a polar solvent solution capable of stable spinning and casting can be obtained by decreasing the water content in the solution and increasing the viscosity of the solution.
  • FIG. 1 is a graph showing changes in viscosity with respect to temperature changes in some examples and comparative examples of the present invention.
  • FIG. 2 is a graph showing the presence or absence of humidity control, the change in viscosity when the protein concentration and temperature are changed in some other examples of the present invention.
  • FIG. 3 is a graph showing a change in moisture content when an absolutely dry spider silk protein (powder) is exposed to the atmosphere.
  • the present inventors have found that a polyamino acid (particularly, a polypeptide) itself and a polar solvent solution in which a solute containing the polyamino acid is dissolved in a polar solvent can easily absorb moisture, and lowering the viscosity becomes a problem when the moisture is absorbed. .
  • this invention is less than 5 mass% (0 mass% or more) when the said solution is 100 mass%. Less than 5% by mass).
  • the moisture content is preferably 0% by mass or more and 3% by mass or less, more preferably 0% by mass or more and 1.5% by mass or less.
  • a polyamino acid (especially polypeptide) will melt
  • the polar solvent solution may be referred to as a dope solution.
  • a polypeptide that is a typical example of a polyamino acid will be mainly described as an example.
  • the polar solvents used in the present invention are (i) dimethyl sulfoxide (DMSO), (ii) N, N-dimethylformamide (DMF), (iii) N, N-dimethylacetamide (DMA), and (iv) N Those containing at least one aprotic polar solvent selected from the group consisting of -methyl-2-pyrrolidone (NMP) are preferred. This is because these aprotic polar solvents easily dissolve the solute containing the polypeptide.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • DMF N-dimethylformamide
  • DMA N-dimethylacetamide
  • NMP -methyl-2-pyrrolidone
  • the polar solvent used in the present invention includes those containing the aprotic polar solvent described above, as well as hexafluoroisopropanol (HFIP), formic acid, various alcohols (for example, carbon such as methanol, ethanol, 2-propanol). Also included are those containing a protic polar solvent such as lower alcohols of 1-6.
  • the polar solvent has a ratio of the total amount of at least one aprotic polar solvent selected from the group of (i) to (iv) of 10 to 100 when the total amount of the polar solvent is 100% by mass. A value within the range of mass% is desirable. This increases the solubility of the solute containing the polypeptide.
  • the solute used in the present invention is not particularly limited as long as it contains a polyamino acid (in particular, a polypeptide).
  • the polyamino acid refers to a polyamide compound obtained by polymerizing an amino group and a carboxyl group of a plurality of amino acids through an amide bond.
  • the amino acid constituting the polyamide compound is preferably 15 or more, more preferably 20 or more, further preferably 30 or more, still more preferably 100 or more, and particularly preferably 500 or more. preferable.
  • the polyamino acid is preferably 6000 or less, more preferably 5000 or less, still more preferably 3000 or less, and particularly preferably 2000 or less.
  • a polyamino acid may be used alone, or, for example, one or more of non-polyamino acids such as carbohydrates and synthetic resins may be combined with a polypeptide. It may be used.
  • the solute used in the present specification may be, for example, a polypeptide alone, or a combination of one or more of non-polypeptides such as carbohydrates and synthetic resins with a polypeptide. May be used.
  • the polypeptide is preferably a structural protein, and further preferably includes a crystalline region. Such a polypeptide can exhibit high strength and toughness when formed into a fiber or film.
  • the structural protein refers to a protein related to the structure of a living organism or a protein constituting a structure created by a living organism, and examples thereof include fibroin, sericin, collagen, keratin, elastin, and resilin.
  • the polypeptide is preferably a fibroin such as a spider silk protein or a silk protein, and among them, a spider silk protein is particularly preferable. This is because spider silk proteins have high affinity with polar solvents and are easily dissolved.
  • the concentration of the solute is preferably 2 to 50% by mass, more preferably 3 to 40% by mass, and particularly preferably 5 to 30% by mass.
  • the polar solvent solution of the present invention preferably has a viscosity of 10 to 100000 mPa ⁇ s, more preferably 15 to 20000 mPa ⁇ s, in a state where unnecessary materials such as dust and bubbles are removed.
  • the pressure is preferably 100 to 10,000 mPa ⁇ s.
  • the viscosity of the polar solvent solution is adjusted by changing the water content in the polar solvent solution.
  • the manufacturing method of this invention increases the viscosity of the said polar solvent solution by reducing the water
  • the water content in the polar solvent solution is preferably less than 5% by mass, more preferably 0 to 3% by mass, and still more preferably 0 to 0% when the polar solvent solution is 100% by mass. It adjusts so that it may become 1.5 mass%. By doing so, it is possible to obtain a polar solvent solution capable of stable spinning and casting when used as a spinning or film dope solution.
  • the adjustment for reducing the water content in the solution is performed by, for example, pre-drying the solute or solvent, vacuum-drying, or during the production and storage of the solution. Adjust the relative humidity of the atmosphere in at least one of the above, or heat the manufactured solution to evaporate water, or absorb moisture using various hygroscopic agents (hygroscopic materials) such as zeolite. For example, or by appropriately combining these operations.
  • hygroscopic agents hygroscopic materials
  • zeolite zeolite
  • the relative humidity of the atmosphere in at least one of the production and storage of the solution is preferably 1.3. % RH or less is maintained.
  • processing such as solution preparation and storage in a so-called dry room.
  • DMSO which is suitably used as a polar solvent for dissolving a solute containing a polypeptide is particularly advantageously used as a solvent for dissolving a solute containing a spider silk protein, for example.
  • DMSO has a melting point of 18.4 ° C. and a boiling point of 189 ° C. Compared to the boiling point of 59 ° C. of hexafluoroisopropanol (HFIP) used in the conventional method and the boiling point of hexafluoroacetone (HFAc) —26.5 ° C. Is much higher.
  • HFIP hexafluoroisopropanol
  • HFAc hexafluoroacetone
  • DMSO is also used as a polymerization and spinning solution for acrylic fibers in the general industrial field, and is also used as a polymerization solvent for polyimide. Therefore, DMSO is a material that is low in cost and safe.
  • the spider silk protein exemplified as the polypeptide contained in the solute in the present invention is not particularly limited as long as it is derived from or similar to the natural spider silk protein (hereinafter referred to as “derived”).
  • derived from natural spider silk protein has an amino acid sequence similar to or similar to the amino acid repetitive sequence of natural spider silk protein, such as recombinant spider silk protein and natural spider silk. Examples include protein variants, analogs, and derivatives.
  • the spider silk protein is preferably a large sphincter bookmark protein produced in the spider large bottle-like gland or a spider silk protein derived therefrom.
  • Examples of the large sputum bookmark thread protein include large bottle-shaped gland spiders MaSp1 and MaSp2 derived from Nephila clavipes, and ADF3 and ADF4 derived from two-banded spider (Araneus diadematus).
  • the spider silk protein may be a sphincter bookmark silk protein produced in a spider small gland or a spider silk protein derived therefrom.
  • Examples of the small sputum bookmark thread protein include small bottle-shaped gland spidroin MiSp1 and MiSp2 derived from Nephila clavipes.
  • the spider silk protein may be a weft protein produced in the flagellate gland of the spider or a spider silk protein derived therefrom.
  • the weft protein include flagellum silk protein derived from Nephila clavipes.
  • the unit of the amino acid sequence represented by Formula 1: REP1-REP2 (1) is 2 or more, preferably 4 or more, more preferably Includes 6 or more recombinant spider silk proteins.
  • the unit of the amino acid sequence represented by the formula (1): REP1-REP2 (1) may be the same or different.
  • REP1 means a polyalanine region mainly composed of alanine and represented by (X1) p, and preferably REP1 means polyalanine.
  • p is not particularly limited, but preferably represents an integer of 2 to 20, more preferably an integer of 4 to 12.
  • X1 represents alanine (Ala), serine (Ser), or glycine (Gly).
  • the total number of residues of alanine is preferably 80% or more, more preferably 85% or more of the total number of residues of amino acids in the region.
  • alanine arranged continuously is preferably 2 residues or more, more preferably 3 residues or more, still more preferably 4 residues or more, particularly preferably 5 residues or more. It is. In the REP1, alanine continuously arranged is preferably 20 residues or less, more preferably 16 residues or less, still more preferably 12 residues or less, and particularly preferably 10 residues. Below the group.
  • REP2 is an amino acid sequence consisting of 10 to 200 amino acids, and the total number of residues of glycine, serine, glutamine, proline and alanine contained in the amino acid sequence is the total number of amino acid residues. Is 40% or more, preferably 50% or more, more preferably 60% or more.
  • the REP1 corresponds to a crystal region that forms a crystal ⁇ sheet in the fiber
  • the REP2 corresponds to an amorphous region that is more flexible and lacks a regular structure in the fiber.
  • [REP1-REP2] corresponds to a repetitive region (repetitive sequence) composed of a crystal region and an amorphous region, and is a characteristic sequence of a bookmark thread protein.
