CN113260745A - 改造丝心蛋白 - Google Patents

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CN113260745A CN202080007966.1A CN202080007966A CN113260745A CN 113260745 A CN113260745 A CN 113260745A CN 202080007966 A CN202080007966 A CN 202080007966A CN 113260745 A CN113260745 A CN 113260745A
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Abstract

本发明涉及一种改造丝心蛋白，其为包含式1：[(A)n基序‑REP]m或式2：[(A)n基序‑REP]m‑(A)n基序所表示的结构域序列的改造丝心蛋白，其中，丝氨酸残基含有率小于5.5％。[式1和式2中，(A)n基序表示由4～27个氨基酸残基构成的氨基酸序列，并且(A)n基序中的丙氨酸残基数相对于总氨基酸残基数为80％以上。REP表示由10～200个氨基酸残基构成的氨基酸序列。m表示10～300的整数。两个以上存在的(A)n基序彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。两个以上存在的REP彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。]。

Description

改造丝心蛋白
技术领域
本发明涉及改造丝心蛋白。更具体而言，本发明涉及丝氨酸残基的含量降低的改造丝心蛋白。
背景技术
丝心蛋白为纤维状蛋白质之一。丝心蛋白中含有高达90％的甘氨酸残基、丙氨酸残基、丝氨酸残基、酪氨酸残基等小侧链的氨基酸残基。作为丝心蛋白，已知有构成昆虫和蜘蛛类产生的丝的蛋白质(蚕丝蛋白、蜂丝蛋白、蛛丝蛋白)等。
蚕丝蛋白具有优良的机械特性、吸湿特性和除臭特性，是广泛作为衣服原料使用的原材料。另外，蚕丝为免疫耐受的天然纤维，生物亲和性高，因此也用于手术用缝合线等用途。
利用一些异源蛋白生产系统产生了重组蛛丝蛋白和重组蚕丝蛋白。例如，报道了许多利用以山羊、家蚕、植物、哺乳类细胞、酵母、霉菌、革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌等为宿主的重组蛋白生产系统进行的重组丝心蛋白生产，并得到了一定的成果(非专利文献1、专利文献1和2)。
还制造了包含改造丝心蛋白的各种组合物。例如，作为包含改造丝心蛋白的组合物的一例，已知有蛋白质纤维。作为蛋白质纤维的制造方法，已知有一种将从喷嘴喷出的纺丝原液在凝固浴液中凝固而形成纤维的湿式纺丝法及干湿式纺丝法。作为通过湿式纺丝法和干湿式纺丝法等制造蛋白质纤维的方法，已知将使蛋白质溶解在溶剂中的蛋白质溶液作为纺丝原液使用，将纺丝原液从喷头挤出到脱溶剂槽的凝固液中，使溶剂从纺丝原液中脱离的同时，形成纤维并制成未延伸丝，以获得蛋白质纤维(例如，参照专利文献3)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2014-502140号公报
专利文献2：国际公开第2015/042164号
专利文献3：国际公开第2013/065651号
非专利文献
非专利文献1：Science,2002年,295卷,pp.472-476
发明内容
发明所要解决的问题
在制造蛋白质纤维时，作为纺丝原液的溶剂和/或凝固浴液的添加剂，有时使用甲酸。本发明人等发现，当将使用甲酸制造的蛋白质纤维放置于大气中时具有产生异味的问题。本发明人等还发现，使用甲酸等羧酸作为纺丝原液的溶剂和/或凝固浴液的添加剂而制造的蛋白质纤维，在纺丝过程中通过蛋白质中的羟基与羧酸之间的脱水缩合反应来形成酯基。以如此方法得到的蛋白质纤维中，以微量残留在蛋白质表面或内部的甲酸等羧酸为催化剂，对加至蛋白质的酯基进行水解，有时羧酸会发生游离，而游离的羧酸成为产生异味等的原因。本发明旨在解决本发明人等新发现的这些课题。
即，本发明的目的在于提供一种减少通过与甲酸等羧酸接触所形成的酯键的改造丝心蛋白。
用于解决问题的方法
本发明人等发现，可以通过减少改造丝心蛋白的氨基酸序列中的丝氨酸残基的含量来实现上述目的。本发明以该发现为基础。
本发明涉及例如下述各发明。
[1]
一种改造丝心蛋白，其为包含式1：[(A)n基序-REP]m或式2：[(A)n基序-REP]m-(A)n基序所表示的结构域序列的改造丝心蛋白，其中，
丝氨酸残基含有率小于5.5％。
[式1和式2中，(A)n基序表示由4～27个氨基酸残基构成的氨基酸序列，并且(A)n基序中的丙氨酸残基数相对于总氨基酸残基数为80％以上。REP表示由10～200个氨基酸残基构成的氨基酸序列。m表示10～300的整数。两个以上存在的(A)n基序彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。两个以上存在的REP彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。]
[2]
如[1]所述的改造丝心蛋白，其中，苏氨酸残基含有率为9％以下。
[3]
如[1]或[2]所述的改造丝心蛋白，其中，丝氨酸残基和苏氨酸残基的含有率为9％以下。
[4]
一种改造丝心蛋白，其包含序列号2、序列号3、序列号4、序列号5或序列号28所表示的氨基酸序列、或者与序列号2、序列号3、序列号4、序列号5或序列号28所表示的氨基酸序列具有90％以上的序列一致性的氨基酸序列。
[5]
如[1]～[4]中任一项所述的改造丝心蛋白，其中，进一步在N末端和C末端中的任意一个末端或两个末端包含标签序列。
[6]
如[5]所述的改造丝心蛋白，其中，上述标签序列包含序列号17或序列号18所表示的氨基酸序列。
[7]
一种改造丝心蛋白，其包含序列号10、序列号11、序列号12、序列号13或序列号25所表示的氨基酸序列、或者与序列号10、序列号11、序列号12、序列号13或序列号25所表示的氨基酸序列具有90％以上的序列一致性的氨基酸序列。
[8]
一种核酸，其编码[1]～[7]中任一项所述的改造丝心蛋白。
[9]
一种核酸，其在严格条件下与[8]所述的核酸的互补链杂交，并且编码包含式1：[(A)n基序-REP]m或式2：[(A)n基序-REP]m-(A)n基序所表示的结构域序列的改造丝心蛋白。
[式1和式2中，(A)n基序表示由4～27个氨基酸残基构成的氨基酸序列，并且(A)n基序中的丙氨酸残基数相对于总氨基酸残基数为80％以上。REP表示由10～200个氨基酸残基构成的氨基酸序列。m表示10～300的整数。两个以上存在的(A)n基序彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。两个以上存在的REP彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。]
[10]
一种核酸，其与[8]所述的核酸具有90％以上的序列一致性，并且编码包含式1：[(A)n基序-REP]m或式2：[(A)n基序-REP]m-(A)n基序所表示的结构域序列的改造丝心蛋白。
[式1和式2中，(A)n基序表示由4～27个氨基酸残基构成的氨基酸序列，并且(A)n基序中的丙氨酸残基数相对于总氨基酸残基数为80％以上。REP表示由10～200个氨基酸残基构成的氨基酸序列。m表示10～300的整数。两个以上存在的(A)n基序彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。两个以上存在的REP彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。]
[11]
一种表达载体，其具有[8]～[10]中任一项所述的核酸序列和以能够工作的方式与该核酸序列连接的一个或两个以上调节序列。
[12]
如[11]所述的表达载体，其为质粒载体或病毒载体。
[13]
一种宿主，其是利用[11]或[12]所述的表达载体进行转化而得到的。
[14]
如[13]所述的宿主，其为原核生物。
[15]
如[14]所述的宿主，其中，上述原核生物为属于选自由埃希氏菌属、短芽孢杆菌属、沙雷氏菌属、芽孢杆菌属、微杆菌属、短杆菌属、棒杆菌属和假单胞菌属组成的组中的属的微生物。
[16]
如[13]所述的宿主，其为真核生物。
[17]
如[16]所述的宿主，其中，上述真核生物为酵母、丝状真菌或昆虫细胞。
[18]
一种人造改造丝心蛋白组合物，其包含[1]～[7]中任一项所述的改造丝心蛋白。
[19]
如[18]所述的人造改造丝心蛋白组合物，其为蛋白质粉末。
[20]
如[18]所述的人造改造丝心蛋白组合物，其为纺丝原液。
[21]
如[18]所述的人造改造丝心蛋白组合物，其为纤维。
[22]
如[18]所述的人造改造丝心蛋白组合物，其为膜。
[23]
一种制造方法，其为改造丝心蛋白的制造方法，其中，
其包括通过用表达载体转化的宿主表达该核酸的工序，该表达载体具有编码改造丝心蛋白的核酸序列和以能够工作的方式与该核酸序列连接的一个或两个以上调节序列，
上述改造丝心蛋白是[1]～[7]中任一项所述的改造丝心蛋白。
[24]
一种制造方法，其为包含改造丝心蛋白的人造改造丝心蛋白组合物的制造方法，其中，
其包括准备改造丝心蛋白的工序，
上述改造丝心蛋白是[1]～[7]中任一项所述的改造丝心蛋白。
[25]
如[23]或[24]所述的制造方法，其中，其还包括使上述改造丝心蛋白与羧酸接触的工序。
[26]
如[24]所述的制造方法，其中，其还包括调整含有上述改造丝心蛋白和羧酸的改造丝心蛋白溶解液的工序。
[27]
一种产品，其包含[1]～[7]中任一项所述的改造丝心蛋白，
并选自由纤维、丝、膜、发泡体、粒体、纳米纤丝、凝胶和树脂组成的组。
发明效果
根据本发明，可以提供一种减少通过与甲酸等羧酸接触所形成的酯键的改造丝心蛋白。
附图说明
图1是示出用改造丝心蛋白形成的膜的红外吸收光谱的测量结果的图表。
图2是示出用改造丝心蛋白形成的蛋白质纤维的红外吸收光谱的测量结果的图表。
具体实施方式
以下，对本发明具体实施方式详细进行说明。但是，本发明并不限定于以下的实施方式。
[改造丝心蛋白]
本发明的改造丝心蛋白为包含式1：[(A)n基序-REP]m或式2：[(A)n基序-REP]m-(A)n基序所表示的结构域序列的蛋白质。改造丝心蛋白可以在结构域序列的N末端侧和C末端侧中的任意一个末端侧或两个末端侧进一步附加有氨基酸序列(N末端序列和C末端序列)。N末端序列和C末端序列典型地为不具有丝心蛋白中特征性的氨基酸基序的重复的区域，由约100个残基的氨基酸构成，但不限于此。
在本说明书中，"改造丝心蛋白"是指其氨基酸序列与天然来源的丝心蛋白的氨基酸序列不同的丝心蛋白。本说明书中所说的“天然来源的丝心蛋白”是指其氨基酸序列与自然存在的昆虫或蜘蛛类等产生的丝心蛋白相同的丝心蛋白。天然来源的丝心蛋白也是包含式1：[(A)n基序-REP]m或式2：[(A)n基序-REP]m-(A)n基序所表示的结构域序列的蛋白质。
作为天然来源的丝心蛋白，例如可以列举出昆虫或蜘蛛类产生的丝心蛋白。
作为昆虫产生的丝心蛋白，可以列举例如家蚕(Bombyx mori)、野桑蚕(Bombyxmandarina)、天蚕(Antheraea yamamai)、柞蚕(Anteraea pernyi)、枫蚕(Eriogynapyretorum)、蓖麻蚕(Pilosamia Cynthia ricini)、樗蚕(Samia cynthia)、樟蚕(Caligurajaponica)、印度柞蚕(Antheraea mylitta)、琥珀蚕(Antheraea assama)等蚕产生的蚕丝蛋白、雀蜂(Vespa simillima xanthoptera)的幼虫吐出的蜂丝蛋白。
作为昆虫产生的丝心蛋白的更具体的示例，可以列举例如蚕·丝心蛋白L链(GenBank登录号M76430(碱基序列)、AAA27840.1(氨基酸序列))。
作为蜘蛛类产生的丝心蛋白，可以列举例如大腹园蛛、十字园蛛、肥胖园蛛、五纹园蛛和野岛园蛛(Araneus nojimai)等属于园蛛属(Araneus属)的蜘蛛、青新园蛛、嗜水新园蛛、灌木新园蛛和类青新园蛛等属于新园蛛属(Neoscona属)的蜘蛛、小岬蛛等属于岬蛛属(Pronus属)的蜘蛛、蟾蜍曲腹蛛和对称曲腹蛛等属于曲腹蛛属(Cyrtarachne属)的蜘蛛、库氏棘腹蛛和乳突棘腹蛛等属于棘腹蛛属(Gasteracantha属)的蜘蛛、何氏瘤腹蛛和六刺瘤腹蛛等属于瘤腹蛛属(Ordgarius属)的蜘蛛、悦目金蛛、小悦目金蛛和横纹金蛛等属于金蛛属(Argiope属)的蜘蛛、双峰尾园蛛等属于尾园蛛属(Arachnura属)的蜘蛛、褐吊叶蛛等属于吊叶蛛属(Acusilas属)的蜘蛛、红云斑蛛、花云斑蛛和全色云斑蛛等属于云斑蛛属(Cytophora属)的蜘蛛、丑锥头蛛等属于锥头蛛属(Poltys属)的蜘蛛、八瘤艾蛛、四突艾蛛、圆腹艾蛛和黑尾艾蛛等属于艾蛛属(Cyclosa属)的蜘蛛和日本壮头蛛等属于壮头蛛属(Chorizopes属)的蜘蛛所产生的蛛丝蛋白、以及前齿肖蛸、锥腹肖蛸、直伸肖蛸和鳞纹肖蛸等属于肖蛸属(Tetragnatha属)的蜘蛛、纵条银鳞蛛、肩斑银鳞蛛和小肩斑银鳞蛛等属于银鳞蛛属(Leucauge属)的蜘蛛、棒络新妇和斑络新妇等属于络新妇属(Nephila属)的蜘蛛、美丽麦蛛等属于麦蛛属(Menosira属)的蜘蛛、柔弱粗螯蛛等属于锯螯蛛属(Dyschiriognatha属)的蜘蛛、红斑寇蛛、哈氏寇蛛、几何寇蛛和间斑寇蛛等属于寇蛛属(Latrodectus属)的蜘蛛、以及属于育儿网蛛属(Euprosthenops属)的蜘蛛等属于肖蛸科(Tetragnathidae科)的蜘蛛所产生的蛛丝蛋白。作为蛛丝蛋白，可以列举例如MaSp(MaSp1和MaSp2)、ADF(ADF3和ADF4)等牵引丝蛋白、MiSp(MiSp1和MiSp2)等。
作为蜘蛛类产生的丝心蛋白的更具体的示例，可以列举例如丝心蛋白-3(fibroin-3，adf-3)[十字园蛛(Araneus diadematus)来源](GenBank登录号AAC47010(氨基酸序列)、U47855(碱基序列))、丝心蛋白-4(fibroin-4，adf-4)[十字园蛛来源](GenBank登录号AAC47011(氨基酸序列)、U47856(碱基序列))、牵引丝蛋白蛛丝蛋白1(draglinesilk protein spidroin 1)[金纺蜘蛛(Nephila clavipes)来源](GenBank登录号AAC04504(氨基酸序列)、U37520(碱基序列))、大壶状腺蛛丝蛋白1(major ampullatespidroin 1)[黑寡妇蜘蛛(Latrodectus hesperus)来源](GenBank登录号ABR68856(氨基酸序列)、EF595246(碱基序列))、牵引丝蛋白蛛丝蛋白2(dragline silk proteinspidroin 2)[棒络新妇(Nephila clavata)来源](GenBank登录号AAL32472(氨基酸序列)、AF441245(碱基序列))、大壶状腺蛛丝蛋白1[非洲育儿网蛛(Euprosthenops australis)来源](GenBank登录号CAJ00428(氨基酸序列)、AJ973155(碱基序列))和大壶状腺蛛丝蛋白2(major ampullate spidroin2)[非洲育儿网蛛](GenBank登录号CAM32249.1(氨基酸序列)、AM490169(碱基序列))、小壶状腺丝蛋白1(minor ampullate silk protein 1)[金纺蜘蛛](GenBank登录号AAC14589.1(氨基酸序列))、小壶状腺丝蛋白2(minor ampullatesilk protein 2)[金纺蜘蛛](GenBank登录号AAC14591.1(氨基酸序列))、小壶状腺蛛丝蛋白样蛋白质(minor ampullate spidroin-like protein)[Nephilengys cruentata](GenBank登录号ABR37278.1(氨基酸序列)等。