  • Examples of the spider silk protein containing two or more units of the amino acid sequence represented by the formula 1: REP1-REP2 (1) include, for example, the amino acid sequence represented by any one of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, and SEQ ID NO: 3.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is an amino acid sequence of ADF3 in which an amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) consisting of a start codon, a His10 tag and an HRV3C protease (Human rhinovirus 3C protease) recognition site is added to the N-terminus.
  • the 13th repeat region was increased to approximately double and the translation was mutated to terminate at the 1154th amino acid residue.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is a start codon at the N-terminus of the amino acid sequence of the partial amino acid sequence of ADF3 obtained from the NCBI database (NCBI Genebank accession number: AAC47010, GI: 1263287), His10 It is an amino acid sequence to which an amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) consisting of a tag and an HRV 3C protease (Human rhinovirus 3C protease) recognition site is added.
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 is an amino acid sequence of ADF3 in which an amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) consisting of a start codon, a His10 tag and an HRV3C protease (Human rhinovirus 3C protease) recognition site is added to the N-terminus.
  • the thirteenth repeat area is increased to approximately double.
  • the spider silk protein containing two or more units of the amino acid sequence represented by Formula 1: REP1-REP2 (1) is 1 in the amino acid sequence represented by any of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3.
  • a spider silk protein having an amino acid sequence in which a plurality of amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added and having a repetitive region consisting of a crystalline region and an amorphous region may be used.
  • Examples of the spider silk protein (polypeptide) derived from the above-mentioned small splint bookmark silk protein include a recombinant spider silk protein containing an amino acid sequence represented by Formula 2: REP3-REP4-REP5 (2).
  • REP3 means an amino acid sequence represented by (Gly-Gly-Z) m
  • REP4 means an amino acid sequence represented by (Gly-Ala) l
  • REP5 represents (Ala) r.
  • the amino acid sequence represented by In REP3, Z means any one amino acid, but is particularly preferably one amino acid selected from the group consisting of Ala, Tyr and Gln.
  • m is preferably 1 to 4.
  • REP4 l is preferably 0 to 4
  • REP5, r is preferably 1 to 6.
  • small splint bookmark yarn is spirally wound from the center of the spider's web, and is used as a reinforcing material for the web or as a yarn that wraps the captured prey. It is known that the tensile strength is inferior to that of the large spout tube bookmark thread, but the stretchability is high. This is because in the small spout bookmark thread, many crystal regions are formed from regions in which glycine and alanine are alternately arranged, so that the crystal region is larger than the large spout bookmark yarn in which the crystal region is formed only with alanine. This is thought to be due to the fact that the hydrogen bond in the fragile metal tends to be weak.
  • Examples of the recombinant spider silk protein (polypeptide) derived from the above weft protein include a recombinant spider silk protein containing an amino acid sequence represented by Formula 3: REP6 (3).
  • REP6 means an amino acid sequence represented by (U1) n or (U2) n.
  • U1 means an amino acid sequence represented by Gly-Pro-Gly-XX (SEQ ID NO: 12), and U2 is represented by Gly-Pro-Gly-Gly-X (SEQ ID NO: 13).
  • X means any one amino acid, but is preferably one amino acid selected from the group consisting of Ala, Ser, Tyr, Gln, Val, Leu, and Ile.
  • n represents a number of at least 4 or more, preferably 10 or more, more preferably 20 or more.
  • a great feature of spider silk is that the weft does not have a crystal region but has a repeating region consisting of an amorphous region. It is presumed that the large splint bookmark yarn has both high stress and stretchability because it has a repetitive region consisting of a crystal region and an amorphous region. On the other hand, the weft yarn is inferior in stress to the large splint guide yarn, but has high stretchability. This is considered to be because most of the weft is composed of amorphous regions.
  • the recombinant spider silk protein can be produced using a host transformed with an expression vector containing a gene encoding a natural spider silk protein to be recombined.
  • the gene production method is not particularly limited, and a gene encoding a natural spider silk protein is cloned from a spider-derived cell by polymerase chain reaction (PCR) or the like, or chemically synthesized.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the method of chemical synthesis of the gene is not particularly limited. For example, AKTA oligopilot plus 10/100 (GE Healthcare Japan Co., Ltd.) based on the amino acid sequence information of the natural spider silk protein obtained from the NCBI web database.
  • Oligonucleotides automatically synthesized by a company can be synthesized by ligation by PCR or the like.
  • a gene encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which an amino acid sequence consisting of a start codon and a His10 tag is added to the N-terminus of the amino acid sequence may be synthesized.
  • the expression vector a plasmid, phage, virus or the like capable of expressing a protein from a DNA sequence can be used.
  • the plasmid type expression vector is not particularly limited as long as it can express a target gene in a host cell and can amplify the gene itself.
  • a pET22b (+) plasmid vector when Escherichia coli Rosetta (DE3) is used as a host, a pET22b (+) plasmid vector, a pCold plasmid vector, or the like can be used. Among these, it is preferable to use a pET22b (+) plasmid vector from the viewpoint of protein productivity.
  • the host examples include animal cells, plant cells, and microorganisms.
  • Viscosity Viscosity was measured using an EMS viscometer (EMS-01S) manufactured by Kyoto Electronics Industry Co., Ltd.
  • Relative humidity The temperature and dew point temperature of the experimental environment were measured and calculated by a known calculation formula.
  • Moisture content in dope solution Measured using a hybrid Karl Fischer moisture meter (MKH-700) manufactured by Kyoto Electronics Industry Co., Ltd.
  • a pUC57 vector (with an Nde I site immediately upstream of the 5 ′ end and an Xba I site immediately downstream of the 5 ′ end) into which the ADF3Kai gene consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 had been introduced was obtained. Thereafter, the gene was treated with restriction enzymes with Nde I and EcoR I and recombined into a pET22b (+) expression vector.
  • a PCR reaction was performed using ADF3Kai as a template using a T7 promoter primer (SEQ ID NO: 8) and Rep Xba I primer (SEQ ID NO: 9), and the 5 ′ half of the ADF3Kai gene sequence
  • sequence A The sequence (hereinafter referred to as “sequence A”) was amplified, and the fragment was subjected to restriction enzyme treatment with Nde I and Xba I in advance using a Mighty Cloning Kit (manufactured by Takara Bio Inc.). Recombined.
  • PCR reaction was performed using ADF3Kai as a template and an Xba I Rep primer (SEQ ID NO: 10) and a T7 terminator primer (SEQ ID NO: 11), and the sequence of the 3 ′ half of the gene sequence of ADF3Kai (hereinafter referred to as sequence B and The fragment was recombined into a pUC118 vector previously treated with Xba I and EcoR I using a Mighty Cloning Kit (Takara Bio Inc.).
  • the pUC118 vector into which the sequence A was introduced was treated with Nde I and Xba I
  • the pUC118 vector into which the sequence B was introduced was treated with restriction enzymes with Xba I and EcoR I, respectively, and the target DNA fragments of the sequences A and B were obtained by cutting out the gel.
  • the DNA fragments A and B and pET22b (+) previously treated with Nde I and EcoR I were subjected to a ligation reaction and transformed into E. coli DH5 ⁇ .
  • ADF3Kai-Large gene shown in SEQ ID NO: 6 was confirmed.
  • the amino acid sequence of ADF3Kai-Large is as shown in SEQ ID NO: 3.
  • pET22b (+) expression vector containing the ADF3Kai-Large-NRSH1 gene sequence obtained above was transformed into Escherichia coli Rosetta (DE3). After culturing the obtained single colony in 2 ml of LB medium containing ampicillin for 15 hours, 1.4 ml of the same culture solution was added to 140 ml of LB medium containing ampicillin and cultured at 37 ° C. and 200 rpm. The culture was continued until the OD 600 was 3.5. Then, OD 600 of the culture broth of 3.5, added with 50% glucose 140ml to 2 ⁇ YT medium 7L containing ampicillin, and further cultured until an OD 600 of 4.0.
  • IPTG isopropyl- ⁇ -thiogalactopyranoside
  • ⁇ Purification> (1) About 50 g of E. coli cells expressing the ADF3Kai-Large-NRSH1 protein and 300 ml of buffer AI (20 mM Tris-HCl, pH 7.4) are added to a centrifuge tube (1000 ml), and a mixer (IKA) is added. Disperse the cells with “T18 Basic Ultra Thalax”, Level 2), and centrifuge (11,000 g, 10 minutes, room temperature) with a centrifuge (“Model 7000” manufactured by Kubota). Abandoned Qing.
  • the mixture was stirred with a shaker (manufactured by Taitec Corporation, 200 rpm, 37 ° C.) for 60 minutes. Then, it centrifuged with the said Kubota centrifuge (11,000g, 30 minutes, room temperature), the supernatant liquid was thrown away, and the SDS washing
  • the SDS washed granules were suspended in a DMSO solution containing 1M lithium chloride to a concentration of 100 mg / ml and heat-treated at 80 ° C. for 1 hour. Then, it centrifuged with the said Kubota centrifuge (11,000g, 30 minutes, room temperature), and collect
  • the degree of purification of the target protein ADF3Kai-Large-NRSH1 (about 56.1 kDa) in the obtained freeze-dried powder was obtained by using the total lab (nonlinear dynamics ltd.) Of the results of polyacrylamide gel electrophoresis (CBB staining) of the powder. This was confirmed by analysis. As a result, the purification degree of ADF3Kai-Large-NRSH1 was about 85%.