作为天然来源的丝心蛋白的更具体的示例，可以进一步列举在NCBI GenBank中登记了序列信息的丝心蛋白。例如，可以通过从NCBI GenBank中登记的序列信息中包含INV作为分类码(DIVISION)的序列中提取出在定义(DEFINITION)中记载了蛛丝蛋白、壶状腺、丝心蛋白、"丝和多肽"或"丝和蛋白质"作为关键词的序列、从CDS中提取出指定产物的字符串、从来源(SOURCE)中提取出在组织类型(TISSUE TYPE)中记载了指定字符串的序列来确认。
"改造丝心蛋白"只要具有本发明中指定的氨基酸序列即可，可以为依据天然来源的丝心蛋白对其氨基酸序列进行改造而得到的丝心蛋白(例如，通过对克隆出的天然来源的丝心蛋白的基因序列进行改造来改造氨基酸序列而得到的丝心蛋白)，另外也可以为不依赖于天然来源的丝心蛋白而人为设计氨基酸序列的丝心蛋白(例如，通过对编码所设计的氨基酸序列的核酸进行化学合成而具有所期望的氨基酸序列的丝心蛋白)。
在本说明书中，"结构域序列"为生成丝心蛋白特有的结晶区(典型地，相当于氨基酸序列的(A)n基序)和非晶区(典型地，相当于氨基酸序列的REP)的氨基酸序列，是指式1：[(A)n基序-REP]m或式2：[(A)n基序-REP]m-(A)n基序所表示的氨基酸序列。在此，(A)n基序表示由4～27个氨基酸残基构成的氨基酸序列，并且(A)n基序中的丙氨酸残基数相对于总氨基酸残基数为80％以上。REP表示由10～200个氨基酸残基构成的氨基酸序列。m表示10～300的整数。m优选为20～300的整数，更优选为30～300的整数。两个以上存在的(A)n基序彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。两个以上存在的REP彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。
关于(A)n基序，只要(A)n基序中的丙氨酸残基数相对于总氨基酸残基数为80％以上即可，优选为85％以上，更优选为90％以上，进一步优选为95％以上，进一步更优选为100％(是指仅由丙氨酸残基构成的情况)。在结构域序列中两个以上存在的(A)n基序优选至少7个仅由丙氨酸残基构成。仅由丙氨酸残基构成是指(A)n基序具有(Ala)k(Ala表示丙氨酸残基，k表示4～27的整数、优选表示4～20的整数、更优选表示4～16的整数)所表示的氨基酸序列。
本实施方式的改造丝心蛋白具有降低丝氨酸残基的含量的氨基酸序列。本实施方式的改造丝心蛋白由于降低了丝氨酸残基的含量，因此减少了通过与甲酸等羧酸接触所形成的酯键。由此，即使放置在大气中，也难以产生异味。
本实施方式的改造丝心蛋白中，丝氨酸残基含有率优选为9％以下，优选为小于8.5％，优选为8％以下，优选为小于7.5％，优选为7％以下，优选为小于6.5％，优选为6％以下，优选为小于5.5％，优选为5％以下，优选为小于4.5％，优选为4％以下，优选为小于3.5％，优选为3％以下，优选为小于2.5％，优选为2％以下，优选为小于1.5％，优选为1％以下，优选为小于0.5％，特别优选为0％。通过使丝氨酸残基含有率处于该范围，可以更显著地发挥本发明的效果。
在本说明书中，“丝氨酸残基含有率”是指在包含式1：[(A)n基序-REP]m或式2：[(A)n基序-REP]m-(A)n基序所表示的结构域序列的丝心蛋白中，将丝氨酸残基的总数设为x、丝心蛋白的氨基酸残基的总数设为y时，以x/y×100％算出的值。
本实施方式的改造丝心蛋白中，进一步地苏氨酸残基含有率优选为9％以下，优选为小于8.5％，优选为8％以下，优选为小于7.5％，优选为7％以下，优选为小于6.5％，优选为6％以下，优选为小于5.5％，优选为5％以下，优选为小于4.5％，优选为4％以下，优选为小于3.5％，优选为3％以下，优选为小于2.5％，优选为2％以下，优选为小于1.5％，优选为1％以下，优选为小于0.5％，特别优选为0％。通过使苏氨酸残基含有率处于该范围，可以更显著地发挥本发明的效果。
在本说明书中，“苏氨酸残基含有率”是指在包含式1：[(A)n基序-REP]m或式2：[(A)n基序-REP]m-(A)n基序所表示的结构域序列的丝心蛋白中，将苏氨酸残基的总数设为z、丝心蛋白的氨基酸残基的总数设为y时，以z/y×100％算出的值。
本实施方式的改造丝心蛋白中，丝氨酸残基和苏氨酸残基含有率优选为9％以下，优选为小于8.5％，优选为8％以下，优选为小于7.5％，优选为7％以下，优选为小于6.5％，优选为6％以下，优选为小于5.5％，优选为5％以下，优选为小于4.5％，优选为4％以下，优选为小于3.5％，优选为3％以下，优选为小于2.5％，优选为2％以下，优选为小于1.5％，优选为1％以下，优选为小于0.5％，特别优选为0％。通过使丝氨酸残基和苏氨酸残基含有率处于该范围，可以更显著地发挥本发明的效果。
在本说明书中，“丝氨酸残基和苏氨酸残基”是指在包含式1：[(A)n基序-REP]m或式2：[(A)n基序-REP]m-(A)n基序所表示的结构域序列的丝心蛋白中，将丝氨酸残基的总数设为z、苏氨酸残基的总数设为z、丝心蛋白的氨基酸残基的总数设为y时，以(x+z)/y×100％算出的值。
本发明的改造丝心蛋白的分子量没有特别限定，例如可以为10kDa以上且700kDa以下。本发明的改造丝心蛋白的分子量例如可以为20kDa以上、30kDa以上、40kDa以上、50kDa以上、60kDa以上、70kDa以上、80kDa以上、90kDa以上或100kDa以上，还可以为600kDa以下、500kDa以下、400kDa以下、300kDa以下或200kDa以下。
作为本发明的改造丝心蛋白的更具体的示例，可以列举(i)包含序列号2、序列号3、序列号4、序列号5或序列号28所表示的氨基酸序列的改造丝心蛋白、或者(ii)包含与序列号2、序列号3、序列号4、序列号5或序列号28所表示的氨基酸序列具有90％以上的序列一致性的氨基酸序列的改造丝心蛋白。
序列号2所表示的氨基酸序列(Met-PRT1104)是用丙氨酸残基(A)或甘氨酸残基(G)置换序列号19所表示的氨基酸序列(Met-PRT410)的丝氨酸残基(S)的大部分而得到的氨基酸序列。序列号19所表示的氨基酸序列是从序列号20所表示的氨基酸序列(Met-PRT380)中从N末端侧向C末端侧使(A)n基序每隔两个发生了缺失、进一步在C末端序列的近前处插入一个[(A)n基序-REP]而得到的氨基酸序列。序列号20所表示的氨基酸序列是将相当于天然来源的丝心蛋白的序列号21(Met-PRT313)所表示的氨基酸序列的REP中的GGX全部置换为GQX而得到的氨基酸序列。
序列号3所表示的氨基酸序列(Met-PRT1105)是用丙氨酸残基(A)或甘氨酸残基(G)置换序列号1所表示的氨基酸序列(Met-PRT918)的丝氨酸残基(S)而得到的氨基酸序列。序列号1所表示的氨基酸序列是将序列号19所表示的氨基酸序列中的QQ全部置换为VF、并且将剩余的Q置换为I而得到的氨基酸序列。
序列号4所表示的氨基酸序列(Met-PRT1103)是将序列号19所表示的氨基酸序列的酪氨酸残基(Y)置换为苯丙氨酸残基(F)、并且将丝氨酸残基(S)的大部分置换为丙氨酸残基(A)或甘氨酸残基(G)而得到的氨基酸序列。
序列号5所表示的氨基酸序列(Met-PRT1107)是用丙氨酸残基(A)、缬氨酸残基(V)、亮氨酸残基(L)或异亮氨酸残基(I)置换序列号1所表示的氨基酸序列的丝氨酸残基(S)而得到的氨基酸序列。
序列号28所表示的氨基酸序列(Met-PRT1171)是在包含式1：[(A)n基序-REP]m所表示的氨基酸序列的单位的氨基酸序列中，将(A)n基序的氨基酸残基数统一为7，并使REP(非结晶区域)越靠近C末端越短而得到的氨基酸序列。
(i)的改造丝心蛋白可以由序列号2、序列号3、序列号4、序列号5或序列号28所表示的氨基酸序列构成。
(ii)的改造丝心蛋白包含与序列号2、序列号3、序列号4、序列号5或序列号28所表示的氨基酸序列具有90％以上的序列一致性的氨基酸序列。另外，(ii)的改造丝心蛋白也是包含式1：[(A)n基序-REP]m或式2：[(A)n基序-REP]m-(A)n基序所表示的结构域序列的蛋白质。上述序列一致性优选为95％以上。
(ii)的改造丝心蛋白优选丝氨酸残基含有率小于5.5％。此外，(ii)的改造丝心蛋白优选苏氨酸残基含有率为9％以下。并且，(ii)的改造丝心蛋白优选丝氨酸残基和苏氨酸残基含有率为9％以下。
上述改造丝心蛋白可以在N末端和C末端中的任意一个末端或两个末端包含标签序列。由此，能够进行改造丝心蛋白的分离、固定化、检测和可见化等。
作为标签序列，可以列举例如利用与其他分子的特异性亲和性(结合性、affinity)的亲和性标签。作为亲和性标签的具体例，可以列举组氨酸标签(His标签)。His标签是由约4至10个组氨酸残基排列而成的短肽，具有与镍等的金属离子特异性地结合的性质，因此能够用于通过金属螯合层析(chelating metal chromatography)进行的改造丝心蛋白的分离。作为标签序列的具体例，可以列举例如序列号17或序列号18所示的氨基酸序列(包含His标签的氨基酸序列)。
另外，也可以利用与谷胱甘肽特异性地结合的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、与麦芽糖特异性地结合的麦芽糖结合蛋白(MBP)等标签序列。
此外，也可以使用利用抗原抗体反应的"表位标签"。通过附加显示抗原性的肽(表位)作为标签序列，能够使其针对该表位的抗体进行结合。作为表位标签，可以列举HA(流感病毒的血凝素的肽序列)标签、myc标签、FLAG标签等。通过利用表位标签，能够以高特异性容易地对改造丝心蛋白进行纯化。
也可以使用进一步利用特定的蛋白酶将标签序列切除而得到的改造丝心蛋白。也可以通过对经由该标签序列吸附的蛋白质进行蛋白酶处理而回收切除标签序列后的改造丝心蛋白。
作为包含标签序列的改造丝心蛋白的更具体的示例，可以列举(iii)包含序列号10、序列号11、序列号12、序列号13或序列号25所表示的氨基酸序列的改造丝心蛋白、或者包含与序列号10、序列号11、序列号12、序列号13或序列号25所表示的氨基酸序列具有90％以上的序列一致性的氨基酸序列的改造丝心蛋白。
序列号10、序列号11、序列号12和序列号13所表示的氨基酸序列具有分别在序列号2、序列号3、序列号4和序列号5所表示的氨基酸序列的N末端附加序列号18所表示的氨基酸序列(包含His标签)而得到的氨基酸序列。序列号25所表示的氨基酸序列具有在序列号28所表示的氨基酸序列的N末端附加序列号17所表示的氨基酸序列(包含His标签)而得到的氨基酸序列。
(iii)的改造丝心蛋白可以由序列号10、序列号11、序列号12、序列号13或序列号25所表示的氨基酸序列构成。
(iii)的改造丝心蛋白包含与序列号10、序列号11、序列号12、序列号13或序列号25所表示的氨基酸序列具有90％以上的序列一致性的氨基酸序列。(iii)的改造丝心蛋白也是包含式1：[(A)n基序-REP]m或式2：[(A)n基序-REP]m-(A)n基序所表示的结构域序列的蛋白质。上述序列一致性优选为95％以上。
(iii)的改造丝心蛋白优选丝氨酸残基含有率小于5.5％。此外，(iii)的改造丝心蛋白优选苏氨酸残基含有率为9％以下。并且，(iii)的改造丝心蛋白优选丝氨酸残基和苏氨酸残基含有率为9％以下。
上述改造丝心蛋白可以包含用于将重组蛋白生产系统中生产的蛋白质释放到宿主的外部的分泌信号。分泌信号的序列可以根据宿主的种类适当设定。
[核酸]
本发明的核酸编码本发明的改造丝心蛋白。作为核酸的具体例，可以列举编码包含序列号2、序列号3、序列号4、序列号5或序列号28所表示的氨基酸序列的改造丝心蛋白、或者编码在这些氨基酸序列的N末端和C末端中的任意一个末端或两个末端结合有序列号17和/或序列号18所表示的氨基酸序列(标签序列)的改造丝心蛋白等的核酸。
一个实施方式的核酸为下述核酸：在严格条件下与编码本发明的改造丝心蛋白的核酸的互补链杂交，并且编码包含式1：[(A)n基序-REP]m或式2：[(A)n基序-REP]m-(A)n基序所表示的结构域序列的改造丝心蛋白。由该核酸编码的改造丝心蛋白优选丝氨酸残基含有率小于5.5％。另外，由该核酸编码的改造丝心蛋白优选苏氨酸残基含有率为9％以下。并且，由该核酸编码的改造丝心蛋白优选丝氨酸残基和苏氨酸残基含有率为9％以下。
"严格条件"是指所谓的形成特异性杂交体而不形成非特异性杂交体的条件。"严格条件"可以为低严格条件、中严格条件和高严格条件中的任意一种。低严格条件是指仅在序列间存在至少85％以上的一致性时发生杂交，可以列举例如使用含有0.5％SDS的5×SSC在42℃下进行杂交的条件。中严格条件是指仅在序列间存在至少90％以上的一致性时发生杂交，可以列举例如使用含有0.5％SDS的5×SSC在50℃下进行杂交的条件。高严格条件是指仅在序列间存在至少95％以上的一致性时发生杂交，可以列举例如使用含有0.5％SDS的5×SSC在60℃下进行杂交的条件。
另一个实施方式的核酸为下述核酸：与编码本发明的改造丝心蛋白的核酸具有90％以上的序列一致性，并且编码包含式1：[(A)n基序-REP]m或式2：[(A)n基序-REP]m-(A)n基序所表示的结构域序列的改造丝心蛋白。由该核酸编码的改造丝心蛋白优选丝氨酸残基含有率小于5.5％。另外，由该核酸编码的改造丝心蛋白优选苏氨酸残基含有率为9％以下。并且，由该核酸编码的改造丝心蛋白优选丝氨酸残基和苏氨酸残基含有率为9％以下。
[宿主和表达载体]
本发明的表达载体具有本发明的核酸序列和以能够工作的方式与该核酸序列连接的一个或两个以上调节序列。调节序列是对宿主中的重组蛋白的表达进行调控的序列(例如启动子、增强子、核糖体结合序列、转录终止序列等)，可以根据宿主的种类适当选择。表达载体的种类可以根据宿主的种类适当选择质粒载体、病毒载体、柯斯质粒(cosmid)载体、福斯质粒(fosmid)载体、人工染色体载体等。
本发明的宿主是利用本发明的表达载体进行转化而得到的。作为宿主，原核生物、以及酵母、丝状真菌、昆虫细胞、动物细胞和植物细胞等真核生物均可以优选使用。
作为表达载体，优选使用在宿主细胞中能够自主复制、或者能够整合到宿主的染色体中、且在能够对本发明的核酸进行转录的位置含有启动子的表达载体。
在使用细菌等原核生物作为宿主的情况下，本发明的表达载体优选为在原核生物中能够自主复制的同时包含启动子、核糖体结合序列、本发明的核酸和转录终止序列的载体。也可以包含对启动子进行调控的基因。
作为原核生物，可以列举属于埃希氏菌属、短芽孢杆菌属、沙雷氏菌属、芽孢杆菌属、微杆菌属、短杆菌属、棒杆菌属和假单胞菌属等的微生物。
作为属于埃希氏菌属的微生物，可以列举例如大肠杆菌BL21(Novagen公司)、大肠杆菌BL21(DE3)(Life Technologies公司)、大肠杆菌BLR(DE3)(默克密理博公司)、大肠杆菌DH1、大肠杆菌GI698、大肠杆菌HB101、大肠杆菌JM109、大肠杆菌K5(ATCC 23506)、大肠杆菌KY3276、大肠杆菌MC1000、大肠杆菌MG1655(ATCC 47076)、大肠杆菌No.49、大肠杆菌Rosetta(DE3)(Novagen公司)、大肠杆菌TB1、大肠杆菌Tuner(Novagen公司)、大肠杆菌Tuner(DE3)(Novagen公司)、大肠杆菌W1485、大肠杆菌W3110(ATCC 27325)、大肠杆菌(Escherichia coli)XL1-Blue、大肠杆菌XL2-Blue等。
作为属于短芽孢杆菌属的微生物，可以列举例如土壤短芽孢杆菌、波茨坦短芽孢杆菌、中孢短芽孢杆菌、美丽短芽孢杆菌、铫子短芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、沼泽短芽孢杆菌、副短短芽孢杆菌、罗伊氏短芽孢杆菌、热红短芽孢杆菌、短短芽孢杆菌47(FERM BP-1223)、短短芽孢杆菌47K(FERM BP-2308)、短短芽孢杆菌47-5(FERM BP-1664)、短短芽孢杆菌47-5Q(JCM8975)、桥石短芽孢杆菌HPD31(FERM BP-1087)、桥石短芽孢杆菌HPD31-S(FERMBP-6623)、桥石短芽孢杆菌HPD31-OK(FERM BP-4573)、桥石短芽孢杆菌SP3株(Takara公司制)等。
作为属于沙雷氏菌属的微生物，可以列举例如液化沙雷氏菌(Serratialiquefacience)ATCC14460、嗜虫沙雷氏菌(Serratia entomophila)、无花果沙雷氏菌(Serratia ficaria)、居泉沙雷氏菌(Serratia fonticola)、格氏沙雷氏菌(Serratiagrimesii)、变形斑沙雷氏菌(Serratia proteamaculans)、气味沙雷氏菌(Serratiaodorifera)、普城沙雷氏菌(Serratia plymuthica)、深红沙雷氏菌(Serratia rubidaea)等。
作为属于芽孢杆菌属的微生物，可以列举例如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)等。
作为属于微杆菌属的微生物，可以列举例如嗜氨微杆菌ATCC15354等。
作为属于短杆菌属的微生物，可以列举例如叉开短杆菌(谷氨酸棒杆菌)ATCC14020、黄色短杆菌(谷氨酸棒杆菌ATCC14067)ATCC13826、ATCC14067、乳发酵短杆菌(Brevibacterium immariophilum)ATCC14068、乳酸发酵短杆菌(谷氨酸棒杆菌ATCC13869)ATCC13665、ATCC13869、玫瑰色短杆菌ATCC13825、解糖短杆菌(Brevibacteriumsaccharolyticum)ATCC14066、生硫短杆菌ATCC19240、白色短杆菌ATCC15111、蜡状短杆菌ATCC15112等。
作为属于棒杆菌属的微生物，可以列举例如产氨棒杆菌(Corynebacteriumammoniagenes)ATCC6871、ATCC6872、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC13032、谷氨酸棒杆菌ATCC14067、嗜乙酰乙酸棒杆菌(Corynebacteriumacetoacidophilum)ATCC13870、醋谷棒杆菌ATCC15806、解碱棒杆菌ATCC21511、帚石南棒杆菌ATCC15991、谷氨酸棒杆菌ATCC13020、ATCC13032、ATCC13060、百合棒杆菌ATCC15990、栖糖蜜棒杆菌ATCC17965、热产氨棒杆菌AJ12340(FERMBP-1539)、力士棒杆菌ATCC13868等。
作为属于假单胞菌(Pseudomonas)属的微生物，可以列举例如恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、油菜假单胞菌(Pseudomonas brassicacearum)、黄褐假单胞菌(Pseudomonas fulva)和假单胞菌属细菌(Pseudomonas sp.)D-0110等。
作为向上述宿主细胞中导入表达载体的方法，只要是向上述宿主细胞中导入DNA的方法则均可以使用。可以列举例如使用钙离子的方法[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69,2110(1972)]、原生质体法(日本特开昭63-248394号公报)、或Gene,17,107(1982)、Molecular&General Genetics,168,111(1979)中记载的方法等。
属于短芽孢杆菌属的微生物的转化可以利用例如Takahashi等的方法(J.Bacteriol.,1983,156:1130-1134)、Takagi等的方法(Agric.Biol.Chem.,1989,53:3099-3100)、或Okamoto等的方法(Biosci.Biotechnol.Biochem.,1997,61:202-203)来实施。
作为导入本发明的核酸的载体(以下简称为"载体")，可以列举例如pBTrp2、pBTac1、pBTac2(均由Boehringer Mannheim公司销售)、pKK233-2(Pharmacia公司制)、pSE280(Invitrogen公司制)、pGEMEX-1(Promega公司制)、pQE-8(QIAGEN公司制)、pKYP10(日本特开昭58-110600号公报)、pKYP200[Agric.Biol.Chem.,48,669(1984)]、pLSA1[Agric.Biol.Chem.,53,277(1989)]、pGEL1[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82,4306(1985)]、pBluescript II SK(-)(Stratagene公司制)、pTrs30[由大肠杆菌JM109/pTrS30(FERM BP-5407)制备]、pTrs32[由大肠杆菌JM109/pTrS32(FERM BP-5408)制备]、pGHA2[由大肠杆菌IGHA2(FERM B-400)制备、日本特开昭60-221091号公报]、pGKA2[由大肠杆菌IGKA2(FERMBP-6798)制备、日本特开昭60-221091号公报]、pTerm2(US4686191、US4939094、US5160735)、pSupex、pUB110、pTP5、pC194、pEG400[J.Bacteriol.,172,2392(1990)]、pGEX(Pharmacia公司制)、pET系统(Novagen公司制)等。
在使用大肠杆菌作为宿主的情况下，可以列举pUC18、pBluescriptII、pSupex、pET22b、pCold等作为优选的载体。
作为属于短芽孢杆菌属的微生物的优选载体的具体例，可以列举作为枯草杆菌载体公知的pUB110、或pHY500(日本特开平2-31682号公报)、pNY700(日本特开平4-278091号公报)、pHY4831(J.Bacteriol.,1987,1239-1245)、pNU200(鹈高重三、日本农艺化学会志1987,61:669-676)、pNU100(Appl.Microbiol.Biotechnol.,1989,30:75-80)、pNU211(J.Biochem.,1992,112:488-491)、pNU211R2L5(日本特开平7-170984号公报)、pNH301(Appl.Environ.Microbiol.,1992,58:525-531)、pNH326、pNH400(J.Bacteriol.,1995,177:745-749)、pHT210(日本特开平6-133782号公报)、pHT110R2L5(Appl.Microbiol.Biotechnol.,1994,42:358-363)、或大肠杆菌与属于短芽孢杆菌属的微生物的穿梭载体pNCO2(日本特开2002-238569号公报)等。
作为启动子，只要在宿主细胞中发挥功能则没有限制。可以列举例如trp启动子(Ptrp)、lac启动子、PL启动子、PR启动子、T7启动子等来源于大肠杆菌或噬菌体等的启动子。另外，也可以使用将两个Ptrp串联而成的启动子(Ptrp×2)、tac启动子、lacT7启动子、let I启动子这样人为地进行了设计改造的启动子等。
优选使用将作为核糖体结合序列的夏因-达尔加诺(Shine-Dalgarno)序列与起始密码子之间调节为适当距离(例如6～18个碱基)的质粒。在本发明的表达载体中，本发明的核酸的表达不一定需要转录终止序列，但优选紧挨在结构基因的下游配置转录终止序列。
作为真核生物的宿主，可以列举例如酵母、丝状真菌(霉菌等)和昆虫细胞。
作为酵母，可以列举例如属于酵母(Saccharomyces)属、裂殖酵母(Schizosaccharomyces)属、克鲁维酵母(Kluyveromyces)属、丝孢酵母(Trichosporon)属、许旺酵母(Schwanniomyces)属、毕赤酵母(Pichia)属、假丝酵母(Candida)属、耶氏酵母属和汉逊酵母属等的酵母。更具体而言，可以列举酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、丛生丝孢酵母(Trichosporon pullulans)、河岸许旺酵母(Schwanniomyces alluvius)、西方许旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、多形毕赤酵母(Pichia polymorpha)、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)等。
使用酵母作为宿主细胞的情况下的表达载体通常优选包含复制起点(需要在宿主中扩增的情况)和用于大肠杆菌中的载体的增殖的筛选标志物、用于酵母中的重组蛋白表达的启动子和终止子、以及用于酵母的筛选标志物。
在表达载体为非整合载体的情况下，优选进一步包含自主复制序列(ARS)。由此，能够提高表达载体在细胞内的稳定性(Myers、A.M.、et al.(1986)Gene 45:299-310)。
作为使用酵母作为宿主的情况下的载体，可以列举例如YEP13(ATCC37115)、YEp24(ATCC37051)、YCp50(ATCC37419)、YIp、pHS19、pHS15、pA0804、pHIL3Ol、pHIL-S1、pPIC9K、pPICZα、pGAPZα、pPICZ B等。
作为启动子，只要能够在酵母中表达则没有限制。可以列举例如己糖激酶等糖酵解系统的基因的启动子、PHO5启动子、PGK启动子、GAP启动子、ADH启动子、gal 1启动子、gal10启动子、热休克多肽启动子、MFα1启动子、CUP 1启动子、pGAP启动子、pGCW14启动子、AOX1启动子、MOX启动子等。
作为向酵母中导入表达载体的方法，只要是将DNA导入酵母中的方法则均可以使用，可以列举例如电穿孔法(Methods Enzymol.,194,182(1990))、原生质球法(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,81,4889(1984))、乙酸锂法(J.Bacteriol.,153,163(1983))、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,75,1929(1978)记载的方法等。
作为丝状真菌，可以列举例如属于顶孢霉(Acremonium)属、曲霉(Aspergillus)属、黑粉霉(Ustilago)属、木霉(Trichoderma)属、链孢霉(Neurospora)属、镰孢霉(Fusarium)属、腐质霉(Humicola)属、青霉(Penicillium)属、毁丝霉(Myceliophtora)属、灰霉(Botryts)属、稻瘟霉(Magnaporthe)属、毛霉(Mucor)属、绿僵菌(Metarhizium)属、红曲霉(Monascus)属、根霉(Rhizopus)属和根毛霉属的菌等。
作为丝状真菌的具体例，可以列举阿拉巴马顶孢霉(Acremonium alabamense)、解纤维素顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)、棘孢曲霉(aculeatus)(Aspergillusaculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、清酒曲霉(Aspergillus sake)、酱油曲霉(sojae)(Aspergillus sojae)、塔宾曲霉(Aspergillustubigensis)、黑曲霉(Aspergillus niger)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)、无花果曲霉(ficuum)(Aspergillus ficuum)、海枣曲霉(Aspergillus phoeicus)、臭曲霉(foetidus)(Aspergillus foetidus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、日本曲霉(japonicus)(Aspergillus japonicus)、绿色木霉(Trichoderma viride)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、里氏木霉(Trichoderma reseei)、拉克淖金孢子菌(Chrysosporiumlucknowense)、嗜热子囊菌(Thermoascus)、孢子丝菌(Sporotrichum)、嗜纤维素侧孢霉(Sporotrichum cellulophilum)、篮状菌(Talaromyces)、太瑞斯梭孢壳霉(Thielaviaterrestris)、梭孢壳霉(Thielavia)、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)、尖孢镰孢霉(Fusarium oxysporus)、禾谷镰孢霉(Fusarium graminearum)、镶片镰孢霉(Fusariumvenenatum)、特异腐质霉(Humicola insolens)、产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)、卡门培尔青霉(Penicillium camemberti)、灰白青霉(Penicillium canescens)、埃默森青霉(Penicillium emersonii)、绳状青霉(Penicillium funiculosum)、灰玫瑰青霉(Penicillium griseoroseum)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、娄地青霉(Penicillium roqueforti)、嗜热毁丝霉(Myceliophtaora thermophilum)、不明毛霉(Mucor ambiguus)、卷枝毛霉(Mucor circinelloides)、易脆毛霉(Mucor fragilis)、冻土毛霉(Mucor hiemalis)、不等孢毛霉(Mucor inaequisporus)、Mucor oblongiellipticus、总状毛霉(Mucor racemosus)、反屈毛霉(Mucor recurvus)、土星状毛霉(Mocorsaturninus)、Mocor subtilissmus、多形欧加铁菌(Ogataea polymorpha)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)、微小根毛霉(Rhizomucor pusillus)、少根根霉(Rhizopus arrhizus)等。