  • Examples 1 to 4 in which the water content in the dope solution is less than 5% by mass are compared with Comparative Example 1 in which the water content in the dope solution is 5% by mass.
  • the viscosity is high regardless of the temperature, and the rate of increase in viscosity with a decrease in temperature is clearly increased.
  • the lower the water content, the higher the viscosity, and the viscosity of Example 1 having a water content of 0% by mass is the highest.
  • the viscosities of Examples 1 to 4 are extremely large, 2.8 to 4.7 times that of Comparative Example 1.
  • Examples 5 to 9 In this experiment, the presence or absence of humidity control and the change in viscosity when the spider silk protein concentration and temperature were changed were examined.
  • the spider silk protein (powder) obtained above was vacuum-dried (absolutely dried) and then completely dried (moisture content was 0 mass) in a dry room with an atmospheric relative humidity of 1.3% RH or less. %)
  • Spider silk protein (powder) was dissolved in a DMSO solvent so as to have the concentrations shown in Table 2 below to produce four types of dope solutions (Examples 5 to 8) having different spider silk protein concentrations, Thereafter, the four types of dope solutions of Examples 5 to 8 were stored in a dry room having a relative humidity of 1.3% RH or less for 24 hours.
  • Example 9 a completely dried spider silk protein (powder) is dissolved in a DMSO solvent so as to have a concentration of 22.0% by mass, and a dope solution (implemented) Example 9) was prepared.
  • the dope solution of Example 9 was stored for 24 hours in a normal laboratory where the humidity was not controlled. Each condition was as shown in Table 2 below. Then, the relationship between the temperature and viscosity of the dope solutions of Examples 5 to 9 was examined. The results are shown in FIG.
  • the relationship between the temperature and the viscosity of the dope solution of Example 9 (protein concentration 22.0% by mass produced and stored in an environment where humidity is not controlled)
  • the relationship between the temperature and viscosity of the dope solution having a stored protein concentration of 20.5% by mass is substantially the same. This is presumably because moisture in the atmosphere was mixed in the dope liquid of Example 9 while the dope liquid of Example 9 was manufactured and stored. From these results, it was confirmed that the viscosity of the dope solution can be maintained high by reducing the relative humidity of the atmosphere and suppressing the water absorption of the dope solution during the production and storage of the dope solution.
  • the viscosity of the dishwashing detergent before adding water at a temperature of 50 ° C. was 143 mPa ⁇ s
  • the viscosity of the dishwashing detergent after adding water at a temperature of 50 ° C. was 133 mPa ⁇ s.
  • the rate of decrease in viscosity at a temperature of 50 ° C. due to the addition of moisture in the dishwashing detergent was 7%.
  • the viscosity at 50 ° C. of the dope liquid of Example 1 is 153 mPa ⁇ s
  • the reason why the viscosity of the polar solvent solution of the polypeptide is extremely decreased by the incorporation (containment) of water into the solution is considered to be as follows.
  • Amino acids constituting a protein (polypeptide) molecule have various side chains. Therefore, when water molecules enter the protein polar solvent solution, hydrogen bonds are formed between the side chains of the protein molecules, causing the protein molecules to aggregate. Thereby, it is thought that the solubility of protein falls and the viscosity of the polar solvent solution of protein falls. Therefore, conversely, if water molecules are removed from the protein polar solvent solution, it is possible to suppress the aggregation of protein molecules and increase the solubility of the protein in the polar solvent solution. It is believed that the viscosity of the solution can be increased.
  • the polar solvent solution of the present invention is useful for wet spinning, film casting, gels, particles, mesh bodies, and various molded products.

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Abstract

　本発明の極性溶媒溶液は、ポリアミノ酸を含む溶質を極性溶媒に溶解した極性溶媒溶液であって、前記溶液を１００質量％としたときの前記溶液中の水分含有量が５質量％未満とされている。本発明の製造方法は、前記溶液中の水分含有量を変えることにより、前記溶液の粘度を調整する。また、本発明の製造方法は、前記溶液中の水分含有量を減少させることにより、前記溶液の粘度を増加させる。これにより、本発明は、紡糸やフィルムなどのドープ液などとして使用する際に、粘度低下することがなく、安定した紡糸やキャスティングができる極性溶媒溶液及びその製造方法を提供する。

Description

極性溶媒溶液及びその製造方法
　本発明は、溶液の粘度を高く保つことが可能な極性溶媒溶液及びその製造方法に関する。
　ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの極性溶媒はポリマーなどの物質を溶解しやすいことから、アクリル繊維の重合、紡糸液、又はポリイミドの重合溶媒などとして使用されている。本出願人はクモ糸タンパク質及びシルクタンパク質などのポリペプチドの溶媒として前記極性溶媒の適用を特許文献１～２で提案している。
特許第５４２７３２２号公報 特許第５５８４９３２号公報
　しかし、クモ糸タンパク質及びシルクタンパク質などのポリペプチドを溶解させたジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの極性溶媒溶液は、管理の仕方によっては粘度低下することがあり、紡糸やフィルムなどのドープ液として使用する際に、安定した紡糸やキャスティングを行うという観点からは、改善の余地があった。