作为宿主为丝状真菌的情况下的启动子，可以为参与糖酵解系统的基因、参与构成性表达的基因、参与水解的酶基因等中的任意一种，具体而言，可以列举amyB、glaA、agdA、glaB、TEF1、xynF1tannasegene、No.8AN、gpdA、pgkA、enoA、melO、sodM、catA、catB等。
表达载体向丝状真菌中的导入可以使用现有公知的方法进行。可以列举例如Cohen等的方法(氯化钙法)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69:2110(1972)]、原生质体法[Mol.Gen.Genet.,168:111(1979)]、感受态细胞法[J.Mol.Biol.,56:209(1971)]、电穿孔法等。
作为昆虫细胞，可以列举例如鳞翅类的昆虫细胞，更具体而言，可以列举Sf9和Sf21等草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)来源的昆虫细胞、以及High 5等粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)来源的昆虫细胞等。
作为使用昆虫细胞作为宿主的情况下的载体，可以列举例如作为感染夜蛾科昆虫的病毒的苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica nuclearpolyhedrosis virus)等杆状病毒(Baculovirus Expression Vectors,A LaboratoryManual(杆状病毒表达载体实验室手册),W.H.Freeman and Company,纽约(1992))。
在使用昆虫细胞作为宿主的情况下，可以利用例如Current protocols inmolecular biology(分子生物学现行规范)；Baculovirus Expression Vectors,ALaboratory Manual(杆状病毒表达载体实验室手册),W.H.Freeman and Company,纽约(1992)；Bio/Technology,6,47(1988)等中记载的方法对多肽进行表达。即，可以将重组基因导入载体和杆状病毒共导入昆虫细胞中，在昆虫细胞培养上清中得到重组病毒(表达载体)后，进一步使重组病毒感染昆虫细胞，使多肽进行表达。作为该方法中使用的基因导入载体，可以列举例如pVL1392、pVL1393、pBlueBacIII(均为Invitorogen公司制)等。
作为用于制备重组病毒的、重组基因导入载体和杆状病毒向昆虫细胞中的共导入方法，可以列举例如磷酸钙法(日本特开平2-227075号公报)、脂质体转染法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,7413(1987))等。
本发明的重组载体优选进一步含有用于转化体选择的选择标志物基因。例如，在大肠杆菌中，作为选择标志物基因，可以使用针对四环素、氨苄青霉素、卡那霉素等各种药剂的抗性基因。也可以使用能够与营养缺陷型相关的基因变异互补的劣性的选择标志物。在酵母中，作为选择标志物基因，可以使用针对遗传霉素的抗性基因，也可以使用与营养缺陷型相关的基因变异互补的基因、LEU2、URA3、TRP1、HIS3等选择标志物。在丝状真菌中，作为选择标志物基因，可以列举选自由niaD(Biosci.Biotechnol.Biochem.,59,1795-1797(1995))、argB(Enzyme Microbiol Technol,6,386-389,(1984))、sC(Gene,84,329-334,(1989))、ptrA(BiosciBiotechnol Biochem,64,1416-1421,(2000))、pyrG(BiochemBiophys Res Commun,112,284-289,(1983))，amdS(Gene,26,205-221,(1983))、金担子素抗性基因(Mol Gen Genet,261,290-296,(1999))、苯菌灵抗性基因(Proc NatlAcad Sci USA,83,4869-4873,(1986))和潮霉素抗性基因(Gene,57,21-26,(1987))组成的组中的标志物基因、亮氨酸缺陷型互补基因等。另外，在宿主为营养缺陷型变异株的情况下，也可以使用与该营养缺陷型互补的野生型基因作为选择标志物基因。
利用本发明的表达载体进行了转化的宿主的选择可以通过使用选择地与本发明的核酸结合的探针的噬菌斑杂交和菌落杂交等来进行。作为该探针，可以使用将基于本发明的核酸的序列信息利用PCR法扩增出的部分DNA片段用放射性同位素或地高辛进行修饰而得到的探针。
[改造丝心蛋白的制造方法]
本发明的改造丝心蛋白可以通过包含利用本发明的表达载体进行了转化的宿主来表达本发明的核酸的工序的方法，进行制造。作为表达方法，除了直接表达以外，还可以依据分子克隆第二版中记载的方法等进行分泌生产、融合蛋白表达等。在利用酵母、动物细胞、昆虫细胞进行表达的情况下，可以以附加有糖或糖链的多肽的形式得到改造丝心蛋白。
本发明的改造丝心蛋白例如可以通过将利用本发明的表达载体进行了转化的宿主在培养用培养基中进行培养，使本发明的改造丝心蛋白在培养用培养基中生成蓄积，并从该培养用培养基中收集来进行制造。将本发明的宿主在培养用培养基中进行培养的方法可以按照宿主的培养中通常使用的方法来进行。
在本发明的宿主为大肠杆菌等原核生物或酵母等真核生物的情况下，作为本发明的宿主的培养用培养基，只要是含有该宿主可同化的碳源、氮源和无机盐类等、能够高效地进行该宿主的培养的培养基，则可以使用天然培养基、合成培养基中的任意一种。
作为碳源，只要是该宿主可同化的碳源即可，可以使用例如葡萄糖、果糖、蔗糖以及含有这些糖的糖蜜、淀粉和淀粉水解物等碳水化合物、乙酸和丙酸等有机酸、以及乙醇和丙醇等醇类。
作为氮源，可以使用例如氨、氯化铵、硫酸铵、乙酸铵和磷酸铵等无机酸或有机酸的铵盐、其他含氮化合物、以及蛋白胨、肉膏、酵母提取物、玉米浆、酪蛋白水解物、豆粕和豆粕水解物、各种发酵菌体及其消化产物。
作为无机盐，可以使用例如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜和碳酸钙。
大肠杆菌等原核生物或酵母等真核生物的培养例如可以在振荡培养或深部通气搅拌培养等需氧条件下进行。培养温度例如为15～40℃。培养时间通常为16小时～7天。培养中的培养用培养基的pH优选保持于3.0～9.0。培养用培养基的pH的调节可以使用无机酸、有机酸、碱溶液、尿素、碳酸钙和氨等进行。
另外，培养中，可以根据需要在培养用培养基中添加氨苄青霉素和四环素等抗生素。在对利用使用诱导性启动子作为启动子的表达载体进行了转化的微生物进行培养时，可以根据需要在培养基中添加诱导剂。例如，在对利用使用lac启动子的表达载体进行了转化的微生物进行培养时，可以在培养基中添加异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷等；在对利用使用trp启动子的表达载体进行了转化的微生物进行培养时，可以在培养基中添加吲哚丙烯酸等。
作为昆虫细胞的培养用培养基，可以使用通常使用的TNM-FH培养基(Pharmingen公司制)、Sf-900 II SFM培养基(Life Technologies公司制)、ExCell400、ExCell405(均为JRH Biosciences公司制)、Grace's昆虫培养基(Nature,195,788(1962))等。
昆虫细胞的培养例如可以在培养用培养基的pH为6～7、培养温度为25～30℃等条件下使培养时间为1～5天来进行。另外，培养中，可以根据需要在培养用培养基中添加庆大霉素等抗生素。
在宿主为植物细胞的情况下，转化后的植物细胞可以直接进行培养，另外也可以分化为植物的器官来进行培养。作为培养该植物细胞的培养基，可以使用通常使用的Murashige&Skoog(MS)培养基、怀特(White)培养基、或者在这些培养基中添加生长素、细胞分裂素等植物激素而得到的培养基等。
动物细胞的培养例如可以在培养用培养基的pH为5～9、培养温度为20～40℃等条件下使培养时间为3～60天来进行。另外，培养中，可以根据需要在培养基中添加卡那霉素、潮霉素等抗生素。
作为使用利用本发明的表达载体进行了转化的宿主来生产改造丝心蛋白的方法，有下述方法：在宿主细胞内生产该改造丝心蛋白的方法；使该改造丝心蛋白分泌到宿主细胞外的方法；和在宿主细胞外膜上生产该改造丝心蛋白的方法。可以通过改变所使用的宿主细胞和所生产的改造丝心蛋白的结构来选择这些各方法。
例如，在改造丝心蛋白生产于宿主细胞内或宿主细胞外膜上的情况下，可以通过应用鲍尔森等的方法(J.Biol.Chem.，264，17619(1989))、Row等的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86,8227(1989)、Genes Develop.,4,1288(1990))、或日本特开平5-336963号公报、国际公开第94/23021号等中记载的方法来进行变更，以使改造丝心蛋白主动地分泌到宿主细胞外。即，使用基因重组的方法，以在包含改造丝心蛋白的活性部位的多肽上附加有信号肽的形式进行表达，由此能够使改造丝心蛋白主动地分泌到宿主细胞外。
由利用本发明的表达载体进行了转化的宿主生产的改造丝心蛋白可以利用蛋白质的分离纯化中通常使用的方法进行分离和纯化。例如，在改造丝心蛋白以溶解状态在细胞内进行表达的情况下，在培养结束后，通过离心分离回收宿主细胞，悬浮于水系缓冲液中后，利用超声波破碎机、弗氏压碎器、Manton-Gaulin匀浆器和戴诺研磨机(DYNO-MILL)等将宿主细胞破碎，得到无细胞提取液。从通过将该无细胞提取液离心分离而得到的上清中，单独或组合使用蛋白质的分离纯化中通常使用的方法、即溶剂提取法、利用硫酸铵等的盐析法、脱盐法、利用有机溶剂的沉淀法、使用二乙基氨基乙基(DEAE)-琼脂糖、DIAION HPA-75(三菱化成公司制)等树脂的阴离子交换层析法、使用S-琼脂糖FF(Pharmacia公司制)等树脂的阳离子交换层析法、使用丁基琼脂糖、苯基琼脂糖等树脂的疏水性层析法、使用分子筛的凝胶过滤法、亲和层析法、聚焦层析法、等电聚焦电泳等电泳法等方法，能够得到纯化制备品。
作为上述层析法，优选使用采用苯基-TOYOPEARL(东曹)、DEAE-TOYOPEARL(东曹)、Sephadex G-150(Pharmacia Biotech)的柱层析。
另外，在改造丝心蛋白在细胞内形成不溶体而进行表达的情况下，同样在回收宿主细胞后将其破碎并进行离心分离，由此以沉淀级分的形式回收改造丝心蛋白的不溶体。回收的改造丝心蛋白的不溶体可以利用蛋白变性剂进行可溶化。该操作后，利用与上述同样的分离纯化法能够得到改造丝心蛋白的纯化制备品。
在改造丝心蛋白或在改造丝心蛋白上附加有糖链的衍生物被分泌到细胞外的情况下，可以从培养上清中回收改造丝心蛋白或其衍生物。即，利用离心分离等方法对培养物进行处理，由此获得培养上清，通过使用与上述同样的分离纯化法，能够从该培养上清中得到纯化制备品。
本发明的改造丝心蛋白减少了通过与甲酸等羧酸接触所形成的酯键，由此，即使放置在大气中，也难以产生异味。因此，本实施方式的改造丝心蛋白的制造方法即使包含使改造丝心蛋白与甲酸等羧酸接触的工序也没有问题。
[人造改造丝心蛋白组合物]
本实施方式的人造改造丝心蛋白组合物至少包含本发明的改造丝心蛋白。
人造改造丝心蛋白组合物中的改造丝心蛋白的含量以人造改造丝心蛋白组合物总量为基准，可以为30～100质量％，优选为35～100质量％，更优选为40～100质量％。
本实施方式的人造改造丝心蛋白组合物根据其形态、用途等，还可以包含其他添加剂。作为添加剂，例如可以列举增塑剂、流平剂、交联剂、结晶成核剂、抗氧化剂、紫外线吸收剂、着色剂、填料和合成树脂。相对于改造丝心蛋白的总量100质量份，添加剂的含量可以为50质量份以下。
本实施方式的人造改造丝心蛋白组合物可以是粉末状、糊状、液体状(例如悬浊液、溶液)中的任意一种形态。另外，本实施方式的人造改造丝心蛋白组合物，除了原料组合物(例如，蛋白质粉末、纺丝原液)的形态以外，也可以是包含该人造改造丝心蛋白组合物、或由该人造改造丝心蛋白组合物构成的成形体(例如，纤维、丝、膜、发泡体、粒体、模塑成形体)的形态。
(纺丝原液)
本实施方式的人造改造丝心蛋白组合物也可以是纺丝原液的形态。本实施方式的纺丝原液至少包含改造丝心蛋白和溶剂。本实施方式的纺丝原液还可以包含溶解促进剂。本实施方式的纺丝原液还可以进一步包含除改造丝心蛋白以外的蛋白质。
作为溶剂，可以列举例如包含六氟异丙醇(HFIP)、六氟丙酮(HFA)、二甲亚砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲酸以及尿素、胍、十二烷基硫酸钠(SDS)、溴化锂、氯化钙及硫氰酸锂等的水溶液等。这些溶剂可以单独使用1种，也可以混合使用2种以上。
纺丝原液中的改造丝心蛋白的含量以纺丝原液的总质量为基准，可以为15质量％以上、30质量％以上、40质量％以上或50质量％以上。从纺丝原液的制造效率的观点出发，改造丝心蛋白的含量以纺丝原液的总质量为基准，可以为70质量％以下、65质量％以下或60质量％以下。
作为溶解促进剂，可以列举例如由以下所示的路易斯酸和路易斯碱构成的无机盐。作为路易斯碱，可以列举例如含氧酸根离子(硝酸根离子、高氯酸根离子等)、金属含氧酸根离子(高锰酸根离子等)、卤离子、硫氰酸根离子、氰酸根离子等。作为路易斯酸，可以列举例如碱金属离子、碱土金属离子等金属离子、铵根离子等多原子离子、络离子等。作为由路易斯酸和路易斯碱构成的无机盐的具体例，可以列举氯化锂、溴化锂、碘化锂、硝酸锂、高氯酸锂和硫氰酸锂等锂盐、氯化钙、溴化钙、碘化钙、硝酸钙、高氯酸钙和硫氰酸钙等钙盐、氯化铁、溴化铁、碘化铁、硝酸铁、高氯酸铁和硫氰酸铁等铁盐、氯化铝、溴化铝、碘化铝、硝酸铝、高氯酸铝和硫氰酸铝等铝盐、氯化钾、溴化钾、碘化钾、硝酸钾、高氯酸钾和硫氰酸钾等钾盐、氯化钠、溴化钠、碘化钠、硝酸钠、高氯酸钠和硫氰酸钠等钠盐、氯化锌、溴化锌、碘化锌、硝酸锌、高氯酸锌和硫氰酸锌等锌盐、氯化镁、溴化镁、碘化镁、硝酸镁、高氯酸镁和硫氰酸镁等镁盐、氯化钡、溴化钡、碘化钡、硝酸钡、高氯酸钡和硫氰酸钡等钡盐、以及氯化锶、溴化锶、碘化锶、硝酸锶、高氯酸锶和硫氰酸锶等锶盐。
相对于改造丝心蛋白的总量100质量份，溶解促进剂的含量可以为1.0质量份以上、5.0质量份以上、9.0质量份以上、15质量份以上或20.0质量份以上。相对于改造丝心蛋白的总量100质量份，溶解促进剂的含量可以为40质量份以下、35质量份以下或30质量份以下。
在制造本实施方式的纺丝原液时，也可以加温至30～90℃。根据所使用的溶剂、改造丝心蛋白的种类等适时设定可溶解的温度即可。为了促进溶解，可以进行振荡、搅拌。
本实施方式的纺丝原液的粘度可以根据纺丝原液的用途等进行适当设定。例如，在将本实施方式的纺丝原液作为纺丝原液使用的情况下，其粘度可以根据纺丝方法进行适当设定，例如，在35℃下设定为100～15,000cP(厘泊)，在40℃下设定为100～30,000cP(厘泊)等即可。纺丝原液的粘度可以使用例如京都电子工业公司制造的商品名"EMS粘度计"进行测定。
(蛋白质纤维)
本实施方式的人造改造丝心蛋白组合物可以是蛋白质纤维的形态。例如可以通过用丝心蛋白的纺丝中通常使用的方法对上述的纺丝原液(纺丝液)进行纺丝而获得蛋白质纤维。
作为纺丝方法，只要是能够将本发明的改造丝心蛋白纺丝的方法则没有特别限制，可以列举例如干式纺丝、熔融纺丝、湿式纺丝等。作为优选的纺丝方法，可以列举湿式纺丝。
在湿式纺丝中，将纺丝原液从纺丝喷头(喷嘴)挤出到凝固液(凝固液槽)中，使改造丝心蛋白在凝固液中凝固，由此能够得到丝形状的未拉伸丝。作为凝固液，只要是能够脱溶剂的溶液即可，可以列举例如甲醇、乙醇和2-丙醇等碳原子数1～5的低级醇、以及丙酮等。凝固液中可以适当添加水。凝固液的温度优选为0～30℃。在使用具有直径0.1～0.6mm的喷嘴的注射泵作为纺丝喷头的情况下，挤出速度优选为每孔0.2～6.0ml/小时，更优选为1.4～4.0ml/小时。凝固液槽的长度只要是能够高效地进行脱溶剂的长度即可，例如为200～500mm。未拉伸丝的引离速度例如可以为1～20m/分钟，优选为1～3m/分钟。停留时间例如可以为0.01～3分钟，优选为0.05～0.15分钟。另外，可以在凝固液中进行拉伸(预拉伸)。为了抑制低级醇的蒸发，可以将凝固液维持于低温，在未拉伸丝的状态下进行引离。凝固液槽可以设置多段，并且可以根据需要在各段或特定的段中进行拉伸。
利用上述方法得到的未拉伸丝(或预拉伸丝)可以经过拉伸工序制成拉伸丝。作为拉伸方法，可以列举湿热拉伸、干热拉伸等。
湿热拉伸可以在温水中、向温水中添加有机溶剂等而得到的溶液中、蒸气加热中进行。作为温度，例如可以为50～90℃，优选为75～85℃。在湿热拉伸中，可以将未拉伸丝(或预拉伸丝)拉伸例如1～10倍，优选拉伸2～8倍。
干热拉伸可以使用管式电热炉、干热板等来进行。作为温度，例如可以为140℃～270℃，优选为160℃～230℃。在干热拉伸中，可以将未拉伸丝(或预拉伸丝)拉伸例如0.5～8倍，优选拉伸1～4倍。
湿热拉伸和干热拉伸可以分别单独进行，另外也可以将它们以多步或组合进行。即，可以以湿热拉伸进行第一步拉伸，以干热拉伸进行第二步拉伸；或者第一步拉伸进行湿热拉伸，第二步拉伸进行湿热拉伸，进一步以干热拉伸进行第三步拉伸等，可以将湿热拉伸和干热拉伸适当组合进行。
拉伸工序中的最终拉伸倍率相对于未拉伸丝(或预拉伸丝)例如为5～20倍，优选为6～11倍。
蛋白质纤维可以在拉伸后，在蛋白质纤维内的多肽分子间进行化学交联。能够交联的官能团可以列举例如氨基、羧基、硫醇基和羟基等。例如，多肽中含有的赖氨酸侧链的氨基可以通过脱水缩合以酰胺键与谷氨酸或天冬氨酸侧链的羧基交联。可以通过在真空加热下进行脱水缩合反应而进行交联，也可以利用碳二亚胺等脱水缩合剂进行交联。
多肽分子间的交联可以使用碳二亚胺、戊二醛等交联剂来进行，也可以使用谷氨酰胺转移酶等酶来进行。碳二亚胺为通式R1N＝C＝NR2(其中，R1和R2各自独立地表示包含碳原子数1～6的烷基、环烷基的有机基团)所表示的化合物。作为碳二亚胺的具体例，可以列举1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)、1-环己基-3-(2-吗啉基乙基)碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺(DIC)等。这些之中，EDC和DIC由于多肽分子间的酰胺键形成能力高、易于进行交联反应而优选。
交联处理优选对蛋白质纤维赋予交联剂并在真空加热干燥下进行交联。关于交联剂，可以对蛋白质纤维赋予纯品，也可以对蛋白质纤维赋予利用碳原子数1～5的低级醇和缓冲液等稀释至0.005～10质量％的浓度的交联剂。交联处理优选在20～45℃的温度下进行3～42小时。通过交联处理，能够对蛋白质纤维赋予更高的应力(强度)。
(膜)
本实施方式的人造改造丝心蛋白组合物可以是膜的形态。例如可以通过将上述的纺丝原液在基材表面铸塑成形、干燥和/或脱溶剂而获得膜。
纺丝原液溶液的粘度优选为15～80cP(厘泊)，更优选为20～70cP。
将纺丝原液溶液设为100质量％时，本发明的改造丝心蛋白的浓度优选为3～50质量％，更优选为3.5～35质量％，进一步优选为4.2～15.8质量％。
纺丝原液溶液制备时，可以加温至30～60℃来进行。为了促进溶解，可以进行振荡、搅拌。
基材可以为树脂基板、玻璃基板、金属基板等。从能够将流延成形后的膜容易地剥离的观点出发，基材优选为树脂基板。作为树脂基板，例如可以为聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)膜、聚四氟乙烯等氟树脂膜、聚丙烯(PP)膜、或在这些膜表面固定有机硅化合物而得到的剥离膜。从对HFIP、DMSO溶剂等稳定、能够将纺丝原液溶液稳定地流延成形、能够容易地剥离成形后的膜的观点出发，基材更优选为PET膜或在PET膜表面固定有机硅化合物而得到的剥离膜。
对具体步骤进行说明，首先将纺丝原液流延于基材表面，使用涂布器、刮刀涂布机、刮棒涂布机等膜厚控制手段，制作规定厚度(例如，以干燥和/或脱溶剂后的厚度计为1～1000μm)的润湿膜。
干燥和/或脱溶剂可以以干式或湿式进行。作为以干式进行的方法，可以列举真空干燥、热风干燥、风干等。作为以湿式进行的方法，可以列举将流延膜浸渍于脱溶剂液(也称为凝固液)中使溶剂脱离的方法等。作为脱溶剂液，可以列举水、甲醇、乙醇、2-丙醇等碳原子数1～5的低级醇等的醇液、水与醇的混合液等。脱溶剂液(凝固液)的温度优选为0～90℃。
干燥和/或脱溶剂后的未拉伸膜可以在水中进行单轴拉伸或双轴拉伸。双轴拉伸可以为逐级拉伸也可以为同步双轴拉伸。也可以设定为两步以上的多步拉伸。拉伸倍率优选纵、横均为1.01～6倍，更优选为1.05～4倍。若为该范围，则容易取得应力-应变的平衡。水中拉伸优选在20～90℃的水温下进行。拉伸后的膜优选在50～200℃的干热下进行5～600秒钟的热固定。通过该热固定，能够得到常温下的尺寸稳定性。需要说明的是，单轴拉伸后的膜成为单轴取向膜，双轴拉伸后的膜成为双轴取向膜。
[人造改造丝心蛋白组合物的制造方法]
本发明的人造改造丝心蛋白组合物可以通过包括准备本发明的改造丝心蛋白的工序的方法来制造。本发明的人造改造丝心蛋白组合物的制造方法还可以包括调整含有本发明的改造丝心蛋白和羧酸的改造丝心蛋白溶解液(例如，纺丝原液)的工序。
本发明的改造丝心蛋白减少了通过与甲酸等羧酸接触所形成的酯键，由此，即使放置在大气中，也难以产生异味。因此，本实施方式的人造改造丝心蛋白组合物的制造方法即使包括使改造丝心蛋白与甲酸等羧酸接触的工序也没有问题。
[产品]
本发明的蛋白质纤维可以以纤维(长纤维、短纤维、多股长丝或单股长丝等)或丝(纺织丝、捻丝、假捻丝、加工丝、混纤丝、混纺丝等)的形式应用于机织物、针织物、编结物、无纺布等。另外，也可以应用于线环、手术用缝合线、电气部件用的可挠性把手、以及移植用生理活性材料(例如人工韧带和主动脉带)等高强度用途。
另外，本发明的人造改造丝心蛋白组合物除了可以应用于纤维和膜以外，也可以应用于发泡体、粒体(球体或非球体等)、纳米纤丝、凝胶(水凝胶等)、树脂及其等效物，这些可以依照日本特开2009-505668号公报、日本专利第5678283号公报、日本专利第4638735号公报等中记载的方法进行制造。
实施例
以下，基于实施例更具体地对本发明进行说明。但是，本发明并不限定于以下的实施例。
[试验例1]
[改造丝心蛋白的制造]
(1)表达载体的制备
设计了具有序列号9～16所表示的氨基酸序列的改造丝心蛋白(分别为PRT918、PRT1104、PRT1105、PRT1103、PRT1107、PRT1083、PRT826和PRT1127)。
序列号9所表示的氨基酸序列(PRT918)具有在序列号1所表示的氨基酸序列(Met-PRT918)的N末端附加了序列号17所表示的氨基酸序列(包含His标签)的氨基酸序列(比较例1)。
序列号10～13所表示的氨基酸序列(PRT1104、PRT1105、PRT1103和PRT1107)如上所述(实施例1～4)。
序列号14所表示的氨基酸序列(PRT1083)是将序列号9所表示的氨基酸序列(PRT918)中的GPGA置换为GTGA，将GPGS置换为GTGS，将GPGV置换为GLGV，将GPGI置换为GTGI，将GPY置换为GLY，将GPS置换为GTS的氨基酸序列(比较例2)。
序列号15所表示的氨基酸序列(PRT826)是在序列号19所表示的氨基酸序列(Met-PRT410)的N末端附加了序列号18所表示的氨基酸序列(包含His标签)的氨基酸序列中，将丝氨酸残基(S)置换为苏氨酸残基(T)的氨基酸序列(实施例5)。
序列号16所表示的氨基酸序列(PRT1127)是在序列号9所表示的氨基酸序列(PRT918)中，将丝氨酸残基(S)置换为苏氨酸残基(T)的氨基酸序列(实施例6)。
具有序列号9～16所表示的氨基酸序列的改造丝心蛋白的苏氨酸残基含有率、丝氨酸残基含有率、苏氨酸残基和丝氨酸残基含有率如表1所示。
[表1]
Figure BDA0003145334110000391
合成编码所设计的改造丝心蛋白的核酸。该核酸中，在5'末端附加有NdeI位点、在终止密码子下游附加有EcoRI位点。将该核酸克隆至克隆载体(pUC118)中。然后，利用NdeI和EcoRI对该核酸进行限制酶处理并将其切出后，重组到蛋白质表达载体pET-22b(+)中，得到表达载体。
(2)蛋白质的制造
用得到的表达载体转化大肠杆菌BLR(DE3)。将该转化大肠杆菌在含有氨苄青霉素的2mL的LB培养基中培养15小时。将该培养液添加到含有氨苄青霉素的100mL的种子培养用培养基(表2)中，以使OD600达到0.005。将培养液温度保持于30℃，进行烧瓶培养直至OD600达到5为止(约15小时)，得到种子培养液。
[表2]
Figure BDA0003145334110000392
将该种子培养液添加到加有500ml的生产培养基(表3)的发酵罐中，以使OD600达到0.05。将培养液温度保持于37℃，在pH6.9下控制恒定而进行培养。另外，将培养液中的溶解氧浓度维持于溶解氧饱和浓度的20％。
[表3]
Figure BDA0003145334110000401
在生产培养基中的葡萄糖被完全消耗后，立即以1ml/分钟的速度添加补料液(葡萄糖455g/1L、酵母提取物120g/1L)。将培养液温度保持于37℃，在pH6.9下控制恒定而进行培养。另外，将培养液中的溶解氧浓度维持于溶解氧饱和浓度的20％，进行20小时培养。然后，向培养液中添加1M的异丙基-β-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)以使终浓度达到1mM，诱导表达改造丝心蛋白。在添加IPTG后经过20小时的时刻，离心分离培养液，回收菌体。使用由添加IPTG前和添加IPTG后的培养液制备的菌体进行SDS-PAGE，根据依赖于IPTG添加的目标改造丝心蛋白尺寸的条带的出现，确认到目标改造丝心蛋白的表达。
(3)蛋白质的纯化
将添加IPTG后2小时后回收的菌体用20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)进行清洗。使清洗后的菌体悬浮在包含约1mM的PMSF的20mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)中，利用高压均质器(GEA Niro Soavi公司制)将细胞破碎。将破碎的细胞离心分离，得到沉淀物。利用20mMTris-HCl缓冲液(pH7.4)清洗所得到的沉淀物，直至达到高纯度为止。将清洗后的沉淀物以达到100mg/mL的浓度的方式悬浮在8M胍缓冲液(8M胍盐酸盐、10mM磷酸二氢钠、20mM NaCl、1mM Tris-HCl、pH7.0)中，在60℃下用搅拌器搅拌30分钟，使其溶解。溶解后，使用透析管(三光纯药株式会社制造的纤维素管36/32)在水中进行透析。通过离心分离来回收透析后得到的白色凝聚蛋白质，用冷冻干燥机去除水分，通过回收冷冻干燥粉末，而获得改造丝心蛋白(PRT918、PRT1104、PRT1105、PRT1103、PRT1107、PRT1083、PRT826和PRT1127)。
[蛋白质膜的制造和评价]
(1)蛋白质膜的制造
将获得的改造丝心蛋白的干燥粉末添加到甲酸中，在40℃加热1小时后使其溶解，获得纺丝原液(纺丝原液中的蛋白质浓度：26质量％)。
将获得的纺丝原液以0.5mm左右的厚度涂布于载玻片上，并依次浸渍于丙酮和水中(分别15分钟)，进行固化及洗涤。然后，自然干燥一夜后，从载玻片上剥离膜，得到样品。膜的膜厚约为0.5～1.0mm。
(2)蛋白质膜的评价
使用下面的测量装置，测量制造的膜样品的红外吸收光谱，由此评价膜样品内的甲酸酯的生成程度。
测量装置：Nicolet iS50 FT-IR(制造商：Thermo Fisher Scientific株式会社)
计算吸光度比P1/P2来评价甲酸酯的生成程度。吸光度比P1/P2越小，表示甲酸酯越少。
P1：1725cm-1(基于酯的C＝O的峰)的峰高度
P2：1445cm-1(基于蛋白质的酰胺III的峰)的峰高度
结果如图1和表4所示。利用降低了丝氨酸残基含有率的实施例1～6中的改造丝心蛋白而形成的膜，降低了甲酸酯的生成。另外，利用苏氨酸残基含有率为9％以下、并且丝氨酸残基和苏氨酸残基含有率为9％以下的实施例1～4中的改造丝心蛋白而形成的膜在甲酸酯吸收区域(1715～1730cm-1)中没有观察到峰，并且没有生成甲酸酯。另一方面，利用丝氨酸残基含有率高的比较例1和比较例2中的改造丝心蛋白而形成的膜在甲酸酯吸收区域观察到峰，并确认到生成了大量的甲酸酯。
[表4]
改造丝心蛋白 吸光度比P1/P2
比较例1 PRT918(序列号9) 0.030
实施例1 PRT1104(序列号10) 0.000
实施例2 PRT1105(序列号11) 0.000
实施例3 PRT1103(序列号12) 0.000
实施例4 PRT1107(序列号13) 0.000
比较例2 PRT1083(序列号14) 0.086
实施例5 PRT826(序列号15) 0.003
实施例6 PRT1127(序列号16) 0.010
[蛋白质纤维的制造和评价]
(1)蛋白质纤维的制造
将获得的改造丝心蛋白(PRT918和PRT1107)的干燥粉末添加到甲酸中，在40℃加热1小时后使其溶解，获得纺丝原液(纺丝原液中的蛋白质浓度：26质量％)。