　本発明は、紡糸やフィルムなどのドープ液として使用する際に、粘度低下することがなく、安定した紡糸やキャスティングができる極性溶媒溶液及びその製造方法を提供する。
　本発明は、ポリアミノ酸を含む溶質を極性溶媒に溶解した極性溶媒溶液であって、前記溶液を１００質量％としたときの前記溶液中の水分含有量（水分含有率）が５質量％未満であることを特徴とする極性溶媒溶液に関する。
　本発明は、また、ポリアミノ酸を含む溶質を極性溶媒に溶解した極性溶媒溶液の製造方法であって、前記溶液中の水分含有量を変えることにより、前記溶液の粘度を調整することを特徴とする極性溶媒溶液の製造方法に関する。
　本発明は、また、ポリアミノ酸を含む溶質を極性溶媒に溶解した極性溶媒溶液の製造方法であって、前記溶液中の水分含有量を減少させることにより、前記溶液の粘度を増加させることを特徴とする極性溶媒溶液の製造方法に関する。
　本発明の極性溶媒溶液は、ポリアミノ酸を含む溶質を極性溶媒に溶解した極性溶媒溶液の水分含有量が５質量％未満とされていることで、格段の粘度低下が防止され、それにより、紡糸やフィルムなどのドープ液として使用した際などに、安定した紡糸やキャスティングができる。また本発明の製造方法では、ポリアミノ酸を含む溶質を極性溶媒に溶解した極性溶媒溶液中の水分含有量を変えて、前記溶液の粘度を調整することにより、安定した紡糸やキャスティングが可能な極性溶媒溶液を得ることができる。また本発明の製造方法では、前記溶液中の水分含有量を減少させて、前記溶液の粘度を増加させることにより、安定した紡糸やキャスティングが可能な極性溶媒溶液を得ることができる。
図１は本発明の幾つかの実施例と比較例における温度変化に対する粘度変化を調べたグラフである。 図２は本発明の別の幾つかの実施例における湿度管理の有無とタンパク質濃度と温度を変えたときの粘度変化を調べたグラフである。 図３は絶乾状態のクモ糸タンパク質（粉体）を大気に暴露したときの含水率の変化を示すグラフである。
　本発明者らは、ポリアミノ酸（特に、ポリペプチド）自体も、前記ポリアミノ酸を含む溶質を極性溶媒に溶解した極性溶媒溶液も吸湿しやすく、吸湿すると粘度低下などが問題となることを見出した。このため、本発明は、ポリアミノ酸を含む溶質を極性溶媒に溶解した極性溶媒溶液において、前記溶液を１００質量％としたときの前記溶液中の水分含有量が５質量％未満（０質量％以上、５質量％未満）とされる。好ましい水分含有量は０質量％以上、３質量％以下であり、更に好ましくは０質量％以上、１．５質量％以下である。前記の範囲であれば、極性溶媒にポリアミノ酸（特に、ポリペプチド）は膨潤した状態で溶解し、極性溶媒溶液の粘度が高く維持される。水分含有量が５質量％以上となると粘度が格段に低下し、紡糸やフィルムなどを作製するためのドープ液などとして使用した際に紡糸性やキャスティング性が低下する。本明細書においては、前記極性溶媒溶液をドープ液と言う場合もある。以下、主として、ポリアミノ酸の代表例であるポリペプチドを例に説明する。
　本発明で使用される極性溶媒は、（i）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、（ii）Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、（iii）Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、及び（iv）Ｎ－メチル－２－ピロリドン（ＮＭＰ）からなる群から選ばれる少なくとも一つの非プロトン性極性溶媒を含むものが好ましい。これらの非プロトン性極性溶媒はポリペプチドを含む溶質を溶解させやすいからである。また、本発明で使用される極性溶媒には、前記した非プロトン性極性溶媒を含むものの他、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）やギ酸、各種のアルコール（例えば、メタノール、エタノール、２－プロパノールなどの炭素数１～６の低級アルコール）などのプロトン性極性溶媒を含むものも含まれる。なお、前記極性溶媒は、前記極性溶媒の全体を１００質量％としたとき、前記（i）～（iv）なる群から選ばれる少なくとも一つの非プロトン性極性溶媒の合計量の割合が１０～１００質量％の範囲内の値であることが望ましい。これによって、ポリペプチドを含む溶質の溶解度が高められる。
　本発明で使用される溶質は、ポリアミノ酸（特に、ポリペプチド）を含むものであればよく、特に限定されない。本明細書において、ポリアミノ酸とは、複数のアミノ酸のアミノ基とカルボキシル基とがアミド結合して重合したポリアミド化合物を言う。ポリアミノ酸としては、ポリアミド化合物を構成するアミノ酸が、１５以上であることが好ましく、２０以上であることがより好ましく、３０以上であることがさらに好ましく、１００以上がよりさらに好ましく、５００以上が特に好ましい。ポリアミノ酸としては、６０００以下であることが好ましく、５０００以下であることがより好ましく、３０００以下であることがさらに好ましく、２０００以下であることが特に好ましい。本明細書で使用される溶質は、例えば、ポリアミノ酸を単独で用いてもよく、或いは例えば炭水化物や合成樹脂等のポリアミノ酸以外のもののうちの１種又は２種以上とポリペプチドとを組み合わせて用いてもよい。また本明細書で使用される溶質は、例えば、ポリペプチドを単独で用いてもよく、或いは例えば炭水化物や合成樹脂等のポリペプチド以外のもののうちの１種又は２種以上とポリペプチドとを組み合わせて用いてもよい。前記ポリペプチドは、構造タンパク質であることが好ましく、更に結晶領域を含むものが好ましい。このようなポリペプチドは繊維やフィルムにしたときに高い強度やタフネスを発揮できる。なお、構造タンパク質とは、生物体の構造に関わるタンパク質、或いは生物体が作り出す構造体を構成するタンパク質を言い、例えば、フィブロイン、セリシン、コラーゲン、ケラチン、エラスチン、レシリンなどが挙げられる。
　また、前記ポリペプチドは、クモ糸タンパク質やシルクタンパク質などのフィブロインが好ましく、その中でも特にクモ糸タンパク質が好ましい。クモ糸タンパク質は極性溶媒と親和性が高く、溶解しやすいからである。
　本発明の極性溶媒溶液を１００質量％としたとき、溶質（例えば、クモ糸タンパク質）の濃度は２～５０質量％であることが望ましく、更に好ましくは３～４０質量％であり、特に好ましくは５～３０質量％である。このような濃度とすることによって、極性溶媒溶液の粘度の低下や過剰な上昇を効果的に防止できる。
　本発明の極性溶媒溶液は、粘度が、好ましくはゴミなどの不要物や泡などを取り除いた状態で１０～１０００００ｍＰａ・ｓとされることが望ましく、更に好ましくは１５～２００００ｍＰａ・ｓとされ、特に好ましくは１００～１００００ｍＰａ・ｓとされる。このような範囲内の粘度の極性溶媒溶液をドープ液として用いることで、良好に湿式紡糸したりフィルムキャスト成形したりすることができる。
　本発明の製造方法は、前記極性溶媒溶液中の水分含有量を変えることによって、前記極性溶媒溶液の粘度を調整するものである。また、本発明の製造方法は、前記極性溶媒溶液中の水分含有量を減少させることにより、前記極性溶媒溶液の粘度を増加させるものである。これらの製法では、前記極性溶媒溶液中の水分含有量を、前記極性溶媒溶液を１００質量％としたときに、好ましくは５質量％未満、より好ましくは０～３質量％、更に好ましくは０～１．５質量％となるように調整する。そうすることで、紡糸やフィルムのドープ液などとして使用した際に安定した紡糸やキャスティングが可能な極性溶媒溶液を得ることができる。
　本発明の製造方法においては、前記溶液中の水分含有量を減らすための調整が、例えば、前記溶質や溶媒を予め加熱乾燥したり、真空乾燥したり、前記溶液の製造時と貯蔵時のうちの少なくとも何れか一方における雰囲気の相対湿度を調整したり、若しくは製造された前記溶液を加熱して水分を蒸発させたり、ゼオライトを始めとした各種の吸湿剤（吸湿材）などを用いて吸湿したりすることなどによって、又はそれらの操作を適宜に組み合わせたりすることなどによって実現される。なお、前記溶液中の水分含有量を減らすための調整方法としては、前記溶質を前記溶媒に溶解させる前に乾燥させる方法が好適に採用される。これによって、前記溶液中の水分含有量をより確実かつ効率的に減らすことができる。また、雰囲気の相対湿度の調整によって前記溶液中の水分含有量を変える場合には、前記溶液の製造時と貯蔵時のうちの少なくとも何れか一方における雰囲気の相対湿度が、有利には１．３％ＲＨ以下の条件に保たれる。雰囲気を相対湿度１．３％ＲＨ以下の条件に保つには、溶液作製や保存などの処理をいわゆるドライルーム内でするのが好ましい。
　本発明において、ポリペプチドを含む溶質を溶解する極性溶媒として好適に用いられるＤＭＳＯは、例えば、クモ糸タンパク質を含む溶質を溶解する溶媒として、特に有利に使用される。ＤＭＳＯは融点１８．４℃、沸点１８９℃であり、従来法で使用されているヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）の沸点５９℃、ヘキサフルオロアセトン（ＨＦＡｃ）の沸点－２６．５℃に比べると、沸点ははるかに高い。また、ＤＭＳＯは、一般産業分野においてもアクリル繊維の重合、紡糸液として使用され、ポリイミドの重合溶媒としても使用されていることから、コストも安く安全性も確認されている物質である。
　本発明において溶質に含まれるポリペプチドとして例示されるクモ糸タンパク質は、天然クモ糸タンパク質と、天然クモ糸タンパク質に由来又は類似（以下、由来と言う。）するものであればよく、特に限定されない。また、ここで言う天然クモ糸タンパク質に由来するものとは、天然クモ糸タンパク質が有するアミノ酸の反復配列と同様乃至類似のアミノ酸配列を有するものであって、例えば組換えクモ糸タンパク質や天然クモ糸タンパク質の変異体、類似体又は誘導体などが挙げられる。前記クモ糸タンパク質は、強靭性に優れるという観点からクモの大瓶状腺で産生される大吐糸管しおり糸タンパク質やそれに由来するクモ糸タンパク質であることが好ましい。前記大吐糸管しおり糸タンパク質としては、アメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ）に由来する大瓶状腺スピドロインＭａＳｐ１やＭａＳｐ２、二ワオニグモ（Ａｒａｎｅｕｓ　ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）に由来するＡＤＦ３やＡＤＦ４などが挙げられる。
　上記クモ糸タンパク質は、クモの小瓶状腺で産生される小吐糸管しおり糸タンパクやそれに由来するクモ糸タンパク質であってもよい。上記小吐糸管しおり糸タンパク質としては、アメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ）に由来する小瓶状腺スピドロインＭｉＳｐ１やＭｉＳｐ２が挙げられる。
　その他にも、上記クモ糸タンパク質は、クモの鞭毛状腺（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍ　ｇｌａｎｄ）で産生される横糸タンパク質やそれに由来するクモ糸タンパク質であってもよい。上記横糸タンパク質としては、例えばアメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ　ｃｌａｖｉｐｅｓ）に由来する鞭毛状絹タンパク質（ｆｌａｇｅｌｌｉｆｏｒｍ　ｓｉｌｋ　ｐｒｏｔｅｉｎ）などが挙げられる。