将获得的纺丝原液放入安装有孔径0.2mm的喷嘴的注射器中，并以纤维状向凝固浴(甲醇浴)中排出并使其固化。通过甲醇浴的纤维经水浴、加热辊进行洗涤、干燥后，卷取后获得纤维样品。获得的纤维样品的纤维直径约为30～40μm。
(2)蛋白质纤维的评价
使用下面的测量装置，测量制造的纤维样品的红外吸收光谱，由此确认纤维样品内有无甲酸酯的产生。
测量装置：Nicolet iS50 FT-IR(制造商：Thermo Fisher Scientific株式会社)
结果如图2所示。利用降低了丝氨酸残基含有率的实施例4中的改造丝心蛋白(PRT1107)而形成的蛋白质纤维在甲酸酯吸收区域(1715～1730cm-1)中没有观察到峰，并且没有生成甲酸酯。另一方面，利用丝氨酸残基含有率高的比较例1中的改造丝心蛋白(PRT918)而形成的蛋白质纤维在甲酸酯吸收区域观察到峰，并确认其生成了大量的甲酸酯。
[试验例2]
[改造丝心蛋白的制造]
(1)表达载体的制备
设计具有序列号24和25所表示的氨基酸序列的改造丝心蛋白(分别为PRT219和PRT1171)。
序列号24所表示的氨基酸序列(PRT219)是在N末端附加了序列号26所表示的氨基酸序列(包含His标签)和序列号27所表示的氨基酸序列(由HRV3C蛋白酶(Humanrhinovirus 3C蛋白酶)识别位点构成的氨基酸序列)的ADF3的氨基酸序列(NCBI的Genebank的登录号：AAC47010，GI：1263287)中，删除了C末端的非重复区域，并添加了缬氨酸残基(V)的氨基酸序列(参考例1)。
序列号25所表示的氨基酸序列(PRT1171)如上所述(实施例7)。
具有序列号24和25所表示的氨基酸序列的改造丝心蛋白的苏氨酸残基含有率、丝氨酸残基含有率、苏氨酸残基和丝氨酸残基含有率如表5所示。
[表5]
Figure BDA0003145334110000441
合成编码所设计的改造丝心蛋白的核酸。该核酸中，在5'末端附加有NdeI位点、在终止密码子下游附加有EcoRI位点。将该核酸克隆至克隆载体(pUC118)中。然后，利用NdeI和EcoRI对该核酸进行限制酶处理并将其切出后，重组到蛋白质表达载体pET-22b(+)中，得到表达载体。
(2)蛋白质的制造和精制
蛋白质的制造和精制使用与试验例1相同的方法实施。
[蛋白质膜的制造和评价]
(1)蛋白质膜的制造
将获得的改造丝心蛋白的干燥粉末添加到甲酸中，在40℃加热1小时后使其溶解，获得纺丝原液(纺丝原液中的蛋白质浓度：26质量％)。
将获得的纺丝原液以0.2mm左右的厚度涂布于载玻片上，并依次浸渍于丙酮和水中(分别15分钟)，进行固化及洗涤。然后，自然干燥一夜后，从载玻片上剥离膜，得到样品。膜的膜厚约为0.1mm。
(2)蛋白质膜的评价
将制造的膜样品(0.08～0.1g)浸入20mL甲醇中，在4℃下静置16小时，通过酯交换反应提取甲酸。轻轻振荡以使浓度均匀后，从甲醇中去除膜样品。将获得的甲醇(包括提取的甲酸)作为分析样品，使用高效液相色谱(HPLC)，对在下述条件下提取的甲酸进行定量。
HPLC系统；
送液单元：LC-20AD(岛津制作所制)
系统控制器：CBM-20A(岛津制作所制)
自动取样器：SIL-20AC(岛津制作所制)
检测器：SPD-M20A(岛津制作所制)
柱烘箱：CTO-20AC(岛津制作所制)
色谱柱：Synergi(注册商标)4μm Hydro-RP
Figure BDA0003145334110000451
LC Column 250×4.6mm,Ea(Phenomenex制)
洗脱液：20mM磷酸钾(pH2.9)
流速：0.7mL/分钟
检测波长：220nm
通过下述式计算膜中的残留甲酸比率来评价甲酸酯的生成程度。
膜中的残留甲酸比率＝(甲醇中提取的甲酸总重量(g)/膜样品重量(g))×100(％)
将结果示于表6。
[表6]
改造丝心蛋白 膜中的残留甲酸比率(％)
参考例1 PRT219(序列号24) 0.9
实施例7 PRT1171(序列号25) 0.1
利用丝氨酸残基含有率更低的实施例7中的改造丝心蛋白(PRT1171)而形成的蛋白质膜与利用参考例1中的改造丝心蛋白(PRT219)而形成的蛋白质膜相比，膜中的残留甲酸比率更小，并确认其进一步抑制了甲酸酯的生成。
序列表
<110> 丝芭博株式会社
<120> 改造丝心蛋白
<130> FP19-1336-00
<160> 28
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 590
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Met-PRT918
<400> 1
Met Gly Pro Gly Val Phe Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala
1 5 10 15
Ala Ala Ala Gly Ile Asn Gly Pro Gly Ser Gly Val Phe Gly Pro Gly
20 25 30
Ile Ser Gly Ile Tyr Gly Pro Gly Val Phe Gly Pro Gly Val Phe Gly
35 40 45
Pro Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Ile Tyr Gly Pro
50 55 60
Gly Val Phe Gly Pro Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly
65 70 75 80
Ser Gly Val Phe Gly Pro Gly Ala Ser Gly Ile Tyr Gly Pro Gly Val
85 90 95
Phe Gly Pro Gly Val Phe Gly Pro Gly Ser Ser Ala Ala Ala Ala Ala
100 105 110
Gly Ile Tyr Gly Ser Gly Pro Gly Val Phe Gly Pro Tyr Gly Ser Ala
115 120 125
Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Ser Gly Ile Tyr Gly Ile Gly Pro Tyr
130 135 140
Gly Pro Gly Ala Ser Gly Pro Gly Ile Tyr Gly Pro Gly Val Phe Gly
145 150 155 160
Pro Ser Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Gly Val Phe Gly Pro
165 170 175
Gly Ile Tyr Gly Pro Tyr Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ile Tyr
180 185 190
Gly Ser Gly Pro Gly Val Phe Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ile Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Val Phe Gly Pro Gly Val Phe Gly Pro Tyr Ala Ser Ala Ala
210 215 220
Ala Ala Ala Gly Pro Gly Val Phe Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ser Ser
225 230 235 240
Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ile Tyr Gly Tyr Gly Pro Gly Val Phe Gly
245 250 255
Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Gly Ile Asn Gly Pro Gly Ser Gly Ile
260 265 270
Tyr Gly Pro Gly Val Phe Gly Pro Gly Ile Ser Ala Ala Ala Ala Ala
275 280 285
Gly Pro Gly Val Phe Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala
290 295 300
Ala Ala Gly Ile Tyr Gly Pro Gly Val Phe Gly Pro Gly Ile Tyr Gly
305 310 315 320
Pro Gly Ser Ser Gly Pro Gly Val Phe Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ser
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Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ile Tyr Gly Pro Gly Val Phe Gly Pro
340 345 350
Tyr Gly Pro Gly Ile Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ile Tyr Val Phe
355 360 365
Gly Pro Gly Val Phe Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Gly Pro Gly
370 375 380
Val Phe Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly
385 390 395 400
Pro Gly Ile Tyr Gly Pro Gly Val Phe Gly Pro Ser Ala Ser Ala Ala
405 410 415
Ala Ala Ala Gly Ile Tyr Gly Ser Gly Pro Gly Ile Tyr Gly Pro Tyr
420 425 430
Gly Pro Gly Ile Ser Gly Pro Gly Ser Gly Val Phe Gly Ile Gly Pro
435 440 445
Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ile Tyr Gly Pro
450 455 460
Gly Val Phe Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ile Ser Ala Ala Ala Ala Ala
465 470 475 480
Gly Pro Gly Ser Gly Ile Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Gly Ile Asn Gly
485 490 495
Pro Gly Ser Gly Ile Tyr Gly Pro Gly Val Phe Gly Pro Gly Ile Ser
500 505 510
Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ile Tyr Val Phe Gly Pro Gly Val Phe Gly
515 520 525
Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ser Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ile Tyr Gly
530 535 540
Ser Gly Pro Gly Val Phe Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ile Ser Gly Ser
545 550 555 560
Gly Val Phe Gly Pro Gly Val Phe Gly Pro Tyr Ala Ser Ala Ala Ala
565 570 575
Ala Ala Gly Pro Gly Ser Gly Val Phe Gly Pro Gly Ala Ser
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<210> 2
<211> 590
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Met-PRT1104
<400> 2
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1 5 10 15
Ala Ala Ala Gly Gln Asn Gly Pro Gly Ala Gly Gln Gln Gly Pro Gly
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Gln Ala Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly
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Gly Gln Gln Gly Pro Ser Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly
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Ala Gly Gln Gln Gly Pro Gly Ala Ala Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln
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Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala
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Gly Gln Tyr Gly Ala Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Gly Ala
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Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Ala Gly Gln Tyr Gly Gln Gly Pro Tyr
130 135 140
Gly Pro Gly Ala Ala Gly Pro Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly
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Pro Ser Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gly Gln Gln Gly Pro
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Gly Gln Tyr Gly Pro Tyr Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Tyr
180 185 190
Gly Ala Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Gln Ala Gly
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Ala Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Ala Gly Ala Ala
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Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Gly
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Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Tyr Gly Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly
245 250 255
Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ala Gly Gln Asn Gly Pro Gly Ala Gly Gln
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Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gly Ala Ala Ala Ala Ala
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Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Gly Ala Ala Ala
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Ala Ala Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Tyr Gly
305 310 315 320
Pro Gly Ala Ala Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala
325 330 335
Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro
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Tyr Gly Pro Gly Gln Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Tyr Gln Gln
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Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ala Gly Pro Gly
370 375 380
Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly
385 390 395 400
Pro Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ser Ala Gly Ala Ala
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Ala Ala Ala Gly Gln Tyr Gly Ala Gly Pro Gly Gln Tyr Gly Pro Tyr
420 425 430
Gly Pro Gly Gln Ala Gly Pro Gly Ala Gly Gln Gln Gly Gln Gly Pro
435 440 445
Tyr Gly Pro Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Tyr Gly Pro
450 455 460
Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Gln Gly Ala Ala Ala Ala Ala
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Gly Pro Gly Ala Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Ala Ala Gly Gln Asn Gly
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Pro Gly Ala Gly Gln Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gly
500 505 510
Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Tyr Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly
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Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Tyr Gly
530 535 540
Ala Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Gln Ala Gly Ala
545 550 555 560
Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Ala Gly Ala Ala Ala
565 570 575
Ala Ala Gly Pro Gly Ala Gly Gln Gln Gly Pro Gly Ala Ser
580 585 590
<210> 3
<211> 590
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Met-PRT1105
<400> 3
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1 5 10 15
Ala Ala Ala Gly Ile Asn Gly Pro Gly Ala Gly Val Phe Gly Pro Gly
20 25 30
Ile Ala Gly Ile Tyr Gly Pro Gly Val Phe Gly Pro Gly Val Phe Gly
35 40 45
Pro Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Ile Tyr Gly Pro
50 55 60
Gly Val Phe Gly Pro Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly
65 70 75 80
Ala Gly Val Phe Gly Pro Gly Ala Ala Gly Ile Tyr Gly Pro Gly Val
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Phe Gly Pro Gly Val Phe Gly Pro Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala
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Gly Ile Tyr Gly Ala Gly Pro Gly Val Phe Gly Pro Tyr Gly Gly Ala
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Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Ala Gly Ile Tyr Gly Ile Gly Pro Tyr
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Gly Pro Gly Ala Ala Gly Pro Gly Ile Tyr Gly Pro Gly Val Phe Gly
145 150 155 160
Pro Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gly Val Phe Gly Pro
165 170 175
Gly Ile Tyr Gly Pro Tyr Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ile Tyr
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Gly Ala Gly Pro Gly Val Phe Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ile Ala Gly
195 200 205
Ala Gly Val Phe Gly Pro Gly Val Phe Gly Pro Tyr Ala Gly Ala Ala
210 215 220
Ala Ala Ala Gly Pro Gly Val Phe Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Gly
225 230 235 240
Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ile Tyr Gly Tyr Gly Pro Gly Val Phe Gly
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Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ala Gly Ile Asn Gly Pro Gly Ala Gly Ile
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Tyr Gly Pro Gly Val Phe Gly Pro Gly Ile Gly Ala Ala Ala Ala Ala
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Ala Ala Gly Ile Tyr Gly Pro Gly Val Phe Gly Pro Gly Ile Tyr Gly
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Pro Gly Ala Ala Gly Pro Gly Val Phe Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala
325 330 335
Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ile Tyr Gly Pro Gly Val Phe Gly Pro
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Tyr Gly Pro Gly Ile Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ile Tyr Val Phe
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Gly Pro Gly Val Phe Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Ala Gly Pro Gly
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Val Phe Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly
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Gly Pro Gly Ile Ala Gly Pro Gly Ala Gly Val Phe Gly Ile Gly Pro
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<213> 人工序列
<220>
<223> Met-PRT1103
<400> 4
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Gly Pro Gly Ala Ala Gly Pro Gly Gln Phe Gly Pro Gly Gln Gln Gly
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Pro Ser Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Gly Gln Gln Gly Pro
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Gly Ala Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Phe Gly Pro Gly Gln Ala Gly
195 200 205
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Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Phe Gly Pro Gly Ala Gly
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Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Phe Gly Phe Gly Pro Gly Gln Gln Gly
245 250 255
Pro Phe Gly Pro Gly Ala Ala Gly Gln Asn Gly Pro Gly Ala Gly Gln
260 265 270
Phe Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gly Ala Ala Ala Ala Ala