　前記大吐糸管しおり糸タンパク質に由来するクモ糸タンパク質（ポリペプチド）としては、例えば、式１：ＲＥＰ１－ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位を２以上、好ましくは４以上、より好ましくは６以上含む組換えクモ糸タンパク質が挙げられる。なお、前記組換えクモ糸タンパク質において、式（１）：ＲＥＰ１－ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位は、同一であってもよく、異なっていてもよい。
　前記式（１）において、ＲＥＰ１は、主としてアラニンにより構成され（Ｘ１）ｐで表されるポリアラニン領域を意味し、好ましくはＲＥＰ１はポリアラニンを意味する。ここで、ｐは特に限定されるものではないが、好ましくは２～２０の整数，より好ましくは４～１２の整数を示す。Ｘ１は、アラニン（Ａｌａ）、セリン（Ｓｅｒ）、又はグリシン（Ｇｌｙ）を示す。（Ｘ１）ｐで表されるポリアラニン領域において、アラニンの合計残基数が該領域のアミノ酸の合計残基数の８０％以上であることが好ましく、より好ましくは８５％以上である。前記ＲＥＰ１において、連続して並んでいるアラニンは、２残基以上であることが好ましく、より好ましくは３残基以上であり、さらに好ましくは４残基以上であり、特に好ましくは５残基以上である。また、前記ＲＥＰ１において、連続して並んでいるアラニンは、２０残基以下であることが好ましく、より好ましくは１６残基以下であり、さらに好ましくは１２残基以下であり、特に好ましくは１０残基以下である。前記式（１）において、ＲＥＰ２は１０～２００残基のアミノ酸からなるアミノ酸配列であり、前記アミノ酸配列中に含まれるグリシン、セリン、グルタミン、プロリン及びアラニンの合計残基数がアミノ酸残基数全体に対して４０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは６０％以上である。
　前記ＲＥＰ１は繊維内で結晶βシートを形成する結晶領域に該当し、前記ＲＥＰ２は繊維内でより柔軟性があり大部分が規則正しい構造を欠いている無定型領域に該当する。そして、前記［ＲＥＰ１－ＲＥＰ２］は、結晶領域と無定型領域からなる繰り返し領域（反復配列）に該当し、しおり糸タンパク質の特徴的配列である。
　前記式１：ＲＥＰ１－ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位を２以上含むクモ糸タンパク質としては、例えば、配列番号１、配列番号２及び配列番号３の何れかに示されているアミノ酸配列を有するＡＤＦ３由来の組換えクモ糸タンパク質が挙げられる。配列番号１に示されるアミノ酸配列は、Ｎ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎ　ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ　３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号４）を付加したＡＤＦ３のアミノ酸配列において、第１～１３番目の反復領域をおよそ２倍になるように増やすとともに、翻訳が１１５４番目アミノ酸残基で終止するように変異させたものである。配列番号２に示されているアミノ酸配列は、ＮＣＢＩデータベースから入手したＡＤＦ３の部分的なアミノ酸配列（ＮＣＢＩのＧｅｎｅｂａｎｋのアクセッション番号：ＡＡＣ４７０１０、ＧＩ：１２６３２８７）のアミノ酸配列のＮ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎ　ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ　３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号４）を付加したアミノ酸配列である。配列番号３に示されるアミノ酸配列は、Ｎ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎ　ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ　３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号４）を付加したＡＤＦ３のアミノ酸配列において、第１～１３番目の反復領域をおよそ２倍になるように増やしたものである。また、前記式１：ＲＥＰ１－ＲＥＰ２（１）で示されるアミノ酸配列の単位を２以上含むクモ糸タンパク質としては、配列番号１、配列番号２及び配列番号３の何れかに示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列からなり、結晶領域と無定型領域からなる繰り返し領域を有するクモ糸タンパク質を用いてもよい。
　上記小吐糸管しおり糸タンパク質に由来するクモ糸タンパク質（ポリペプチド）としては、例えば、式２：ＲＥＰ３－ＲＥＰ４－ＲＥＰ５（２）で示されるアミノ酸配列を含む組換えクモ糸タンパク質が挙げられる。上記式２において、ＲＥＰ３は（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｚ）ｍで表されるアミノ酸配列を意味し、ＲＥＰ４は、（Ｇｌｙ－Ａｌａ）ｌで表されるアミノ酸配列を意味し、ＲＥＰ５は（Ａｌａ）ｒで表されるアミノ酸配列を意味する。ＲＥＰ３において、Ｚは任意の一つのアミノ酸を意味するが、特にＡｌａ、Ｔｙｒ及びＧｌｎからなる群から選ばれる一つのアミノ酸であることが好ましい。またＲＥＰ３において、ｍは１～４であることが好ましく、ＲＥＰ４においてｌは０～４であることが好ましく、ＲＥＰ５においてｒは１～６であることが好ましい。
　クモ糸において、小吐糸管しおり糸はクモの巣の中心から螺旋状に巻かれ、巣の補強材として使われたり、捉えた獲物を包む糸として利用されたりする。大吐糸管しおり糸と比べると引っ張り強度は劣るが伸縮性は高いことが知られている。これは小吐糸管しおり糸において、多くの結晶領域がグリシンとアラニンが交互に連なる領域から形成されているため、アラニンのみで結晶領域が形成されている大吐糸管しおり糸よりも結晶領域の水素結合が弱くなりやすいためと考えられている。
　上記横糸タンパク質に由来する組換えクモ糸タンパク質（ポリペプチド）としては、例えば、式３：ＲＥＰ６（３）で示されるアミノ酸配列を含む組換えクモ糸タンパク質が挙げられる。前記式３において、ＲＥＰ６は（Ｕ１）ｎ、又は、（Ｕ２）ｎで表されるアミノ酸配列を意味する。ＲＥＰ６において、Ｕ１は、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｘ－Ｘ（配列番号１２）で表されるアミノ酸配列を意味し、Ｕ２は、Ｇｌｙ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｘ（配列番号１３）で表されるアミノ酸配列を意味する。また、Ｕ１及びＵ２において、Ｘは任意の一つのアミノ酸を意味するが、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅからなる群から選ばれる一つのアミノ酸であることが好ましく、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｇｌｎ及びＶａｌからなる群から選ばれる一つのアミノ酸であることがより好ましく、複数あるＸは、同一であっても異なってもよい。またＲＥＰ６において、ｎは少なくとも４以上の数字を表し、好ましくは１０以上、より好ましくは２０以上である。
　クモ糸において、横糸は結晶領域を持たず、無定形領域からなる繰り返し領域を持つことが大きな特徴である。大吐糸管しおり糸などにおいては結晶領域と無定形領域からなる繰り返し領域を持つため、高い応力と伸縮性を併せ持つと推測される。一方、横糸については、大吐糸管しおり糸に比べると応力は劣るが、高い伸縮性を持つ。これは横糸の大部分が無定形領域によって構成されているためだと考えられている。
　前記組換えクモ糸タンパク質（ポリペプチド）は、組換えの対象となる天然型クモ糸タンパク質をコードする遺伝子を含有する発現ベクターで形質転換した宿主を用いて製造することができる。遺伝子の製造方法は特に制限されず、天然型クモ糸タンパク質をコードする遺伝子をクモ由来の細胞からポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などで増幅してクローニングするか、若しくは化学的に合成する。遺伝子の化学的な合成方法も特に制限されず、例えば、ＮＣＢＩのウェブデータベースなどより入手した天然型クモ糸タンパク質のアミノ酸配列情報をもとに、ＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ　ｐｌｕｓ　１０／１００（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）などで自動合成したオリゴヌクレオチドをＰＣＲなどで連結して合成することができる。この際に、タンパク質の精製や確認を容易にするため、前記のアミノ酸配列のＮ末端に開始コドン及びＨｉｓ１０タグからなるアミノ酸配列を付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子を合成してもよい。前記発現ベクターとしては、ＤＮＡ配列からタンパク質を発現し得るプラスミド、ファージ、ウイルスなどを用いることができる。前記プラスミド型発現ベクターとしては、宿主細胞内で目的の遺伝子が発現し、かつそれ自体が増幅することのできるものであればよく、特に限定されない。例えば宿主として大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）を用いる場合は、ｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドベクター、ｐＣｏｌｄプラスミドベクターなどを用いることができる。中でも、タンパク質の生産性の観点から、ｐＥＴ２２ｂ（＋）プラスミドベクターを用いることが好ましい。前記宿主としては、例えば動物細胞、植物細胞、微生物などを用いることができる。
　以下実施例を用いて、本発明をさらに具体的に説明する。なお、本発明は下記の実施例に限定されるものではない。
＜各測定方法＞
（１）粘度：京都電子工業株式会社製のＥＭＳ粘度計（ＥＭＳ－０１Ｓ）を使用して測定した。
（２）相対湿度：実験環境の温度と露点温度を測定し、公知の計算式にて算出した。
（３）ドープ液中の水分率：京都電子工業株式会社製のハイブリッドカールフィッシャー水分計(ＭＫＨ－７００)を使用して測定した。
　（実施例１～４、比較例１）
１．クモ糸タンパク質の準備
　＜遺伝子合成＞
（１）ＡＤＦ３Ｋａｉの遺伝子の合成
　ニワオニグモの２つの主要なしおり糸タンパク質の一つであるＡＤＦ３（ＧＩ：１２６３２８７）の部分的なアミノ酸配列をＮＣＢＩのウェブデータベースより取得し、同配列のＮ末端に開始コドン、Ｈｉｓ１０タグ及びＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ（Ｈｕｍａｎ　ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ３Ｃプロテアーゼ）認識サイトからなるアミノ酸配列（配列番号４）を付加したアミノ酸配列（配列番号２）をコードする遺伝子を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社に合成委託した。その結果、配列番号５で示す塩基配列からなるＡＤＦ３Ｋａｉの遺伝子が導入されたｐＵＣ５７ベクター（遺伝子の５’末端直上流にＮｄｅ　Ｉサイト、及び５’末端直下流にＸｂａ　Ｉサイトあり）を取得した。その後、同遺伝子をＮｄｅ　Ｉ及びＥｃｏＲ　Ｉで制限酵素処理し、ｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターに組み換えた。
（２）ＡＤＦ３Ｋａｉ－Ｌａｒｇｅの遺伝子の合成
　ＡＤＦ３Ｋａｉを鋳型にＴ７プロモータープライマー（配列番号８）とＲｅｐ　Ｘｂａ　Ｉプライマー（配列番号９）を用いてＰＣＲ反応を行い、ＡＤＦ３Ｋａｉの遺伝子配列における５’側半分の配列（以下、配列Ａと記す。）を増幅し、同断片をＭｉｇｈｔｙ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を使用して、予めＮｄｅ　Ｉ及びＸｂａ　Ｉで制限酵素処理をしておいたｐＵＣ１１８ベクターに組み換えた。同様に、ＡＤＦ３Ｋａｉを鋳型にＸｂａ　Ｉ　Ｒｅｐプライマー（配列番号１０）とＴ７ターミネータープライマー（配列番号１１）を用いてＰＣＲ反応を行い、ＡＤＦ３Ｋａｉの遺伝子配列における３’側半分の配列（以下、配列Ｂと記す。）を増幅し、同断片をＭｉｇｈｔｙ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を使用して、予めＸｂａ　Ｉ、ＥｃｏＲ　Ｉで制限酵素処理をしておいたｐＵＣ１１８ベクターに組み換えた。配列Ａの導入されたｐＵＣ１１８ベクターをＮｄｅ　Ｉ、Ｘｂａ　Ｉで、配列Ｂの導入されたｐＵＣ１１８ベクターをＸｂａ　Ｉ、ＥｃｏＲ　Ｉでそれぞれ制限酵素処理し、ゲルの切り出しによって配列Ａ及び配列Ｂの目的ＤＮＡ断片を精製した。ＤＮＡ断片Ａ、Ｂ及び予めＮｄｅ　Ｉ及びＥｃｏＲ　Ｉで制限酵素処理をしておいたｐＥＴ２２ｂ（＋）をライゲーション反応させ、大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。Ｔ７プロモータープライマー及びＴ７ターミネータープライマーを用いたコロニーＰＣＲにより、目的ＤＮＡ断片の挿入を確認した後、目的サイズ（３．６　ｋｂｐ）のバンドが得られたコロニーからプラスミドを抽出し、３１３０ｘｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたシーケンス反応により全塩基配列を確認した。その結果、配列番号６に示すＡＤＦ３Ｋａｉ－Ｌａｒｇｅの遺伝子の構築が確認された。なお、ＡＤＦ３Ｋａｉ－Ｌａｒｇｅのアミノ酸配列は配列番号３で示すとおりである。
（３）ＡＤＦ３Ｋａｉ－Ｌａｒｇｅ－ＮＲＳＨ１の遺伝子の合成
　前記で得られたＡＤＦ３Ｋａｉ－Ｌａｒｇｅの遺伝子が導入されたｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクターを鋳型に、ＰｒｉｍｅＳｔａｒ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｂａｓａｌ　Ｋｉｔ（タカラバイオ株式会社製）を用いた部位特異的変異導入により、ＡＤＦ３Ｋａｉ－Ｌａｒｇｅのアミノ酸配列（配列番号３）における１１５５番目のアミノ酸残基グリシン（Ｇｌｙ）に対応するコドンＧＧＣを終止コドンＴＡＡに変異させ、配列番号７に示すＡＤＦ３Ｋａｉ－Ｌａｒｇｅ－ＮＲＳＨ１の遺伝子をｐＥＴ２２ｂ（＋）上に構築した。変異の導入の正確性については、３１３０ｘｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いたシーケンス反応により確認した。なお、ＡＤＦ３Ｋａｉ－Ｌａｒｇｅ－ＮＲＳＨ１のアミノ酸配列は配列番号１で示すとおりである。
　＜タンパク質の発現＞
　前記で得られたＡＤＦ３Ｋａｉ－Ｌａｒｇｅ－ＮＲＳＨ１の遺伝子配列を含むｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクターを、大腸菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）に形質転換した。得られたシングルコロニーを、アンピシリンを含む２ｍｌのＬＢ培地で１５時間培養後、同培養液１．４ｍｌを、アンピシリンを含む１４０ｍｌのＬＢ培地に添加し、３７℃、２００ｒｐｍの条件下で、培養液のＯＤ６００が３．５になるまで培養した。次に、ＯＤ６００が３．５の培養液を、アンピシリンを含む７Ｌの２×ＹＴ培地に５０％グルコース１４０ｍｌと共に加え、ＯＤ６００が４．０になるまでさらに培養した。その後、得られたＯＤ６００が４．０の培養液に、終濃度が０．５ｍＭになるようにイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加してタンパク質発現を誘導した。ＩＰＴＧ添加後２時間経過した時点で、培養液を遠心分離し、菌体を回収した。ＩＰＴＧ添加前とＩＰＴＧ添加後の培養液から調製したタンパク質溶液をポリアクリルアミドゲルに泳動させたところ、ＩＰＴＧ添加に依存して目的サイズ（約１０１．１ｋＤａ）のバンドが観察され、目的とするタンパク質が発現していることを確認した。
　＜精製＞
（１）遠沈管（１０００ｍｌ）にＡＤＦ３Ｋａｉ－Ｌａｒｇｅ－ＮＲＳＨ１のタンパク質を発現している大腸菌の菌体約５０ｇと、緩衝液ＡＩ（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４）３００ｍｌを添加し、ミキサー（ＩＫＡ社製「Ｔ１８ベーシック　ウルトラタラックス」、レベル２）で菌体を分散させた後、遠心分離機（クボタ製の「Ｍｏｄｅｌ　７０００」）で遠心分離（１１，０００ｇ、１０分、室温）し、上清を捨てた。
（２）遠心分離で得られた沈殿物（菌体）に緩衝液ＡＩを３００ｍｌと、０．１ＭのＰＭＳＦ（イソプロパノールで溶解）を３ｍｌ添加し、前記ＩＫＡ社製のミキサー（レベル２）で３分間分散させた。その後、高圧ホモジナイザー（ＧＥＡ　Ｎｉｒｏ　Ｓａｏｖｉ社製の「Ｐａｎｄａ　Ｐｌｕｓ　２０００」）を用いて菌体を繰り返し３回破砕した。
（３）破砕された菌体に、３ｗ／ｖ％のＳＤＳを含む緩衝液Ｂ（５０ｍＭ　ＴｒｉｓーＨＣｌ、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）３００ｍｌを加え、前記ＩＫＡ社製のミキサー（レベル２）で良く分散させた後、シェイカー（タイテック社製、２００ｒｐｍ、３７℃）で６０分間攪拌した。その後、前記クボタ製の遠心分離機で遠心分離（１１，０００ｇ、３０分、室温）し、上清を捨て、ＳＤＳ洗浄顆粒（沈殿物）を得た。
（４）ＳＤＳ洗浄顆粒を１００ｍｇ／ｍｌの濃度になるよう１Ｍの塩化リチウムを含むＤＭＳＯ溶液で懸濁し、８０℃で１時間熱処理した。その後、前記クボタ製の遠心分離機で遠心分離（１１，０００ｇ、３０分、室温）し、上清を回収した。
（５）回収した上清に対して３倍量のエタノールを準備し、エタノールに回収した上清を加え、室温で１時間静置した。その後、前記クボタ製の遠心分離機で遠心分離（１１，０００ｇ、３０分、室温）し、凝集タンパク質を回収した。次に純水を用いて凝集タンパク質を洗浄し、遠心分離により凝集タンパク質を回収するという工程を３回繰り返した後、凍結乾燥機で水分を除き、凍結乾燥粉末を回収した。得られた凍結乾燥粉末における目的タンパク質ＡＤＦ３Ｋａｉ－Ｌａｒｇｅ－ＮＲＳＨ１（約５６．１ｋＤａ）の精製度は、粉末のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＣＢＢ染色）の結果をＴｏｔａｌｌａｂ（ｎｏｎｌｉｎｅａｒ　ｄｙｎａｍｉｃｓ　ｌｔｄ．）を用いて画像解析することにより確認した。その結果、ＡＤＦ３Ｋａｉ－Ｌａｒｇｅ－ＮＲＳＨ１の精製度は約８５％であった。
２．ドープ液の調整と粘度測定
　前記で得られたクモ糸タンパク質（粉体）を真空乾燥（絶乾）した後、この絶乾状態のクモ糸タンパク質を、予め所定量ずつ準備しておいた５つのＤＭＳＯ溶媒にそれぞれ濃度１５質量％の割合で添加し、その後、それらクモ糸タンパク質が添加された５つのＤＭＳＯ溶媒のうちの４つに、互いに異なる量の純水を添加し、混合して、水分含有量（水分率）が下記表１に示す値となる５種類のドープ液を作製した。それら５種類のドープ液のうち、水分含有量が０質量％、０．７５質量％、１．５質量％、３質量％のものはそれぞれ実施例１、実施例２、実施例３、実施例４であり、水分含有量が５質量％のものは比較例１であった。なお、それら実施例１～４と比較例１の５種類のドープ液の作製に際しては、シェイカーを用いて、クモ糸タンパク質を５時間溶解した後、ゴミと泡を取り除いた。この処理はすべて相対湿度１．３％ＲＨ以下のドライルームで行った。保存も相対湿度１．３％ＲＨ以下のドライルームで行った。そして、実施例１～４のドープ液と比較例１のドープ液のそれぞれについて、温度を変えたときの粘度変化を調べた。それらの結果を下記表１と図１に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１及び図１から明らかなとおり、ドープ液中の水分含有量が５質量％未満の実施例１～４は、ドープ液中の水分含有量が５質量％である比較例１に比して、温度に関係なく粘度が高くなっており、温度低下に伴う粘度の上昇率も明らかに大きくなっている。また、実施例１～４のドープ液の中でも、水分含有量が低いほど粘度が高く、水分含有量０質量％の実施例１の粘度が最も高くなっている。しかも、室温に近い２５℃の温度では、実施例１～４の粘度が、比較例１の粘度に対して２．８～４．７倍の極めて大きな値となっている。これらの結果は、ドープ液中の水分含有量を５質量％未満とすることによって、粘度を増大させ得ることを如実に示している。なお、実施例１～４のドープ液を用いたときに安定した紡糸やキャスティングができることも確認した。
　（実施例５～９）
　この実験は、湿度管理の有無とクモ糸タンパク質濃度と温度を変えたときの粘度変化を調べたものである。先ず、前記で得られたクモ糸タンパク質（粉体）を真空乾燥（絶乾）した後、雰囲気の相対湿度１．３％ＲＨ以下のドライルーム内で、絶乾状態（水分含有量が０質量％）のクモ糸タンパク質（粉体）を下記表２に示す濃度となるようにＤＭＳＯ溶媒に溶かして、クモ糸タンパク質濃度が互いに異なる４種類のドープ液（実施例５～８）を製造し、その後、それら実施例５～８の４種類のドープ液を相対湿度１．３％ＲＨ以下のドライルーム内に２４時間保存した。また、湿度管理していない通常の実験室内（大気中）で、絶乾状態のクモ糸タンパク質（粉体）を濃度が２２.０質量％になるようにＤＭＳＯ溶媒に溶かして、ドープ液（実施例９）を製造した。この実施例９のドープ液は、湿度管理していない通常の実験室内に２４時間保存した。各条件は次の表２のとおりであった。そして、実施例５～９のドープ液の温度と粘度の関係を調べた。その結果を図２に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　図２に示すように、実施例９（湿度管理をしていない環境で製造・保存したタンパク質濃度２２．０質量％）のドープ液の温度と粘度の関係は、実施例７（ドライルームで製造・保存したタンパク質濃度２０．５質量％）のドープ液の温度と粘度の関係と略同様なものとなっている。これは、実施例９のドープ液を製造・保存している間に、大気中の水分が実施例９のドープ液中に混入したためであると考えられる。これらの結果から、ドープ液の製造時や保存時に、雰囲気の相対湿度を低くして、ドープ液の吸水を抑えることによりドープ液の粘度を高く維持できることが確認された。