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Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Phe Gly Pro Gly Ala Gly Ala Ala Ala
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Ala Ala Gly Gln Phe Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Phe Gly
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Pro Gly Ala Ala Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Phe Gly Pro Gly Ala
325 330 335
Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Phe Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro
340 345 350
Phe Gly Pro Gly Gln Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Gln Phe Gln Gln
355 360 365
Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Phe Gly Pro Gly Ala Ala Gly Pro Gly
370 375 380
Gln Gln Gly Pro Phe Gly Pro Gly Ala Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly
385 390 395 400
Pro Gly Gln Phe Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ser Ala Gly Ala Ala
405 410 415
Ala Ala Ala Gly Gln Phe Gly Ala Gly Pro Gly Gln Phe Gly Pro Phe
420 425 430
Gly Pro Gly Gln Ala Gly Pro Gly Ala Gly Gln Gln Gly Gln Gly Pro
435 440 445
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450 455 460
Gly Gln Gln Gly Pro Phe Gly Pro Gly Gln Gly Ala Ala Ala Ala Ala
465 470 475 480
Gly Pro Gly Ala Gly Gln Phe Gly Pro Gly Ala Ala Gly Gln Asn Gly
485 490 495
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Met-PRT1107
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Met Gly Pro Gly Val Phe Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Ala Val Ala Ala
1 5 10 15
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Gln Gln Ser Gly Gly Asn Gly Pro Gly Gln Gln Gly Gly Tyr Gly Pro
100 105 110
Gly Gln Gln Gly Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Tyr
115 120 125
Gly Tyr Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gln Gln Gly Pro Gly Gln
130 135 140
Gln Ser Gly Gly Asn Gly Pro Gly Gln Gln Gly Gly Tyr Gly Pro Gly
145 150 155 160
Gln Gln Gly Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Tyr Gly
165 170 175
Tyr Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln
180 185 190
Ser Gly Gly Asn Gly Pro Gly Gln Gln Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gln
195 200 205
Gln Gly Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Tyr Gly Pro
210 215 220
Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Asn Gly
225 230 235 240
Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Pro Gly Ala Ala
245 250 255
Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr
260 265 270
Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Asn Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln
275 280 285
Gln Gly Pro Gly Gln Gln Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly
290 295 300
Pro Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gln Gln Gly Pro Gly Gln
305 310 315 320
Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Pro Gly Ala Ala Ala
325 330 335
Ala Ala Ala Ala Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Tyr Gln
340 345 350
Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln
355 360 365
Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro
370 375 380
Gly Gly Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ser
385 390 395 400
Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro
405 410 415
Gly Gly Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Gly Gln Gln Gly Pro Ser
420 425 430
Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Tyr Gln Gln Gly Pro
435 440 445
Gly Gly Gln Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Pro Gly Ala Ala Ala
450 455 460
Ala Ala Ala Ala Gly Pro Tyr Gln Gln Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro
465 470 475 480
Tyr Gly Pro Gly Gln Gln Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly
485 490 495
Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gly Gln Gly Pro Ser Pro Gly Ala Ala
500 505 510
Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gly Tyr Gly Pro Gly Gly Gln Gly
515 520 525
Pro Ser Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gln Gln
530 535 540
Gly Pro Tyr Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Gln
545 550 555 560
Gln Gly Pro Tyr Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly
565 570 575
Pro Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gly Pro Gly Pro Gly
580 585 590

Claims (27)

1.一种改造丝心蛋白，其为包含式1：[(A)n基序-REP]m或式2：[(A)n基序-REP]m-(A)n基序所表示的结构域序列的改造丝心蛋白，其中，
丝氨酸残基含有率小于5.5％，
[式1和式2中，(A)n基序表示由4～27个氨基酸残基构成的氨基酸序列，并且(A)n基序中的丙氨酸残基数相对于总氨基酸残基数为80％以上，REP表示由10～200个氨基酸残基构成的氨基酸序列，m表示10～300的整数，两个以上存在的(A)n基序彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列，两个以上存在的REP彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。]
2.如权利要求1所述的改造丝心蛋白，其中，苏氨酸残基含有率为9％以下。
3.如权利要求1或2所述的改造丝心蛋白，其中，丝氨酸残基和苏氨酸残基的含有率为9％以下。
4.一种改造丝心蛋白，其包含序列号2、序列号3、序列号4、序列号5或序列号28所表示的氨基酸序列、或者与序列号2、序列号3、序列号4、序列号5或序列号28所表示的氨基酸序列具有90％以上的序列一致性的氨基酸序列。
5.如权利要求1～4中任一项所述的改造丝心蛋白，其中，进一步在N末端和C末端中的任意一个末端或两个末端包含标签序列。
6.如权利要求5所述的改造丝心蛋白，其中，所述标签序列包含序列号17或序列号18所表示的氨基酸序列。
7.一种改造丝心蛋白，其包含序列号10、序列号11、序列号12、序列号13或序列号25所表示的氨基酸序列、或者与序列号10、序列号11、序列号12、序列号13或序列号25所表示的氨基酸序列具有90％以上的序列一致性的氨基酸序列。
8.一种核酸，其编码权利要求1～7中任一项所述的改造丝心蛋白。
9.一种核酸，其在严格条件下与权利要求8所述的核酸的互补链杂交，并且编码包含式1：[(A)n基序-REP]m或式2：[(A)n基序-REP]m-(A)n基序所表示的结构域序列的改造丝心蛋白，
[式1和式2中，(A)n基序表示由4～27个氨基酸残基构成的氨基酸序列，并且(A)n基序中的丙氨酸残基数相对于总氨基酸残基数为80％以上，REP表示由10～200个氨基酸残基构成的氨基酸序列，m表示10～300的整数，两个以上存在的(A)n基序彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列，两个以上存在的REP彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。]
10.一种核酸，其与权利要求8所述的核酸具有90％以上的序列一致性，并且编码包含式1：[(A)n基序-REP]m或式2：[(A)n基序-REP]m-(A)n基序所表示的结构域序列的改造丝心蛋白，
[式1和式2中，(A)n基序表示由4～27个氨基酸残基构成的氨基酸序列，并且(A)n基序中的丙氨酸残基数相对于总氨基酸残基数为80％以上，REP表示由10～200个氨基酸残基构成的氨基酸序列，m表示10～300的整数，两个以上存在的(A)n基序彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列，两个以上存在的REP彼此可以为相同的氨基酸序列，也可以为不同的氨基酸序列。]
11.一种表达载体，其具有权利要求8～10中任一项所述的核酸序列和以能够工作的方式与该核酸序列连接的一个或两个以上调节序列。
12.如权利要求11所述的表达载体，其为质粒载体或病毒载体。
13.一种宿主，其是利用权利要求11或12所述的表达载体进行转化而得到的。
14.如权利要求13所述的宿主，其为原核生物。
15.如权利要求14所述的宿主，其中，所述原核生物为属于选自由埃希氏菌属、短芽孢杆菌属、沙雷氏菌属、芽孢杆菌属、微杆菌属、短杆菌属、棒杆菌属和假单胞菌属组成的组中的属的微生物。
16.如权利要求13所述的宿主，其为真核生物。
17.如权利要求16所述的宿主，其中，所述真核生物为酵母、丝状真菌或昆虫细胞。
18.一种人造改造丝心蛋白组合物，其包含权利要求1～7中任一项所述的改造丝心蛋白。
19.如权利要求18所述的人造改造丝心蛋白组合物，其为蛋白质粉末。
20.如权利要求18所述的人造改造丝心蛋白组合物，其为纺丝原液。
21.如权利要求18所述的人造改造丝心蛋白组合物，其为纤维。
22.如权利要求18所述的人造改造丝心蛋白组合物，其为膜。
23.一种制造方法，其为改造丝心蛋白的制造方法，其中，
其包括通过用表达载体转化的宿主表达该核酸的工序，该表达载体具有编码改造丝心蛋白的核酸序列和以能够工作的方式与该核酸序列连接的一个或两个以上调节序列，
所述改造丝心蛋白是权利要求1～7中任一项所述的改造丝心蛋白。
24.一种制造方法，其为包含改造丝心蛋白的人造改造丝心蛋白组合物的制造方法，其中，
其包括准备改造丝心蛋白的工序，
所述改造丝心蛋白是权利要求1～7中任一项所述的改造丝心蛋白。
25.如权利要求23或24所述的制造方法，其中，其还包括使所述改造丝心蛋白与羧酸接触的工序。
26.如权利要求24所述的制造方法，其中，其还包括调整含有所述改造丝心蛋白和羧酸的改造丝心蛋白溶解液的工序。
27.一种产品，其包括权利要求1～7中任一项所述的改造丝心蛋白，
并选自由纤维、丝、膜、发泡体、粒体、纳米纤丝、凝胶和树脂组成的组。
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