　（参考試験１）
　前記で得られたクモ糸タンパク質（粉体）を真空乾燥（絶乾）した後、絶乾状態のクモ糸タンパク質（粉体）を温度２５℃、相対湿度７２％ＲＨの大気に暴露し、含水率の変化を調べた。その結果を図３に示した。図３から明らかなとおり、絶乾状態のクモ糸タンパク質（粉体）は、約２０分で水分率は約１３質量％（平衡水分率）に達していた。このことから、粉体のクモ糸タンパク質を真空乾燥してからドープ液とすることは重要であることが分かった。真空乾燥しないと、室温や相対湿度が高い環境下で保存したクモ糸タンパク質の粉体に吸着した水分がそのままドープ液に入ることになる。
　（参考試験２）
　ドープ液中への水分の混入によるドープ液の粘度低下が、単なるドープ液の水分による希釈に起因するものでないことを確認するために、以下の試験を行った。先ず、温度５０℃での粘度が、実施例１のドープ液と同程度である食器用洗剤を準備した。次いで、準備した食器用洗剤を１００質量％としたきの食器用洗剤中の水分含有量が３質量％となるように、食器用洗剤に対して水分を添加し、温度５０℃で粘度を測定して、水分の添加前と後での粘度の変化率を調べた。
　その結果、水分を添加する前の食器用洗剤の温度５０℃での粘度は１４３ｍＰａ・ｓで、水分添加後の食器用洗剤の温度５０℃での粘度は１３３ｍＰａ・ｓであった。食器用洗剤の水分添加による温度５０℃での粘度の低下率は７％となっていた。これに対して、実施例１のドープ液の温度５０℃での粘度は１５３ｍＰａ・ｓで、水分添加により水分含量が３質量％とされた実施例４のドープ液の温度５０℃での粘度は８９ｍＰａ・ｓであった。クモ糸タンパク質を溶解したドープ液の水分添加による温度５０℃での粘度の低下率は４２％となっていた。これらのことから、クモ糸タンパク質などのポリペプチドを溶解してなる極性溶媒溶液中への水分混入による粘度低下が単なる水分による希釈に起因するものでないことが明確に認識された。
　ポリペプチドの極性溶媒溶液の粘度が溶液中への水分の混入（含有）によって極端に低下するのは、以下のような理由によるものと考えられる。タンパク質（ポリペプチド）の分子を構成するアミノ酸は多様な側鎖を有している。そのため、タンパク質の極性溶媒溶液中に水分子が入り込むと、タンパク質分子の側鎖間で水素結合が形成されて、タンパク質分子が凝集する。それにより、タンパク質の溶解性が低下して、タンパク質の極性溶媒溶液の粘度が低下すると考えられる。従って、その逆に、タンパク質の極性溶媒溶液中から水分子を除去すれば、タンパク質分子の凝集を抑制して、極性溶媒溶液へのタンパク質の溶解性を高めることが可能となり、その結果、極性溶媒溶液の粘度を上昇させ得るようになると考えられる。
　本発明の極性溶媒溶液は湿式紡糸、フィルムキャスト、ゲル、パーティクル、メッシュ体、各種成形物に有用である。
　配列番号１～４、１２、１３　　アミノ酸配列
　配列番号５～７　　塩基配列
　配列番号８～１１　プライマーシーケンス

Claims (17)

  1. 　ポリアミノ酸を含む溶質を極性溶媒に溶解した極性溶媒溶液であって、前記溶液を１００質量％としたときの前記溶液中の水分含有量が５質量％未満であることを特徴とする極性溶媒溶液。
  2. 　前記ポリアミノ酸は、ポリペプチドである請求項１に記載の極性溶媒溶液。
  3. 前記極性溶媒は、ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド(ＤＭＦ)、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド(ＤＭＡ)、及びＮ－メチル－２－ピロリドン(ＮＭＰ)からなる群から選ばれる少なくとも一つを含むものである請求項１又は２に記載の極性溶媒溶液。
  4. 　前記ポリペプチドは、構造タンパク質である請求項２又は３に記載の極性溶媒溶液。
  5. 　前記構造タンパク質は、結晶領域を含むものである請求項４に記載の極性溶媒溶液。
  6. 　前記ポリペプチドは、クモ糸タンパク質である請求項２～５の何れか１項に記載の極性溶媒溶液。
  7. 　ポリアミノ酸を含む溶質を極性溶媒に溶解した極性溶媒溶液の製造方法であって、前記溶液中の水分含有量を変えることにより、前記溶液の粘度を調整することを特徴とする極性溶媒溶液の製造方法。
  8. 　ポリアミノ酸を含む溶質を極性溶媒に溶解した極性溶媒溶液の製造方法であって、前記溶液中の水分含有量を減少させることにより、前記溶液の粘度を増加させることを特徴とする極性溶媒溶液の製造方法。
  9. 　前記ポリアミノ酸は、ポリペプチドである請求項７又は８に記載の極性溶媒溶液の製造方法。
  10. 　前記溶液を１００質量％としたときの前記溶液中の水分含有量を５質量％未満とするようにした請求項７～９の何れか１項に記載の極性溶媒溶液の製造方法。
  11. 　前記極性溶媒は、ジメチルスルホキシド(ＤＭＳＯ)、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド(ＤＭＦ)、Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド(ＤＭＡ)、及びＮ－メチル－２－ピロリドン(ＮＭＰ)からなる群から選ばれる少なくとも一つを含むものである請求項７～１０の何れか１項に記載の極性溶媒溶液の製造方法。
  12. 　前記ポリペプチドは、構造タンパク質である請求項９～１１の何れか１項に記載の極性溶媒溶液の製造方法。
  13. 　前記構造タンパク質は、結晶領域を含むものである請求項１２に記載の極性溶媒溶液の製造方法。
  14. 　前記ポリペプチドは、クモ糸タンパク質である請求項９～１３の何れか１項に記載の極性溶媒溶液の製造方法。
  15. 　前記ポリアミノ酸を含む溶質を乾燥させた後、前記極性溶媒に溶解させることによって、前記溶液中の水分含有量を変えるようにした請求項７～１４の何れか１項に記載の極性溶媒溶液の製造方法。
  16. 　前記溶液の製造及び／又は貯蔵の際に雰囲気の相対湿度を調整することによって、前記溶液中の水分含有量を変えるようにした請求項７～１５の何れか１項に記載の極性溶媒溶液の製造方法。
  17. 　前記溶液の製造及び／又は貯蔵の際に雰囲気の相対湿度を１．３％ＲＨ以下に調整する請求項１６に記載の極性溶媒溶液の製造方法。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11208736B2 (en) 2017-09-25 2021-12-28 Bolt Threads, Inc. Methods of generating highly-crystalline recombinant spider silk protein fibers
EP3833524A4 (en) * 2018-08-10 2022-06-22 Bolt Threads, Inc. COMPOSITION FOR A MOLDED BODY

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013065651A1 (ja) * 2011-11-02 2013-05-10 スパイバー株式会社 タンパク質溶液及びこれを用いたタンパク質繊維の製造方法
WO2013065650A1 (ja) * 2011-11-02 2013-05-10 スパイバー株式会社 ポリペプチドの溶液とこれを用いた人造ポリペプチド繊維の製造方法及びポリペプチドの精製方法

Family Cites Families (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH02240165A (ja) 1989-03-13 1990-09-25 Kanebo Ltd 保存安定性に優れた絹フィブロイン水溶液及びその製造法
US5171505A (en) 1990-11-28 1992-12-15 E. I. Du Pont De Nemours And Company Process for spinning polypeptide fibers
JPH06502993A (ja) 1990-11-28 1994-04-07 イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー 人工遺伝子からの構造タンパク質
AT395863B (de) 1991-01-09 1993-03-25 Chemiefaser Lenzing Ag Verfahren zur herstellung eines cellulosischen formkoerpers
US5252285A (en) 1992-01-27 1993-10-12 E. I. Du Pont De Nemours And Company Process for making silk fibroin fibers
JP3021944B2 (ja) 1992-03-11 2000-03-15 株式会社クラレ 強度の優れたポリビニルアルコール系繊維の製法
IT1274603B (it) 1994-08-08 1997-07-18 Novamont Spa Materiali espansi plastici biodegradabili
JP2922432B2 (ja) 1994-08-31 1999-07-26 帝人株式会社 メタ型アラミド繊維の製造方法
US7014802B1 (en) 1997-02-20 2006-03-21 Mannington Mills, Of Delaware, Inc. Methods to make a surface covering having a natural appearance
JP4095704B2 (ja) 1998-02-04 2008-06-04 出光興産株式会社 シルク含有樹脂組成物、シルク含有成形品及びシルク含有樹脂組成物の製造方法
AU1412201A (en) 1999-11-15 2001-05-30 Akira Hachimori Molecularly composite polymeric material of fibroin/cellulose and process for producing the same
GB9927950D0 (en) 1999-11-27 2000-01-26 Knight David P Apparatus and method for forming materials
US6620917B1 (en) 2000-01-20 2003-09-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Method for the purification and aqueous fiber spinning of spider silks and other structural proteins
WO2001070973A1 (fr) 2000-03-24 2001-09-27 Japan As Represented By President Of Tokyo University Of Agriculture And Technology Precurseurs de matieres de type soie, matieres de type soie et procede de production desdits precurseurs et desdites matieres
EP1472394A1 (en) 2002-01-09 2004-11-03 E. I. du Pont de Nemours and Company Polypeptide fibers and processes for making them
US7057023B2 (en) 2002-01-11 2006-06-06 Nexia Biotechnologies Inc. Methods and apparatus for spinning spider silk protein
WO2003060099A2 (en) 2002-01-11 2003-07-24 Nexia Biotechnologies, Inc. Methods and apparatus for spinning spider silk protein
ATE482695T1 (de) 2002-12-13 2010-10-15 Durect Corp Orale darreichungsform mit flüssigen hochviskosen trägersystemen
US8568637B2 (en) 2004-08-02 2013-10-29 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Method of forming a fiber made of peptide nanostructures
JP2006257000A (ja) 2005-03-16 2006-09-28 Iwase Cosfa Kk セリシン誘導体およびそれを含有する組成物
WO2007048121A2 (en) 2005-10-20 2007-04-26 Centocor, Inc. Methods of preparing targeted immunoliposomes
US8173772B2 (en) 2005-12-30 2012-05-08 Spiber Technologies Ab Spider silk proteins and methods for producing spider silk proteins
CN100424239C (zh) 2006-04-28 2008-10-08 韩晓根 玉米蛋白质有色纺纤维及其生产方法
JP4981355B2 (ja) 2006-05-10 2012-07-18 公立大学法人 滋賀県立大学 静電紡糸装置
WO2008004356A1 (fr) 2006-07-04 2008-01-10 National University Corporation Tokyo University Of Agriculture And Technology Composition d'ensimage en solution, procédé de production de fibre de soie régénérée avec ladite composition, et fibre de soie régénérée obtenue par ledit procédé
CN101139501B (zh) * 2007-10-11 2011-05-25 同济大学 一种聚酰亚胺耐高温水性分散体涂料及其制备方法和应用
JP2011511668A (ja) 2008-02-07 2011-04-14 トラスティーズ オブ タフツ カレッジ ３次元絹ハイドロキシアパタイト組成物
JP2010024586A (ja) 2008-07-22 2010-02-04 Kaneka Corp 再生コラーゲン系人工毛髪用繊維
CN102176904B (zh) 2008-08-08 2014-06-25 巴斯夫欧洲公司 基于生物聚合物的包含活性物质的连续纤维层、其用途和产生方法
CN101705559A (zh) 2008-08-19 2010-05-12 江苏金太阳卧室用品有限公司 一种功能性色纺纱织物面料
CN101721739B (zh) 2008-10-10 2013-02-13 陈东 可缓控释治疗性药物的高分子复合纤维手术缝合线及其制备方法
JP2010104946A (ja) * 2008-10-31 2010-05-13 Riso Kagaku Corp 逆ベシクルを用いて形成された油中水（ｗ／ｏ）型エマルション
WO2010123450A1 (en) 2009-04-22 2010-10-28 Spiber Technologies Ab Method of producing polymers of spider silk proteins
CN101564914B (zh) 2009-05-27 2011-06-22 东华大学 纳米蛛网/纳米纤维复合型防护材料的制备方法
CN101724920B (zh) 2009-11-13 2011-04-27 东华大学 干纺制备再生蚕丝纤维的方法
WO2011113446A1 (en) 2010-03-17 2011-09-22 Amsilk Gmbh Method for production of polypeptide containing fibres
JP5761736B2 (ja) 2010-12-24 2015-08-12 国立大学法人信州大学 セリシンナノファイバーおよびその製造方法、金属イオン吸着材、染色機能増強材、耐薬品増強材、ならびにセリシン・フィブロイン複合ナノファイバーおよびその製造方法
CN102181948A (zh) 2011-05-23 2011-09-14 北京化工大学 一种制备一维有序结构的纳米纤维的静电纺丝方法及装置
JP5739992B2 (ja) 2011-06-01 2015-06-24 スパイバー株式会社 タンパク質繊維及びその製造方法
CN103502516B (zh) 2011-06-01 2015-04-22 丝芭博株式会社 人造多肽纤维及其制造方法
CN103126974B (zh) * 2011-11-30 2018-04-10 王冕 一种凝胶剂
EP2868782B1 (en) * 2012-06-28 2020-07-15 Spiber Inc. Spun-dyed protein fiber and method for producing same
EP2867005B1 (en) 2012-06-29 2019-12-11 Archer Daniels Midland Co. Method for forming a nanomaterial
US20140175179A1 (en) * 2012-12-21 2014-06-26 Robert Carter Context aware passcodes
EP2940066B1 (en) * 2012-12-26 2020-02-05 Spiber Inc. Spider silk protein film, and method for producing same
US20150329587A1 (en) * 2012-12-27 2015-11-19 Spiber Inc. Extraction method for hydrophilic recombinant protein
CN103184570B (zh) * 2013-04-09 2015-08-26 南京维赛医药科技有限公司 一种丝素蛋白基抗菌纳米纤维及其制备方法
JP5823079B2 (ja) 2013-04-25 2015-11-25 Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 ポリペプチドパーティクルの製造方法
WO2014175178A1 (ja) * 2013-04-25 2014-10-30 スパイバー株式会社 ポリペプチド多孔質体及びその製造方法
US9968682B2 (en) 2013-04-25 2018-05-15 Spiber Inc. Polypeptide hydrogel and method for producing same
JP6856828B2 (ja) * 2015-04-09 2021-04-14 Ｓｐｉｂｅｒ株式会社 極性溶媒溶液及びその製造方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013065651A1 (ja) * 2011-11-02 2013-05-10 スパイバー株式会社 タンパク質溶液及びこれを用いたタンパク質繊維の製造方法
WO2013065650A1 (ja) * 2011-11-02 2013-05-10 スパイバー株式会社 ポリペプチドの溶液とこれを用いた人造ポリペプチド繊維の製造方法及びポリペプチドの精製方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DESAI, U. R. ET AL.: "Assessing the Structural Integrity of a Lyophilized Protein in Organic Solvents", JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, vol. 117, no. 14, 1995, pages 3940 - 3945, XP055320389 *
See also references of EP3281948A4 *
TERAMOTO, H. ET AL.: "Chemical Modification of Silk Sericin in Lithium Chloride/Dimethyl Sulfoxide Solvent with 4-Cyanophenyl Isocyanate", BIOMACROMOLECULES, vol. 5, no. 4, 2004, pages 1392 - 1398, XP055067201 *
WAYBRIGHT, T. J. ET AL.: "Overcoming Problems of Compound Storage in DMSO: Solvent and Process Alternatives", JOURNAL OF BIOMOLECULAR SCREENING, vol. 14, no. 6, 2009, pages 708 - 715, XP009143553 *

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